Nghiên cứu nhân nhanh invitro trồng ngoài tự nhiên giống lan phi điệp (dendrobium anosmum) và giống lan cát (cattleya sp)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MÔ'
KHOA TÀI NGUYÊN MÔI TRƯỜNG

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CỦA SINH VIÊN THAM GIA
CUỘC THI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2015-2016
XÉT GIẢI THƯỞNG “TÀI NĂNG KHOA HỌC TRẺ ĐẠI
HỌC THỦ DẦU MỘT” NĂM 2015 - 2016
NGÀNH: SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO;
TRỒNG NGOÀI TỰ NHIÊN GIỐNG
LAN PHI ĐIỆP (Dendrobium anosmum) VÀ
GIỐNG LAN CÁT (Cattleya sp.)

THUỘC NHÓM NGÀNH KHOA HỌC:
KHOA TÀI NGUN MƠI TRƯỜNG

Bình Dương, năm 2016
TRƯỜNG ĐẠI HỌC THU DẬU MỌ'


KHOA KHOA TÀI NGUYÊN MÔI TRƯỜNG

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CỦA SINH VIÊN THAM GIA
CUỘC THI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2015-2016
XÉT GIẢI THƯỞNG “TÀI NĂNG KHOA HỌC TRẺ ĐẠI
HỌC THỦ DẦU MỘT” NĂM 2015 - 2016
NGÀNH: SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO;
TRỒNG NGOÀI TỰ NHIÊN GIỐNG
LAN PHI ĐIỆP (Dendrobium anosmum) VÀ
GIỐNG LAN CÁT (Cattleya sp.)
THUỘC NHÓM NGÀNH KHOA HỌC:
KHOA TÀI NGUYÊN MỌI TRƯỜNG

Giảng viên hướng dẫn : ThS. PHAN VÃN THUẦN
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ THÚY HẠNH PHẠM THỊ DIỆU
VIÊN NGUYỄN LÝ LÊ
Lớp : C14SH02
Khố : 2014 - 2017

Bình Dương, năm 2016


UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG
CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
1. Thông tin chung:
- Tên đề tài: “Nghiên cứu nhân nhanh in vitro; trồng ngoài điều kiện tự nhiên
giống lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) và giống lan Cát (Cattleya sp.).”
- Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Thúy Hạnh - Phạm Thị Diệu Viên - Nguyễn Lý Lê
- Lớp: C14SH02
- Khoa: Tài Nguyên Môi Trường
- Năm thứ: 2
- Số năm đào tạo: 3

- Người hướng dẫn: Th.S Phan Văn Thuần
2. Mục tiêu đề tài:
- Nhân nhanh, tạo số lượng cây con in vitro lớn trong phịng thí nhiệm các giống: giống
lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) và giống lan Cát (Cattleya).
- Trồng cây con thích nghi với điều kiện tự nhiên.
3. Tính mới và sáng tạo:
- Ứng dựng của phương pháp nhân giống invitro vào sản xuất trực tiếp giống lan Phi điệp
và Cattleya.
- Nghiên cứu được giá thể thích hợp với điều kiện tự nhiên ở Bình Dương cho cây con đạt
mức sống cao.
4. Kết quả nghiên cứu:
Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi đạt được những kết quả sau:
- Chất khử trùng HgCl2 0.1% rất thích hợp để khử trùng quả lan Phi điệp, thời gian tối
thích là 5 phút và hạt lan cấy lên môi trường MS bổ sung 0.5 mg/L BAP cho tỉ lệ nảy mầm
cao.
- Để nhân nhanh số lượng lớn chồi in vitro lan Phi điệp nên sử dụng môi trường MS + 1.5
mg/L BAP + 0.9 mg/L Kinetin cho hệ số nhân chồi cao (39.75 chồi/mẫu) và thời gian nuôi


cấy cần 5 tháng.
- Môi trường MS + 10%V nước dừa + 50g/L chuối chín + 0.5g/L than là thích hợp cho quá
trình tạo rễ lan Phi điệp với số lượng rễ trung bình đạt 9.11 rễ/mẫu. Thời gian tạo rễ thích hợp
nhất là 4 tháng.
- Mơi trường MS + 50g/L chuối chín + 1.2g/L than + 15%V nước dừa + 2mg/L NAA là thích
hợp cho q trình tạo rễ lan Cattleya với số lượng rễ trung bình đạt 4.29 rễ/mẫu. Thời gian
tạo rễ thích hợp nhất là 4 tháng.
- Giá thể bằng xơ dừa và than là thích hợp nhất cho việc đưa cây lan Phi điệp và lan
Cattleya ra trồng ngồi tự nhiên. Tỉ lệ sống sót đạt 95%
5. Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, khả năng áp dụng của đề
tài:

- Chủ động nguồn giống lan quý cung cấp cho thị trường.
- Cung cấp một số mẫu vật cho giảng dạy thực hành ở trường ĐH Thủ Dầu Một
- Cung cấp một số phương pháp trồng lan Phi điệp và lan Cattleya
6. Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài:
Ngày tháng năm Sinh viên chịu
trách nhiệm chính thực hiện đề tài
(Ký, họ và tên)

Nguyễn Thị Thúy Hạnh


Nhận xét của người hướng dẫn về những đóng góp khoa học của sinh viên thực hiện
đề tài (Phần này do người hướng dẫn ghi)
Tôi đánh giá cao về kết quả nghiên cứu đề tài. Trong thời gian nghiên cứu nhóm sinh viên
đã làm việc nghiêm túc và hồn thành được nội dung lớn. Kết quả thu được nhân nhanh
được số lượng cây con invitro lớn trong phịng thí nghiệm các giống: giống lan Phi điệp và
giống lan Cattleya và trồng cây con thích nghi với điều kiện tự nhiên. Những đóng góp trên
đã góp phần ứng dụng invitro vào sản xuất trực tiếp giống lan Phi điệp và lan Cattleya.
Nghiên cứu giá thể thích hợp trồng ngồi tự nhiên ở Bình Dương cho cây con đạt mức sống
cao.

