tính đa dạng di truyền ở thực vật

MỤC LỤC
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ………………………………..............3
1.1.

Cây ngô …………………………………………………………............3

1.1.1. Đặc điểm cây ngơ…………………………………………………..........5
1.1.2. Vai trị cây ngơ trong đời sống …………………………………............9
1.1.3. Đặc điểm hóa sinh hạt ngơ………………………………………...........15
1.1.4. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và ở Việt Nam ……………...........15
1.1.4.1. Tình hình sản xuất ngơ trên thế giới …………………………...........15
1.1.4.2. Tình hình sản xuất ngơ ở VIệt Nam …………………………............19
1.2.

Tình hình ngiên cứu tính đa dạng di truyền ở thực vật.......................21

1.2.1. Một số phương pháp sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu quan hệ
di truyền ở thực vật ……………………………………………………..21
1.2.1.1. Kỹ thuật RFLP (restriction fragment length polymorphisms – đa hình
độ dài các đoạn cắt giới hạn)………………………………………...21
1.2.1.2. Kỹ thuật AFLP (amplified fragment length polymorphism – đa hình độ
dài các đoạn được nhân bản chọn lọc)………………….....................23
1.2.1.3. Kỹ thuật RAPD…………………………………………………........25
1.2.1.4.Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat – trình tự lặp lại đơn
giản………………...……………………………………………………….......29
1.2.1.5. Bản đồ QTL (Quantiative Trait loci) ….…………………………........29
1.2.1.6. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ………........30
1.2.2. Nghiên cứu sự đa dạng di truyền ở thực vật bằng kỹ thuật
RAPD …………………………………………………………………….........32
1.2.3. Tình hình nghiên cứu sự đa dạng di truyền của ngô bằng kỹ thuật RAPD
…………………………………………………………………….....................34

1.3. Nhận xét chung………………………………………………….……......36
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………...........38
2.1. Vật liệu nghiên cứu………………………………………………….........38
2.1.1. Vật liệu thực vật …………………………………………………….......38
1


2.1.2. Hóa chất ……………………………………………………………..39
2.1.3. Thiết bị………………………………………………………………39
2.2. Phương pháp nghiên cứu ……………………………………….......39
2.2.1. Phương pháp hóa sinh …………………………………………........39
2.2.1.1. Xác định hàm lượng lipid………………………………………….39
2.2.1.2. Xác định hàm lượng protein……………………………………….40
2.2.1.3. Xác định hàm lượng đường tan …………………………………...40
2.2.2. Phương pháp sinh học phân tử ……………………………………...41
2.2.2.1. Phương pháp tách DNA từ lá non của ngô………………………...41
2.2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch DNA
tổng số ……………………………………………………………………..41
2.2.2.3. Phản ứng RAPD …………………………………………………..42
2.2.2.4. Phương pháp xử lý kết quả và tính tốn số liệu …………………..45
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……………………………….46
3.1.

Đặc điểm hình thái hóa sinh các giống ngơ nghiên cứu ……………46

3.1.1. Đặc điểm hình thái của 14 giống ngô nghiên cứu …………………..46
3.1.2. Hàm lượng protein, lipid, đường của 14 giống ngô nghiên cứu ……47
3.2. Phân tích đa hình DNA bằng kỹ thuật RAPD ……………………..50
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá ngô ………………………….50
3.2.2. Kết quả nghiên cứu đa hình DNA bằng kỹ thuật RAPD ……….......52

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……………………………………………….61

2


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÂY NGƠ
Ngơ, bắp hay bẹ (danh pháp khoa học: Zea mays L. ssp. mays) là một loại
cây lương thực được thuần canh tại khu vực Trung Mỹ và sau đó lan tỏa ra khắp
châu Mỹ. Ngơ lan tỏa ra phần cịn lại của thế giới sau khi có tiếp xúc của người
châu Âu với châu Mỹ vào cuối thế kỷ 15, đầu thế kỷ 16.
Ngô là cây lương thực được gieo trồng nhiều nhất tại châu Mỹ (Chỉ riêng
tại Hoa Kỳ thì sản lượng đã là khoảng 270 triệu tấn mỗi năm). Các giống ngô lai
ghép được các nông dân ưa chuộng hơn so với các giống, thứ ngơ thơng thường
do có năng suất cao vì có ưu thế giống lai. Trong khi một vài giống, thứ ngơ có
thể cao tới 7 m (23 ft) tại một số nơi, thì các giống ngơ thương phẩm đã được
tạo ra với chiều cao chỉ khoảng 2,5 m (8 ft). Ngô ngọt (Zea mays var. rugosa
hay Zea mays var. saccharata) thông thường thấp hơn so với các thứ, giống ngô
khác.
Nguồn gốc và phân loại cây Ngô.
Cây Ngô (Zea mays L.) thuộc chi Maydeae, họ Hịa thảo Gramineae, có
nguồn gốc từ từ Trung Mỹ. Ngơ có bộ nhiễm sắc thể (2n=20). Có nhiều cách để
phân loại Ngơ, một trong số các cách đó là dựa vào đặc điểm của nội nhũ của
hạt và hình thái bên ngồi của hạt. Ngơ được phân loại thành các lồi phụ: Ngơ
đá rắn, Ngô răng ngựa, Ngô nếp, Ngô đường, Ngô nổ, Ngô bột , Ngơ nửa răng
ngựa. Từ các lồi phụ dựa vào màu hạt và màu lõi, Ngô được phân thành các
thứ. Ngồi ra Ngơ cịn được phân loại theo sinh thái học, nông học, thời gian
sinh trưởng và thương phẩm. Hiện nay, xung quanh vấn đề nguồn gốc của cây
Ngô có nhiều giả thuyết:

3


1. Ngô là sản phẩm thuần dưỡng trực tiếp từ cỏ ngô (Zea mays ssp.
parviglumis) một năm ở Trung Mỹ, có nguồn gốc từ khu vực thung lũng sơng
Balsas ở miền nam Mexico, với tối đa khoảng 12% vật chất gen của nó thu được
từ Zea mays ssp. mexicana thơng qua xâm nhập gen.

Hai loại cỏ ngô được coi là nguồn gốc của ngơ
2. Ngơ sinh ra từ q trình lai ghép giữa ngơ đã thuần hóa nhỏ (dạng thay
đổi không đáng kể của ngô dại) với cỏ ngô thuộc đoạn Luxuriantes, có thể là Z.
luxurians hoặc Z. diploperennis.
3. Ngơ trải qua 2 hay nhiều lần thuần dưỡng của ngô dại hay cỏ ngơ.
4. Ngơ tiến hóa từ q trình lai ghép của Z. diploperennis với Tripsacum
dactyloides. (Thuật ngữ cỏ ngơ ở đây chỉ tất cả các lồi và phân loài trong chi
Zea, ngoại trừ Zea mays ssp. mays.) Vào cuối thập niên 1930, Paul Mangelsdorf
cho rằng ngô thuần dưỡng là kết quả của lai ghép giữa ngô dại mà con người
khơng biết rõ với lồi trong chi Tripsacum, một chi có họ hàng gần. Tuy nhiên,
vai trị được đề xuất của Tripsacum (cỏ gama) trong nguồn gốc của ngô đã bị
phân tích gen hiện đại bác bỏ, qua đỏ phủ nhận mơ hình của Mangelsdorf và
thuyết thứ tư trên đây.
1.1.1 Đặc điểm cây Ngô.

