Giáo trình: Công nghệ sản xuất Enzym

PHẦN MỞ ĐẦU
LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN NGÀNH ENZIM HỌC
MỘT SỐ KHÁI NIỆM CHUNG
Định nghĩa:
xúc tác sinh học; bản chất protein; hồ tan trong nước và dung dịch muối lỗng; phân tử lượng lớn.
Đặc tính sinh học:
Bị biến tính dưới tác dụng của các yếu tố làm biến tính protein
Tính đặc hiệu xúc tác cao.
Các enzim nguồn gốc tự nhiên không độc
Cường lực xúc tác lớn
Tác dụng trong điều kiện êm dịu
Nguồn nguyên liệu thu enzim
Nguồn động vật: dạ dày lợn (pepsin); dạ dày bê (renin); tuỵ tạng (pancreatin)
Nguồn thực vật: nhựa đu đủ (papain); lá và vỏ dứa (bromelin);
Nguồn vi sinh vật: vô cùng phong phú; thay đổi hệ enzim VSV bằng cách thay đổi điều kiện nuôi
cấy; VSV sinh sản & phát triển và STH enzim với vận tốc rất lớn; enzim có hoạt tính rất mạnh
Các loại chế phẩm enzim sử dụng trong công nghiệp
Chế phẩm enzim thô: nhận được sau lên men không qua tinh chế
Chế phẩm enzim kỹ thuật: Chế phẩm nhận được sau khi đã tinh chế sơ bộ tách một số protein và
enzim tạp
Chế phẩm enzim tinh khiết: Chế phẩm enzim đã được loại bỏ hoàn toàn protein và enzim tạp
Đơn vị hoạt độ (IU)
Lượng enzim xúc tác chuyển hoá 1M cơ chất trong 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn
Đơn vi Katal
Lượng enzim xúc tác chuyển hoá 1M cơ chất trong 1 giây ở điều kiện tiêu chuẩn
1IU = 1/60 katal = 16,67 nkatal
Hoạt độ riêng
Số đơn vị hoạt độ enzim trên đơn vị khối lượng protein của chế phẩm
IU hoặc katal / 1 mg protein
Hoạt độ phân tử
Số phân tử cơ chất được chuyển hoá bởi một phân tử enzim trong 1 phút

Hoạt độ tâm xúc tác
Số phân tử cơ chất được chuyển hoá bởi một trung tâm hoạt động trong 1 phút
Những điều lưu ý khi xác định hoạt độ enzim
Tránh những yếu tố có thể gây biến tính protein enzim
Enzim tồn tại bền vững và ổn định trong điều kiện phản ứng
Lượng cơ chất được chuyển hoá khoảng 20 – 30%
Thời gian xác định hoạt độ ngắn, nếu dài cần có các giải pháp tránh sự phát triển của VSV
Làm mẫu kiểm chứng với enzim bị vô hoạt trước khi cho vào tiếp xúc với cơ chất
Xác định thông số động học của chế phẩm enzim
Một enzim cấu tạo gồm 2 dưới đơn vị giống nhau về trọng lượng phân tử 50kDa. Enzim xúc tác
phản ứng:
Ta có chế phẩm enzim chứa 3 mg protein/ml và độ tinh khiết của enzim là 80%. Xác
định hoạt độ được thực hiện bằng hấp thụ ánh sáng ở 512 nm. Đây là chiêu dài bước sóng mà sản
phẩm phản ứng hấp thụ. Hệ số hấp thụ phân tử của sản phẩm là  = 5000 mol-1. L cm-1.


Mơi trường phản ứng bão hồ cơ chất được điều chỉnh tới pH = 7,0 và duy trì nhiệt độ ở 30 oC. Thể
tích dịch là 3ml. Người ta sử dụng 100ml tách chiết enzim đã được pha loãng 500 lần. Để xác định
dùng phương pháp 2 điểm, bằng cách bổ sung 2ml chất dừng phản ứng vào môi trường phản ứng
sau 2 phút tiến hành. Sự thay đổi hấp thụ đọc được là 0,6uA.
Đơn vị enzim được định nghĩa là lượng enzim có thể xúc tác thuỷ phân 1 M cơ chất trong 1 phút
ở 30oC và pH = 7,0.
Tính nồng độ hoạt độ enzim xúc tác trong chế phẩm và hoạt độ riêng. Từ đó rút ra hoạt độ phân tử
và hoạt độ tâm xúc tác (Tun Over Number) 30oC v pH = 7,0.
Tính toán
Tính nồng độ hoạt độ xúc tác (theo đơn vị/ ml tách chiết)
Tính hoạt độ đặc hiệu của chế phẩm
Hoạt độ tâm xúc t¸c cđa enzim
Qui trình xin phép sử dung chế phẩm Enzym mi v
Nhà sản xuất, Nhà hoàn thiện sản phẩm và Nhà kinh doanh.

Hoạt độ enzym chính, các hoạt độ enzym phụ, cách thức tác dụng lên cơ chất, chất thải trao đổi
chất.
Đặc tính hoá chính xác tổ chức sản xuất hay các tế bào động vật, thực vật sử dụng, dữ liệu
về taxonomiques và nhận biết chính xác chủng sản xuất.
Trong tr-ờng hợp biến đổi gen: nguồn gốc gen, đoạn codantes hay diều chỉnh, vectơ, sự có mặt
của gen đánh dấu
Qui trình thu nhận chế phẩm enzim, kỹ thuật tách chiết và tinh chế.
Thành phần của chế phẩm, những đặc điểm riêng, phù hợp hay không với luật 5.09.89
Tính chất không độc của chế phẩm và các sản phẩm tạo ra do tác dụng của enzim (hay các
enzim đ-ợc sử dụng trong chế phẩm) và xác định đ-ợc hệ sè an toµn.
CHƯƠNG 1. QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHUNG
1. VI SINH VẬT
1. Các tiêu chí lựa chọn vi sinh vật
Khơng tạo độc tố
Các chủng VSV dùng để sản xuất phải tuân theo luật quốc tế.
Danh sách các chủng được phép sử dụng trong bảng “Generally recognized As Safe”.
Không sinh độc tố thậm chí trong điều kiện thuận lơị cho QT này.
Khả năng tách chiết
Kết thúc quá trình lên men, tiêu diệt VSV này mà vẫn giữ nguyên hoạt độ enzim mong muốn.
Ổn định gen
Chủng giống phải được bảo quản và tái tạo mãi mà khơng có bất cứ lạc hướng nào trong q trình
ni cấy liên tục.
2. CÁC VI SINH VẬT VÀ ENZIM CHỦ YẾU SỬ DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP
Danh mục các vi sinh vật và enzim được liệt kê trong bảng
3.Phân lập, tuyển chọn và cải tạo giống VSV


Phân lập và tuyển chọn giống VSV
Được phân lập từ đất, nước, khơng khí, từ một số thực vật... hoặc từ bộ sưu tập giống VSV có sẵn
Tuyển chọn chủng VSV có khả năng sinh trưởng phát triển nhanh, sinh tổng hợp enzim mong

muốn cao và ổn định...
Với mục đích sử dụng trong CNTP, chế phẩm cần phải được kiểm tra kỹ trên phương diện Độ
độc.
Cải tạo giống VSV
mục đích:
Tăng hiệu suất tăng trưởng và hoạt động đặc hiệu liên quan tới tổng hợp protein enzim.
Gây đột biến cấu trúc khi enzim là enzim cảm ứng.
Cải thiện sức đề kháng tốt với các sản phẩm chuyển hoá.
Đột biến bằng các tác nhân vật lý hoặc hoá học
Các tác nhân vật lý: gồm có tia cực tím (tia tử ngoại) tia X (rơnghen), tia , hoặc bắn phá bằng hạt
nơtron, electron. Trong đó thường sử dụng nhất là tia cực tím (UV).
Các tác nhân hoá học: các hợp chất chứa nitơ như: nitrozometylguanidin, metyldicloroetylamin,
nitrithydroxylamin, etylmetylsulfonat.
Đột biến bằng phương pháp sinh học phân tử
Phương pháp biến nạp: là sự truyền ADN từ tế bào cho đến tế bào nhận có thể xảy ra trong ống
nghiệm khi cho tế bào nhận tiếp xúc với dịch chiết từ tế bào cho mà không cần có sự tiếp xúc trực
tiếp giữa các tế bào.
Phương pháp tiếp hợp gen: vật liệu di truyền (ADN) chỉ được truyền từ tế bào cho đến tế bào
nhận khi hai tế bào tiếp xúc với nhau, do vậy các VSV có khả năng biến nạp thì khơng có khả
năng tham gia tiếp hợp gen
Phương pháp tải nạp: vật liệu di truyền ADN được chuyển từ tế bào cho đến tế bào nhận nhờ vai
trò trung gian của thực khuẩn thể (Phage). Trong quá trình tải nạp các đoạn ADN được chuyển từ
tế bào cho đến tế bào nhận tiếp hợp với ADN của tế bào nhận do đó làm biến đổi tính chất di
truyền của tế bào nhận.
2. MƠI TRƯỜNG NI CẤY
1. Các tiêu chí lựa chọn ngun liệu
Đáp ứng được các luật hiên hành ở các nước tiên tiến: khơng có các chất sát trùng, kháng sinh,
thuốc trừ sâu, kim loại nặng …
Nguồn cung cấp ổn định về số lượng và chất lượng suốt trong năm.
Giá cả rẻ nhất có thể được bao gồm cả bảo quản và vận chuyển.

Trong thực tế tất cả các sản phẩm được sử dụng làm môi trường thường được lấy từ các nhà máy
nông sản thực phẩm. Nguyên liệu của môi trường lên men bao gồm :
Nguồn cacbon: bột ngũ cốc, bột đậu, bột ngơ, khoai tây, cám mì hoặc cám gạo, tinh bột,
maltodextrin, xenluloza, glucoza, sacaroza, … nguồn phi gluxit như glyxerol, axit béo...
Nguồn nitơ: tách chiết nấm men, casein (13% nitơ), bột cá, khô lạc, khô đậu, sản phẩm thuỷ phân
của casein (nguồn nitơ hữu cơ). Các muối amôn và nitrat … (nguồn nitơ vô cơ).
Các muối vô cơ: mang lại một lượng tối thiểu các kim loại như Mg, Ca, K, Fe, Mn, Zn … Photpho
dưới dạng muối photphat và lưu huỳnh dưới dạng muối sulfat.