Ngày tháng năm
Xác nhận của lãnh đạo khoa
(Ký, họ và tên)

Người hướng dẫn (Ký, họ và
tên)

Phan Văn Thuần
UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG

CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN


CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
I.SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN: Họ và tên: NGUYỄN THỊ THÚY
HẠNH Sinh ngày: 14/03/1995

Ảnh 4x6

Nơi sinh: Quảng Bình
Lớp: C14SH02 - Khóa: 2014 - 2017 Khoa: Tài Nguyên Môi Trường
Địa chỉ liên hệ: 104/8/1 khu 4 phường Phú Hòa TP Thủ Dầu Một tỉnh Bình Dương Điện
thoại: 0987236874 - Email:
II.Q TRÌNH HỌC TẬP
* Năm thứ 1:
Ngành học: Cao đẳng Sư phạm Sinh học - Khoa: Khoa học tự nhiên Kết quả xếp loại học
tập: TB Khá
* Năm thứ 2:
Ngành học : Cao đẳng Sư phạm Sinh học - Khoa: Tài Nguyên Môi Trường Kết quả xếp
loại học tập: Khá

Xác nhận của lãnh đạo khoa

Ngày tháng năm
Sinh viên chịu trách nhiệm chính
thực hiện đề tài

(Ký, họ và tên)

Nguyễn Thị Thúy Hạnh


DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI
STT
Họ và tên
Lớp
Chữ kí
1.

Nguyễn Thị Thúy Hạnh

C14SH02

2.

Phạm Thị Diệu Viên

C14SH02

3.

Nguyễn Lý Lê

C14SH02


8

MỤC LỤC
Trang phụ bìa

PHỤ LỤC...................................................................................................................


9

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT
TẮT
Từ viết tắt

Ý nghĩa

BAP

Benzyl amino purine

cs

Cộng sự

HgCl2

Clorua thủy ngân

HCl

Axit clohydric

IAA

p - indolacetic acid

PP

Vitamin B3

MS

Murashige và Skoog (1962)

NAA

1-Naphthaleneacetic acid

NaOH

Natri hiđroxit

TP

Thành phố

2,4-D

2,4-D dichlorophenoxy acetic acid

DNA

Deoxyribonucleotide acid


DANH MỤC BẢNG BIỂU

rpA________

_r_

12___________ rp_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Tên các bảng

Trang


DANH MỤC HÌNH

Tên các hình Trang


12

MỞ ĐẦU
1. Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài
Nuôi cấy mô thực vật (nuôi cấy thực vật in vitro) là q trình nhân giống vơ tính
thực vật trong ống nghiệm. Nuôi cấy mô thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất
cả các kỹ thuật nuôi cấy các bộ phận khác nhau (tế bào, mô, cơ quan...) trong môi
trường nhân tạo dưới điều kiện vô trùng. Kỹ thuật in vitro dựa trên nguyên lý là tế bào

thực vật có tính tồn năng, nghĩa là từ một mô, một cơ quan, tế bào bất kỳ một bộ phận
nào của cây đều có thể phát triển thành một cây hồn chỉnh nếu được ni trong mơi
trường thích hợp [21].
Năm 1960, Morel trong lúc tìm cách làm sạch bệnh cho cây hoa lan bằng kỹ thuật
nuôi cấy mô phân sinh đỉnh đã nhận thấy khả năng sinh sản, đâm chồi một cách tự
nhiên của các mô phân sinh ngọn của một số loại hoa lan. Và cuối cùng, Morel (1966)
đã thành công trong việc nhân nhanh in vitro cây hoa lan thuộc chi Cymbidium.
Trên thế giới, nhiều loài lan thuôc các chi như Cymbidium, Dendrobium,
Epidendrum, Laeliocattleya, Acampe... đã được nhân giống vơ tính in vitro thành cơng.
Đối với chi Nervilia, có nhiều báo cáo của các tác giả Trung Quốc thành cơng trong
việc nhân giống vơ tính như He Fuchang và cs (1990), Pan Xue Feng và cs (2001),
Chen Jenn-Yih và cs (2002), Du Qin và cs (2005), Li Bin (2008) [31, 32, 33, 34]. Năm
2009, báo cáo của Li Shou Ling và cộng sự cho thấy môi trường MS có bổ sung
2.0mg/L 6-BA, 0.1mg/L NAA, 10%V nước dừa và 0.1% than hoạt tính thích hợp để tạo
chồi, cịn mơi trường MS bổ sung 2.0mg/L 6-BA và 0.5mg/L NAA thích hợp để tạo rễ
[31].
Ngày nay, bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã nhân giống và phục
tráng hàng loạt các cây trồng có giá trị như khoai tây, thuốc lá, dứa, các cây lương thực,
cây ăn quả, cây cảnh, cây dược liêu.... Việc nhân giống này đã trở thành công nghệ và
đã được áp dụng ở nhiều nước trên thế giới.
Ở Viêt Nam, kỹ thuât nuôi cấy mô thực vật cũng đã được áp dùng và thành công trên
nhiều đối tượng. Đăc biêt, trên đối tượng là các lồi thc họ Lan (Orchidaceae) đã có
nhiều báo cáo như Dương Tấn Nhựt và Đỗ Thị Tâm đã tiến hành "Nhân giống vơ tính
một số giống địa lan Cymbidium bằng đỉnh sinh trưởng" [15], Phan Xuân Huyên và cs


