Tài liệu Báo cáo thực tập tốt nghiệp “Xác định các virus thuộc chi Begomovirus (họ Geminiviridae) trên cây cà chua và cây khác khu vực Hà Nội và vùng phụ cận" doc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
Đề tài:
Đề tài:
“
“
Xác định các virus thuộc chi Begomovirus (họ Geminiviridae) trên
Xác định các virus thuộc chi Begomovirus (họ Geminiviridae) trên
cây cà chua và cây khác khu vực Hà Nội và vùng phụ cận
cây cà chua và cây khác khu vực Hà Nội và vùng phụ cận
”
”
ơ
ơ


Giảng viên hướng dẫn: TS.Hà Viết Cường
Giảng viên hướng dẫn: TS.Hà Viết Cường


Bộ môn: Bệnh cây - khoa Nông học
Bộ môn: Bệnh cây - khoa Nông học


Sinh viên thực hiện: Lê Văn Hải

Sinh viên thực hiện: Lê Văn Hải


Lớp: Công nghệ sinh học – khóa 50
Lớp: Công nghệ sinh học – khóa 50
Phần I. Mở đầu
1.1. Đặt vấn đề.
1.1. Đặt vấn đề.

Họ Geminiviridae là một trong những họ thực vật lớn nhất (289 loài). Họ
Họ Geminiviridae là một trong những họ thực vật lớn nhất (289 loài). Họ
virus này có 4 chi trong đó chi
virus này có 4 chi trong đó chi
Begomovirus
Begomovirus
là chi quan trọng nhất về số
là chi quan trọng nhất về số
lượng loài (185 loài) (Fauquet
lượng loài (185 loài) (Fauquet
et al.,
et al.,
2008), cũng như các bệnh mà chúng
2008), cũng như các bệnh mà chúng
gây ra trên cây trồng.
gây ra trên cây trồng.

Nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây trồng được xác định là do
Nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây trồng được xác định là do
begomovirus gây ra.
begomovirus gây ra.


Begomovirus gây bệnh tạo ra các triệu chứng giống nhau trên cây trồng,
Begomovirus gây bệnh tạo ra các triệu chứng giống nhau trên cây trồng,
danh tính của chúng chỉ được xác định dựa trên phân tích phân tử.
danh tính của chúng chỉ được xác định dựa trên phân tích phân tử.

Begomovirus là các virus có bộ gien DNA sợi vòng đơn, kích thước
Begomovirus là các virus có bộ gien DNA sợi vòng đơn, kích thước
khoảng 2.6 – 2.8 kb. Begomovirus có thể có bộ gien đơn (gồm một phân
khoảng 2.6 – 2.8 kb. Begomovirus có thể có bộ gien đơn (gồm một phân
tử DNA-A) hoặc có bộ gen kép (gồm hai phân tử DNA-A và DNA-B).
tử DNA-A) hoặc có bộ gen kép (gồm hai phân tử DNA-A và DNA-B).
Triệu chứng của bệnh xoăn vàng lá cà chua và
Triệu chứng của bệnh xoăn vàng lá cà chua và
vector truyền bệnh
vector truyền bệnh
Hình 1. Triệu chứng bệnh xoăn
vàng lá cà chua (msucares.com)
Hình 2. Vector truyền bệnh là Bọ
phấn (tabaci). (www.aaas.org)
Hình 3: triệu chứng do begomovirus gây ra trên một số đối tượng cây trồng và
cây dại. (1) Cotton leaf curl virus (www.padil.gov.au), (2) Ludwigia yellow vein
Vietnam virus & Ludwigia yellow vein; (3) African cassava mosaic virus
(eastafrica.usaid.gov); (4) Siegesbeckia yellow vein Guangxi virus
(www.bspp.org.uk); (5) Dolichos yellow mosaic virus (www.bspp.org.uk); (6) Okra
yellow crinkle Mali virus (www.bspp.org.uk).
1
2
3
6

5
4
Hình 4. Tổ chức bộ gen phân tử DNA-A của begomovirus
Hình 4. Tổ chức bộ gen phân tử DNA-A của begomovirus
CR = common region
DNA-A
2.6-2.8kb
AC4
AC2 (TrAP)
AC1 (Rep)
AV1 (CP)
AC3 (REn)
AV2
CR
•
Tái bản
•
Tương tác với protein ký
chủ điều khiển chu kỳ tế
bào
•
Tăng cường tái bản
•
Tương tác với protein ký chủ
điều khiển chu kỳ tế bào
•
Hoạt hóa phiên mã
•
Ức chế phản ứng phòng
thủ của cây.