Các chất tăng trưởng và các chất kích thích tăng trưởng: chất cảm ứng; các coenzym (thiamin
tăng sản xuất pyruvat cacboxylase); sản phẩm của phản ứng enzym (maltodextrin đối với aamylase, maltoza đối với pullulanase).
2. Chuẩn bị và thanh trùng môi trường
Nguyên tắc chung
Vệ sinh môi trường nuôi cấy phải được duy trì cho tới thời điểm thu hồi VSV, xử lý tách enzim
Không nên thanh trùng tạo ra các sản phẩm bất lợi cho sự tăng trưởng của VSV và tổng hợp enzim
(phản ứng Maillard).
Đối với phương pháp nuôi cấy bề mặt
Gồm các nguyên liệu tự nhiên: cám gạo, khô cám, cám mỳ, tấm gạo, ngô (chiếm 90 – 95%).
Bổ sung trấu nhỏ hoặc mùn cưa (5 – 10%) để làm xốp canh trường.
Trước khi gieo VSV, môi trường cần được làm ẩm đến 50 – 65% và thanh trùng 1 at ở 120oC để
diệt VSV lạ, sau đó hạ nhiệt độ xuống 30 – 40oC và tiến hành gieo cấy VSV.
Đối với phương pháp ni cấy chìm
Dịch dinh dưỡng được cho vào thùng lên men. Sau đó đưa trực tiếp hơi nước nống vào thanh trùng
ở nhiệt đô 118 – 125oC trong 45 – 60 phút.
Hạ nhiệt độ và bổ sung VSV.
3. QUÁ TRÌNH LÊN MEN
1. Các phương phỏp lờn men c s dng
Ph-ơng pháp lên men bề mỈt
Ngun tắc: sử dụng một chất mang rắn, trên đó ni cấy VSV (thường là nấm sợi)). Q trình

ni cấy diễn ra trong thiết bị dạng giàn làm ẩm hay dạng thùng quay.
Ưu điểm: cho phép nâng cao hoạt lực enzim trong sản phẩmlên men. Canh trường sau khi sấy khơ
vận chuyển được dễ dàng. Tránh được nhiễm trùng tồn khối canh trường và ít tốn điện năng.
Nhược điểm: năng suất thấp, không nâng cao được năng suất thiết bị. Tốn nhiều cơng lao động thủ
cơng. Khó điều chỉnh thành phần mơi trường. Khó cơ giới hố và tự động hoỏ.
Ph-ơng pháp lên men bề sâu
Nguyờn tc: s dng mụi trường lỏng trong thiết bị phản ứng để nuôi cấy VSV. Tất cả các thơng
số của q trình lên men được kiểm tra và điều chỉnh trong suốt quá trình.
Ưu điểm: Chủ động điều khiển quá trình lên men. Dễ cơ giới hố, tự động hố. Năng suất cao. Có
tính liên tục tiết kiệm được diện tích sản xuất. Sử dụng hợp lý các chất dinh dưỡng của môi
trường. độ đồng nhất trong môi trường lên men tốt, thuận lợi cho quá trình tách chiết.
Nhược điểm: Nồng độ enzim trong canh trường thấp. Phải cô đặc nên giá thành cao. Tốn điện
năng do sục khí liên tục. Khi khơng đảm báo vơ trùng tuyệt đối dễ bị nhiễm tồn bộ mơi trường.
2. Q trình lên men chính
2.1. Khía cạnh sinh học
Khi ni VSV tạo enzim có hai q trình liên quan mật thiết với nhau: sinh khối VSV và tích tụ
enzim. Hai q trình này khơng phải lúc nào cũng trùng khớp nhau về mặt thời gian.
Theo lý thuyết hiện đại giữa vận tốc ST và vận tốc STH enzim có mối tượng quan phụ thuộc. Hai
kiểu phụ thuộc giữa các quá trình này:
Kiểu 1: vận tốc ST của VSV hồn tồn phù hợp chính xác với vận tốc STH enzim.
Kiểu 2: Sự không trùng khớp của 02 giai đoạn này được xác định bằng « tuổi thọ » của axit
ribonucleic thông tin hay axit axit ribonucleic khuôn.


Theo lý thuyết về các q trình đồng hố và dị hoá. Ba dạng biểu hiện tương quan các quá trình
này:
Dạng 1
Dạng 2
Dạng 3
Dạng 1: Tăng trưởng VSV và STH enzim đi đơi với nhau (hình 1a). Enzim tạo nên bằng con

đường dị hố, cơ chất chính của lên men cũng là chất cảm ứng enzim.
Dạng 2: sản xuất enzim liên tục, thậm chí sau pha tăng trưởng (hình 1b). Enzim tạo nên bằng con
đường dị hoá, nhưng cơ chất chính của lên men và chất cảm ứng enzim là khác nhau.
Dạng 3: Một giai đoạn lệch pha giữa pha tăng trưởng VSV và STH enzim (hình 1c). Enzim tạo
nên bằng con đường đồng hố. Sự kìm hãm ngừng lại khi nồng độ của chất kìm hãm đã bị giảm
xuống do sự tăng trưởng của VSV.
2.2. Khía cạnh hố sinh
Các tế bào VSV sử dụng oxy (3 – 10 tấn oxy tinh khiết/ ngày/ thiết bị LM 100m3); sử dụng các
chất dinh dưỡng của môi trường lên men.
Sản sinh ra sinh khối (tăng trưởng từ 1 tới 108 chỉ trong 5 – 10 ngày); CO2, nhiệt (2106kj/h); tiết
ra các sản phẩm trao đổi chất và enzim.
2.3.3. Phương pháp lên men liên tục
Cung cấp NL và rút dịch môi trường LM được thực hiện liên tục.
Điều chỉnh lưu lượng dòng chảy vào và ra đảm bảo nhận được nồng độ enzim mong muốn tối ưu
và ổn định.
2.4. Các thông số vật lý và sinh lý ảnh hưởng tới QTLM
2.4.1. Các thông số vật lý
Nhiệt độ: Lượng nhiệt giải phóng có thể đạt 2106kcal/h. Cần phải làm nguội.
pH: pH phải được điều chỉnh liên tục nhờ các điện cực bằng các chất kiềm (NaOH, KOH, …)
hoặc các chất đệm photphat hoặc axit vô cơ (photphoric, sulfuric…).
Bọt: Khi khuấy trộn môi trường giàu protein sinh ra bọt. Bổ sung các chất chống tạo bọt là các
dầu thực vật, động vật và silicon. Các chất này ảnh hưởng không tốt tới sự vận chuyển oxy và đối
với VSV.
Oxy hố mơi trường: thơng số đặc trưng đặc biệt khó điều khiển trong qui mơ cơng nghiệp. Khó
khăn ở chỗ các cấu phần chung “lên men - thiết bị lên men” tuân theo các luật tự nhiên khác nhau:
QT vật lý (chuyển khối), QT sinh lý (các VSV), QT hỗn hợp khi có sự tương tác giữa hai QT trên:
Phương thức chuyển dịch: trong một hệ thống cân bằng tỷ lệ chuyển dịch oxy (TCO) tỷ lệ tuyến
tính với các nồng độ khác nhau của oxy trên bề mặt khí - lỏng. Trong QTLM tồn bộ tổng thể
khuấy trộn - sục khí – mơi trường tương tác với giá trị hệ số chuyển dịch thể tích.
TCO = KLa (C* – CL)

C* trong màng khí; CL trong pha lỏng; KLa hệ số chuyển dịch thể tích
Tương tác với hình thái của VSV: trong QTLM các sợi nấm biểu thị những biến đổi hình thái phức
tạp. Độ nhớt biểu kiến cao sẽ gây trở ngại cho sự chuyển khối. Sự cọ xát có xu hướng phá vỡ các
sợi khi tốc độ ngoại vi đạt 5.10 m/s trong thiết bị LM có dung tích lớn.
Độ hồ tan của oxy trong nước ở 25oC, dưới áp suất 1at (oxy tinh khiết) chỉ là 1,29mM (hoặc
0,041g/l) và giảm xuống khi nhiệt độ tăng lên.
2.4.2. Các thông số sinh lý
Cân bằng năng lượng: Một lượng lớn năng lượng phát tán dưới dạng nhiệt cần phải loại bỏ bằng
hệ thống làm nguội của thiết bị. Cần phải hướng việc sử dụng năng lượng này cho sự tổng hợp
enzim.


Áp suất CO2: Khí CO2 có mặt trong tất cả các QTLM với tỷ lệ dao động. Nó đóng vai trị quan
trọng trong các phản ứng cacboxyl hố và sự tổng hợp một vài loại enzim. Trong trường hợp này
sục khí q mạnh sẽ khơng có lợi.
Áp suất O2: Oxy có tác dụng khác nhau trong các giai đoạn sinh trưởng hay tổng hợp enzim:
Tổng hợp penicilinaxylase bởi E. coli: Tỷ lệ oxy hoà tan cao tạo điều kiện thuận lợi cho sinh
trưởng, nhưng không thuận lợi cho STH enzim.
Tổng hợp glucooxydase bởi Asp. Niger: tăng áp suất oxy liên quan tới tăng độ tăng trưởng và phân
tiết đạt giá trị cực đại; nhưng lại giảm xuống nếu tiếp tục tăng áp suất oxy.
Cảm ứng - ức chế: Trong một số QTLM người ta cần một chất cảm ứng. Một số trường hợp khác
phải tránh sự có mặt của các chất ức chế vào thời điểm ban đầu hay sự xuất hiện của chúng trong
QTLM.
4. QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT ENZIM
1Làm lạnh môi trường nuôi cấy ngay khi QTLM kết thúc tới 3 – 5oC
Tránh vô hoạt enzim.
Tránh nguy cơ nhiễm tạp VSV.
2Phân tách pha chứa enzim
Đối với enzim ngoại bào
Điều chỉnh pH môi trường tới giá trị pH tối ưu của enzim và duy trì suốt trong QTTC.