4


Cơ quan sinh dưỡng của Ngô bao gồm rễ, thân, lá làm nhiệm vụ duy trì đời
sống cá thể. Hạt được coi là cơ quan khởi đầu của cây.
Sau khi gieo hạt, ngô phát triển thành mầm. Cây mầm chủ yếu sử dụng

nguồn dinh dưỡng chứa trong nội nhũ hạt. Bộ phận phía trên hạt phát triển lên
mặt đất gồm có trụ giữa lá mầm. Phần đỉnh trụ lá mầm có mấu bao lá mầm, từ
đó phát sinh bao lá mầm và bên trong bao lá mầm là thân lá mầm. Trên trục của
cây mầm, một đầu hình thành rễ cây mầm, sau đó phát triển thành rễ chính, từ rễ
chính hình thành các rễ phụ. Ngơ là loại cây có rễ chùm tiêu biểu cho bộ rễ cây
hịa thảo. Hệ rễ có ba loại là: rễ mầm, rễ đốt và rễ chân kiềng. Rễ đốt giúp cho
cây hút nước và chất dinh dưỡng. Rễ chân kiềng mọc xung quanh các đốt phần
thân sát gốc trên mặt đất, rễ này giúp cây chống đổ, đồng thời cũng tham gia vào
hút nước và chất dinh dưỡng cho cây. Số lượng rễ, số lông rễ và chiều dài rễ
khác nhau ở mỗi giống.
Thân ngô thường phát triển mạnh, thẳng cứng dạng bền chắc. Thân chia
thành nhiều gióng, các gióng nằm giữa các đốt, các gióng dài và to dần từ dưới
lên, chiều dài mỗi gióng khoảng 20-30 cm (8-12 inch) tùy thuộc vào giống ngô.
Lá ngô mọc từ mắt trên đốt và mọc đối xứng xen kẽ nhau. Độ lớn và số lá
ngô dao động từ 6 đến 22 lá tùy thuộc vào giống ngô và điều kiện tự nhiên. Lá
ngô trưởng thành bao gồm các bộ phận: bẹ lá, phiến lá, và thìa lá. Ngơ có hình
thái phát triển rất khác biệt; các lá hình mũi mác rộng bản, dài 50–100 cm và
rộng 5-10 cm (2–4 ft trên 2-4 inch); thân cây thẳng, thông thường cao 2–3 m (7–
10 ft), với nhiều mấu, với các lá tỏa ra từ mỗi mấu với bẹ nhẵn. Dưới các lá này
và ôm sát thân cây là các bắp. Khi còn non chúng dài ra khoảng 3 cm mỗi ngày.
Từ các đốt ở phía dưới sinh ra một số rễ.

5


Các cây ngô non trên đồng
Bắp ngô phát sinh từ mầm nách lá trên thân, số mầm nách lá trên thân nhiều
nhưng chỉ có 1-3 mầm nách trên cùng phát triển thành thành bắp. Tùy thuộc vào
giống, điều kiện sinh thái và chăm bón, mật độ , mùa vụ … mà tỷ lệ cây có 2-3
bắp, số hạt trên bắp, vị trí đóng bắp, thời gian phun râu, trổ cờ… khác nhau.

Các bắp ngô (bẹ ngô) là các cụm hoa cái hình bơng, được bao bọc trong
một số lớp lá, và được các lá này bao chặt vào thân đến mức chúng không lộ ra
cho đến khi xuất hiện các râu ngơ màu hung vàng từ vịng lá vào cuối của bắp
ngô. Râu ngô là các núm nhụy thuôn dài trơng giống như một búi tóc, ban đầu
màu xanh lục và sau đó chuyển dần sang màu hung đỏ hay hung vàng.
Ngô là loại thực vật cần thời gian ban đêm dài và ra hoa trong một lượng
nhất định ngày nhiệt độ tăng trưởng > 10 °C (50 °F) trong mơi trường mà nó
thích nghi. Biên độ ảnh hưởng mà thời gian ban đêm dài có đối với số ngày cần
phải có để ngơ ra hoa được quy định theo di truyền và được điều chỉnh bởi hệ
thống sắc tố thực vật. Tính chu kỳ theo ánh sáng có thể bị sai lệch ở các giống
6


cây trồng cho khu vực nhiệt đới, nơi mà thời gian ban ngày kéo dài ở các cao độ
lớn làm cho cây sẽ phát triển rất cao và chúng không đủ thời gian để ra hoa, tạo
hạt trước khi bị chết vì sương giá. Tuy nhiên, đặc tính này là hữu ích khi sử dụng
ngơ làm nguồn cung cấp nhiên liệu sinh học.
Trên đỉnh của thân cây là cụm hoa đi sóc hình chùy chứa các hoa đực,
được gọi là cờ ngơ. Mỗi râu ngơ đều có thể được thụ phấn để tạo ra một hạt ngô
trên bắp. Các bắp ngơ non có thể dùng làm rau ăn với tồn bộ lõi và râu, nhưng
khi bắp đã già (thường là vài tháng sau khi trổ hoa) thì lõi ngơ trở nên cứng và
râu thì khơ đi nên khơng ăn được.
Các hạt ngơ là các dạng quả thóc với vỏ quả hợp nhất với lớp áo hạt, là kiểu
quả thông thường ở họ Hịa thảo (Poaceae). Nó gần giống như một loại quả
phức về cấu trúc, ngoại trừ một điều là các quả riêng biệt (hạt ngô) không bao
giờ hợp nhất thành một khối duy nhất. Các hạt ngơ có kích thước cỡ hạt đậu Hà
Lan, và bám chặt thành các hàng tương đối đều xung quanh một lõi trắng để tạo
ra bắp ngô. Mỗi bắp ngô dài khoảng 10 – 25 cm (4 - 10 inch), chứa khoảng 200 400 hạt. Các hạt có màu như ánh đen, xám xanh, đỏ, trắng và vàng. Khi được
nghiền thành bột, ngô tạo ra nhiều bột và ít cám hơn so với lúa mì. Tuy nhiên,
nó khơng có gluten như ở lúa mì và như thế sẽ làm cho các thức ăn dạng nướng

có độ trương nở nhỏ hơn.
Thân cây ngơ non tích lũy một chất kháng sinh mạnh là DIMBOA (2,4dihydroxy-7-methoxy-1,4-benzoxazin-3-on). DIMBOA là thành viên của nhóm
các axít hydroxamic (cịn gọi là các benzoxazinoit) có khả năng phịng chống tự
nhiên đối với một loạt các lồi gây hại như cơn trùng, nấm và vi khuẩn gây
bệnh. DIMBOA cũng được tìm thấy trong một số lồi “cỏ” có họ hàng gần, cụ
thể là lúa mì. Giống ngơ đột biến (bx) thiếu DIMBOA rất dễ bị các loài rệp và
nấm gây bệnh. DIMBOA cũng là chất có tác dụng đề kháng tương đối của ngô