13

với báo cáo "Phục tráng và nhân nhanh các giống địa lan Cymbidium bằng nuôi cấy
đỉnh sinh trưởng" [8], Dương Mông Hùng và cs đã "Nhân giống lan tai trâu bằng

phương pháp nuôi cấy trong ống nghiệm" [3], Mai Văn Phơ và Nguyễn Hồng Lộc báo
cáo thành cơng trong viêc nuôi cấy mô lan nghing xuân [15], Nguyễn Quang Thạch và
cs đã xây dựng quy trình kỹ thuật ni trồng cây địa lan Cymbidium spp. cấy mô |20|...
Sở dĩ việc nhân giống vơ tính in vitro cây hoa lan thành cơng nhanh chóng và mỹ
mãn là do bởi hoa lan có phương thức sinh sản thơng qua protocorm. Phương thức này
chủ yếu gặp ở các đối tượng một lá mầm (monocotyledon) như phong lan, dứa, huệ...
Cùng một lúc đỉnh sinh trưởng sẽ tạo thành hàng loạt protocorm và các protocorm này
có thể phân chia thành các protocorm mới hoặc phát triển thành cây hoàn chỉnh. Bằng
phương thức này trong một thời gian ngắn người ta có thể thu được hàng triệu cá thể.
2. Lý do chọn đề tài.
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một lĩnh vực bao gồm nhiều kỹ thuật khác nhau
trong nuôi cấy in vitro như: nuôi cấy phôi, cơ quan, tế bào và protoplast. Việc ra đời của
các kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mở ra một hướng mới cho nghiên cứu
thực vật, nó nhanh chóng dành được một vị trí quan trọng trong lĩnh vực cơng nghệ
sinh học về sản xuất và cải thiện giống cây trồng [2].
Kỹ thuật nhân giống in vitro không chỉ ứng dụng để nhân giống và phục tráng cây
trồng mà nó cịn đem lại hiệu quả kinh tế cao trong việc nhân nhanh và tạo ra một số
lượng lớn cây con đồng đều, sạch bệnh, đặc biệt là cịn giữ được tính trạng quý của bố
mẹ và cho phép chủ động cung cấp nguồn giống cũng như vật liệu vô trùng cho các thí
nghiệm [22].
Cho đến nay, có nhiều đối tượng cây hoa khác nhau đã được nhân giống bằng
phương pháp nuôi cấy mô, tế bào và thu được nhiều kết quả đáng kể như: hoa tulip, hoa
lay ơn, hoa cẩm chướng, hoa hồng,...
Trước đây chủ yếu nhân giống lan bằng phương pháp hữu tính hoặc phương pháp vơ
tính. Q trình nhân giống hữu tính, gieo hạt mang tính ngẫu nhiên thu được cây có tính
trạng u thích và gần như khơng thể có được cây con cho hoa đẹp như cây mẹ. Cịn
trong q trình tạo ra cây mới bằng phương pháp nhân giống vơ tính, khơng đảm bảo
được số lượng cây khỏe mạnh, có một số trường hợp cây bị nhiễm bệnh từ cây bố mẹ,
hệ số nhân ra để đáp ứng nhu cầu thị trường thì khơng đủ.

14

Để có số lượng lớn cây giống, đồng đều đáp ứng nhu cầu thị trường, trong những
năm gần đây phương pháp nhân giống vơ tính in vitro phổ biến hơn các phương pháp
khác. Vì nó nhân nhanh với hệ số nhân giống cao, đưa ra sản phẩm nhanh hơn, các
giống cây đồng nhất và sạch bệnh. Do vậy nuôi cấy mô cây lan đã được ứng dụng gần
đây nhưng chi phí đắt và giá thành giống thì lại cao. Để giảm chi phí trong q trình
ni cấy sẽ khơng sử dụng các chất điều hịa sinh trưởng, thay vào đó sẽ sử dụng các
chất phụ gia hữu cơ như chuối chín, nước dừa, than hoạt tính,...và kết hợp với điều kiện
mơi trường ngồi tự nhiên.
Trong thế giới đầy màu sắc của phong lan thì Cattleya được mệnh danh là nữ hoàng
bởi hoa Cattleya là tổng hợp của vẻ đẹp và hương sắc vẹn toàn. Lan Cattleya là một
trong những loài hoa to có rất nhiều những sắc màu rực rỡ, khi hoa nở thì tỏa hương
thơm ngào ngạt từ sắc hồng, tím trắng cho đến cam, vang....Cattleya có tuổi thọ rất dài,
có thể sống đến 20 - 30 năm nếu chăm sóc tốt [35], [36].
Có thể nói đây là một trong những loại lan tuyệt đẹp, hoa thường có mùi thơm nhưng
lại chống tàn và ngắn nhất có thể kể đến là lồi Cattleya Mantini chỉ có thời gian nở
hoa trong một tuần lễ. Nhưng với những loài khác thuộc giống này thì thời gian nở hoa
thường là nửa tháng, với những lồi cá biệt có thể đạt đến 3 tuần lễ [35].
Lan Phi điệp cịn có tên khác như Hoàng thảo đùi gà, Hoàng thảo dẹt, Huỳnh
thảo, Phi điệp. Cây dùng trong y học cổ truyền với tên thuốc là Thạch hộc hay Kẹp
thảo. Giống lan thơng thường có chiều cao 40 - 60 cm. Hoa có nhiều màu, phần đơng
tím trắng, nhạt hay thẫm. Hoa mọc ở các đốt gần ngọn 2 - 4 chiếc to khoảng 10 cm lâu
tàn và thơm. Một khóm hoa có thể đạt tới 100 hoa, có mùi hương thơm nồng nàn. [1]
Để tiến hành nhân nhanh các giống lan này nhằm chủ động nguồn giống lan quý
“Nghiên cứu nhân nhanh in vitro; trồng ngoài điều kiện tự nhiên giống lan Phi
Điệp (Dendrobium anosmum) và giống lan Cát (Cattleya sp.).”
3. Mục tiêu đề tài:
- Nhân nhanh, tạo số lượng cây con in vitro lớn trong phịng thí nghiệm các

