Xây dựng phương pháp nhận diện và phân tích tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao băng kỹ thuật Microsatellite 2

Phần 2
Tổng quan tài liệu

2.1.Giới thiệu tổng quan về cây cacao
Cây cacao có tên khoa học là Theobroma cacao L. (2n = 20), thuộc họ
Sterculiacea, là cây duy nhất trong số 22 loài của thứ Theobroma được trồng sản xuất.
Hiện nay có 3 vùng chính trên thế giới trồng cacao:
- Nam Mỹ: Brazil, Ecuador.
- Tây Phi: Bờ Biển Ngà, Ghana, Cameroon, Nigeria.
- Đông Nam Á: Indonesia, Malaysia, Việt Nam.
2.1.1.Nguồn gốc cây cacao
Cacao là một loại cây trồng bản địa của các nước nhiệt đới ẩm và được người
Maya trồng ở Châu Mỹ từ rất lâu, trước khi người Châu Âu có mặt. Từ “cacao” từ tiếng
Maya mà ra, và cho đến ngày nay, khắp nơi đều dùng từ này. Cacao xuất hiện lần đầu
tiên trong danh mục từ thực vật từ năm 1605.
2.1.2.Đặc điểm hình thái
Hình 2.1: Theobroma cacao
3
Rễ: rễ cacao có dạng trụ, dài khoảng 1.5-2 m. Trên suốt chiều dài của rễ trụ có
nhiều rễ ngang phân nhánh và rất nhiều rễ con tập trung chủ yếu dưới cổ rễ khoảng 20
cm.
Thân: Cacao là loài cây thân gỗ nhỏ, có thể cao từ 10-20 m nếu mọc tự nhiên.
Trong điều kiện sản xuất, chiều cao trung bình của cây cacao khoảng 5-7 m, đường kính
khoảng 10-18 cm. Trên mỗi thân cacao có thể có từ 4-5 tầng cành.
Lá: Lá cacao phát triển theo từng đợt, buông thỏng xuống. Màu sắc lá thay đổi
tùy theo giống, từ màu xanh nhạt đến vàng, từ màu hồng đến đỏ đậm. Trong quá trình
trưởng thành, lá mất sắc tố nên có màu xanh hoặc xanh thẫm, cứng cáp hơn và có thể
nằm ngang. Lá dưới bóng che có phiến rộng và xanh hơn lá ở ngoài nắng. Khí khổng
chỉ có mặt ở dưới phiến lá. Trên mặt lá, mô dậu có nhiều khoang giữa các tế bào và
chứa đầy chất nhựa, lớp ngoại bì bị cutin hóa rất mạnh. Lá tồn tại được từ 4-5 tháng, sau
đó đi vào giai đoạn lão suy và rụng.

Hoa: Hoa cacao xuất hiện trên sẹo lá của thân, cành. Hằng năm, hoa xuất hiện
trên cùng một chỗ ở vết sẹo lá, lâu ngày chỗ ra hoa phình to và nhô lên thành đệm hoa.
Hoa có cuống dài 1-3 cm, có 5 cánh đều đặn xen kẽ với 5 cánh đài. Hoa nở từ 3 giờ
chiều đến 9 giờ sáng hôm sau.
Quả: Những đặc tính về màu sắc, kích thước và hình dạng quả thay đổi rất nhiều
tùy thuộc vào giống.
+ Màu sắc: Quả chưa chín có thể có màu xanh, đỏ tím hoặc xanh điểm sắc đỏ
tím…Khi quả đạt độ chín, màu xanh chuyển qua vàng, màu đỏ tím thường chuyển qua
màu da cam.
+ Hình dạng, kích thước: Hình dạng quả thay đổi từ hình cầu, hình oval đến hơi
dài, nhọn hoặc hình trứng. Thường quả có chiều dài 7-30 cm, rộng 7-9 cm.
Hạt: Hạt cacao không có nhân, mập, dài 2-3 cm và có cùi nhớt màu trắng, có vị
hơi chua bao bên ngoài. Kế lớp cùi nhớt là lớp vỏ mỏng, nhiều đường gân bao bọc lấy
hạt ở bên trong. Hạt chứa tử diệp màu tím (màu trắng ngà hoặc vàng nhạt đối với giống
Criollo) và hóa nâu sau khi lên men. Kích thước hạt có thể thay đổi tùy theo giống và
mùa vụ. Mỗi quả cacao có từ 30-40 hạt.