7


non đối với sâu ngô bore châu Âu (họ Crambidae). Khi ngơ trở nên già hơn thì
hàm lượng DIMBOA cũng như khả năng đề kháng trước sâu bore cũng giảm đi.
Mỗi giai đoạn sinh trưởng, cây ngô yêu cầu về điều kiện sinh thái khác
nhau. Trong điều kiện đảm bảo về độ ẩm, oxy và nhiệt độ thích hợp cho ngô nảy
mầm nhanh sau khi gieo. Nhiệt độ tối thiểu cho nảy mầm 8-12 0C, nhiệt độ tối đa
cho nảy mầm 40-450C, nhiệt độ tối thích từ 25-280C. Ở các thời kỳ sinh trưởng
khác nhau thì sự hút chất dinh dưỡng cũng như yêu cầu về dinh dưỡng của ngô
cũng khác nhau: Ở thời kỳ đầu ngô hút chất dinh dưỡng chậm, thời kỳ 7-8 lá đến
sau 15 ngày, toàn bộ các bộ phận trên mặt đất cũng như các bộ phận dưới mặt
đất của cây ngô tăng trưởng nhanh, các cơ quan sinh dưỡng phát triển mạnh,
lượng tinh bột và chất khô tăng nhanh. Đây là giai đoạn cây ngô hấp thu chất
dinh dưỡng tối đa (bằng 70-90% dinh dưỡng cả vòng đời cây hút). Ở thời kỳ này
nếu cây thiếu nước và chất dinh dưỡng sẽ làm giảm năng suất từ 10-20%. Trong
các yếu tố dinh dưỡng thì đạm là yếu tố quan trọng nhất đối với cây ngơ.
1.1.2. Vai trị cây ngơ trong đời sống.
Ngơ làm lương thực cho con người: Ngô là lương thực nuôi sống 1/3 dân số
trên toàn thế giới, tất cả các nước trồng ngơ nói chung đều ăn ngơ ở các mức độ
khác nhau. Toàn thế giới sử dụng 21% sản lượng ngô làm lương thực cho người.
Các nước ở Trung Mỹ, Nam Á, và Châu Phi sử dụng ngô làm lương thực chính.

Các nước Đơng Nam Phi sử dụng 85% sản lượng ngô làm lương thực cho
người, Tây Trung Phi 80%, Bắc Phi 42%, Tây Á 27%, Nam Á 75%, Đông Nam
Á và Thái Bình Dương 39%, Đơng Á 30%, Trung Mỹ và các vùng Caribe 61%
…Nếu như ở Châu Âu khẩu phần ăn cơ bản là bánh mỳ, khoai tây sữa; Châu Á
là cơm (gạo), cá, thịt, rau xanh thì châu Mỹ Latinh là bánh ngơ, đậu, ớt. Vì vậy,
trên phạm vi thế giới ngô vẫn là cây lương thực rất quan trọng, vì ngơ rất phong
phú dinh dưỡng hơn lúa mỳ và gạo.

8


Tại Hoa Kỳ và Canada, sử dụng chủ yếu của ngô là nuôi gia cầm và gia
súc, cỏ khô, cỏ ủ chua hay lấy hạt làm lương thực. Cỏ ủ chua được sản xuất
bằng cách lên men các đoạn thân cây ngơ non. Hạt ngơ có nhiều ứng dụng trong
cơng nghiệp, như chuyển hóa thành chất dẻo hay vải sợi. Một lượng ngô nhất
định được thủy phân hay xử lý bằng enzym để sản xuất xi rô, cụ thể là xi rô
chứa nhiều fructoza, gọi là xi rô ngô, một tác nhân làm ngọt và đôi khi được lên
men để sau đó chưng cất trong sản xuất một vài dạng rượu. Rượu sản xuất từ
ngô theo truỳen thống là nguồn của wisky bourbon. Etanol từ ngô cũng được
dùng ở hàm lượng thấp (10% hoặc ít hơn) như là phụ gia của xăng làm nhiên
liệu cho một số động cơ để gia tăng chỉ số octan, giảm ô nhiễm và giảm cả mức
tiêu thụ xăng (ngày nay gọi chung là "các nhiên liệu sinh học" và đã từng gây ra
tranh cãi mạnh liên quan tới sự cần thiết về các nguồn nhiên liệu mới đối với
con người với sự cần thiết phải duy trì, trong các khu vực như châu Mỹ Latinh,
các thói quen ăn uống là bản chất của các nền văn minh như các nền văn minh
xuất phát từ khu cực Trung Mỹ; Sự chấp nhận các thỏa thuận thương mại về ngô
của NAFTA đã làm trầm trọng thêm các tranh cãi này, liên quan tới các điều
kiện lao động tồi tệ của người công nhân trên các cánh đồng, và chủ yếu là
NAFTA "mở cửa cho việc nhập khẩu ngô từ Hoa Kỳ, nơi mà các nông dân trồng
ngô nhận được trợ cấp nhiều tỷ đôla và các hỗ trợ khác từ chính quyền. (...)

Theo OXFAM UK, sau khi NAFTA có hiệu lực, giá ngơ tại Mexico đã giảm
70% trong giai đoạn từ năm 1994 tới năm 2001. Số lượng việc làm cũng giảm
theo: từ 8,1 triệu vào năm 1993 xuống còn 6,8 triệu vào năm 2002. Phần nhiều
trong số những người mất việc làm là những người trồng ngô ở quy mô nhỏ [11].
Tuy nhiên, việc đưa vào các khu vực tại các vĩ độ xa hơn về phía bắc của Hoa
Kỳ các loại ngơ sản xuất nhiên liệu sinh học không nhằm mục tiêu tiêu thụ của
con người hay động vật, có thể làm giảm xu hướng này. Sự tiêu thụ ngơ từ phía
con người như là một loại lương thực chính diễn ra tại nhiều khu vực trên thế
giới. Trong nhiều nền văn hóa người ta sử dụng các món cháo ngơ, như polenta
ở Italia, angu ở Brasil, mămăligă ở Romania hay mush tại Hoa Kỳ hoặc các thức
9


ăn gọi là sadza, nshima, ugali và mealie pap tại châu Phi. Ngơ cũng là thành
phần chính trong tortilla, atole và nhiều món ăn khác trong ẩm thực Mexico, hay
chicha, một loại đồ uống lên men ở Trung và Nam Mỹ. Việc ăn ngơ cịn trên lõi
cũng tùy thuộc vào từng nền văn hóa. Nó là khá phổ biến tại Hoa Kỳ nhưng
dường như không thấy tại châu Âu.
Ngô ngọt (hạt)
Giá trị dinh dưỡng 100 g (3,5 oz)
Năng lượng

360 kJ (86 kcal)

Các bon hyđrát

19 g

Đường

3.2 g

Chất xơ thực phẩm

2.7 g

Chất béo

1.2 g

Protein

3.2 g

Vitamin A equiv.