giống: giống lan Phi Điệp
(Dendrobium anosmum) và giống lan Cát
(Cattleya).
- Trồng cây con thích nghi với điều kiện tự nhiên.
4. Phương pháp nghiên cứu
A 1 T\ • f •

A

.

A

y\ • Ả


15

4.1.

Điều kiện và môi trường nuôi cấy

4.1.1.

Môi trường nuôi cấy

Các môi trường được sử dụng gồm: Môi trường MS cơ bản, mơi trường MS có bổ
sung chất điều hịa sinh trưởng BAP, phụ gia hữu cơ: chuối chín, nước dừa và than hoạt
tính với các nồng độ và hàm lượng ở các mức khác nhau để thăm dị mơi trường thích
hợp nhất.

Nguồn carbon là đường saccharose. Mơi trường được làm đặc bằng agar, pH của môi
trường được điều chỉnh đến 5,8 (bằng KOH 0,1N và NaOH 0,1N). Môi trường nuôi cấy
được khử trùng ở 121oC trong 20 phút.


16

Bảng 4.1.1. Thành phần môi trường cơ bản Murashige và Skoog (1962)
THÀNH PHẦN

HÀM LƯỢNG (mg/L)

1. Đa lượng
KNO3

1900

KH2PO4

170

NH4NO3

1650

MgSO4.7H2O

370

CaCl2.2H2O

440

FeSO4.7H2O

27,8

Na2-EDTA

37,3

2. Vi lượng
H3BO3

6,2

MnSO4.4H2O

22,3

CoCl2.6H2O

0,025

CuSO4.5H2O

0,025

ZnSO4.4H2O

8,6

Na2MoO4.2H2O

0,25

KI

0,83

3. Vitamin
Myo-inositol

100

Thiamine.HCl

0,1

Pyridoxine.HCl

0,5

Nicotinic acid

0,5

4. Amoni acid
Glycine
4.1.2.

Điều kiện trong phịng thí nghiệm
Điều kiện ni cấy in vitro:
+ Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày
+ Nhiệt độ:

22 ± 20C

+ Cường độ ánh sáng: 2000 - 3000lux
4.1.3.

Điều kiện trong tự nhiên

2


17

Điều kiện tự nhiên vườn lan:
+ Thời gian chiếu sáng: 12 giờ/ngày
+ Nhiệt độ:

19 - 390C

+ Cường độ ánh sáng: 960 - 10200 lux
4.2.

Phương pháp xác định môi trường tối ưu.

4.2.1 Đối với lan Phi Điệp.
- Từ quả lan được thu thập ngoài tự nhiên được khử trùng và được gieo trên các môi

trường MS bổ sung 0.5 mg/L BAP chất điều hòa sinh trưởng. Sau 6 tháng đánh giá khả
năng nảy mầm, sinh trưởng của cây con in vitro.
- Cây con in vitro được cấy lên môi trường MS bổ sung 1.5 mg/L BAP kết hợp 0.9
mg/L Kinetin để tăng nhanh số lượng chồi. Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển
của chồi in vitro.
- Chồi
vitro
được
cấy
lên độ
mơi
trường
MSđể
bổđánh
sunggiá
chất
điều
tạo
hịa
sinh
rễ,in
khả
trưởng
năngvới
sinh
các
trưởng
nồng
và khác
phát

triển.
nhau
khả
năng


- Các cây con in vitro sau khi đạt chiều cao, số lá, đầy đủ các bộ phận (thân, lá, rễ)
khỏe mạnh được huấn luyện, thích nghi dần và trồng trên các giá thể khác nhau để đánh
giá khả năng sống sót, khả năng sinh trưởng ngồi tự nhiên. Giá thể với tỷ lệ khác nhau.
Chọn giá thể tốt nhất để đưa cây ra đất.
4.2.2

Đối với lan Cattleya.

- Chồi in vitro được cung cấp bởi phịng thí nghiệm Sinh học trường đại học Thủ
Dầu Một được cấy lên môi trường MS bổ sung 50 g/L chuối chín, 1.2 g/L than hoạt
tính, 15%V nước dừa để tạo rễ cho chồi in vitro. Đánh giá khả năng tạo chồi và sinh
trưởng, phát triển của cây con.
- Các cây con in vitro sau khi đạt chiều cao, số lá, đầy đủ các bộ phận (thân, lá, rễ)
khỏe mạnh được huấn luyện, thích nghi dần và trồng trên các giá thể khác nhau để đánh
giá khả năng sống sót, khả năng sinh trưởng ngồi tự nhiên. Chọn giá thể tốt nhất để
đưa cây ra đất.
4.3.