•
Cảm ứng triệu chứng
•
Di chuyển hệ thống
•
Tích lũy DNA virus
•
Cảm ứng triệu chứng
•
Di chuyển hệ thống
•
Vỏ protein
•
Lan truyền qua vector
•
Xâm nhập nhân tế bào

Trên thế giới đã có 50 loài begomovirus được xác định gây hại trên cà
Trên thế giới đã có 50 loài begomovirus được xác định gây hại trên cà
chua.
chua.

Tại Việt Nam, bệnh xoăn vàng lá được xem là bệnh virus quan trọng nhất
Tại Việt Nam, bệnh xoăn vàng lá được xem là bệnh virus quan trọng nhất
trên cà chua. Có 3 begomovirus được phát hiện gây ra bệnh xoăn vàng lá
trên cà chua. Có 3 begomovirus được phát hiện gây ra bệnh xoăn vàng lá
cà chua ở Việt Nam gồm tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus
cà chua ở Việt Nam gồm tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus
(TYLCKaV) và 2 virus được phát hiện ở miền Bắc là tomato leaf curl
(TYLCKaV) và 2 virus được phát hiện ở miền Bắc là tomato leaf curl

Vietnam virus (ToLCVV), tomato yellow leaf curl Vietnam virus
Vietnam virus (ToLCVV), tomato yellow leaf curl Vietnam virus
(TYLCVNV).
(TYLCVNV).

Việt Nam dường như là trung tâm đa dạng của begomovirus. Nhưng hiện
Việt Nam dường như là trung tâm đa dạng của begomovirus. Nhưng hiện
tại số lượng begomovirus phát hiện được mới 19 loài, trong đó chủ yếu là
tại số lượng begomovirus phát hiện được mới 19 loài, trong đó chủ yếu là
các loài cây dại. Điều đó gợi ý rằng có nhiều loài begomovirus đang gây
các loài cây dại. Điều đó gợi ý rằng có nhiều loài begomovirus đang gây
hại trên cà chua và các cây khác của Việt nam cần phải được xác định.
hại trên cà chua và các cây khác của Việt nam cần phải được xác định.
Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài:
Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài:


“
“
Xác định các virus thuộc chi Begomovirus (họ Geminiviridae) trên
Xác định các virus thuộc chi Begomovirus (họ Geminiviridae) trên
cây cà chua và cây khác khu vực Hà Nội và vùng phụ cận”
cây cà chua và cây khác khu vực Hà Nội và vùng phụ cận”
Claude Fauquet, 2006
Hình 6: Tám trung tâm đa dạng của geminivirus. Trung tâm
Đông Nam Á là vòng tròn C (Nawaz-ul-Rehman & Fauquet, 2009).
1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
1.2.1. Mục đích