4
2.1.3.Yêu cầu sinh thái
Khí hậu: Cacao thường được trồng ở các vùng có độ cao 800 m so với mực
nước biển, trên các vùng có lượng mưa khoảng 1500-2000 mm/năm. Cây cacao thích
nghi tốt ở nhiệt độ tối đa là 30-32
o
C và nhiệt độ tối thiểu là 18-21
o
C. Cây bị thiệt hại
nghiêm trọng ở nhiệt độ nhỏ hơn 10
o
C. Ẩm độ thích hợp cho cây khoảng 70-80%.
Cacao đặc biệt sinh trưởng phát triển tốt trong điều kiện che bóng (chỉ cho 70% lượng

ánh sáng lọt qua).
Đất: Cacao thích hợp với nhiều loại đất khác nhau, đất cát, đất phù sa ven
sông, đất trên các triền dốc và cả trên đất nghèo dinh dưỡng nhưng có bóng che và gần
nguồn nước. Cacao sinh trưởng và phát triển tốt nhất với đất có độ pH trong khoảng
5.5-6.7. Đất phải đảm bảo khả năng thoát nước tốt nhưng đồng thời cũng giữ nước tốt.
Vì thế, ở nước ta, cacao thường được trồng ở Tây Nguyên, Duyên Hải Miền Trung,
Đông Nam Bộ và một số tỉnh miền Tây Nam Bộ.

2.1.4.Các giống cacao
Trên thế giới, cacao có nhiều dòng, nhóm. Mỗi dòng, nhóm đều mang những
đặc tính khác nhau, thích hợp trên những vùng sinh thái khác nhau. Hiện nay giống
cacao được chia làm 3 nhóm chính:
- Nhóm Criollo: Hoa có nhị màu vàng nhạt, trước khi chín quả có màu xanh
hoặc đỏ, quả dài, chóp nhọn và có 10 khía đều nhau, vỏ quả sần sùi, mỏng, dễ cắt, hạt
có tiết diện tròn, phôi nhũ có màu trắng ngà.
- Nhóm Forastero – Amazone: Hoa có nhị màu tím, quả màu xanh, sau chuyển
sang màu vàng, đuôi quả tròn, vỏ dày, khó cắt, ít hoặc không có khía, hạt có phôi nhũ
màu đỏ tím.
- Nhóm Trinitario: Có đặc tính trung gian giữa 2 nhóm Forastero và Criollo.
Ở Việt Nam, giống cacao hiện có là con lai giữa nhóm Forastero và nhóm
Trinitario. Tuy nhiên, trước đây, giống được trồng ở các địa phương là thế hệ con cháu
của sự tạp giao giữa 3 nhóm trên.

5
2.1.5.Đặc điểm chính của 21 dòng cacao nghiên cứu trong đề tài
Các dòng cacao nghiên cứu trong đế tài thuộc những giống có năng suất cao,
có giá trị thương mại nhờ được chọn lọc từ những cây bố, mẹ có đặc tính tốt trong quá
trình lai tạo giống.
13 dòng cacao thương mại được nhập từ Malaysia có đời bố mẹ của một số
dòng như sau:

Tên dòng Đời bố mẹ
TD1 PA 35 x NA 32
TD3 Con lai của Trinitario
TD5 UAWA 18 x T.S.15/43.352
TD10 NA 31 x PA 15
TD13 UIT 1 x NA 33
TD14 PA 173 x SCA 9
TD12 (PA 76 x SCA 20) x (UIT 1 x SCA 6)