Đánh giá các chỉ số, chỉ tiêu thu mẫu và phân tích.

- Thu thập các chỉ số qua mỗi thời gian cách nhau 1 tuần: chiều cao của chồi, số
lượng chồi, chiều dài của lá, số lượng lá, chiều dài của rễ, số lượng rễ, tỷ lệ mẫu nhiểm,
tỷ lệ mẫu chết, màu sắc của cây, sinh trưởng và phát triển của cây...
- Các số liệu thu thập được xử lý bằng Excel. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
5.1.

Đối tượng nghiên cứu

5.1.1 Giống lan Cát
- Tên khoa học: Cattleya sp.
- Chi: Cattleya
- Họ: Orchidaceae
5.1.2

Giống lan Phi điệp

- Tên khoa học: Dendrobium anosmum
- Chi: Dendrobium
- Họ: Orchidaceae [1].[17].
5.2.

Phạm vi nghiên cứu


Kết hợp giữa phịng thí nghiệm ni cấy mơ thực vật trường Đại học Thủ Dầu Một
với vườn trồng lan thực nghiệm trường Đại học Thủ Dầu Một.

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Lược sử phát triển của nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật là q trình ni cấy vơ trùng in vitro các bộ
phận tách rời khác nhau của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật nhanh
chóng đi vào thực tiễn cuộc sống. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật

được bao hàm trong ứng dụng của Cơng nghệ Sinh học. Nó bao gồm nhân giống và
nhân nhanh giống, sản xuất sinh khối các sản phẩm sinh hóa, sản xuất và chuyển hóa
sinh học các dược liệu tự nhiên, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý, cải thiện và tạo
giống cây trồng, nghiên cứu bệnh học thực vật, làm sạch virus.. .[21].
Năm 1838, hai nhà sinh học người Đức là Schleiden và Schwann đã chính thức xây
dựng học thuyết tế bào. Học thuyết tế bào khẳng định: Mỗi cơ thể động thực vật đều
bao gồm những thể tồn tại độc lập, riêng rẽ và tách biệt, đó chính là tế bào [32].
Năm 1898, Haberlandt tiến hành nuôi cấy tế bào đơn, các tế bào này tách từ nhu mô
lá, tượng tầng của tầng biểu bì và lơng hút của nhiều lồi thực vật, kết quả thu được là
khơng thành cơng [33]. Năm 1902, Haberlandt để chứng minh cho tính tồn năng của tế
bào ông đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật. Theo ông, mỗi một tế
bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành
một cá thể hồn chỉnh. Điều đó, theo kiến thức sinh học hiện đại có nghĩa là: Mỗi tế
bào riêng rẽ của một cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ tồn bộ lượng thơng tin di truyền
cần thiết của cả sinh vật đó và nếu gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tế bào có thể phát
triển thành một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh. Tuy nhiên, Haberlandt đã khơng thành cơng
trong thí nghiệm chứng minh chứng tính tồn năng của tế bào do bởi ông đã chọn cây
Một lá mầm là đối tượng rất khó ni cấy, mặt khác do ông lại dùng các tế bào đã mất
hết khả năng tái sinh. Một nguyên nhân khác nữa của sự thất bại là do vào thời kỳ đó


những hiểu biết khoa học về nhu cầu dinh dưỡng của mơ thực vật cịn hạn chế nên ơng
đã khơng tìm ra được mơi trường dinh dưỡng tối thích hợp cho sự phân chia tế bào [3],
[11], [20].
Phải mất hàng chục năm sau mới có những thí nghiệm thành cơng để chứng minh
cho khả năng tồn tại và phát triển độc lập của tế bào. Nổi bật là các công trình sau:
Năm 1922, Kotte và cs. đã ni cấy đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ của một cây hòa
thảo và đã tạo được một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ. Nhưng sau một thời gian ngắn thì hệ rễ
này sinh trưởng chậm dần và ngừng lại [5], [35].
Đến năm 1934, White đã nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ Cà chua

(Lycopersicum esculentum) trên một mơi trường lỏng chứa muối khống, glucose và
nước chiết nấm men. Năm 1937, ông phát hiện tầm quan trọng của các vitamin thuộc
nhóm B là B1, B6 và PP để thay thế cho dịch chiết nấm men và thấy rằng việc thay thế
này hồn tồn phù hợp. Từ đó việc nuôi cấy đầu rễ trong thời gian vô hạn đã được tiến
hành ở nhiều cây khác nhau. Cùng lúc với White, Gautheret cũng đã thu được kết quả
phân chia các tế bào của tầng sinh gỗ ở cây liễu [11], [5].
Năm 1939, Nobécourt và Gautheret đã thành công trong việc duy trì sự sinh trưởng
trong thời gian vơ hạn của mô sẹo Cà rốt (Daucus carota) bằng cách cấy chuyền đều
đặn 6 tuần một lần. Lúc này, White đã thành công tương tự với cây thuốc lá. Kỹ thuật
nuôi cấy mơ thực vật được khai sinh từ đó [12].
Từ năm 1941 - 1954, những phát hiện về vai trò của các chất kích thích sinh trưởng
như IAA, NAA, 2,4-D, kinetin và vai trò của các vitamin, nước dừa là tiền đề kỹ thuật
cho việc làm thí nghiệm ổn định, dẫn đến các giai đoạn tiếp theo của kỹ thuật nuôi cấy
mô, tế bào [30].
Năm 1951, Nitsch đã khắc phục được tính khơng giao hợp tiền giao tử khi nghiên
cứu và thành công trong nuôi cấy mô quả bầu non, cà chua, dưa chuột và lần đầu tiên
tạo được hạt trong quả cà chua in vitro có khả năng nảy mầm (hạt có sức sống). Sau này
có rất nhiều nhà khoa học thành công trong nuôi cấy hạt phấn, các quá trình sinh trưởng
của ống phấn, thụ tinh và tạo thành quả trong điều kiện in vitro [17].
Năm 1953, Miller và Skoog tạo được rễ từ mãnh mô cắt từ thân cây Thuốc lá
(Nicotiana tabacum). Đến năm 1957, hai ông công bố kết quả nghiên cứu ảnh hưởng