Bổ sung các chất trợ lắng như bột diatomit, silic, xenluloza...
Phân tách các vật liệu tế bào và các vật liệu khơng hồ tan: vi lọc, ly tâm, lọc màng.
Siêu lọc dung dịch protein vô trùng để thu nhận được tối đa enzim mong muốn với ngưỡng cắt
màng và lưu lượng dòng chảy được lựa chọn. Nồng độ enzim nhận được tăng 20 – 40 lần.
Đối với enzim nội bào
Sự phân bố enzim trong tế bào VSV
Cấu trúc thành tế bào VSV: bền vững và cấu trúc thay đổi tuỳ theo từng loại VSV; cấu tạo bởi
peptido glucan.
Khu trú của enzim trong cấu trúc vi thể của tế bào VSV:
Enzim ngoại bào: Enzim được STH trong tế bào và được tiết ra bên ngồi mơi trường trong
QTLM.
Enzim nội bồ: Enzim được STH và sử dụng hoàn toàn bên trong tế bào. Chúng tồn tại dưới dạng
liên hợp, dạng liên kết hay dạng “bị nhốt trong các bào quan của tế bào.
Enzim périplasmique: Enzim nzừm ngoài màng sinh chất nhưng bên trong tế bào.
Phân tách pha chứa enzim
Phân giải tế bào ngay sau khi dừng lên men chính:
Các phương pháp phân giải tế bào:
Tự phân.
Phân giải bằng các chế phẩm enzim (chitinase, mananase, protease…).
Lysozim của lòng trắng trứng.
Sốc áp suất thẩm thấu đối với enzim periferique
Sóng siêu tần (20 MHz).
…
Khi enzim được giải phóng khỏi tế bào các xử lý tiếp theo giống nhau đối với enzim ngoại bào.
5. QUÁ TRÌNH TINH CHẾ ENZIM
Thành phần của dịch chứa enzim: nhiều loại enzim; protein; các tạp chất khác.
Quá trình phân tách được phân ra 03 giai đoạn:


Giai đoạn 1: Trích ly cho phép nhận được hỗn hợp phân tử dưới dạng hồ tan có các tính chất lý

hoá học rất gần nhau.
Giai đoạn 2: Phân đoạn hỗn hợp dựa vào độ hoà tan khác nhau để nhận được một họ các phân tử.
Giai đoạn 3: Tinh sạch bằng các phương pháp lý hoá học và đặc hiệu sinh học tinh tế hơn để nhận
được một phân tử enzim tinh khiết.
6. Q TRÌNH CƠ ĐẶC VÀ HỒN THIỆN SẢN PHẨM
Cô đặc
Siêu lọc: màng bán thấm dạng sợi xốp hay sợi màng; lọc ở áp suất cao (vài atm); các phần tử nhỏ
đi qua màng bán thấm (nước và muối vô cơ).
Làm bay hơi nước ở áp suất thấp (cô đặc chân không).
Làm bay hơi nước ở nhiệt độ cao trong thời gian ngắn (sấy phun).
Hoàn thiện sản phẩm
Dạng bột: bổ sung các chất nền để điều chỉnh nồng độ hoạt độ enzim của chế phẩm.
Dạng lỏng: Bổ sung các chất bảo quản NaCl, socbitol, glyxerol, benzoat.
7. KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM
CHƯƠNG 2. MỘT SỐ CÔNG NGHỆ TÁCH CHIẾT ENZIM
1. Các nguyên tắc chung
Tách chiết enzim
Làm cho tế bào trở nên thẩm thấu và giải phóng enzim khỏi tâm gắn của nó.
Phá huỷ thành tế bào, màng tế bào và cấu trúc dưới phân tử.
Khống chế mức độ phá vỡ để thuận lợi cho giai đoạn tinh chế sau này.
Khơng làm biến tính enzim.
Q trình tách chiết thực hiện ở nhiệt độ thấp.
Loại bỏ các mảnh tế bào
Loại bỏ toàn bộ các phần tử rắn, kết tủa của các axit nucleic, protein…
Chọn phương pháp lọc hoặc ly tâm phụ thuộc vào qui mô SX và bản chất của chất rắn.
Loại bỏ các axit nucleic
Axit nucleic làm tăng độ nhớt của mơi trường.
Cần thiết khi phá huỷ hồn tồn thành tế bào VSV.
2. CƠ SỞ CHUNG ĐỂ TRÍCH LY CÁC ENZIM
Năng lượng cần thiết để phá vỡ tế bào phụ thuộc loại tế bào, trạng thái sinh lý của tế bào.

Phương trình thể hiện quá trình phá vỡ tế bào
Ln.Pm/Pm-P=k.t
Trong đó Pm: Lượng protein tối đa được giải phóng
P: Lượng protein giải phóng ra tại thời điểm xác định
k: Hằng số tỷ lệ
: Thời gian phá tế bào
Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính enzim khi phá vỡ tế bào
Nhiệt độ: cần loại bỏ lượng nhiệt sinh ra khi phá vỡ TB. Bổ sung cơ chất hoặc các chất tương tự
cơ chất hoặc các polyol làm bền enzim
Lực cắt: lực cắt có thể phá huỷ enzim; đặc biệt khi có mặt các ion kim loại hoặc trên bề mặt phân
tách với khơng khí.
pH: dung dịch đệm rất quan trọng trong việc ổn định hoạt lực enzim.


Hố chất: các chất tẩy rửa và dung mơi có thể gây biến tính enzim.
Chất chống oxy hố: các tác nhân khử axit ascorbic, mercapto etanol, ditiotreitol… có thể rất cần
thiết.
Chất tạo bọt: mặt phân cách lỏng – khí trong các bọt có thể phá huỷ hình thể enzim.
Kim loại nặng: các ion đồng, sắt, niken… nhiễm vào từ các thiết bị gây vô hoạt bất thuận nghịch
enzim.
2. CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ENZIM
1. Các phương pháp cơ học
Phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm
Điều kiện: huyền phù VSV; sóng siêu tần 18KHz – 1MHz chuyển động hình sin với bước chuyển
dịch nhỏ < 50m, vận tốc vài m.s-1, gia tốc lớn 80 000g.
Nguyên lý: Vô số vi bọt tạo thành, lớn dần lên và xẹp xuống. Bọt xẹp chuyển năng lượng âm
thanh thành năng lượng cơ học gây sốc với áp suất hàng ngàn atm (300MPa).
Giải pháp: Một lượng lớn năng lượng chuyển thành nhiệt, nên phải làm lạnh. Sóng siêu âm dễ
làm biến đổi cấu trúc enzim và phá huỷ enzim do oxy hoá các gốc tự do, dùng N2O giảm được tác
dụng xấu này.

Ưu điểm: phương pháp phổ biến, hữu ích, đơn giản, phù hợp với qui mô nhỏ.
Nhược điểm: pH, Nhiệt độ, lực ion của MT huyền phù thời gian tác dụng có ảnh hưởng lớn.
Lạnh đông và nhả lạnh đông
Điều kiện: huyền phù VSV; làm lạnh đông ở -20oC, nén dưới áp suất cao (10 – 15 tấn/inch
vuông) qua các lỗ hẹp của máy nén.
Nguyên lý: Kết quả của việc làm lạnh đông đột ngột tế bào là cơ đặc chất hồ tan nằm bên trong
tế bào. Sự hình thành các tinh thể bên trong và ngoài tế bào kéo theo việc phá vỡ tế bào. Khi nén,
tế bào sẽ bị phá vỡ do sự thay đổi pha và thay đổi thể tích, cũng như do tác dụng của lực cắt các
tinh thể đá.
Ưu điểm: phương pháp phổ biến, đơn giản, phù hợp với qui mô nhỏ.
Nhược điểm: năng suất thấp (10kg/h), thiết bị làm việc gián đoạn từng mẻ một, dễ làm biến tính
enzim.
Nghiền hay đảo trộn với bột mài
Điều kiện: huyền phù VSV; các hạt thuỷ tinh (hoặc inox) đường kính 0,2 – 1,0mm. Cùng một thể
tích viên bi, sử dụng các hạt nhỏ sẽ cho hiệu quả tốt hơn. Số lượng các viên bi tối ưu khi khoảng
cách giữa hai viên là 0,22mm.
Nguyên lý: huyền phù tế bào được đảo trộn với các viên bi sẽ bị phá huỷ do lực cắt của chất lỏng
cao, do va chạm với các viên bi. Mức độ phá huỷ phụ thuộc vào tốc độ và thời gian đảo trộn, nồng
độ VSV, số lượng và kích thước các hạt.
Ưu điểm: phương pháp phổ biến, phá huỷ được tế bào của tất cả sinh khối tế bào dạng sợi đơn
bào, đơn giản, năng suất tương đối cao có thể đạt 340kg/h huyền phù sinh khối.
Nhược điểm: thiết bị làm việc gián đoạn từng mẻ một, hiệu suất phá vỡ tế bào khơng cao, dễ làm
biến tính enzim.
Phá huỷ ở áp suất cao
Điều kiện: huyền phù VSV; làm lạnh đông ở -25oC được nén dưới áp suất 1 – 2,5 tấn/cm2 qua một
đĩa có kích thước lỗ 1,5 – 2,5mm. Nhiệt độ của máy được duy trì khơng đổi nhờ dịng tác nhân
lạnh glycol -25oC.
Ngun lý: dư ới áp su ất l ớn huy ền phù t ế bào đi qua c ửa thoát s ẽ đư ợc phá v ỡ t ế bào.

Nhược điểm: năng su ất th ấp, thi ết b ị làm vi ệc gián đo ạn t ừng m ẻ m ột, d ễ làm bi ến tính
enzim.
Đồng hố dưới áp suất cao
Điều kiện: huyền phù VSV được bơm vào máy với áp suất 8000 – 20000PSI (150MPa; 10tấn/inch
vuông) với lưu lượng 10 000l/h qua một van xả có miệng hẹp, sau đó áp suất nhanh chóng được
đưa đến áp suất khí quyển.
Nguyên lý: các tế bào bị nén lại va chạm với nhau, sau đó nổ vỡ ra bởi áp suất giảm đột ngột khi
qua van là nhân tó chủ yếu phá vỡ tế bào. Protein được giải phóng tương ứng với phản ứng bậc 1
(đối với nấm men):
2. Các phương pháp không phải cơ học
Xử lý kiềm: pH môi trường pH = 11,5 – 12,5 cho phép thuỷ phân màng TB. Kỹ thuật này chỉ áp
dụng cho enzim bền trong MT này ít nhất 20 – 30 phút (L asparaginase, pH = 12,0,  = 20 phút).
Sử dụng chất tẩy rửa: chất tẩy rửa ở dạng ion hoặc không sẽ liên kết với các lipoprotein màng tạo
ra các mixen trong một số điều kiện pH, lực ion, nhiệt độ làm cho màng TB trở nen thẩm thấu.
Chất tẩy ion laurylsulfat natri (CH3(CH2)10CH2-SO4-Na, Tween 20; chất tẩy không ion Triton
X100.
Sốc thẩm thấu: huyền phù TB trong môi trường ưa trương (dung dịch 20% sacaroza trong nước) ở
4oC tạo ra sốc thẩm thấu trên màng TB. Kỹ thuật này chỉ sử dụng cho vi khuẩn Gram âm để trích
ly enzim periplasmic. Khơng làm biến tính enzim, tinh chế enzim đơn giản. Năng suất thấp 400
dm3 cho 10kg huyền phù TB.
Dung giải bằng enzim: lysozim xúc tác thuỷ phân các liên kết -1,4 glucozit của các
peptidoglucan giữ vai trò duy trì độ cứng của TB VK. Sử dụng kết hợp lysozim với etilendiamin
tetraaxetic axit (EDTA) để tạo phức với Ca làm giải phóng các lipopolisacarit và phá huỷ màng
TB. Lysozim lòng trắng trứng là enzim dung giải duy nhất được sử dụng ở qui mô thương mại. Kỹ
thuật này chỉ áp dụng ở qui mơ nhỏ vì KT thao tac và giá thành cao.
3. Các phương pháp tách chiết bằng dung môi
Nguyên tắc tách chiết: Sau khi phá vỡ tế bào tiến hành tách các chất không phải protein enzim trên
cơ sở tính hồ tan. Một dung mơi tách chiết tốt phải đảm bảo enzim hoà tan suốt trong quá trình
tinh chế nếu có sự thay đổi về tính đệm MT, T, pH.
Định luật Raoult: Các phân tử hoà tan và dung môi độc lập với nhau. Hai hướng của luật này là:

Dương: nếu tương tác CHT – CHT; DM – DM mạnh, còn CHT – DM yếu.
Âm: nếu tương tác CHT – DM mạnh.
Hướng dương tương ứng tính tan yếu, hướng âm với tính tan mạnh.
Dung mơi tách chiết:
Các dung mơi có cực như dung dich muối vơ cơ tương tác mạnh với enzim làm cho chúng trở nên
hoà tan, nhưng khi nồng độ muối đậm đặc hơn xảy ra hiện tượng giảm tính hồ tan mới.
Các dung dịch ít có cực như dung mơi hữu cơ làm giảm ĐHT của enzim. Trong trường hợp này
tách các chất hoà tan không phải protein ra khỏi enzim. Dung môi hữu cơ thường dùng butanol,
axeton.
Các yếu tố ảnh hưởng: pH, nhiệt độ, một số ion đặc hiệu.
CHƯƠNG 3. CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH CHẾ ENZIM
1. LỊCH SỬ PHAT TRIỂN CỦA TINH CHẾ ENZIM
Giai đoạn 1: dựa trên các tính chất lý – hoá học tác động lên các chất phân tử lượng lớn.


Giai đoạn 2:
Khai thác các tính chất đặc trưng khác nhau của protein cầu.
Phân tách dựa trên các thông số riêng như trọng lượng phân tử, điện tích của protein.
Giai đoạn 3: dựa trên những tương tác đặc hiệu và có tính rhuận nghịch giữa enzim và:
Cơ chất.
Coenzim.
Chất gắn.
Chất hoạt hoá.
2. NGUYÊN TẮC CHỌN PHƯƠNG PHÁP TINH CHẾ ENZIM
Xác định enzim mong muốn là gì và chọn nguyên liệu giàu enzim.
Xác định các đặc trưng của nguyên liệu:
Bản chất của NL: lỏng, rắn
Dạng chung của NL: động vật, thực vật, VSV.
Cấu trúc sinh học của NL: tế bào VSV, tế bào thực vật.
Xác định vùng chứa enzim: ty thể, tế bào chất, màng tế bào.

Xác định các tính chất cấu trúc và lý hoá của enzim: trọng lượng PT, cấu trúc PT, hằng số động
học, tính ổn định PT, pH tối ưu, điểm đẳng điện, chất hoạt hố, chất kìm hãm…
Phải có phương pháp giải phóng protein dưới dạng hồ tan mà khơng làm mất hoạt tính của nó.
Xử lý phải thực hiện ở T thấp (+4OC); mơi trường có chất đệm; tác nhân bảo về (nếu cần như
EDTA, 2-mecaptoetanol…); thời gian xử lý ngắn.
3. CÁC PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA ĐỂ PHÂN ĐOẠN ENZIM
Kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính
Ngun tắc:
Protein hồ tan trong các dung dịch muối có pH xa với điểm đẳng điện.
Độ hoà tan của P chỉ tăng cùng với lực ion MT trong một khoảng nhất định của [muối], Nồng độ
muối cao hơn protein enzim có thể kết tủa.
Mối enzim có một khoảng [muối] mà enzim kết tủa hoàn toàn, gọi là nồng độ muối tích. Dựa vào
tính tan khác nhau mà phân đoạn enzim.
Cách tiến hành
Bổ sung vào dịch chứa enzim một thể tích muối bão hồ hoặc một lượng muối trung tính dạng rắn
để đạt được độ phần trăm bão hồ nào đó của muối này.
Nếu kết tủa là những phần tử không phải enzim mong muốn thì tách hai pha lỏng rắn và loại bỏ
kết tủa thu hồi dịch trong.
Nếu enzim cần tinh chế kết tủa thì sau khi phân tách hai pha lỏng - rắn hoà tan kết tủa trong một
lượng nhỏ dung dịch đệm.
Loại muối và cách tính lượng muối sử dụng
Muối sulfat amôn và muối sulfat natri: giá rẻ, khả năng kết tủa cao, độ hoà tan lớn, protein ít bị
biến tính, thao tác đơn giản.
Các công thức tính lượng muối cần thiết đưa vào dung dịch như sau:
Y=100(S2-S1)/1-S2; A=0.1(S2-S1)G/1-S2(Vg/1000)
Trong đó:G số gam (NH4)2SO4 trong 1000ml dung dịch bão hoà
(G = 515g ở 0oC; 530,7g ở 15oC; 536g ở 20oC.
Vg thể tích riêng biểu kiến của dung dịch (NH4)2SO4 bão
(Vg/1000 = 0,271 ở 0oC; Vg/1000 = 0,288 ở 15oC; Vg/1000 = 0,29 ở 20oC.

Y: dung dịch muối bão hoà (ml) bổ sung vào 100ml dịch enzim
A: trọng lượng muối tinh thể (g) bổ sung vào 100ml dịch enzim
S1: độ bão hoà ban đầu của dung dịch
S2: độ bão hoà của dung dịch cuối nhận được
Kết tinh enzim
Kết tủa enzim thu hồi được phân tách nhờ dung dịch muối sulfat amơn có nồng độ giảm dần ở
0oC. Các protein nhiễm tạp hoà tan ở nồng độ muối cao hơn enzim sẽ được loại ra.
Ví dụ: một enzim kết tủa trong khoảng độ bão hoà 45 – 60% sẽ được tách chiết với các dung
dịch muối bão hoà 65; 58; 52%.
Nâng nhiệt độ của các phần phân đoạn nhận được tới nhiệt độ môi trường và protein enzim kết
tinh. Qúa trình kết tinh có thể thực hiện chỉ trong một vài phút hoặc vài giờ.
Các đoạn protein enzim thu được sau đó phải được loại bỏ muối bằng phương pháp thẩm tích hoặc
phương pháp lọc gel.
Ưu nhược điểm của phương pháp
Kỹ thuật này cho phép nhận được một phần phân đoạn được làm giàu enzim từ thể tích lớn: loại
bỏ các protein, enzim liên kết hạy các tạp chất khác khơng hồ tan trước và sau phần phân đoạn có
chứa enzim cần tách chiết.
Thao tác đơn giản, dễ áp dụng nên được dùng phổ biến, nhưng khi làm việc với thể tích lớn có
nhiều khó khăn do đòi hỏi thiết bị phải chịu độ ăn mịn của muối cao (inox).
Khoảng nồng độ muối tích của các protein thường hay trùng nhau nên không bao giờ có thể thu
được các phần phân đoạn enzim tinh khiết hoàn toàn.
Thường sử dụng phương pháp này vào giai đoạn đầu của quá trình tinh chế enzim.
2. Kết tủa đẳngđiện
Nguyên tắc:
Enzim có độ hồ tan tối thiểu xung quanh điểm đẳng điện (pI), vì phân tử protein enzim có tổng
điện tích bằng khơng.
Khơng có lực đẩy tĩnh điện nên các phân tử protein enzim sẽ kết hợp với nhau tạo nên kết tủa.
Mỗi protein có một pI khác nhau phụ thuộc thành phần axit amin trong chuỗi mạch bên ion hố,
do đó kết tủa được enzim mong muốn hoặc các protein tạp khác.

Cách tiến hành
Điều chỉnh pH của dịch hỗn hợp chứa enzim tới điểm đẳng điện của enzim cần phân tách hoặc của
các protein tạp.
Lọc hay ly tâm để thu hoặc loại bỏ các kết tủa.
Ưu nhược điểm của phương pháp
Kỹ thuật đơn giản, dễ áp dụng.
Quá trình điều chỉnh pH mơi trường có thể dẫn tới biến tính protein enzim ở một vài pH.
3. Tác dụng của nhiệt độ
Ngun tắc:
Enzim có độ hồ tan tăng cùng với nhiệt độ trong giới hạn dưới 40 – 50oC.
Vượt qua ngưỡng giới hạn này protein enzim trở nên không ổn định và biến tính.
Dựa vào sự khác nhau về độ ổn định của protein enzim ở nhiệt độ cao để phân huỷ một cách chọn
lọc một số enzim nhiễm tạp.
Ưu nhược điểm của phương pháp
Kỹ thuật đòi hỏi giá thành cao.


Cần phải kiểm soát chặt chẽ để tránh tổn thất enzim mong muốn.
4. Kết tủa bằng dung môi hữu cơ
Nguyên tắc:
Dung mơi hữu cơ trung tính hồ tan trong nước sẽ làm thay đổi hằng số điện môi của dung dịch,
làm tăng lực hút tĩnh điện giữa các phân tử protein.
Khi bổ sung lượng dung mơi tăng dần thì phức hợp giữa các phân tử protein enzim tích điện trái
dấu lớn dần cho tới khi kết tủa.
Tuỳ tính chất từng loại protein enzim, dung môi hữu cơ và điều kiện kết tủa mà mỗi enzim được
kết tủa được kết tủa ở nồng độ dung môi hữu cơ khác nhau.
Protease kết tủa với etanol 76 – 78% (v/v)
-amylase kết tủa với etanol 70%; hoặc izopropanol 55%; hoặc axeton 60%.
Glucoamylase kết tủa với etanol 45%.
Ưu nhược điểm của phương pháp