2.2.Qui trình ly trích DNA ở tế bào thực vật
Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu
nhận một lượng lớn nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm kế
tiếp. Mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận được
các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ
học (phân tử bị gẫy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải bởi các
enzyme nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ). Các nucleic acid cần
được tách chiết ở nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào
(Desoxyribonuclease-Dnase và Ribonuclease-Rnase)
Một qui trình ly trích DNA ở tế bào thực vật gồm 3 bước cơ bản:
Bước 1: Phá vỡ màng tế bào.
Thông thường người ta nghiền tế bào hoặc mô trong một hỗn hợp dung dịch
đệm chiết gồm Tris – HCl 1M (pH 7.5), NaCl 5M, EDTA 0.5M, sodium dodecyl sulfat
10% (SDS). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi
trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.
Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu chủ yếu là các
protein.
Có thể sử dụng CTAB/NaCl (CTAB: Cetyltrimethylammonium bromide) tạo
phức hợp với polysaccharide và protein rồi kết tủa chúng. Loại bỏ protein và phức hợp
6
CTAB – polysaccharide – protein bằng hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol

(25:24:1). Phenol và chloroform sẽ làm biến tính protein. Ngoài ra chloroform còn làm
cho pha nước và pha hữu cơ dễ tách rời nhau. Isoamyl alcohol hạn chế sự nổi bọt trong
suốt quá trình ly trích. Mặc dù phenol làm biến tính protein nhưng nó có thể làm ức chế
hình dạng của Rnase và làm dung môi cho phân tử Rnase có chứa những chuỗi dài
polyA (Brawerman và ctv,1972). Do đó, có thể khắc phục nhược điểm này bằng cách sử
dụng thêm chloroform sẽ giúp loại bỏ tất cả các dấu vết còn sót lại của phenol trong
nucleic acid. Protein bị biến tính sẽ không hòa tan trong pha nước có chứa nucleic acid
và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha hữu cơ. Pha nước có
chứa nucleic acid được thu nhận lại.
Bước 3: Tủa nucleic acid trong isopropanol.
Các DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị tủa nên có thể loại bỏ chúng
bằng tủa trong isopropanol. Nucleic acid sẽ được thu nhận lại bằng ly tâm. Sau đó, cặn
tủa phải được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của
isopropanol còn dính lại (Hồ Huỳnh Thùy Dương,1998).
 Phân tích định tính và định lượng DNA bằng quang phổ kế.
Sau khi thu nhận nucleic acid ở dạng sạch, chúng ta có thể tiến hành phân tích
định tính và định lượng DNA bằng quang phổ kế.
Phương pháp này cho phép ước lượng tương đối nồng độ nucleic acid có trong
mẫu sau khi ly trích được. Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào sự hấp thụ mạnh
ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine. Giá trị mật độ
quang (OD: optical density) ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép xác định
nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào tương quan: một đơn vị OD
260nm
tương ứng với
nồng độ 50ng/μl cho dung dịch chứa DNA mạch kép. Tuy nhiên, cách tính này chỉ đúng
với dung dịch chứa nucleic acid sạch. Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, người ta đo
thêm giá trị OD
280nm
. Tại bước sóng 280 nm, protein có mức hấp thụ cao nhất, nhưng các
protein cũng hấp thu bước sóng ở 260 nm như các nucleic acid và do đó làm sai lệch giá

trị thật của nồng độ nucleic acid. Tỉ số OD
260nm
/OD
280nm
là tỉ số cho thấy độ nhiễm các
chất như phenol hoặc protein.
- Tỉ số OD
260nm
/OD
280nm
= 1.8 đối với DNA tinh khiết.
- Tỉ số OD
260nm
/OD
280nm
= 2 đối với RNA tinh khiết (Quách Tuyết Oanh, 2003)
7
2.3.Giới thiệu về kỹ thuật PCR
2.3.1.Nguyên tắc của kỹ thuật PCR
PCR được thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ nối tiếp
nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 trình tự như sau :
Bước 1: Biến tính
Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao (94-95
o
C) trong vòng 30 giây đến 1
phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch đơn. Chính 2 mạch đơn này
đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới.
Bước 2: Phản ứng của primer gắn vào đầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã
trên dây template để có phân tử DNA mới.
Ở giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp cho phép các primer bắt cặp với khuôn,