của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan của mơ
sẹo thuốc lá. Khi giảm tỉ lệ kinetin/auxin mơ sẹo có khuynh hướng phát triển rễ, ngược
lại nếu tỉ lệ này tăng thì dẫn đến sự tạo chồi ở mô sẹo. Hiện tượng này được xác nhận
trên nhiều đối tượng thực vật khác nhau và đóng góp rất lớn vào việc điều khiển sinh
trưởng, phát triển, phát sinh cơ quan của mô tế bào trong nuôi cấy [11], [12], [26], [35].
Năm 1958, Reinert và Steward tạo được phơi và cây cà rốt hồn chỉnh từ tế bào đơn
nuôi cấy trong dung dịch [35].

Năm 1960, Cooking ở Đại học Nottingham (Anh) lần đầu tiên đã tách được tế bào
trần (protoplast) khi dùng enzyme cellulose để phân hủy vỏ cellulose của tế bào thực
vật. Cũng trong năm 1960, Bergman thành công trong việc thu một số dung dịch huyền
phù khơng có các tế bào kết cụm mà gồm hầu hết các tế bào đơn. Các tế bào này có thể
gieo trên mơi trường, trong các hộp lồng, nó sẽ tiếp tục sống, phân chia và tái tạo lại mô
sẹo [11], [12].
Năm 1962, Kante và cs. thông báo về khả năng thụ phấn trong điều kiện in vitro của
cây Thuốc phiện (Papaver somniferum) [4].
Năm 1964, Guha và cs. thu được phôi trưởng thành từ nuôi cấy bao phấn cây Cà độc
dược (Datura inoxia). Năm 1966, ông tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn
cây Cà độc dược. Năm 1967, nhóm Bourgin và Nitsch lại thành công khi tạo cây đơn
bội từ túi phấn thuốc lá. Những thành công này đã khiến giới khoa học bắt đầu chú ý
đến việc tạo cây đơn bội thông qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn. Việc này đã đóng góp
rất nhiều kiến thức cho lĩnh vực di truyền thực vật và thực tiễn chọn giống [26].
Năm 1966, Morel hồn thành quy trình nhân nhanh cây hoa lan thuộc chi
Cymbidium. Ý tưởng của ông được thai nghén từ năm 1960 khi ông ngẫu nhiên quan
sát sự sinh trưởng và phát triển của chồi ngọn cây hoa lan trong lúc cố tìm cách để làm
sạch bệnh cây hoa lan giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật [4].
Năm 1970, Nagata và Takebe đã sử dụng kỹ thuật tế bào của Bergman để nuôi cấy
protoplast của lá cây thuốc lá và tái sinh được cây hoàn chỉnh. Cho đến nay, kỹ thuật
protoplast đã được thực tế xác nhận sau nhiều công bố lai thành công giữa các lồi, một
việc khơng thể thực hiện được bằng lai hữu tính cổ điển. Protoplast giúp sự nghiên cứu
hiện tượng nhiễm sắc thể hòa hợp của các tế bào khác loài sau khi dung hợp, giúp cho


việc nghiên cứu vai trò của các DNA trong các cơ quan tử và quan hệ của chúng với
DNA trong phân bào. Tính đến ngày 1/1/1985 kỹ thuật dung hợp protoplast đã thu được
104 trường hợp lai, bao gồm con lai trong loài, con lai giữa các loài, con lai giữa các chi
và con lai giữa các chi phụ. Đến năm 1995, con số trên đã gấp hai lần. Điều đó chứng tỏ
kỹ thuật dung hợp protoplast đã trợ giúp rất hiệu quả cho công tác chọn tạo giống [11],