Một số dung mơi sau khi sử dụng có thể chưng cất và thu hồi lại được.
Xử lý phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp (trên điểm lạnh đơng) vì dung mơi là các chất dễ cháy (5oC).
Phương pháp chr sử dụng đối với enzim ít bị biến tính bởi dung mơi hữu cơ.
Dùng với qui mơ nhỏ do chi phí cao.
5.
Kết tủa bằng các polyme có khối lượng phân tử lớn
Các polyme như dextran, polyetylen glycol thường rất háo nước sẽ làm mất lớp vỏ solvat hoá của
các phân tử protein enzim, kéo theo sự thay đổi hằng số điện môi của môi trường xung quanh, thay
đổi các tương tác không gian của các nhóm háo nước trong các phân tử protein enzim.
Polyetylen glycol ở nồng độ 5% (theo trọng lượng) trong nước có thể làm kết tủa phần lớn các
protein nồng độ 6 – 20%.
Hiệu suất kết tủa phụ thuộc vào nhiệt độ, lực ion, pH, nồng độ protein và khối lượng phân tử của
các enzim.
6. Kết tủa bằng ion kim loại và các tác nhân đặc hiệu
Liên kết ion kim loại – protein làm giảm độ hoà tan của protein.
Kỹ thuật này không áp dụng để tạo kết tủa enzim mong muốn vì phức tạo nên thường khơng phải
là thuận nghịch (dẫn suất sulhydryl) và biến tính protein enzim.
Kỹ thuật này được áp dụng để tách axit nucleic ra khỏi hỗn hợp sau khi phá vỡ tế bào VSV. Ion
kim loại (Mn+2) tạo muối kết tủa với axit nucleic và được loại ra ngoài. Axit nucleic chiếm khoảng
7% ở E. coli, có độ nhớt cao ảnh hưởng lớn tới q trình tinh chế enzim.
Axit nucliec có nhóm axit mạnh liên kết với nhóm amin cuỉa protein enzim trong mơi trường axit
làm kết tủa chúng. Bổ sung protein kiềm tính như protamin sẽ thay thế được vị trí của protein
trong phức hợp và enzim sẽ tồn tại trong dung dịch. Ly tâm để laọi bỏ phức này.
Các chất phản ứng thường sử dụng là muối mangan, sulfat streptomycin, sulfat protamin,
bromcetytrimetylamôn, polyetylenimin (polyme cationic). Kinh tế nhất là sử dụng chế phẩm enzim
nuclease (ribo và desoxyribo nuclease).
3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÁCH LỎNG - LỎNG VÀ LỎNG - RẮN
Phân tách lỏng - lỏng
Phân tách trong dung dịch có hai polyme khơng trộn lẫn nhau
Hai polyme tự phân thành hai pha phân biệt nhau, mỗi pha hoà tan được một trong các protein.

Sự phân tách phụ thuộc vào khối lượng phân tử và nồng độ của các polyme; khối lượng phân tử
của protein; nhiệt độ và lực ion.


Hệ dung mơi sử dụng có thể là polyetylen glycol/ dextran hay polyetylen glycol/ sulfat amơn.
Phương pháp này ít được sử dụng trong công nghiệp do giá thành cao.
Phân tách dựa vào sự thay đổi tính hồ tan
Thay đổi pH: kết tủa ở điểm đẳng điện.
Thay đổi lực ion: kết tủa bằng muối trung tính.
Làm giảm hằng số điện mơi: dung mơi hữu cơ hồ tan trong nước.
Phân tách dựa vào điện tích: điện di, sắc ký trao đổi ion.
Phân tách dựa vào khối lượng phân tử: ly tâm, lọc gel, thẩm tích, siêu lọc.
Phân tách dựa vào vị trí liên kết đặc hiệu bề mặt: sắc ký ái lực.
Phân tách dựa vào tính ổn định: tác động nhiệt, axit hoặc kiềm.
2.Phân tách lỏng - rắn
Thu nhận enzim hoặc loại bỏ các phần tử rắn (mảnh tế bào hay các phần tử khác), sau đó tiến hành
các xử lý khác.
Sử dụng các phương pháp lọc (lọc ép) hay ly tâm: cần chú ý tới các yếu tố ảnh hưởng tới enzim
(sự tạo bọt, oxy hoá enzim, năng lượng và ma sát sinh ra ở tốc độ lớn
Phân tách sử dụng màng
Loại bỏ các phần tử hồ tan nhỏ khơng mong muốn ra khỏi phần kết tủa enzim thu nhận được
(sulfat amơn) bằng các phương pháp khác nhau:
Phương pháp thẩm tích:
Túi thẩm tích chứa dịch chiết enzim. Túi được cấu tạo bằng một màng bán thấm (selophan).
Đặt túi trong thể tích lớn dung dịch đệm khơng chứa chất hồ tan cần loại bỏ.
Chất hoà tan khuếch tán ra khỏi màng theo chiều gradient nồng độ cho đến khi đạt trạng thái cân
bằng.
Thay dung dich đệm mới cho tới khi đạt độ tinh sạch mong muốn.
Phương pháp trường điện: chất hoà tan dịch chuyển do trường điện.
Phương pháp tác động áp suất lên dung dịch phía trước màng lọc: dung mơi đi qua (thẩm thấu

ngược); các phần tử nhỏ đi qua (siêu lọc). Phương pháp sử dụng vào cuối QT tinh chế để loại bỏ
các tác nhân tách rửa (sắc ký).
4. CÁC PHƯƠNG PHÁP sắc ký
Các khái niệm về sắc ký
Nguyên tắc : Sự phân tách có được nhờ sự chuyển dịch khác nhau trong pha động của các chất
hoà tan ban đầu được gắn trên pha tĩnh ở trạng thái rắn.
Pha tĩnh: khả năng gắn các chất hoà tan phải lớn. Tương tác giữa CHT và pha tĩnh là kết quả của
cơ chế hấp phụ, phân chia, tương tác ion, rây lọc phân tử, tương tác kỵ nước hay tương tác sinh
học đặc hiệu.
SK hấp phụ: CHT gắn vào pha tĩnh bằng LK kỵ nước; lực Van der Waals.
SK trao đổi ion: CHT gắn vào pha tĩnh bằng LK ion giữa các điện tích của CHT và pha tĩnh.
SK lọc gel: CHT khuếch tán vào trong pha tĩnh có dạng hạt xốp tuỳ theo kích thước các phân tử.
SK kỵ nước: Phần kỵ nước trong CHT tạo LK với phần kỵ nước của pha tĩnh.
SK đặc hiệu sinh học: CHT và pha tĩnh có liên kết sinh học đặc hiệu enzim – cơ chất; kháng
nguyên – kháng thể.
Pha động: chất lỏng có khả năng làm thay đổi dần tương tác giữa CHT và pha tĩnh, bằng cách lôi
cuốn CHT cùng với nó.


Sắc ký lọc gel
Nguyên tắc : Khi dung dịch hỗn hợp protein chảy qua cột tuỳ theo khối lượng, kích thước và hình
dạng của CHT chúng sẽ xâm nhập nhiều hay ít vào trong pha tĩnh xốp (là các hạt gel xốp chứa đầy
trong cột).
Các phân tử có đường kính lớn hơn lỗ xốp của pha tĩnh, không thể kuếch tán vào trong nên bị loại
trừ, chúng ra khỏi cột cùng với thể tích rửa bằng thể tích giữa các hạt gel Vo.
Các phân tử bé nhất sẽ kuếch tán tối đa vào trong hạt gel. Thể tích dịch rửa của chúng sẽ bằng tổng
thể tích pha lỏng của cột (Vt).
Các phân tử có kích thước trung gian sẽ khuếch tán hạn chế vào trong hạt.thể bỏ qua nêu các
protein trong hỗn hợp đều là hình cầu.
Phân đoạn hỗn hợp protein theo khối lượng, kích thước và hình dạng phân tử

Mức độ phân tách rộng hẹp khác nhau tuỳ theo mức độ tạo mạng của gel.
Kích thước phân tử càng nhỏ, đường đi càng lớn, thể tích dịch rửa càng lớn.
Chất rửa cột sắc ký thu hồi trong các bình chứa được kết nối với detecteur UV.
Gel Sephadex
Gel Sephadex là một loại bột khô, không tan trong nước, nhưng khi ngâm trương ra và tạo thành
gel.
Gel Sephadex bền trong MT axit yếu, kiềm yếu. Liên kết glucozit trong gel sẽ bị thuỷ phân trong
MT axit / hoặc kiềm mạnh.
Đặc tính gel của Sephadex như sau:
gel dextran có liên kết ngang giữa các mạch polysacarit với nhau tạo thành mạng lưới ba chiều.
Gel trung hồ về điện tích nên khơng có tương tác anion và cation.
Mức độ liên kết ngang quyết định kích thước mắt lưới. Nếu ít liên kết thì mắt lưới lớn, ngậm nứoc
nhiều và ngưộc lại.
Tuỳ thuộc mức độ liên kết chia gel Sephadex làm các loại
Một số gel khác
Gel Sepharose và Superose: dẫn suất của agarose.
Gel Sephacryl: dẫn suất của dextran.
Gel Gel Ultrogel: hỗn hợp dẫn suất của agarose và polyacrylamit có liên kết ngang.
Kích thước lỗ lớn để tách enzim có khói lượng PT cao trên 75.000 Da với vận tốc dòng cao.
Gel chịu nén kém nên không sử dụng với chiều cao cột lớn.
Sắc ký trao đổi ion
Nguyên tắc
Sử dụng tính chất lưỡng tính của protein enzim đại phân tử với nhiều nhóm chức tích điện và có
tính chất như polyelectrode. Nếu sử dụng vật liệu mang điện tích trái dấu với điện tích của protein
cần tách sẽ giữ lại được protein cần tách. Ngược lại sẽ giữ protein nhiễm tạp.
Các protein của hỗn hợp có các nhóm bên ion hố khác nhau, do đó ở một pH nhất định các
protein sẽ có điện tích không giống nhau. Kảh năng được giữ trên nhựa khác nhau.
Chất mang

Nhựa trao đổi ion: là khung vật liệu rắn không hồ tan, trên đó có gắn bằng liên kết đồng hố trị
với các nhóm ion hố được. Các nhóm này lại liên kết với các ion đối và các ion đối lại có thể trao
đỏi thuận nghịch với các ion trái dấu.
Khung mang nhóm tích điện dương và ion đối điện tích âm được gopị là nhựa trao đổi anion.
Khung mang nhóm tích điện âm và ion đối tích điện dương gọi là nhựa trao đổi cation.
Nhựa trao đổi ion có bản chất hố học khác nhau nhằm đáp ứng mọt số đặc tính cần thiết: độ xốp
lớn, háo nước, chịu lực cao, khả năng giữ nước cao, độ phân tách cao, có tính ổn định hố học và
nhiệt, kết quả phân tách ổn định, độ bền cột cao.
Sắc ký tương tác kỵ nước
Nguyên tắc
Các protein có nhóm kỵ nước trên bề mặt, chất mang có chứa nhóm kỵ nước và dung môi ưa nước
tạo thành hệ ba thành phần và tương tác với nhau. Các phân tử được phân tách tuỳ theo mức độ
tương tác của chúng với chất mang.
Hệ thống ba thành phần có thể bị rối loạn khi thay đổi nhiệt độ, pH, lực ion ...
Nâng cao lực ion (dung dịch NaCl 4M) sẽ giữ các protein lại. Tiến hành rửa giải chọn lọc bằng
một trong các cách:
Giảm lực ion
Giảm độ phân cực của dung môi rửa (bổ sung etylen glycol; bổ sung chất tẩy rửa hay tăng pH dịch
rửa.
Chất mang
Sắc ký hấp phụ không đặc hiệu
Nguyên tắc
Sắc ký ái lực
Nguyên tắc
Enzim có khả năng liên kết đặc hiệu và thuận nghịch với một phân tử khác (phối tử), đã
được gắn bằng LK đồng hoá trị vào một chất mang khơng hồ tan chứa trong cột, cho phép giữ lại
một cách đặc hiệu enzim cần tách từ hỗn hợp protein, trong khi tất cả các protein không tương tác
với phối tử sẽ trôi ra khỏi cột. Cuối cùn enzim được rửa giải ra bằng các phương pháp khác nhau.
Chất mang
Phối tử