nhiệt độ này dao động trong khoảng 30-70
o
C, kéo dài trong khoảng 30 giây đến 1 phút,
tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy Tm (melting temperature) của các primer sử dụng.
Giai đoạn này gọi là giai đoạn lai.
Bước 3: Kéo dài dây mới nhờ primer
Nhiệt độ được tăng lên 72
o
C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời
gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo
dài từ 30 giây đến vài phút.
Kết quả cuối cùng là một đoạn mã hóa di truyền đặc biệt nào đó được khuếch
đại lên rất nhiều lần. Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:
Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2
n
m : là số bản sao của chuỗi mã hóa.
n : là số chu kỳ.
8
Hình 2.2: Nguyên tắc phản ứng PCR
Ba trình tự này xảy ra theo chu kỳ rất nhanh để khuếch đại DNA. Trong chu kỳ
thứ nhất và thứ hai của phản ứng khuếch đại, chỉ có sản phẩm chuỗi dài được hình
thành, còn trong những chu kỳ tiếp theo khuếch đại cả những sản phẩm chuỗi dài và
chuỗi ngắn. Sản phẩm chuỗi dài được tích tụ theo hướng tuyến tính, còn sản phẩm chuỗi
ngắn tích tụ theo logarit. Do dó, người ta hy vọng có khoảng 10
5
lượng sản phẩm chuỗi
ngắn sau khoảng 25-30 chu kỳ. Theo nguyên tắc PCR được áp dụng để khuếch đại các
đoạn DNA có chiều dài 200-2000bp.
Những phản ứng trên được thực hiện nhờ polymerase như Taq polymerase, và sự
thay đổi chu kỳ nhiệt một cách hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho giai đoạn biến tính và

giai đoạn bắt cặp.
Một polymerase của DNA và bốn deoxy (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) được dùng
để khuếch đại một đoạn chuyên tính nào đó của DNA. Khả năng “chọn lọc” này được
thực hiện thông qua sự hợp lại của 2 oligonucleotide (F và R) trong phản ứng. Nhiệm vụ
9
của những oligonucleotide này là tác động làm cho DNA bị biến chất (mở dây đôi thành
dây đơn) và những phần cuối của đoạn nhằm tăng hoạt lên và cho nó hoạt động như
những primer trong sinh tổng hợp DNA.
Primer bên trái tác động trên dây DNA 3’-5’ còn được gọi là forward primer, kí
hiệu là F. Primer bên phải tác động trên dây 5’-3’ còn được gọi là reverse primer, kí
hiệu là R. Sự sắp xếp như vậy đảm bảo vùng bị can thiệp được tăng cường hoạt động,
theo 3 trình tự đã nói ở trên. Tóm lại khi các primer kết hợp với sợi DNA đối lập của nó
trong điều kiện một khoảng cách đã được kích hoạt, các đoạn DNA này có thể sẽ được
khuếch đại lên theo phản ứng dây chuyền với polymerase.
2.3.2.Tối ưu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR
2.3.2.1.DNA mẫu
Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch. Tuy nhiên, những kỹ
thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết
tế bào (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003)
Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm (1μg xuống còn 100ng)
với việc sử dụng các polymerase cho hiệu quả cao. Hơn nữa việc giảm lượng mẫu ban
đầu còn hạn chế các khuếch đại “kí sinh”, tạo những sản phẩm phụ không mong muốn
(Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003).
Thông thường, nhiễm protein trong mẫu DNA trong quá trình ly trích DNA sẽ
không ảnh hưởng xấu đến sự nhân DNA. Tuy nhiên nhiễm DNA lạ sẽ dẫn đến kết quả
PCR bị sai lệch.
Đối với những DNA có kích thước quá lớn (>50kb), sự biến tính có thể không
hữu hiệu và năng suất PCR thấp. Trong trường hợp này, cần phải cắt DNA trước bằng
enzyme cắt hạn chế mà enzyme đó không cắt trong chuỗi đích; hoặc có thể tách DNA
bằng cách dùng nhiệt độ tới 100