10 μg (1%)

Thiamine (Vit. B1)

0.2 mg (15%)

Niacin (Vit. B3)

1.7 mg (11%)

Axít folic (Vit. B9)

46 μg (12%)

Vitamin C

7 mg (12%)

Sắt

0.5 mg (4%)

Ma giê

37 mg (10%)

Ka li

270 mg (6%)

Tỷ lệ phần trăm theo lượng hấp thụ
thường nhật của người lớn.
Nguồn: Cơ sở dữ liệu USDA
Ngô ngọt là dạng biến đổi gen chứa nhiều đường và ít tinh bột, được dùng
như một loại rau. Bỏng ngô là các hạt ngô từ một vài giống, thứ ngô sẽ nổ để
xốp hơn khi bị rang nóng. Nó là một loại đồ ăn chủ yếu dành cho những người
thích ăn quà vặt.

10


Ngơ cũng có thể được chế biến thành bánh đúc ngô, với các hạt ngô được
tẩy trắng bằng một số chất kiềm. Bánh đúc ngơ nói chung hay được sử dụng tại
khu vực đông nam Hoa Kỳ, loại thức ăn này là học tập từ cách chế biến của thổ

dân Mỹ. Một loại thức ăn phổ biến khác từ ngô là bánh bông ngô. Bột ngô cũng
được sử dụng làm một loại bánh mì và món tortilla của Mexico.
Một vài dạng ngô cũng được trồng làm cây cảnh. Đối với mục đích này, các
dạng với lá hay bắp nhiều màu được sử dụng. Ngồi ra, các dạng ngơ với kích
thước lớn, ví dụ ngơ cao tới 9,4 m (31 ft) hay ngô với bắp dài tới 60 cm (24
inch), là các dạng ngơ cảnh trong ít nhất là một thế kỷ đã qua.
Lõi ngơ cũng có thể khoan lỗ và dùng như một loại tẩu hút thuốc rẻ tiền,
lần đầu tiên được sản xuất tại Mỹ vào năm 1869. Lõi ngơ cũng có thể dùng như
một nguồn nhiên liệu. Ngơ tương đối rẻ tiền và các lò sưởi tại gia với việc sử
dụng hạt ngô làm nguồn nhiên liệu cũng đã được tạo ra.
Một công dụng không thông thường khác của ngô là tạo ra các Mê cung
ngô nhằm thu hút du khách. Các mê cung này được tạo ra trên các cánh đồng
ngô. Ý tưởng về mê cung ngô do Adrian Fisher, một nhà thiết kế mê cung hiện
đại nhiều ý tưởng đưa ra, cùng với Công ty The American Maze đã đưa ra mê
cung loại này tại Pennsylvania vào năm 1993. Các mê cung truyền thống tại Mỹ
nói chung dùng các hàng rào thủy tùng, nhưng chúng phải mất vài năm mới có
thể đủ lớn. Sự phát triển nhanh chóng của các cánh đồng ngơ cho phép việc sắp
xếp các mê cung bằng sử dụng Hệ thống định vị toàn cầu (GPS) vào đầu mùa và
tạo ra mê cung khi ngơ đủ cao để che khuất tầm nhìn của du khách vào mùa hè.
Tại Canada và Hoa Kỳ, các "mê cung ngô" khá phổ biến trong nhiều cộng đồng
nơng dân.
Ngơ ngày càng gia tăng vai trị như là một nguồn nhiên liệu sinh học, chẳng
hạn etanol. Nhà máy điện khí hóa sinh khối tại Strem, gần Güssing, Burgenland,

11


Austria đã hoạt động từ năm 2005. Nghiên cứu để sản xuất diesel từ khí sinh học
theo phương pháp Fischer Tropsch cũng đã được thực hiện.
Ngô cũng được dùng như một loại mồi câu gọi là "viên bột nhão". Nó là

phổ biến tại châu Âu để câu nhấp.
Các núm nhụy từ hoa cái của ngô (râu ngô), cũng được buôn bán như là
một loại thảo dược có tác dụng lợi tiểu.
Hạt ngơ cũng có thể dùng thay cho cát sỏi trong một số chỗ vui chơi cho trẻ
em.
Ở Việt Nam, cây ngô được trồng cách đây khoảng 300 năm và được trồng
trên những điều kiện sinh thái khác nhau của cả nước. Hàm lượng chất dinh
dưỡng của ngô phụ thuộc vào từng giống, đặc biệt là các giống ngô nếp địa
phương tuy năng suất không cao nhưng chất lượng của ngô rất tốt phù hợp với
thị hiếu người tiêu dùng. Vì vậy việc nghiên cứu đặc điểm hình thái, hóa sinh
của các giống ngô giúp chọn được các giống ngô có năng suất cao và chất lượng
tốt đáp ứng cho nhu cầu sử dụng của con người.
1.1.3. Đặc điểm hóa sinh hạt ngô.
Các chất trong hạt ngô dễ bị đồng hóa nên có giá trị dinh dưỡng cao. Hạt
ngơ chứa tinh bột, lipit, protein, đường (chiếm khoảng 3,5%), chất khoáng (12,4%), Vitamin (A, B1, B2, B6, C) và một lượng rất nhỏ xenlulose (2,2%).
Hạt Ngô chứa phần lớn tinh bột, hàm lượng tinh bột trong hạt thay đổi
trong giới hạn 60-70%. Hàm lượng tinh bột ở ngô tẻ cao hơn ngô nếp. Tinh bột
tập trung chủ yếu ở nội nhũ và được chia thành hai dạng tinh bột là tinh bột
mềm (tinh bột bột) và tinh bột cứng (tinh bột sừng hay tinh bột phale).