Xác định các virus thuộc chi Begomovirus trên cây cà chua và cây khác khu vực Hà Nội
Xác định các virus thuộc chi Begomovirus trên cây cà chua và cây khác khu vực Hà Nội
và vùng phụ cận.
và vùng phụ cận.
1.2.2. Yêu cầu
1.2.2. Yêu cầu
1.
1.
Điều tra, thu mẫu và xử lý mẫu, bệnh virus với triệu chứng điển hình do nhóm
Điều tra, thu mẫu và xử lý mẫu, bệnh virus với triệu chứng điển hình do nhóm
begomovirus gây ra trên cây cà chua và một một số cây khác .
begomovirus gây ra trên cây cà chua và một một số cây khác .
2.
2.
Xác định sự có mặt của các begomovirus bằng PCR dùng mồi chung DNA-A BegoAFor1
Xác định sự có mặt của các begomovirus bằng PCR dùng mồi chung DNA-A BegoAFor1
& BegoAReV1 .
& BegoAReV1 .
3.
3.
Xác định thành phần loài đã tìm ra ở miền Bắc Việt Nam sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu
Xác định thành phần loài đã tìm ra ở miền Bắc Việt Nam sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu
ToLCVV (ToLCVV-sp-F2 & ToLCVV-sp-R2) và TYLCVNV(TYLCVNV-sp-F1 &
ToLCVV (ToLCVV-sp-F2 & ToLCVV-sp-R2) và TYLCVNV(TYLCVNV-sp-F1 &
TYLCVNV-sp-R1).
TYLCVNV-sp-R1).
4.
4.
Xác định sự có mặt của vệ tinh DNA-β virus bằng cặp mồi đặc hiệu BetaFor2 & BetaRev2.

Xác định sự có mặt của vệ tinh DNA-β virus bằng cặp mồi đặc hiệu BetaFor2 & BetaRev2.
5.
5.
Giải trình tự sản phẩm PCR của 1 - 2 mẫu cây cà chua.
Giải trình tự sản phẩm PCR của 1 - 2 mẫu cây cà chua.
6.
6.
Giải trình tự sản phẩm của 1 cây khác.
Giải trình tự sản phẩm của 1 cây khác.
7.
7.
Phân tích trình tự có được sau giải trình tự.
Phân tích trình tự có được sau giải trình tự.
Phần II: Vật liệu và phương pháp
Phần II: Vật liệu và phương pháp
nghiên cứu
nghiên cứu
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1. Vật liệu nghiên cứu

Các mẫu cà chua, các mẫu cây khác có triệu chứng nhiễm
Các mẫu cà chua, các mẫu cây khác có triệu chứng nhiễm
bệnh xoăn vàng lá thu thập tại khu vực Hà Nội và vùng phụ
bệnh xoăn vàng lá thu thập tại khu vực Hà Nội và vùng phụ
cận.
cận.

Các thiết bị và hóa chất cần thiết.
Các thiết bị và hóa chất cần thiết.


Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho
Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho
begomovirus
begomovirus
,
,
tomato
tomato
yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV)
yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV)
,
,
tomato leaf curl
tomato leaf curl
Vietnam virus (ToLCVV) (Bảng 1).
Vietnam virus (ToLCVV) (Bảng 1).

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu DNA-
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu DNA-β
là
là BetaFor2 & BetaRev2.
BetaFor2 : 5’ TAGCTACGCCGGAGCTTAGCTCG 3’
BetaRev2 : 5’AAGGCTGCTGCGTAGCGTAGTGG 3’
Bảng 1: Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu (trên phân tử DNA-A)
Bảng 1: Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu (trên phân tử DNA-A)
Mồi
Mồi
Trình tự (5’ – 3’)
Trình tự (5’ – 3’)
Vị trí

Vị trí
Kích thước
Kích thước
(bp)
(bp)
Tham khảo
Tham khảo
TYLCVNV-Sp-F1
TYLCVNV-Sp-F1
TGTGTTACATATTCTGTGTTTTCC
TGTGTTACATATTCTGTGTTTTCC
1094-1117
1094-1117
1386
1386
Mã Genebank
Mã Genebank
DQ641697
DQ641697
TYLCVNV-Sp-R1
TYLCVNV-Sp-R1
AAATACATCAAAATCTGCAGAGAGC
AAATACATCAAAATCTGCAGAGAGC
2456-2480
2456-2480
ToLCVV-Sp-F2
ToLCVV-Sp-F2
GACCAGTCTGAAGGTGTGAGTTC
GACCAGTCTGAAGGTGTGAGTTC
1254-1276