[12].
Từ năm 1972 đến 1977, Melchers đã đưa ra những cải tiến mới về phương pháp nuôi
cấy bao phấn và túi phấn để nhận được cây con đơn bội với số lượng lớn và đưa ra các
luận điểm cần phải gắn phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật với các phương pháp
chọn giống khác [26].
Từ năm 1980 đến nay là giai đoạn thành công của lĩnh vực công nghệ gene thực vật.
Đó là kỹ thuật đưa một gene cần thiết có nguồn gốc từ vi sinh vật, thực vật và động vật
hay một gene tổng hợp vào các giống cây trồng muốn cải tạo. Chỉ trong một thời gian
ngắn một loạt phương pháp đưa gene ngoại lai vào thực vật được công bố. Sau khi đưa
được gene ngoại lai vào tế bào người ta sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật
để nuôi cấy các tế bào đã được chuyển nạp. Sau đó cho tái sinh lại thành cây nguyên
vẹn mang những đặc tính sinh học mới. Chúng sinh trưởng, phát triển, ra hoa, kết hạt
bình thường và được coi như một giống cây trồng mới. Lĩnh vực cơng nghệ gene đã có
những thành cơng to lớn khơng chỉ trên đối tượng thực vật mà cịn thành công trên đối
tượng động vật và vi sinh vật. Năm 1988, Toriyama thành công khi chuyển gene kháng
bệnh vàng lụi (Tungro) vào protoplast lúa nhóm Japonica và tái sinh cây hoàn toàn từ
protoplast chuyển gene. Năm 1991, Burbank đã thành cơng trong việc ghép gene miễn
dịch đối với lồi gián cánh cứng Colorado cho khoai tây đã được trồng thử ở một vài
nơi ở Maine Oregar. Kết quả khoai tây có thể miễn dịch đặc biệt với lồi gián cánh
cứng [4], [6], [21].
Ở viện nghiên cứu Nông nghiệp Pháp (INRA), các nhà khoa học đã chuyển thành
công gene Capsul vào cây thuốc lá. Các nhà khoa học của viện lúa Quốc tế (IRRI) đã
chuyển thành công các gene khác nhau vào cây lúa, cụ thể là gene Bt (gene chống sâu
đục thân ở lúa), gene Chitinase chống bệnh do nấm gây ra như đạo ôn, khô vằn. Các
giống cây trồng chuyển gene hiện đang được khảo nghiệm và trồng trong điều kiện nhà
kính tại Cơng ty Di truyền chọn giống và sản xuất hạt giống tại Bruxell (Bỉ). Ở Mỹ đã


sản xuất hai loại cây trồng là cà chua cứng quả và bảo quản lâu hơn 45 ngày, loại thứ
hai là giống ngơ chống sâu đục thân và có năng suất cao. Thực vật chuyển gene thực tế

đã trở thành hàng hóa trên thị trường. Năm 1996, người ta đã ứng dụng cho trồng trọt
khoảng 18.000 km2 từ Ả rập đến Bắc Mỹ và sản phẩm được đem bán trên thị trường với
những ưu việt như bí ngơ chống chịu được virus, khoai tây và bông không bị côn trùng
phá hoại, bông và đậu tương chống chịu được các chất diệt cỏ. Ngô chuyển gene cũng
đã được trồng đại trà và được bán rộng rãi trên thị trường Châu Âu [4], [6].
Nói tóm lại, sự phát triển như vũ bão của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật cùng
với sự ra đời của công nghệ gene thực vật đã mở ra một hướng mới cho nền nông
nghiệp thế giới. Với các giống cây trồng được tạo ra bằng các phương pháp này, nền
nông nghiệp thế giới đang bước vào “Cuộc cách mạng xanh lần thứ hai”, góp phần
khơng nhỏ vào đảm bảo an toàn lương thực và nhu cầu của con người. Các nhà nơng
học sẽ có thêm một phương pháp mới trong việc cải tạo tự nhiên [23].
1.2. Ứng dụng của nhân giống in vitro ở một số cây hoa
Đối với các loài hoa cảnh, phương thức nhân giống truyền đã được tiến thành phổ
biến từ lâu. Việc ứng dụng phương pháp nhân giống vơ tính in vitro chỉ mới được tiến
hành trong những năm đầu của thập niên 70 nhưng đã phát triển mạnh cho đến nay
[25].
Ngày nay việc nhân giống các lồi hoa cảnh có giá trị để phục vụ cho mục đích
thương mại và bảo quản nguồn giống quý hiếm là hướng mà các phịng thí nghiệm ni
cấy mơ, tế bào thực vật đang quan tâm.
Trong q trình nhân giống vơ tính in vitro, việc chọn lựa mơ ni cấy cho từng lồi
hoa cảnh để đạt được hiệu quả cao là vấn đề quan trọng. Tùy thuộc vào nhiều loài cây
trồng khác nhau mà mô được chọn nuôi cấy (cho hiệu quả cao) là không giống nhau
[20].
Dương Mộng Hùng (2003) đã nhân giống lan tai trâu (Rhynchostylis gigangtea). Lan
tai trâu đã được nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy trong ống nghiệm, cho hệ số
nhân chồi cao[3]
Hoa lily (Lilium spp.) là một loài hoa đẹp, sang trọng, màu sắc phong phú, hấp dẫn,
hương thơm mát dịu. Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Hương, Nguyễn Quang Thạch