12


Hàm lượng lipit cao thứ hai sau lúa mạch, nó chiếm khoảng (3,5-7%) và
phụ thuộc vào từng giống điều kiện tự nhiên.
Protein của ngơ được chia thành 3 dạng chính: protein hoạt tính (enzyme),
protein cấu tạo và protein dự trữ, trong đó protein dự trữ chiếm tỷ lệ cao nhất.
Hàm lượng protein chiếm khoảng 4,8-16,6% , tùy vào mỗi giống.
Thành phần dinh dưỡng của ngô vàng đều cao hơn gạo trắng. Ngồi thành
phần tinh bột, protein, lipit, ở ngơ cịn chứa nhiều loại vitamin trong đó vitamin

C cao nhất. Qua đó thấy được ngơ là cây lương thực có giá trị dinh dưỡng tương
đối cao ( bảng 1.1).
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của ngơ và hạt gạo (Phân tích trên 100g).
Thành phần hóa

Gạo trắng

Ngơ vàng

học
Tinh bột (g)
Protein(g)
Lipit(g)
Vitamin A (mg)
Vitamin B1 (mg)
Vitamin B2 (mg)
Vitamin C (mg)
Nhiệt lượng (kalo)

65,00
8,00
2,5
0,00
0,20
0,00
0.00
340

68,20
9,60

5,2
0,03
0,28
0,08
7,70
350
( Cao Đắc Điểm, 1988)

1.1.4. Tình hình sản xuất ngơ trên thế giới và ở Việt Nam.
1.1.4.1.Tình hình sản xuất ngơ trên thế giới.
Trong những năm gần đây diện tích ngơ trên tồn thế giới đã tăng lên gấp
rưỡi, năng suất tăng gấp 2,5 lần. Diện tích ngơ hàng năm khoảng 139 triệu ha,
năng suất bình qn khoảng 3,8 triệu tấn/ha. Ngơ là cây có địa bàn phân bố rộng
nhất thế giới, trải rộng hơn 90 vĩ tuyến: Từ 40 0N đến 550B, từ độ cao 1-2m đến
13


400m so với mực nước biển. Do đó ngơ được trồng ở hầu hết các nơi trên thế
giới như Châu Mỹ, Châu Âu, Châu Úc, Châu Phi, Châu Á.
Theo dự báo của Viện nghiên cứu chương trình lương thực thế giới (IPRI,
2003), vào năm 2020 tổng nhu cầu ngô trên thế giới là 852 triệu tấn, trong đó
15% dùng làm lương thực, 69% dùng làm thức ăn chăn nuôi, 16% dùng làm
nguyên liệu cho công nghiệp. Ở các nước phát triển chỉ dùng 5% ngô làm lương
thực nhưng ở các nước đang phát triển sử dụng 22% ngô làm lương thực (IPRI,
2003). Đến năm 2020 nhu cầu ngô trên thế giới tăng 45% so với năm 1997, chủ
yếu tăng cao ở các nước đang phát triển (72%), riêng Đông Nam Á nhu cầu tăng
70% so với năm 1997 (Bảng 1.2), sở dĩ nu cầu ngô tăng mạnh là do dân số thế
giới tăng, thu nhập bình quân đầu người tăng nên nhu cầu thịt, cá, trứng , sữa…
tăng mạnh dẫn đến địi hỏi lượng ngơ dùng cho chăn ni.
Các nhà sản xuất hàng đầu — năm 2005

Ngô được gieo trồng rộng khắp
thế giới với sản lượng hàng năm

(triệu tấn)
Hoa Kỳ

280

cao hơn bất kỳ cây lương thực

Trung Quốc

131

nào. Trong khi Hoa Kỳ sản xuất

Brasil

35

gần một nửa sản lượng chung của

Mexico

21

Argentina

20

thế giới thì các nước sản xuất hàng

Ấn Độ

15

Pháp

13

Indonesia

12

Cộng hịa Nam Phi

12

Italia. Sản lượng toàn thế giới năm

Ý

11

2003 là trên 600 triệu tấn — hơn

692

cả lúa và lúa mì. Năm 2004, gần

Tồn thế giới

đầu khác cịn có Trung Quốc,
Brasil, Mexico, Argentina, Ấn Độ,
Pháp, Indonesia, Nam Phi và

Nguồn:

33 triệu ha ngô đã được gieo trồng

FAO (FAO)

trên khắp thế giới, với giá trị
khoảng trên 23 tỷ USD.

14


Bảng 1.2: Dự báo nhu cầu ngô trên thế giới đến năm 2020.
Vùng
Thế giới
Các nước đang

Năm 1997

Năm 2020

(triệu tấn)
586

(triệu tấn)
582

% thay đổi
45

295

508

72

phát triển
Đông Á

136

252

85

Nam Á

14

19

36

Cận Sahara-

29

52

79

Châu Phi
Mỹ-Latinh

75

118

57

Tây và Bắc

18

28

56

Phi
(Nguồn: Viện nghiên cứu chương trình lương thực thế giới IPRI, 2003)
Theo Đại học Tổng hợp Iowoa (2006), trong những năm gần đây khi thế
giới cảnh báo nguồn dầu mỏ đang cạn kiệt, thì ngơ vẫn đang được sử dụng để
chế biến ethanol dùng thay thế một phần nhiên lệu xăn dầu chạy ôtô ở Mỹ,

Braxin, Trung Quốc…Riêng ở Mỹ, năm 2002-2003 đã dùng 25,2 triệu tấn ngô
để chế biến ethanol, năm 2005-2006 dùng 40,6 triệu tấn và dự kiến đến năm
2012 dùng 190,5 triệu tấn ngơ (Oxfarm, 2004). Diện tích, năng suất, sản lượng
ngô giữa các châu lục trên thế giới có sự chênh lệch: Bảng 1.3.
Bảng 1.3. Tình hình sản xuất ngô ở một số khu vực trên thế giới giai đoạn 2005-2007.
15


Khu

Diện tích (Triệu

vực
2005

ha)
2006

Năng suất
(ta/ha)
200 2006 2007

2007

Sản lượng (Triệu
2005

tấn)
2006

2007

96,1

82,6

5
Châu Âu

11,9

15,6

13,9

46,5

61,3

59,1

69,1

Châu Á

43,7

45,0

46,4

38,3

40,7

39,9

167,3 183,3 185,4

Trung Mỹ

39,9

40,9

41,3

72,6

81,6

75,7

289,6 333,7 312,0

Thế Giới

144,3 146,9

147,0

44,5

49,9

41,7

642,

Bắc và

724,2 692,0

5
(Nguồn: Số liệu thống kê của FAOSTAT, 2008).
Qua bảng 1.3 cho thấy: Diện tích trồng ngơ giữa các châu lục có sự khác
nhau trong đó Châu Á có diện tích trồng ngơ lớn nhất, năm 2005 là 43,7 triệu ha
đến năm 2007 là 46,4 triệu ha chiếm 31,6% diện tích ngơ tồn thế giới. Đứng ở
vị trí thứ hai là khu vực Bắc và Trung Mỹ chiếm 28% diện tích ngơ trên thế giới.
Châu Âu là khu vực có diện tích trồng ngơ thấp, chiếm 9,5% diện tích ngơ trên
thế giới. Nhìn chung diện tích trồng ngơ của các khu vực trên thế giới biến động
giữa các năm không đáng kể, nếu lấy 2007 làm mốc so sánh thì Châu Âu ó giảm
về diện tích, cịn Châu Á và Bắc Trung Mỹ thì diện tích tăng. Bắc và Trung Mỹ
có năng suất cao nhất đạt 75,5 tạ/ha, đứng thứ hai là khu vực Châu Âu: 59,1
ta/ha, và thấp nhất là Châu Á: 39,91 ta/ha (năm 2007). Sở dĩ Châu Á có năng
suất thấp vì khu vực này có điều kiện khí hậu không thuận lợi như: lũ lụt, hạn

