Xây dựng phương pháp nhận diện và phân tích tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao băng kỹ thuật Microsatellite 3

Phần 3
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.1.Vật liệu
3.1.1.Các giống cacao thí nghiệm
Các dòng cacao thí nghiệm bao gồm:
• 13 dòng cacao thương mại (được liệt kê ở bảng 3.1) được trồng tại vườn
sưu tập giống cacao, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.
• 8 dòng cacao CT bao gồm: CT1, CT3, CT4, CT5, CT6, CT7, CT8 và CT9
được trồng tại 2 vườn giống cacao ở tỉnh Cần Thơ.
Ngoài ra còn có ba giống cacao: trồng tại vườn sưu tập giống cacao, Đại học
Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, được chọn để so sánh kết quả phân tích với Ngân hàng
cacao thế giới.
Cách thức lấy mẫu như sau:
• Giống ở gần phòng thí nghiệm (13 dòng cacao thương mại và 3 giống
AMAZ15/15, NA33 và PA107): chúng tôi lấy mẫu lá tại vườn và đem về
phòng thí nghiệm để ly trích DNA ngay. Vì chúng tôi quan sát thấy lá
cacao nếu lưu trữ lâu quá 24 giờ, cho dù trong tủ -20
o
C, sẽ xuất hiện nhiều
đốm nâu trên bề mặt lá làm ảnh hưởng đến chất lượng DNA ly trích.
• Giống ở xa phòng thí nghiệm (8 dòng cacao CT): mẫu lá sau khi lấy được
giữ lạnh và chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ để ly trích
DNA ngay.
Trên mỗi cây, chúng tôi chọn các lá tươi, có màu xanh thẫm nhưng không quá
già, cũng không chọn những lá non vì chúng chứa nhiều nhựa rất khó li trích, ngoài ra lá
phải không có dấu hiệu bị sâu bệnh hay côn trùng tấn công. Các mẫu lá được trữ trong
tủ -20
o
C cho đến khi tiến hành ly trích.
Những cây chọn để lấy mẫu lá (mỗi giống chọn 2 cây) được cột dây nylon màu

để đánh dấu.
35
Bảng 3.1: Các dòng cacao thương mại khảo sát.
Sồ thứ tự Tên thương mại Tên dòng Nguồn gốc
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
TD1
TD2
TD3
TD5
TD6
TD7
TD8
TD9
TD10
TD11
TD12
TD13
TD14

BAL209
BAL244
BR25
KKM
225
PBC123
PBC154
PBC157
PBC159
PBC230
PBC236
QH1213
QH22
QH441
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
36
3.1.2.Hóa chất thí nghiệm
3.1.2.1.Primer

Tổng hợp kết quả nghiên cứu về 15 cặp primer microsatellite để kiểm tra tính
đồng nhất di truyền của cacao do tổ chức USDA và Đại Học Pennsylvania State, Mỹ,
thực hiện (xem phần 2.6.1 và 2.6.2), chúng tôi chọn ra 5 cặp primer để phát hiện các
trình tự microsatellite nằm trên 5 nhiễm sắc thể (NST) khác nhau trên genome của cacao
(Ingenic Newsletter No.9, 2004).
Năm cặp primer này cho các đoạn khuếch đại có tính đa hình cao giữa các giống
cacao (xem bảng 2.1) do đó có thể cho kết quả phân biệt rõ giữa các dòng cacao khảo
sát.
Các primer có chiều dài từ 18-20bp, primer forward ở mỗi primer được đánh dấu
bằng màu huỳnh quang ở đầu 5’, do công ty Applied-Biosystem, Mỹ, tổng hợp.
Bảng 3.2: Các primer microsatellite dùng trong thí nghiệm
Tên Màu
hùynh
quang
Trình tự microsatellite Vị
trí
trên
Ta
(
o
C)
Trình tự khuếch đại
Hình 3.1: Lấy mẫu lá cacao tại vườn Hình 3.2: Đánh dấu cây được chọn
37
NST
mTcCIR7



mTcCIR8

mTcCIR11
mTcCIR15



mTcCIR18
Xanh
dương
Xanh lá
cây
Vàng
Đỏ
Xanh
dương
5’-6FAMATGCGAATGACAACTGGT-3’

GCTTTCAGTCCTTTGCTT
5’-VICCTAGTTTCCCATTTACCA-3’

TCCTCAGCATTTTCTTTC
5’-NEDTTTGGTGATTATTAGCAG-3’

GATTCGATTTGATGTGAG
5’-PETCAGCCGCCTCTTGTTAG-3’

TATTTGGGATTCTTGATG
5’-6FAMGATAGCTAAGGGGATTGAGGA-3’

GGTAATTCAATCATTTGAGGATA
7
9
2
1
4
51
46
46
46
51
(GA)
11
(TC)
5
TT(TC)
17
TTT(CT)
4
(TC)
13
(TC)
19
(GA)
12
3.1.2.2.Các hóa chất dùng trong ly trích DNA
• Dịch trích DNA (extraction buffer EB), 100mL EB bao gồm of 2g CTAB,
28mL 5M NaCl, 20mL 0.5M Tris-HCl, 4mL 0.5M EDTA, 1mL Mercapto
ethanol, nước cất 2 lần khử ion đã hấp khử trùng.