1254-1276
454
454
Mã Genebank
Mã Genebank
DQ641705
DQ641705
ToLCVV-Sp-R2
ToLCVV-Sp-R2
ACTCAAGCTATAAAGAATACCTAGAC
ACTCAAGCTATAAAGAATACCTAGAC
1683-1708
1683-1708
BegoAFor1
BegoAFor1
TGYGARGGiCCiTGYAARGTYCARTC*
TGYGARGGiCCiTGYAARGTYCARTC*
Xem hình 4
Xem hình 4
~1200
~1200
Ha
Ha
et al
et al
., 2006
., 2006
BegoARev1
BegoARev1
ATHCCMDCHATCKTBCTiTGCAATCC*

ATHCCMDCHATCKTBCTiTGCAATCC*
(CEGPCKVQS)
(IPT/A/SIF/VLCNP)
AV1
AV2
AC3
AC2
AC1
AC4
BegoAFor1 BegoARev1~ 1.2 kb
DNA-A
Hình 7. Sơ đồ tổ chức bộ gien DNA-A (biểu diễn dưới dạng mạch thẳng) của begomovirus và vị trí
tương đối của cặp mồi BegoAFor1 và BegoARev1. Mũi tên dạng hộp biểu diễn vị trí và hướng của các
ORF. Dãy chữ trong 2 ngoặc kép là các chuỗi axit amin bảo thủ tương ứng với 2 mồi BegoAFor1 và
BegoARev1.
* Y (C / T), R (G / A), H (A / C / T), M (A / C), B (C / G / T), D (A / G / T), K (G / T) và i = inosine
2.2. Phương pháp nghiên cứu.
2.2. Phương pháp nghiên cứu.
1. Thu mẫu và xử lý mẫu.
2. Chiết tách DNA tổng số từ mô lá cà chua bằng phương pháp
NaOH (Wang et al., 1993), Phương pháp chiết dùng CTAB
(Doyle & Doyle (1987)).
3. Tiến hành kiểm tra PCR các mẫu cà chua và cây khác thu thập
được, sử dụng các cặp mồi trong bảng 1, cặp mồi đặc hiệu
DNA-
DNA-β và điện di sản phẩm PCR.
4. Tinh chiết sản phẩm PCR từ gel Agarose (Invitrogen)
5. Định lượng sản phẩm tinh chiết.
6. Giải trình tự gen.
7. Phân tích trình tự bằng các phần mềm tin sinh học ClustalX

1.83, BioEdit 7.0.0, MEGA 4.0 và gói phần mềm thương mại
DNASTAR.
Phần III. Kết quả nghiên cứu
Phần III. Kết quả nghiên cứu
3.1. Kết quả điều tra thu mẫu
3.1. Kết quả điều tra thu mẫu


3.1.1. Kết quả điều tra bệnh trên cà chua
3.1.1. Kết quả điều tra bệnh trên cà chua


Bảng 2: Kết quả điều tra tỉ lệ bệnh xoăn vàng lá trên cây cà chua
Bảng 2: Kết quả điều tra tỉ lệ bệnh xoăn vàng lá trên cây cà chua
TT Thời gian Địa điểm
Giai đoạn
sinh trưởng
Tỉ lệ bệnh
1 18/09/2008 Nam Hồng – Đông Anh – Hà Nội Ra quả non 1.00%
2 21/09/2008 Cổ Bi – Gia Lâm – Hà Nội Ra hoa đợt 1 3.96%
3 24/09/2008 Tiên Sơn – Bắc Ninh Ra hoa đợt 1 0.52%
4 27/09/2008 Đa Tốn – Gia Lâm – Hà Nội Ra hoa đợt 1 0.77%
5 30/09/2008 Yên Phú – Yên Mỹ – Hưng Yên Ra hoa đợt 1 4.00%
6 05/10/2008 Duyên Hà – Thanh Trì – Hà Nội Ra hoa đợt 1 0.50%
7 05/10/2008 Yên Mỹ – Thanh Trì – Hà Nội Ra hoa đợt 1 1.30%
8 28/10/2008 Đại học Nông nghiệp Hà Nội Cây non 4.00%