Những chất tương tự cơ chất; chất kìm hãm; cofactơ (ít đặc hiệu) của enzim muốn làm sạch.
Phải đặc hiệu với enzim và có ái lực trung bình với enzim.
Nồng độ phối tử thích hợp.
Cánh tay địn
Cấu tạo từ một mạch hydrocacbon nhị chức có chiều dài 6 – 8 cacbon.
Cánh tay đòn ngắn nhất là axit aminocaproic và hexametylamin.
Hoạt hoá chất mang
Phối tử và cánh tay đòn phải được gắn lên chất mang.
Chất mang trước tiên phải được hoạt hoá.
Chọn phương pháp hoạt hoá tuỳ thuộc vào phối tử và bản chất của nhóm chức hố học muốn gắn
phối tử.
Phương pháp loại rửa
Sử dụng một chất cạnh tranh để rửa giải enzim khỏi cột do phức hợp giữa enzim - phối tử có
bản chất phi đồng hoá trị và thuận nghịch. Dung dịch rửa giải phải có một trong những tính chất
sau:


Chứa phối tử (ở dạng tự do) có thể cạnh tranh với phối tử đạng LK với enzim.
pH của dung dịch gây biến tính thuận nghịch enzim, làm biến dạng TTHĐ enzim.
Làm yếu tương tác đặc hiệu sinh học bằng cách thay đổi lực ion.
Một số sắc ký biến thể của sắc ký ái lực
Sắc ký với phối tử là thuốc nhuộm
Phối tử là thuốc nhuộm sợi tổng hợp được gắn đồng hố trị vào agarose có khả năng hấp phụ các
enzim có cofactơ nucleic.
Các thuốc nhuộm thường sử dụng là cibacron xanh, procion đỏ, da cam A, xanh lá cây A, xanh lục
B.
Cơ chế chưa rõ ràng, xong có sự kìm hãm cạnh tranh giữa thuốc nhuộm và các enzim có cofactơ
này.
Kỹ thuật này có phối tử rất rẻ tiền và chất mang có thể sử dụng nhiều lần.
Sắc ký ái lực chelat kim loại

Phối tử là các ion kim loại nặng tương tác với các gốc cystein (nhóm tiol) và histidin (nhóm
imidazol) của protein.
Phối tử là các ion Zn+2 và Cu+2 tạo phức càng cua với axit iminoaxetic vốn đã được kết gắn vào
chất mang agarose.
Nhả hấp phụ thực hiện bằng cách giảm pH hoặc tăng lực ion của dịch đệm rửa giải.
CHƯƠNG 5. Ứng dụng các chế phẩm enzim trong CNTP
Enzim điều chỉnh những khiếm khuyết tự nhiên của nguyên liệu:
Chất lượng nguyên liệu nông sản phụ thuộc vào các yếu tố thời tiết, điều kiện kỹ thuật canh tác, loại cây trồng…
Sử dụng các nguyên liệu khác thay thế nguyên liệu chính.
Enzim bản thể trong nguyên liệu bị vô hoạt do xử lý công nghệ: thanh trùng.
Enzim là cơng cụ cơng nghệ của các q trình chuyển hoá:
Sản xuất đường glucoza từ tinh bột.
Sản xuất rượu và bia.
Sản xuất phomat.

Enzim là công cụ nâng cao giá trị của nguyên liệu:
Sản xuất đường hoặc rượu từ tinh bột.
Sản xuất cyclodextrin từ tinh bột.
Sản xuất bia sử dụng nguyên liệu thay thế malt đại mạch.
Enzim là công cụ cải thiện chất lượng của sản phẩm:
Izomerase cải thiện độ ngọt và giảm khả năng hấp thu của glucoza.
Papain (protease) tăng độ mềm của thịt.
Protease trung tính tăng chất lượng gluten của bột mì.
Enzim là cơng cụ tăng giá trị các phụ phẩm của chế biến thực phẩm.
Sản phẩm thuỷ phân làm chất độn giống thịt.
Sản phẩm thuỷ phân như nước hầm xương thịt.
Sản phẩm thức ăn gia súc từ phụ phẩm của nhà máy chế biến thuỷ hải sản.
2. TIÊU CHÍ CHỌN ENZIM TRONG CƠNG NGHIỆP THỰC PHẨM
Độ hoạt động của enzim
Mối quan hệ giữa các điều kiện sử dụng và đặc tính của chế phẩm:

pH của mơi trường và pH tối ưu của enzim.
Nhiệt độ môi trường với hoạt lực của enzim
Thời gian tác dụng của enzim
Sự có mặt của các chất hoạt hố và kìm hãm của enzim.
Ảnh hưởng của các chất bổ sung trong quá trình cơng nghệ.
Tính đặc hiệu của enzim
Xác định tính đặc hiệu của enzim trong điều kiện công nghệ ứng dụng.


Xác định các hoạt tính phụ của chế phẩm.
Điều kiện ứng dụng chế phẩm enzim
Lựa chọn chế phẩm enzim dựa trên chất lượng và liều lượng chế phẩm enzim sử dụng.
Mức độ thay đổi dây chuyền công nghệ khi sử dụng chế phẩm.
Khả năng cung ứng chế phẩm enzim.
3. ỨNG DỤNG CÁC CHẾ PHẨM ENZIM TRONG CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỊT CÁ
Hệ enzim protease
Định nghĩa
Enzim thuộc hệ này xúc tác thuỷ phân liên kết peptit trong các peptit hoặc protein theo phản ứng
sau:
-CH-C-N-CH- + H2O
-CH-C-OH + HN-CHR O H R’
R O H R’
Phân loại
Theo nhóm chức hoạt động chủ yếu của TTHĐ
Nhóm
Đặc điểm TTHĐ
pHopt
Protease xerin
Xerin

Kiềm
Protease tiol
-SH
7,0 – 7,5
Protease kim loại
Kim loại hố trị 2
Trung tính
Protease axit
-COOH
axit
Theo tính đặc hiệu
Aminopeptidase xúc tác thuỷ phân LK ở đầu nitơ
Cacboxypeptidase xúc tác thuỷ phân LK ở đầu cacboxyl
Dipeptit hydrolase xúc tác thuỷ phân các dipeptit
Peptidil hydrolase xúc tác thủ phân các LK peptit nội mạch
Công nghệ làm mềm thịt
Chế phẩm papain: chứa enzim protease đơn cấu tử, TTHĐ chứa nhóm –SH tồn tại dưới 02 dạng
+ 2H
Pa – S – S – Pa
- 2H

PaSH + PaSH
Dạng oxy hố
(khơng hoạt động)

Dạng khử
(Hoạt động)

Ổn định ở pH = 5,0.
Nhiệt độ hoạt động tối ưu: 40 – 50oC, vơ hoạt khi vượt q 80oC.

Hoạt hố bởi tác nhân khử: hỗn hợp cystein 0,05M và EDTA 0,001M cho kết quả tốt nhất.
Khơng hoạt động khi có mặt chất oxy hoá.
Muối làm mềm thịt:
30g papain/ 1 kg muối ăn
Tiêm chế phẩm enzim trước khi giết mổ
Tiêm chế phẩm enzim sau khi giết mổ
Tăng giá trị các sản phẩm phụ của thịt
Sản phẩm thuỷ phân làm chất độn giống thịt và nước hầm xương
Mục đích cơng nghệ
Bổ sung chất thuỷ phân cho phép nhận được sản phẩm đồng nhất hơn.
Nhờ tính keo dính của chất thuỷ phân, khối thịt nhận được sau phối trộn không tiết nước, chắc hơn và dễ cắt miếng
hơn.
Tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân bố hương vào khối thịt.
Phối trộn với các loại rau thơm để tăng hương vị của các loại súp sấy khơ, đóng hộp, các loại nước sốt…
Sản xuất protein thực vật thuỷ phân
Sản phẩm thuỷ phân dùng thay sữa mẹ

Chế phẩm enzim sử dụng là Flavourzym.


Nguyên liệu thuỷ phân là cazein và protein của lúa mì.
Mức độ thuỷ phân trên 50%.
Sản xuất nước chấm mazi
Sử dụng các chế phẩm enzim trong công nghệ chế biến cá
Sản xuất nước mắm

Sử dụng Bromelin (0,8%, cofactơ cystein 0,025M): lên men ở 33oC trong 21 ngày. Sản phẩm nhận
được ít có vị đắng.
Sử dụng hỗn hợp trypsin và chymotrypsin (50:50; 0,3%): lên men ở 37 oC trong 02 tháng. Sản
phẩm nhận được giữ được hương vị theo yêu cầu của nước mắm sản xuất theo phương pháp truyền

thống.
Sản xuất bột cá nhạt
Sử dụng chế phẩm enzim trong công nghệ chế biến sữa
Đông tụ sữa trong sản xuất phomat
Sử dụng chế phẩm Renin chứa protease tách chiết từ dịch vị dạ dày bị non.
Thuỷ phân casein K tại vị trí Phe 105 – met 106 tạo ra phần khơng hồ tan paracassein K.
Khi > 85% casein K được thuỷ phân và với sự có mặt của ion Ca+2 chúng sẽ tụ tập lại tạo gel đơng tụ.
Thúc đẩy q trình lên men phomat
Bổ sung enzim trực tiếp vào sữa tươi

Phân bố đồng đều enzim trong q trình tạo vẩy.
Protease hồ tan trong nước và phần lớn enzim bổ sung nằm lại trong sữa trong.
Tạo ra sự thuỷ phân protein quá sớm nên tạo nhiều peptit đắng trong quá trình ủ chín.
Bổ sung enzim trực tiếp vào phomat vẩy sữa
Khó phân bố đồng đều enzim trong toàn khối vấy sữa
Bổ sung enzim được bao bọc vào sữa

Protease được gói trong liposom, đường kính bao 0,2 – 4,5 m.
Protease được giải phóng dần nhờ sự thuỷ phân các liposom trong vẩy sữa. Tránh được sự thuỷ
phân quá sớm protein.
Ứng dụng của một số chế phẩm enzim khác
Lactase ( -D-galactozit galactohydrolase) xúc tác thuỷ phân lactose thành glucose và galactose: giảm mức
độ kết tinh và làm tăng độ ngọt của sữa có nồng độ cao.
Glucooxydase xúc tác oxy hoá glucoza thành axit gluconic, giảm pH tạo nên kết tủa đẳng điện casein cho ta
sản phẩm sữa chua đặc.
Glucoizomerase xúc tác đồng phân hoá glucoza thành fructoza tạo ra sản phẩm sữa ngọt hơn.
Lactoperoxydase (LP) nằm trong hệ thống sát khuẩn (LTP):
Lactoperoxydase - thioxyanat - hydroxyperoxyt
LP
SCN+

H2O2
OSCN- + H2O
Thiocyanat
Hydroperoxyt
Hypothiocyanit
Một lít sữa bị chứa 10 – 30 mg LP. Khơng phải là yếu tố kìm hãm hệ thống.
H2O2 được tích tụ thơng qua chuyển hố oxygen của một số loại vi khuẩn Lactococcus. Cần bổ sung vào sữa tươi.
Thiocyanat (SCN-) dao động 1 – 10 ppm trong sữa bò. Cần bổ sung vào sữa tươi dưới dạng muối thiocyanat.