• TE buffer, bao gồm 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 1mM EDTA (pH 8.0).
• CIA, bao gồm 24V chloroform: 1V isoamylalcohol.
• Isopropanol.
• Sodium acetate.
• Ethanol 70% and 96%.
• RNase.
• Low-salt TE (10 mM Tris-HCl , 1mM EDTA [pH 8.0]).
3.1.2.3.Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR
• 10X PCR buffer (do công ty BioRad cung cấp).
• 25mM MgCl
2
(do công ty BioRad cung cấp).
• 10mM dNTP’s (do công ty Applied-Biosystem-Mỹ cung cấp).
• Taq DNA polymerase (do công ty BioRad cung cấp)
38
• Primer (do công ty Applied-Biosystem-Mỹ cung cấp).
• DNA mẫu (ly trích từ lá cacao).
• H
2
O cất 2 lần, siêu lọc, hấp khử trùng.
3.1.2.4.Các hóa chất dùng trong phân tích trình tự
• Sản phẩm PCR.
• Chất làm biến tính DNA: Hidi Formamide
• Chất chuẩn để xác định kích thước của các peak (size standard).
• Polymer pop 6-ABI.
• Buffer.
3.1.3.Trang thiết bị thí nghiệm
• Chén sứ và chày giã (Đức)
• Eppendorf 0,2 ml; 0,5 ml; 1,5 ml (Mỹ)
• Cân phân tích 4 số (Ohaus - Mỹ)

• Máy hút và tủ cấy vô trùng (Anh Quốc).
• Pipet các loại (Nichiryo –Nhật).
• Đầu típ các loại (Đức)
• Máy ly tâm lạnh (Hettich –Đức).
• Máy luân nhiệt (Biorad –Thụy Điển).
• Máy điện di (Cosmo Bio Co. –Nhật).
• Máy chụp ảnh DNA (Biorad –Mỹ).
• Lò Viba (Electrolux –Thụy Điển).
• Máy định ôn (Memmert –Đức).
• Tủ lạnh các loại (Sanyo –Nhật).
• Máy giải trình tự ABI 3100 (Applied Biosystem-Mỹ)
• Mao quản 36cm (Applied Biosystem-Mỹ)
39
3.2.Phương pháp
3.2.1.Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là DNA được ly trích từ lá của 21 dòng cacao
khảo sát. Từ DNA tổng số thu được, chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu các al có chứa các
trình tự microsatellite đặc trưng cho từng dòng.
3.2.2.Bố trí thí nghiệm
Đề tài được thực hiện tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại Học
Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. Thời gian từ tháng 3/20005 đến tháng 8/2005 gồm 4 giai
đoạn chính như sau:
• Giai đoạn 1: Xây dựng phương pháp nhận diện 21 dòng cacao dựa trên 5 cặp
primer microsatellite mTcCIR7, mTcCIR8, mTcCIR11, mTcCIR15 và
mTcCIR18. Phương pháp nhận diện gồm 4 bước:
1- Lấy mẫu lá của 21 dòng cacao.
2- Tiến hành li trích DNA
3- Thực hiện phản ứng PCR với 5 primer.
4- Phân tích sản phẩm PCR thu được trên máy giải trình tự DNA. Dùng phần
mềm Gene Mapper để đọc kết quả phân tích các đoạn microsatellite của mỗi

dòng. Ghi nhận dữ liệu microsatellite của 21 dòng cacao với 5 primer.
• Giai đoạn 2: Kiểm tra độ chính xác và tính ổn định của phương pháp nhận
diện.qua 2 bước:
1. Thu nhận mẫu lá của 13 dòng cacao thương mại cũng từ vườn giống cacao tại
Đại Học Nông Lâm, 13 dòng này đã được người lấy mẫu mã hoá tên giống dưới dạng:
A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14 (các mã số này được giữ
kín cho đến khi thu được kết quả cụ thể). Tiến hành các bước phân tích như ở giai đoạn
40