o
C trong 2-5 phút.
2.3.2.2.Taq polmerase
Taq polymerase là enzyme chịu nhiệt ly trích từ vi khuẩn suối nước nóng
Thermus aquaticus. Với enzyme này, PCR cho hiệu quả cao nhất, Taq có thể xúc tác
kéo dài khoảng 35-100 nucleotide trong 4 giây ở nhiệt độ 70-80
o
C, đây là giới hạn nhiệt
độ thích hợp nhất cho enzyme này hoạt động (C.R Newton và A.Graham, 1997).
10
Nồng độ Taq polymerase được sử dụng thông thường là 0.5-5 đơn vị/100μl dung
dịch phản ứng. Nếu nồng độ Taq quá cao, những sản phẩm không chuyên tính có thể
nhảy vào làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq quá thấp, chúng ta sẽ không có đủ số
lượng men để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR theo ý muốn.
Trong phản ứng PCR thì Taq polymerase có khuynh hướng thêm một nucleotide
loại “A” vào đầu tận cùng 3’ của sản phẩm PCR, điều này rất quan trong trong việc tạo
dòng (TA- cloning) và nó sẽ bị loại thải đi nếu sự gắn kết xảy ra ở đầu tận cùng là đầu
bằng (blunt end ligation). Ngoài ra có thể làm gia tăng hoạt tính của Taq polymerase
bằng cách sử dụng kết hợp với một số enzyme khác: Tli hoặc Pfu. Use Tli, Pfu và một
số enzyme polymerase khác.
2.3.2.3.Primer
Primer là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu
quả cao. Việc chọn primer là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR, việc thiết kế
primer phải tuân thủ một số chỉ tiêu cơ bản sau (Vincent R. Prezioso, 2004):
1- Chiều dài primer
Đây là một chỉ tiêu quan trọng cho sự thành công của PCR, vì tính đặc hiệu
và nhiệt độ bắt cặp của primer phụ thuộc một phần vào chiều dài primer. Thông thường
primer có chiều dài từ 18-24 base (theo nguyên tắc của Wallace) có tính đặc hiệu cao, và
cho nhiệt độ bắt cặp tối ưu. Kích thước primer không nên quá ngắn, trừ trường hợp phục
vụ cho mục đích đặc biệt, và cũng không nên quá dài vì sẽ làm giảm khả năng bắt cặp.

2- Nhiệt độ nóng chảy T
m
Hai primer xuôi và ngược trong phản ứng PCR phải có nhiệt độ nóng chảy
không cách biệt nhau quá xa, vì nếu sự chênh lệch nhiệt độ lớn thì primer có T
m
cao hơn
sẽ bắt cặp không đặc hiệu, còn primer có T
m
thấp hơn sẽ không thể lai được với DNA.
3- Độ đặc hiệu
Độ đặc hiệu của primer phụ thuộc một phần vào chiều dài primer như đã nói
ở trên. Để có độ đặc hiệu cao, primer phải được thiết kế sao cho chỉ khuếch đại một trình
tự đặc trưng duy nhất trên DNA hay chỉ cho một sản phẩm chính, và không nên có nhiều
trình tự lặp lại trên primer, vì điều này sẽ dẫn đến sự xuất hiện các sản phẩm phụ. Nhiệt
độ của giai đoạn kéo dài không được quá thấp so với nhiệt độ bắt cặp của primer để đảm
bảo tính đặc hiệu.
11
4- Trình tự bổ sung trên primer
Trình tự primer phải được thiết kế sao cho có không quá 3 cặp base có trình
tự bổ sung với nhau, vì điều này sẽ dẫn đến hiện tượng “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung
giữa các phần khác nhau của một primer, làm ngăn cản sự bắt cặp của primer với DNA.
Hai primer xuôi và ngược phải không có trình tự bắt cặp bổ sung với nhau để
tránh hiện tượng “dimer primer”, vì điều này sẽ dẫn đến sự cạnh tranh bắt cặp với DNA
và cản trở sự hình thành sản phẩm mong muốn. Ngoài ra, nồng độ quá thừa của primer
cũng dẫn đến sự hình thành “dimer primer” (Bùi Chí Bửu,1999). Thông thường, primer
xuôi và primer ngược thường có nồng độ bằng nhau, khoảng 0.1μM tương đương với
2.5pmol trong 25 μl dung dịch phản ứng. Trình tự DNA nằm giữa hai mồi “xuôi” và
“ngược” không được quá lớn. Phản ứng sẽ tối ưu trên những trình tự DNA nhỏ hơn 1 kb
(Hoàng Thị Liễu, 2004).
5- Hàm lượng GC và AG