16

hán, đất canh tác chưa thuận lợi. Giai đoạn 2005-2007 khu vực Bắc và Trung
Mỹ năng suất tăng mạnh, Châu Á tăng 2,4 ta/ha, Bắc và Trung Mỹ tăng 9 ta/ha,
đến năm 2007 do nhiều lý do khác nhau hai khu vực này đều có năng suất giảm.
Bắc và Trung Mỹ là khu vực dẫn đầu về sản lượng ngô trên toàn thế giới. Đứng
thứ hai là khu vực Châu Á đạt 185,43 triệu tấn, chiếm 26,79% tổng sản lượng
ngô toàn thế giới.
Như vậy, trong giai đoạn từ năm 2005-2007 diện tích trồng ngơ trên thế
giới tăng khơng đáng kể, nhưng do áp dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật tiên tiến
đặc biệt là việc mở rộng diện tích trồng ngơ lai trên thế giới có sự nhảy vọt về
năng suất và sản lượng ngơ, nhất là các nước có nền kinh tế phát triển có điều
kiện thâm canh cao và sử dụng 100% giống ngô lai trong sản xuất. Tình hình sản
xuất ngơ của một số quốc gia trên thế giới được thể hiện qua bảng 1.4.
Bảng 1.4. Tình hình sản xuất ngơ của một số quốc gia trên
thế giới năm 2007

Tên nước
Italy
Mỹ
Hy Lạp
Canada
Trung Quốc
Ấn Độ

Diện tích

Năng suất

(Triệu ha)
1,06
30,08

0,84
1,08
26,22
7,4

(ta/ha)
93,15
100,64
80,95
77,43
50,01
19,6

Sản lượng
(Triệu tấn)
10,62
280,22
6,80
8,39
131,15
14,5

(Nguồn: Số liệu thống kê của FAO, 2008)
Qua bảng 1.4 cho thấy, Mỹ là quốc gia có năng suất, sản lượng lớn nhất đạt
30,8 triệu ha, với tổng sản lượng đạt 280,22 triệu tấn, năng suất bình quân đạt
100,64 ta/ha. Có thể nói Mỹ và Trung Quốc là hai cường quốc có diện tích trồng
ngơ lớn nhất và cao gấp nhiều lần các quốc gia khác.
Như vậy, trên thế giới trong những năm qua về năng suất ngô đã tăng nhanh
ở một số nước phát triển và một số nước đang phát triển. Hiện nay thị trường
17

ngô trên thế giới được đánh giá là một thị trường tương đối khả quan. Chính vì
vậy mà sản lượng ngơ trên tồn cầu sẽ tăng trưởng mạnh trong những năm tới
(Theo USDA 1/2003).
1.1.4.2.Tình hình sản xuất ngơ ở Việt Nam.
Ở Việt Nam cây ngô được trồng cách đây khoảng 300 năm và được trồng
trên những điều kiện sinh thái khác nhau của cả nước. Là cây trồng quan trọng
thứ hai sau lúa, là cây lương thực chính để phát triển chăn nuôi. Năng suất ngô
của nước ta trước đây rất thấp so với năng suất của thế giới do sử dụng giống
ngô địa phương và áp dụng khoa học kỹ thuật cịn hạn chế, phải đến năm 1991
cây ngơ lai mới bắt đầu được đưa vào trồng ở nước ta, tỷ lệ trồng giống ngô lai
từ 0,1% (năm 1990) đã tăng lên 80% (năm 2006) và đưa Việt Nam thành nước
sử dụng giống ngơ lai nhiều và có năng suất cao ở khu vực Đơng Nam Á.
Bảng 1.5. Tình hình sản xuất ngơ ở Việt Nam từ năm 2004-2006.
Năm
2004
2005
2006

Diện tích

Năng suất

(1000 ha)
991,1
1052,60
1031,60

(Tạ/ha)

34,6171
35,6859
37,024

Sản lượng
(1000 tấn)
343,09
375,63
381,94

Ở nước ta ngơ đượctrồng ở hầu hết các địa phương có đất cao dẽ thốt hơi
nước. Những vùng trồng ngô lớn là Đông Nam Bộ, Tây Ngun, miền núi phía
Bắc, Trung du đồng bằng sơng Hồng, Duyên hải miền Trung. Trong đó khu vực
miền núi phía bắc trồng chủ yếu là các giống ngơ địa phương. Năng suất của các
giống ngô địa phương thường thấp, tuy nhiên các giống ngô này vẫn tiếp tục
được quan tâm nghiên cứu vì các ưu điểm như kar năng chịu hạn, chống sâu
bệnh tốt và có thể gieo trồng trên nhiều loại đất khác nhau. Đặc bệt trong những
năm gần đây việc sử dụng rộng rãi các giống ngô lai làm cạn kiệt nguồn gen các

18


giống ngơ địa phương. Vì vậy việc sưu tầm, đánh giá, nghiên cứu nguồn gen các
giống ngô địa phương là hết sức cần thiết.
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở THỰC
VẬT.
1.2.1. Một số phương pháp sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu
quan hệ di truyền thực vật.
1.2.1.1. Kỹ thuật RFLP (restriction fragment length polymorphisms – đa
hình độ dài các đoạn cắt giới hạn).

Kỹ thuật RFLP là kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân
đoạn DNA dựa trên điểm cắt các enzim giới hạn (Restriction Enzyme ,RE). Khi
ủ DNA với Enzyme giới hạn ở dung dịch đệm thích hợp ở pH, nhiệt độ thích
hợp sẽ tạo ra những phân đoạn DNA với kích thước khác nhau, từ đó lập nên các
bản đồ gen. Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi từ thập niên 80 đến nay.
Nguyên tắc chung: Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ dặc hiệu của
các Enzyme cắt giới hạn (restriction enzyme) đối với vị trí nhận biết của chúng
trên DNA bộ gen. Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân
đoạn cát khác nhau.
Các enzyme giới hạn: Enzym giới hạn (RE) được Werner Arber tìm thấy ở
vi khuẩn vào năm 1962. Ơng cho rằng các RE có khả năng rất đặc biệt đó là khả
năng nhận biết DNA chủ và DNA lạ. Enzyme này hạn chế sự nhân lên của DNA
lạ khi chúng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn bằng cách cắt chúng ra thành từng
đoạn một cách đặc hiệu, vì thế ơng gọi restriction có nghĩa là hạn chế. Với phát
minh này ông và cộng sự đã dành giải nobel năm 1978.
Các

RE

hợp

thành

hệ

thống

bảo

vệ

ở

tế

bào

sơ

hạch

(prokaryote), một câu hỏi đặt ra là vì sao các RE chỉ cắt DNA của các phage mà
không cắt DNA của tế bào vi khuẩn? Câu trả lời là nhờ methylase đây là enzyme
giúp vi khuẩn có khả năng này, chính enzyme này chịu trách nhiệm gắn nhóm