Enzim amilase
Định nghĩa
Enzim xúc tác thuỷ phân các liên kết glucozit trong chuỗi polysacarit và tinh bột theo sơ đồ
sau:
-amilase
R – O – R’ + H2O
ROH + R’OH


Phân loại
Hệ amilase được phân thành các nhóm:
Amilase thuỷ phân các liên kết -1,4 glucozit của tinh bột và các oligosacarit cùng loại: amilase; -amilase; -amilase.
Amilase thuỷ phân các liên kết -1,6 glucozit trong các polysacarit và các dextrin cuối: dextrin-6glucanhydrolase, amilopectin-6-glucan hydrolase và oligodextrin-6-glucanhydrolase.
Enzim -amilase (-1,4 glucan-glucanhydrolase)
Enzim xúc tác thuỷ phân các LK -1,4 glucozit bên trong chuỗi mạch polysacarit một cách
ngẫu nhiên không theo một trật tự nào cả.
Đặc tính sinh hố:
Enzim cơ kim: trong phân tử enzim có chứa tới 30 ngun tử canxi.
Enzim bị vơ hoạt bởi các ion kim loại nặng: Ag+, Hg+, Cu+2…
Enzim có nguồn gốc khác nhau có tính đặc hiệu sinh học khác nhau.
Enzim có khả năng thuỷ phân tinh bột ở trạng thái hạt.

Cơ chế tác dụng:
-amilase
Tinh bột + H2O
-dextrin + maltoza + glucoza
(nhiều)
(ít)
Q trình thuỷ phân tinh bột
Giai đoạn 1 (dextrin hoá): Chỉ một số LK trong phân tử bị thuỷ phân tạo thành lượng lớn dextrin
PTL thấp. Độ nhớt hồ tinh bột giảm nhanh.
Giaiđoạn 2 (đường hoá): Các dextrin PTL thấp vừa tạo thành bị thuỷ phân tiếp tạo ra các tetra-;
trimaltoza. Sau đó chúng bị thuỷ phân rất chậm tới di- và monosacarit.
Sản phẩm cuối cùng sau thuỷ phân
Đối với amiloza: 13% glucoza và 87% maltoza.
Đối với amilopectin: 72% maltoza, 19% glucoza, izomaltoza và dextrin PTL thấp 8 - 10%.
Một số enzim khác
Enzim cyclodextrin glucantransferase
Enzim xúc tác chuyển hoá các mạch thẳng của tinh bột thành phân tử mạch vịng
cyclodextrin. Có ba dạng cyclodextrin được tạo thành -cyclodextrin, -cyclodextrin và cyclodextrin.
Đặc tính sinh hố
Enzim hoạt động tối ưu ở T = 50 – 70oC; pH = 5,0 – 7,0.
Nguồn gốc và điều kiện tác dụng của enzim ảnh hưởng nhiều tới tỷ lệ các cyclodextrin tạo thành.
Cơ chế tác dụng
Enzim xúc tác ít ra 3 phản ứng trong q trình tạo vịng:
Tạo vịng từ các phân tử mạch dài
Gn
G(n – x) + Cyclo Gx
Nối mạch hay liên kết các oligosacarit
Cyclo Gn + A
Gn + A
Tạo sự không cân xứng

Gn + Gm
G(n – x) + G(m + x)
Enzim invectase
Enzim xúc tác thuỷ phân đường sacaroza thành glucoza và fructoza.
Enzim hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 55oC. pH thích hợp trong khoảng 4,5 – 5,5.


Chất kìm hãm hoạt độ enzim là Ag+, Cu+2, Hg+, Cd+2. Enzim vơ hoạt hồn tồn khi có 7 – 8
Ag+/mol enzim.
Tốc độ thuỷ phân đạt tối đa khi nồng độ đường sacaroza 2 – 8%.
Enzim glucoizomerase
Enzim xúc tác đồng phân hoá glucoza thành fructoza
Ứng dụng các chế phẩm enzim
Ứng dụng trong cơng nghệ sản xuất đường từ tinh bột
Tính ưu việt của cơng nghệ có sử dụng chế phẩm enzim
Không cần xử lý nguyên liệu ban đầu.
Chế độ công nhệ mềm dẻo, kinh phí đầu tư thiết bị thấp.
Ít tạo ra các sản phẩm phụ, hiệu suất thu hồi sản phẩm cao.
Xử lý sản phẩm sau thuỷ phân đơn giản.
Đa dạng hố các sản phẩm từ tinh bột.
Tính ưu việt của các sản phẩm
Fructoza có độ ngọt gấp 1,6 lần sacaroza, nhưng độ hấp thụ rất thấp.
Manitol và socbitol có độ ngọt khoảng 50 – 60% so với sacaroza, độ hồ tan gần với sacaroza,
Điểm nóng chảy và Nhiệt tan có giá trị thấp hơn sacaroza nhiều.
Sản xuất mứt quả: giữ được cấu trúc mứt, chống kết dính trong quá trình bảo quản, cải thiện khả
năng giữ ẩm.
Sản xuất kẹo cao su: thay thế đường tạo vị ngọt và tạo độ dẻo cho kẹo.
Sản xuất kẹo socolat: sử dụng dạng bột để thay thế toàn bộ đường.
Sản xuất các loại bánh ngọt: Tăng khả năng giữ nước, tránh khô bánh quá nhanh.
Sản xuất kem: Ngăn cản quá trình tạo tinh thể, cải thiện chất lượng sản phẩm và cấu trúc kem.

Ứng dụng trong cơng nghệ sản xuất bánh mì
Sử dụng chế phẩm enzim a-amilase từ nấm mốc: thuỷ phân hạn chế tinh bột, tạo lượng
đường cần thiết cho nấm men phát triển
Enzim từ nấm mốc có hoạt tính đường hố trội hơn từ vi khuẩn.
Enzim có khoảng pH thích hợp nằm trong vùng axit yếu thích hợp với mơi trường lên men bột
nhào.
Enzim nhạy cảm với nhiệt độ. Nhiệt độ tới hạn của enzim 70 – 80oC, nêm bị vô hoạt ngay khi
nâng nhiệt độ, tránh thuỷ phân sâu sắc ảnh hưởng tới chất lượng bánh.
Sử dụng chế phẩm enzim protease
Bổ sung protease axit vào thời điểm lên men.
Thuỷ phân hạn chế protein (< 10%) cho phép thay đổi tính chất đàn hồi của gluten, làm mềm
mạng lưới gluten.
Bổ sung đồng thời chế phẩm amilase và protease cho phép tăng hiệu quả tác dụng của protease vì
enzim dễ tiếp cận với cơ chất hơn.
Ứng dụng innvectase trong SX nước giải khát, bánh kẹo
Sản xuất nước giải khát: thuỷ phân một phần đường sacaroza sẽ làm giảm nguy cơ kết tinh đường
nâng cao nồng độ của siro sử dụng để bổ sung vào nước giải khát.
Sản xuất bánh, mứt, kẹo: thuỷ phân một phần sacaroza tránh nguy cơ kết tinh đường trở lại (hiện
tượng hồi đường) làm giảm chất lượng sản phẩm theo thời gian bảo quản.
Ứng dụng CD sản xuất từ enzim CTGase
Trong CNTP và hương liệu:


Bảo vệ chất màu, chất thơm, chất dễ oxy hoá; giữ độ ổn định của sản phẩm theo thời gian bảo
quản.
Trộn CD với dầu béo để tách cholesterol khỏi các sản phẩm dầu (HS tách 80%) hoặc loại bỏ các
axit béo khỏi dầu; Sử dụng -CD để loại bỏ chất béo khỏi sữa; Sử dụng-CD (1%) trong sản xuất
nước quả và rau đóng hộp để loại bỏ tác dụng của các hợp chất phenol.
Tăng độ hoà tan của một số chất có lợi cho sức khoẻ nhưng lại khó hồ tan như flavonoit và
terpenoit.

Trong một số ngành khác
Công nghiệp dược: tăng độ hoà tan, độ bền, độ hấp thụ, giảm tác dụng phụ của thuốc. Sử dụng CD
trong SX thuốc giảm đau, chống nhiễm trùng, chống di ứng, lợi tiểu…
Nông nghiệp: tăng độ bền, độ hồ tan của các hố chất bảo vệ thực vật như thuốc diệt cỏ, thuốc trừ
sâu, thuốc trừ nấm… Sử lý mầm ngũ cốc với -CD tăng năng suất cây trồng.
Công ngiệp mỹ phẩm: tăng độ ổn định, độ hồ tan và kiểm sốt hương thơm trong sản xuất kem
đánh răng (tricloran - chất kháng khuẩn), kem dưỡng da (giảm khả năng kích ứng da), giấy vệ
sinh. Sử dụng CD trong các sản phẩm khử mùi cơ thể hoặc trong các sản phẩm chăm sóc tóc làm
giảm khả năng bay hơi của mercaptan có mùi khó chịu.
Trong phân tích: CD được sử dụng để làm phối tử cho pha tĩnh trong sắc ký điện di, sắc ký trao
đổi ion, sắc ký ái lực…
Trong xử lý môi trường: CD sử dụng để loại bỏ các chất ô nhiễm hữu cơ trong nước thải, loại bỏ
dư lượng các chất bảo vệ thực vật ô nhiễm trong nước.
5. ENZIM TRONG CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN NGUYÊN LIỆU GIÀU PECTIN
Hợp chất pectin
Khối lượng phân tử của pectin thường dao động từ 20.000 tới 200.000 phụ thuộc vào nguồn
pectin.
Vai trò của hợp chất pectin
Tính chất lý hố học của tế bào quả.
Khả năng giữ nước của quả. Khả năng tách chiết dịch quả.
Trong dung dịch có ảnh hưởng tới khả năng lọc và cơ đặc.
Phân loại
Protopectin: có cấu tạo hố học rất phức tạp. Protopectin chứa phân tử pectin; xenluloza; các ion
Ca, Mg; các gốc axit photphoric, axetic và đường khử. Protopectin tạo độ cứng cho quả xanh.
Pectin hay pectin hoà tan: là este metilic của hợp chất axit polygalacturonic cao phân tử. Pectin tự
nhiên có khoảng 2/3 nhóm cacboxyl được metoxy hoá. Mức độ metoxy hoá cao tạo ra khả năng
tạo gel trong dung dịch có nồng độ đường 65% và môi trường axit.
Axit pectinic: là phân tử axit polygalacturonic cao phân tử trong đó một phần nhỏ các nhóm
cacboxyl được este hoá bởi metanol.
Axit pectic: là phân tử axit polygalacturonic cao phân tử được giải phóng hồn tồn khỏi nhóm

metoxy. Nghĩa là có một nhóm cacboxyl tự do trên mỗi đơn vị axit galacturonic.
Hệ enzim pectinase
Enzim xúc tác phân giải các hợp chất pectin, làm giảm khối lượng phân tử và giảm độ nhớt
của dung dịch chứa pectin.
Phân loại hệ enzim pectinase
Enzim phân giải vùng “trơn bóng”
Enzim thuộc nhóm này phân giải các đoạn mạch chỉ chứa các chuỗi polygalacturonic.
Người ta phân chúng thành 03 nhóm nhỏ: pectinesterase; polygalacturonase và transeliminase.