Thành phần nucleotide của các primer nên cân bằng, tránh cặp GC lặp lại
nhiều lần. Hàm lượng GC của primer nên nằm trong khoảng 45% đến 50% (Kwork
và ctv., 1990), trình tự primer lý tưởng nhất là có 50% GC (theo nguyên tắc của
Wallace). Trình tự primer phải không có poly G hay poly C, poly A hay poly T, vì điều
này sẽ làm cho sự bắt cặp không đặc hiệu. Trình tự polypyrimidine TC hay polypurine
Agcũng cần phải tránh vì nó làm giảm hiệu quả khuếch đại.
6- Trình tự đầu 3’
Vị trí đầu 3’ của primer rất quan trọng trong việc kiểm soát hiện tượng
“mismatch” - bắt cặp không đặc hiệu. Cần tránh trình tự A hay T ở đầu 3’, mà thay vào
đó là G hoặc C vì mối liên kết hydro giữa G-C mạnh hơn A-T sẽ bảo đảm cho sự bắt
cặp đặc hiệu.
2.3.2.4.Nhiệt độ bắt cặp
Kỹ thuật PCR rất mẫn cảm với nhiệt độ. Vì thế bất cứ sự thay đổi nhiệt độ nào
của phản ứng cũng có thể ảnh hướng mạnh đến năng suất và độ chuyên biệt.
12
Suggs và ctv.(1981) đã đề nghị một công thức để ước đoán nhiệt độ nóng chảy
T
m
của

primer , mà ở nhiệt độ ấy, một nửa các primer sẽ lai với DNA mục tiêu. Công
thức được sử dụng trong điều kiện primer có khoảng 18-24 base, trong đó hàm lượng
GC chiếm khoảng 50%:
T
m
= 4 (G + C) + 2 (A + T)
A, T, C, G là số lượng các base có trong oligonucleotide.
Khi chiều dài primer từ 14 – 70 base
Tms = 81.5 + 16.6(log10[J
+

]) + 0.41(%G+C) - (600/l)
+ [J
+
] : nồng độ mol các cation hoá trị I
+ (%G+C) : % nucleotide loại G và C
Khi chiều dài primer từ 20 - 35 base
Tmp = 22 + 1.46([2 x (G+C)] + (A+T))
Tuy nhiên, việc tính toán này chỉ có tính chất tạm thời, chúng ta phải điều
chỉnh lại nhiệt độ này để có sự khuếch đại cao nhất và thu nhận tần suất đa hình cao
nhất. Bằng kinh nghiệm và thực hiện xét nghiệm nhiều lần, chúng ta mới có thể có số
liệu đúng về nhiệt độ bắt cặp. Số base càng ít nhiệt độ này càng thấp và ngược lại.
Mối quan hệ giữa nhiệt độ bắt cặp T
a
và đoán nhiệt độ nóng chảy T
m
của