19


metyl (CH3) vào các nucleotide ở vị trí cắt của các RE trên DNA của vi khuẩn
vì thế bảo vệ DNA của vi khuẩn khỏi sự phân cắt của RE. Tuy vậy đơi lúc
methylase lại gắn nhầm cả nhóm metyl vào DNA của phage, điều này giải thích
vì sao đối với cả các dịng vi khuẩn kháng phage vẫn có các tế bào bị phân hủy
Enzyme cắt giới hạn đầu tiên được phân lập vào năm 1968, cho đến nay có
khoảng 3400 RE được khám phá. Trong số này có khoảng 540 RE được thương
mại hóa
Quy trình thực hiện RFLP bao gồm các bước: (1) Tách chiết và tinh sạch
DNA; (2) Cắt các mẫu DNA cần phân tích bởi RE; (3) Phân tách DNA trên gel
agarose.
Ưu điểm của kỹ thuật RFLP: Chỉ thị tin cậy trong phân tích liên kết và chọn
giống vì chúng có thể xác định được một tính trạng ở trạng thái đồng hợp tử

hoặc dị hợp tử trong một cá thể, tận dụng được biến dị tự nhiên, phát hiện tính
biến dị của DNA trong các giai đoạn phát triển DNA ở các cơ qua khác nhau và
xây dựng quan hệ di truyền, nghiên cứu quan hệ họ hàng.
Nhược điểm của kỹ thuật RFLP: Là kỹ thuật phức tạp, tốn kém, mất thời
gian. Phương pháp này đòi hỏi một lượng DNA lớn (50-200ng từ mỗi cá thể).
1.2.1.2. Kỹ thuật AFLP (amplified fragment length polymorphism – đa hình
độ dài các đoạn được nhân bản chọn lọc).
Kỹ thuật AFLP được hiểu là sự đa dạng của các đoạn DNA được nhân lên
có định hướng sau khi bị cắt bởi 2 Enzyme giới hạn, sử dụng những phân đoạn
DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP là một trong những kỹ
thuật in dấu DNA được phát triển bởi Vos và cộng sự năm 1995. Kỹ thuật này là
một cơng cụ hữu ích để xác nhận nhiều loci của đa hình DNA mà khơng cần
phải biết trước thơng tin về trình tự DNA của chúng (Michelmore và ctv.,1988),
phương pháp này có thể đưa ra nhanh chóng một ước lượng độ đa dạng di
truyền trong và giữ những quần thể với nhau (Breyen và ctv.,1997;Cervera và
ctv.,1996).

20


Nguyên tắc: Nguyên tắc của phương pháp AFLP cũng giống như RFLP,
điểm khác biệt cơ bản là AFLP không cần tiến hành lai phân tử (lai Southern
blot), do vậy thực hiện nhanh hơn. Kỹ thuật AFLP gồm 2 nội dung cơ bản là:
-

Cắt DNA bằng Enzyme giới hạn có bổ sung các adaptor đặc hiệu tạo nên

các đoạn mút giống nhau, đặc trưng cho các mồi đã chọn trước. Cặp Enzyme
thường được dùng nhiều nhất là EcoRI-MseI. Đoạn adaptor gồm 2 phần phần
trình tự lõi và trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt Enzyme.

-

Khuếch đại đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR ngắt quãng với hai loại mồi

khác nhau. Mồi của phản ứng PCR được thiết kế dựa trên trình tự adaptor và
chứa một trình tự chon lọc khoảng vài Nucleotide. Chỉ những phân đoạn DNA
nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự nucleotide chọn lọc mới được khuếch
đại, chính trình tự chọn lọc sẽ làm giảm sự xuất hiện sản phẩm PCR và làm đơn
giản quá trình phân tích.
Ưu và nhược điểm của kỹ thuật AFLP:
Ưu điểm của kỹ thuật AFLP
-

AFLP không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được tồn bộ gen.

-

Có tính lặp lại cao hơn RFPD và chỉ cần sử dụng một lượng nhỏ DNA ban

đầu (2,5pg – 25ng).
-

Khuếch đại có chọn lọc một lượng lớn các đoạn DNA đa hình

(polymorphism) trong một phản ứng PCR, phù hợp cho việc phân tích đa dạng
giữa các quần thể có các quan hệ gần nhau.
-

Khơng cần biết trước trình tự DNA cần nghiên cứu, khơng cần sử dụng

nhiều loại primer.
-

Là kỹ thuật in dáu DNA còn khá mới lạ nhưng rất hiệu quả, có thể in dấu

DNA của bất kỳ nguồn gốc phức tạp nào từ sinh vật sơ hạch, thức vật, động vật
và con người.
Nhược điểm
-

Tuy nhiên AFLP là một marker trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể

đồng hợp và dị hợp.
21


Quy trình dài, phức tạp tốn nhiều thời gian thực hiện.
-

Lệ thuộc nhiều vào thao tác ở những bước đầu để có được phổ diện các

đoạn DNA lý tưởng.
Ứng dụng
In dấu DNA, lập bản đồ DNA marker có hiệu quả nhất so với các marker
khác.Tạo nhóm liên kết di truyền với các nhóm khác
- Đánh giá mức độ liên hệ di truyền hoặc sự khác nhau giữa các giống
-

Là công cụ hiệu quả để phát hiện tính chất đa hình nên dễ dàng nhận biết

sự khác biệt giữa các cá thể.
1.2.1.3. Kỹ thuật RAPD.
Là phương pháp phân tích đa dạng DNA khuếch đại ngẫu nhiên, kỹ thuật
này được phát hiện vào năm 1990 (Welsh và Mc Clelland; William và ctv.).
Dùng nghiên cứu sự khác biệt di truyền của những loài khac nhau. Mồi được sử
dụng trong kỹ thuật RAPD là những sợi oligonucleotide gồm 10-mer có trình tự
sắp xếp ngẫu nhiên. Các sản phẩm RAPD được phân tích bằng cách điện di trên
gel agarose. Hệ gen của hai loài khác nhau sẽ cho những đoạn băng trên gen
khác nhau, từ đó có thể so sánh sự đa dạng sinh học của các giống cây.
Nguyên tắc:
Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng các primer ngắn
(khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên
những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Các đoạn mồi
oligonucleotide nếu bắt cặp ngẫu nhiên với cả hai mạch đối diện của mạch
khn DNA trong khoảng cách có thể khuếch đại được (dưới 3000 bp) sẽ cho ra
những đoạn DNA có kích thước khác nhau sau khi khuếch đại. Sự có mặt của
các sản phẩm DNA khác nhau chứng tỏ đã có một sự tương đồng hồn tồn hay
một phần giữa DNA bộ gen và mồi. Các mồi dùng trong RAPD thường ngắn vì
vậy thường dễ dàng tìm được các đoạn mồi tương đồng trên mạch đơn DNA bộ
gen. Do đó tính đa dạng thu được từ RAPD là đáng tin cậy, vì khi có sự thay đổi
một base nito nào đó thifnos sẽ ngăn cản việc tiếp hợ giữa mồi và DNA mạch