(2005) đã nghiên cứu thành công tạo củ lily in vitro và sự sinh trưởng của cây lily trồng
từ củ in vitro. Kết quả cho thấy những cây trồng từ củ in vitro sinh trưởng phát triển tốt
và có chất lượng củ thu hoạch cao [7]. Dương Tấn Nhựt và cs. (2004) đã tạo được hạt
nhân tạo của cây hoa lily, tất cả các cây con in vitro có nguồn gốc từ hạt nhân tạo đều
được chuyển ra vườn ươm và trồng trên đất mùn. Sau 3 tháng, các cây con này có tỷ lệ
sống đạt 100%, cây khỏe mạnh và hầu hết đều ra rễ và lá mới. Đồng thời sau 3 tháng
bảo quản ở nhiệt độ phòng, hạt nhân tạo lily vẫn duy trì được sức sống và khả năng tái
sinh tương đối cao khi chuyển sang môi trường tái sinh [11].
Hoa chuông (Sininggia speciosa) là một loại hoa thuộc họ cây tai voi (Gesneriaceae)
có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Nam Mỹ đã được Nguyễn Quang Thạch và cs. (2000)
nuôi cấy in vitro thành công. Sau 3 tuần có thể chuyển ra vườn ươm với tỷ lệ sống từ
70%-100% [8].
Nguyễn Thị Lý Lan và Nguyễn Quang Thạch (2004) đã xây dựng quy trình nhân
giống in vitro hoa cúc Nhật (Rivalry)và đã sản xuất được hàng chục nghìn cây giống để
trồng thử nghiệm ở Hải Phòng, Hà Nội, Thái Bình [7].
Nhiều lồi hoa khác như hoa hồng, hoa đồng tiền, hoa huệ tây...cũng được tiến hành
nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô thành công trong những năm qua.
1.3. Vài nét về cây lan Cattleya và lan Phi điệp
1.3.1. Nguồn gốc lịch sử cây lan Cattleya
Năm 1818, Wiliam Cattleya, một nhà chuyên nghiên cứu thực vật nhiệt đới người
Anh, lúc bấy giờ đang làm việc ở Bamen, nhận được một kiện hàng toàn các loại thực
vật gởi về nước từ Brazil. Ơng thấy có một loại cây có lá lạ dùng để bọc và chèn các
cây có trong kiện hàng. Ơng đem trồng các cây đó trong vườn ươm của mình. Đến
tháng mười một cùng năm, các cây lạ đó trổ hoa. Những đóa hoa đã gây sững sốt cho
giới quý tộc Anh vì vẽ đẹp rực rỡ và mùi thơm đầy quyến rũ của chúng. Rất nhanh
chóng người ta đã đặt cho chúng cái tên Nữ Hoàng của Hoa - The Queen Of Flowers.
Đến năm 1821, Dr John Lindley một nhà phân loại thực vật được William Cattleya
nhận vào làm việc để thay thế Sir Joseph Banks, đã mất, tiếp tục cơng trình nghiên mơ
tả và phân loại thực vật trong bộ sưu tập của Cattleya, và Lindley đã lấy tên của
Cattleya đặt tên cho cây Nữ Hoàng Của Hoa là Cattleya labiata (labiata tiếng la tin có

nghĩa là “cánh hoa tuyệt diệu”) để vinh danh người đầu tiên ở Châu Âu đã trồng nó ra
hoa [18].
1.3.2. Đặc điểm thực vật học của lan Cattleya
Giả hành: tròn hay hơi dẹp, mang một đến hai lá thường to dày.
Lá: xanh hình mũi mác thn dài, đầu nhọn hay có hai thùy khơng đều.
Rễ: to bị trên mặt làm giá đỡ cho thân cây.
Hoa Cattleya: có cấu trúc cơ bản của hoa mẫu ba, là kiểu hoa đặt trưng của lớp một
lá mầm. Nhưng đã biến đổi rất nhiều để hoa có đối xứng qua một mặt phẳng.
Hoa thuộc loại lưỡng tính. Bao hoa có hai vịng, mỗi vịng có ba mảnh chia ra: ba
cánh đài có dạng cánh hoa, ba cánh tràng thì hai cánh bên là cánh hoa, cịn cánh tràng
giữa biến đổi màu sắc, có chức năng đặc biệt trong sự hấp dẫn và thụ phấn nhờ côn
trùng gọi là cánh môi. Môi hoa Catteya thường có ba thùy, hai thùy bên uốn cong lên
tạo thành hình ống, thùy giữa xịa ưỡn ra, mép nhăn nheo. Hoa Cattleya có một nhụy và
bốn phấn khối, kích thước của hoa Cattleya rất lớn so với thân, có loại có đường kính
đến 25cm, loại nhỏ nhất trong chi cũng khoảng 7cm. Phát hoa lúc non trong một mo
mang 1-10 hoa rất đẹp có màu từ trắng vàng đỏ đến tím [1].
1.3.3. Phân loại
Về phương diện ngoại hình Cattleya có thể được chia làm hai nhóm:
+ Nhóm một lá: Mỗi cây chỉ mang một lá trên đỉnh. Nhóm này thường cho từ một
đến sáu hoa, hoa rất lớn với màu sắc rất rực rỡ ví dụ như Cattleya eldorado, Cattleya
labiata, Cattleya gaskelliana.
Thân của nhóm này cao khoảng 8-30cm, lá thường xanh đậm, dày, dài khoảng 20cm,
rộng đến 7cm. Tiêu biểu nhất trong nhóm là Cattleya labiata và Cattleya trianaei.
+ Nhóm hai lá: mỗi cây mang hai hay ba lá trên đỉnh. Nhóm này thường cho hoa nhỏ
hơn và mọc thành từng cụm như Cattleya aclandiae, Cattleya intermadia.
Thân của nhóm này ốm hơn nhưng rất cao, có lồi có thân cao đến 60cm, mang hai
đến ba lá trên đỉnh. Lá nhỏ bản hơn dài 20cm, màu xanh nhạt. Phát hoa vươn cao từ
một bọc trên đỉnh thân mang nhiều hoa có khi lên đến 15 hoa. Hoa nhỏ hơn hoa của

nhóm một lá, khoảng 10-15cm đường kính và cách hoa cũng thường thuôn hơn. Trong