primer
là một trong những vấn đề vẫn đang được tìm hiểu. Thông thường, nhiệt độ bắt cặp
thường thấp hơn nhiệt độ nóng chảy từ 2-5
o
C. Nếu nhiệt độ bắt cặp quá thấp dẫn đến
sản phẩm được nhân lên quá mức do sự bắt cặp các primer không chuyên biệt có thể xảy
ra. Nếu nhiệt độ bắt cặp quá cao, năng suất của sản phẩm mong muốn sẽ giảm.
Nếu primer bắt cặp một cách chính xác với đoạn DNA mẫu, nhiệt độ bắt cặp
nên thấp hơn nhiệt độ lý thuyết T
m
khoảng 5
o
C. Thông thường, với một oligonucleotide

có 20 nucleotide có thể dùng nhiệt độ bắt cặp 50-55
o
C. Nếu chuỗi dài hơn (25
nucleotide hay nhiều hơn) hoặc có thể nhiều base G, C, nhiệt độ bắt cặp có thể đến
55-65
o
C. Trong vài phản ứng, oligonucleotide lớn (từ 30 bp trở lên), giai đoạn bắt cặp
và kéo dài có thể được kết hợp và thực hiện ở 68-72
o
C (Hoàng Thị Liễu, 2004).
2.3.2.5.Tỉ lệ primer/DNA khuôn mẫu
Một trong những yếu tố quan trọng nhất của PCR là tỉ lệ tối hảo giữa primer
DNA mẫu. Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tượng primer-dimer sẽ xuất hiện, giống như
13
trường hợp DNA mẫu quá loãng. Nếu tỉ lệ này quá nhỏ, kết quả sản phẩm PCR sẽ
không nhiều.
Hầu hết các trường hợp áp dụng PCR, đều dùng một nồng độ primer không quá
0.5μM (12.5 pmol/25 μL phản ứng), không tính đến nồng độ DNA mẫu, để tránh hiện
tượng primer-dimer.
2.3.2.6.Các thành phần khác
 Nồng độ dNTP (các deoxynucleotide triphotphat)
Nồng độ dNTP thường được sử dụng là 20-200 μM. Nồng độ cao hơn dễ
dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh". Bên cạnh đó, sự cân bằng trong thành phần các dNTP
cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR. Sự mất cân bằng trong thành phần các dNTP sẽ
làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase.
Nồng độ dNTP thích hợp nhất cho một phản ứng PCR còn phụ thuộc vào
nồng độ Mg
2+
, nồng độ primer, số lượng chu kỳ của phản ứng và chiều dài của sản
phẩm được khuếch đại. Vì thế, nồng độ dNTP tối ưu cho từng phản ứng phải được xác

định qua thực nghiệm.
 Nồng độ MgCl
2
Nồng độ MgCl
2
cũng là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR.
Mg
2+
rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm
tăng Tm của DNA mạch kép. Nồng độ Mg
2+
thấp sẽ làm hạn chế quá trình kéo dài.
Ngược lại nồng độ Mg
2+
cao sẽ giúp ổn định dây đôi DNA và ngăn ngừa sự biến tính
hoàn toàn (do sự mở dây đôi DNA) của sản phẩm trong mỗi chu kỳ, làm cho sản phẩm
PCR ít đi; đồng thời, có thể làm cho hiện tượng bắt cặp giả xảy ra ổn định hơn và cho
ra những sản phẩm mong muốn với số lượng quá lớn nhưng mức độ chuyên biệt thấp.
 Chất ổn định hoạt động enzyme
Những hoạt chất ổn định hoạt động enzyme cũng được chú ý. Nhiều nhà sản
xuất hoá chất đã xem xét gelatin hoặc Triston X-100 trong những buffer để tồn trữ
enzyme. Có trường hợp người ta sử dụng cả hai làm dung dịch đệm. Nhằm bảo quản và
ổn định enzyme trong quá trình xử lý nhiệt của PCR, mỗi dung dịch đệm trong phản
ứng đều có chứa gelatin ở nồng độ 0.01% và Triston X-100 ở nồng độ 0.1%.
 Dung dịch đệm
14