22


khuôn. Sự mất đoạn nhiễm sắc thể hoặc sự thêm bớt điểm gắn mồi cũng như sự
xen vào của một gen nào đó sẽ làm thay đổi kích thước đoạn DNA được khuếch
đại
Dùng nhiều primer khác nhau sẽ khuếch đại nhiều đoạn gen với kích thước
khác nhau, kết quả này được thể hiện trên gel với nhiều băng (bald) ở những vị

trí khác nhau, cá băng đa hình được ghi nhận và từ đó có thể vã được bản đồ trên
một quần thể đang phân ly.
Sinh vật cùng loài sẽ có kiểu gen hồn tồn giống nhau, sẽ khuếch đại các
đoạn DNA có kích thước giống nhau khi sử dụng bất kỳ mồi ngẫu nhiên nào để
chạy PCR. Sinh vật khác ít nhiều sẽ khác nhau vè kiểu gen_ đa dạng về sinh
học, thì với một số mồi ngẫu nhiên nào đó các đoạn DNA được khuếch đại sẽ có
kích thước khác nhau.
Mồi
Là đoạn ngắn oligonucleotide đơn (10 nu) được tổng hợp một cách ngẫu
nhiên, có hàm lượng G+C 60-70%, và khơng có đầu tự bổ sung.
Để tìm sự khác biệt giữa các loài, người ta thường sử dụng một số lượng
lớn các mồi ngẫu nhiên.
Trên thị trường hiện nay có rất nhiều mồi ngẫu nhiên được tổng hợp nhân
tạo.
Quy trình thực hiện kỹ thuật RAPD.
-

Thiết kế mồi.

-

Chuẩn bị mẫu DNA: Mẫu DNA được ly trích phải đủ thuần, ít tạp chất.

-

Pha mix cho phản ứng PCR với các thành phần theo thứ tự sau: H 2O tiệt

trùng, Buffer, dNTP tổng số, mồi xuôi, mồi ngược, Taq Polymarase, DNA mẫu.
-

Cho vào máy lập chương trình chạy hù hợp.

-

Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose với sự có mặt của thang chuẩn

-

Phân tích kết quả bằng phần mền BioPRO.

-

Xác định tính di truyền bằng các phần mền thơng dụng. Các số liệu thu

được cho thấy sự gần gũi hay cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu.
23


-

Hệ số đồng dạng di truyền có thể được tính theo công thức của M.Nei &

Li (1979).
Sij = 2Nij/Ni + Nj
Ni: Số vạch của giống i
Nj: Số vạch của giông j
Nij: Số vạch chung của cả hai giống i và j.
Ứng dụng
Kỹ thuật RAPD được ứng dụng để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các
giống.

Phát hiện khả năng di truyền liên quan đến một tính trạng: Trong chương
trình cải thiện giống, nhà chọn giống thường quan tâm đến những tính trạng mà
nó biểu hiện bên ngồi đó chính là kiểu hình (phynotype), các tính trạng đó có
thể là tính kháng sâu bệnh, tính chống chịu phèn mặn… Nhưng nếu việc phân
tích di truyền chỉ dựa trên kiểu hình thường kết quả sẽ bị sai lệch, do kiểu hình
là tương tác giữa kiểu gen và mơi trường. Chính vì thế nhà, chọn giống cần phải
biết tính trạng đó liên kết với kiểu gen như thế nào, phương pháp RAPD cũng
giúp phát hiện được điều này (Vương Đình Trị, 1988
Thiết lập bản đồ di truyền: Từ quần thể cha mẹ F1 và quần thể phân ly F2,
người ta có thể đánh giá các băng hiện diện, sau đó dùng các phần mềm phổ
biến hiện nay là Mapmarker để thiết lập bản đồ di truyền.
Sử dụng kỹ thuật RAPD “ Nghiên cứu đa dạng các giống cây có múi ở
huyện Gị Quao, tỉnh Kiên Giang”. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng 4 mồi A02,
A04, A11 và A13 trong phân tích đa dạng di truyền; kết quả có 49 dấu phân tử
được ghi nhận. Từ đó vẽ được giản đồ phả hệ của các giống cây này. Nguyễn
Hữu Hiệp, Trần Nhân Dũng, Đặng Thanh Sơn và Nguyễn Văn Được. Tạp chí
Khoa học 2004:1, trang 105-114.
Phương pháp RAPD có những nhược điểm:
Sự xuất hiện các băng tính trội, điều đó khơng phân biệt được cá thể đồng
hợp tử và dị hợp tử.
24


Tính lặp lại khơng cao do primer là primer ngẫu nhiên và phụ thuộc phản
ứng chạy PCR.
Trở ngại trong việc phân tích cá băng có cùng tốc độ di chuyển.
Những ưu điểm nổi bật của kỹ thuật RAPD:
Phương pháp phát hiện nhanh tính đa dạng di truyền.
Đơn giản khơng địi hỏi kỹ thuật cao.
Tương đối rẻ tiền so với các kỹ thuật khác như RFLP, SSR …

Không dùng đồng vị phóng xạ.
1.2.1.4. Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat – trình tự lặp lại đơn giản)
Kỹ thuật SSR còn được gọi là kỹ thuật microsatellies (vi vệ tinh). Kỹ thuật
này được Litt và Luty phát triển năm 1989 dựa trên nguyên tắc của PCR
Trong cấu trúc hệ gen của sinh vật nhân chuẩn tồn tại một loạt các trình tự
nucleotide lặp lại, chúng đặc trưng cho loài. SSR gồm 2 - 5 nucleotide lặp lại
nhiều lần. Ví dụ: (AT)n, (AG)n, (AGTC)n. SSR nằm rải rác trong hệ gen của
thực vật bậc cao. Đoạn mồi được thiết kế dựa trên vùng bảo thủ ở hai đầu của
đoạn SSR. Số lần lặp lại nhiều lần làm cho các phân đoạn DNA được nhân có độ
dài ngắn khác nhau. Các trình tự lặp lại thường có ở vùng dị nhiễm sắc trên mỗi
nhiễm sắc thể. Chúng có vai trị điều hồ hoạt động của các gen, góp phần làm
tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong phân bào, nó có thể mang
thông tin di truyền liên quan đến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật.
Do sự khác nhau về số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại mà số đơn vị
lặp lại xuất hiện sự đa hình về độ dài của SSR được nhân bản. Mức độ đa hình
được xác định sau khi điện di sản phẩm trên gel agarose và gel polyacrylamide.
SSR được phân tích trên nhờ PCR nên chỉ cần địi hỏi một lượng mẫu DNA rất
nhỏ. SSR là cơng cụ hữu ích trong phân tích hệ gen và chọn giống cây trồng vì
đây là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện tính đa hình rất cao. Trong thực tế
chỉ thị này đã được sử dụng nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến năng
suất, bệnh dại, xác định giới tính, phân tích quan hệ di truyền, lập bản đồ gen…

25