Pectinesterase (Pectimetylhydrolase; PE): enzim thuộc nhóm này xúc tác thuỷ phân đề metoxy
hoá hợp chất pectin. Sản phẩm thuỷ phân là hợp chất metanol và các gốc cacboxyl tự do xuất hiện
trong chuỗi mạch polygalacturonic.
Cơ chế xúc tác:
Đặc tính sinh hoá
Enzim thu nhận từ nấm mốc, vi khuẩn và thực vật.
Enzim từ nấm mốc có pHopt= 4,5 – 5,5; Topt = 30 – 45oC và Tth= 55 – 60oC. Enzim tác dụng tới các
nhóm metoxy một cách ngẫu nhiên.
Enzim từ thực vật có pHopt = 5,0 – 8,0. Enzim tác dụng lên các nhóm metoxy đứng ngay cạnh gốc
có nhóm cacboxyl tự do.
Hoạt độ enzim tăng lên khi có mặt của ion Ca+2 và Mg+2.
Cơ chế tác dụng
Transeliminase (TE)
Enzim thuộc nhóm này phân cắt phi thuỷ phân các hợp chất pectin với việc tạo ra nối kép
trong gốc galacturonic giữa nguyên tử cacbon số 4 và số 5 ở đầu khơng khử vừa được giải phóng.
Cơ chế tác dụng
SƠ ĐỒ PHÂN LOẠI ENZIM PECTINASE
Enzim phân giải vùng “gai góc”
Enzim phân giải các vùng nhánh của pectin được tạo nên từ một khung xương
Rhamnogalacturonic mang các nhóm axetyl và các mạch bên trung tính (arabinoza hay galactoza).

Rhamnogalacturonase: enzim thuộc nhóm này thuỷ phân liên kết glucozit giữa Rhamnoza và
axit galacturonic giải phóng ra các oligome. Enzim này được sinh tổng hợp từ nấm mốc, đặc biệt
từ Aspergillus.
Esterase: Enzim thuộc nhóm này xúc tác thuỷ phân các liên kết giữa nhóm axetyl với vùng
Rhamnnogalacturonic và giải phóng ra các axetyl.
Arabinase: Enzim phân giải một cách ngẫu nhiên liên kết a-1,5 giữa hai gốc arabinoza nằm trong
đoạn arabinan giải phóng ra các monome-; dime- và trime arabinoza.
Galactanase: Enzim thuỷ phân liên kết nối gốc galactoza bên trong mạch galactan hoặc
arabinogalactan loại I và loại II. Enzim được sinh tổng hợp từ nấm mốc và thực vật.
Ứng dụng chế phẩm enzim pectinase trong Công nghệ chế biến rau và quả
Một số chế phẩm enzim pectolytic
Pectinex Ultra- SPL
Sản xuất từ một chủng chọn lọc Asp. Niger.
Màu thẫm, mùi thơm đặc trưng của sản phẩm lên men.
Chứa chủ yếu enzim pectinase và có hoạt tính nhất định của hemixenlulase. Enzim xúc tác
phân huỷ màng tế bào thực vật giải phóng dịch quả khỏi các khoang tế bào.
Sử dụng trong quá trình xử lý nguyên liệu để ép tách dịch quả.
Pectinex 3XL và Pectinex AR
Sản xuất từ một chủng chọn lọc Asp. Niger.
Màu thẫm, mùi thơm đặc trưng của sản phẩm lên men.
Chứa chủ yếu enzim pectinase, Có khả năng thuỷ phân hồn tồn araban thành arabinoza;
thuỷ phân hoàn toàn các hợp chất polysacarit.
Sử dụng trong quá trình xử lý làm trong dịch quả.
Ép chiết dịch quả
Phá vỡ thành tế bào quả, tạo điều kiện cho dịch quả thốt ra ngồi, tăng hiệu suất thu hồi dịch quả.


Phá huỷ sâu tế bào quả tạo điều kiện trích ly các chất màu và chất thơm của quả, tăng giá trị cảm
quan của sản phẩm ép.
Phân cắt các hợp chất pectin làm giảm độ nhớt của dịch quả ép tạo thuận lợi cho quá trình lọc ép

thu hồi dịch quả và làm trong dịch quả ép.
Ngâm dầm và ổn định nectar
Nectar là loại nước uống đậm đặc có độ nhớt cao, chứa một lượng lớn các hợp chất ở dạng huyền
phù, đặc biệt là các hợp chất pectin.
Pectin có độ metoxy hoá thấp sẽ kết hợp với canxi tạo kết tủa pectat canxi, làm giảm chất lượng
sản phẩm.
Cần sử dụng chế phẩm enzim PMG, tránh sự có mặt của enzim PE để tăng độ hoà tan của các hợp
chất pectin và hiệu suất xúc tác của enzim PG.
Dịch hoá - nước quả đục
Nước quả đục chứa các hợp chất hồ tan trong thịt quả. Địi hỏi phá vỡ triệt để thành tế bào quả.
Cần có tác dụng đồng thời của pectinase và xenlulase.
Để đảm bảo độ đồng thể của dịch quả cần có độ nhớt cao. Khơng được phân cắt quá nhỏ các hợp
chất pectin. Không sử dụng chế phẩm enzim endo-PG. Cần có tác dụng đồng thời của enzim TE,
xenlulase và hemixenlulase.
Làm trong dịch quả
Nguyên tắc làm trong: các phẩn tử gây đục trong dịch quả được cấu thành bởi protein (ở pH của
dịch quả) tích điện dương được bao quanh bởi các lớp pectin tích điện âm. Khi phân huỷ pectin sẽ
giải phóng ra một phần protein tích điện dương. Phần này sẽ tương tác tĩnh điện với pectin tích
điện âm tạo kết tủa.
Kết tủa các phần tử gây đục được chia làm 03 giai đoạn:
Giai đoạn bất ổn: giảm độ nhớt sâu sắc, gọi là trạng thái phá vỡ.
Giai đoạn kết lắng: bắt đầu từ trạng thái phá vỡ đên khi kết tủa hoàn toàn.
Giai đoạn cuối cùng: kết thúc giai đoạn pectin phân, đặc trưng bằng sự vắng mặt kết tủa
pectin với canxi.
Xử lý enzim các hợp chất gluxit trong chế biến nước quả
A: Pectinase hỗ trợ ép
B: pectinase hỗ trợ chiết rút
C: Pectinase + xenlulase
D: Pectinase làm trong

5. ENZIM TRONG CÔNG NGHỆ ĐỒ UỐNG
Một số chế phẩm enzim thương mại
Termamyl 120L
Chế phẩm dạng lỏng, màu nâu, chứa enzim -amilase được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus
licheniformis.
Sản phẩm thuỷ phân chứa chủ yếu là các dextrin phân tử lượng thấp.
Chế phẩm chứa enzim chịu nhiệt: Topt = 95oC, Tth = 105oC.
pHopt = 6,0 – 6,5.


Độ bền hoạt lực enzim tăng lên khi có mặt của ion Ca+2: [Ca+2]opt = 50 – 70 ppm.
Bảo quản chế phẩm ở T = 25oC hoạt tính enzim duy trì được thời gian 3 tháng; ở 5oC hoạt tính duy
trì 1 năm.
Fungamyl 800L
Chế phẩm dạng lỏng, màu nâu, chứa enzim -amilase được sản xuất từ nấm mốc
Aspergillus oryzae.
Sản phẩm thủy phân chứa nhiều maltoza.
Nhiệt độ thích hợp cho enzim hoạt độ Topt = 55 - 60oC.
pHopt = 4,5 – 6,0.
Độ bền hoạt lực enzim ít thay đổi khi có mặt của ion Ca+2:
Bảo quản chế phẩm ở T = 25oC hoạt tính enzim duy trì được thời gian 3 tháng; ở 5oC hoạt tính duy
trì 1 năm.
Sansuper
Chế phẩm dạng lỏng, màu nâu, chứa enzim -amilase được sản xuất từ nấm mốc Aspergillus
oryzae; ngoai ra con chuas cac enzim phu -milase va protease.
Sản phẩm thủy phân chu yeu la glucose.
Nhiệt độ thích hợp cho enzim hoạt độ Topt = 50 - 55oC.
pHopt = 5,5 – 6,0.
Bảo quản chế phẩm ở T = 25oC hoạt tính enzim duy trì được thời gian 3 tháng; ở 5oC hoạt tính
duy trì 1 năm.

Maturex 200L
Chế phẩm dạng lỏng, màu xám, chứa enzim -axetolactat decacboxylase được sản xuất từ
vi khuẩn Bacillus subtillis. Enzim xúc tác decacboxyl hóa axetolactat thành axetoin.
Nhiệt độ thích hợp cho enzim hoạt độ Topt = 30 - 35oC.
Khoảng pH hoạt động là pH = 4,5 – 6,0. pHopt = 6,0.
Bảo quản chế phẩm ở 5oC hoạt tính duy trì ít nhất trong 6 tháng.
Ứng dụng trong sản xuất bia
Ý nghĩa công nghệ
Có thể nâng cao tỷ lệ gạo thay thế malt đại mạch, giảm chi phí trên một đơn vị sản phẩm.
Linh động hơn trong việc lựa chọn nguyên liệu thay thế.
Kiểm sốt tốt hơn và cải tiến qui trình nấu.
Ổn định và nâng cao chất lượng bia.
Giảm được thời gian sản xuất, nâng cao năng suất thiết bị.
Những công đoạn cơng nghệ có sử dụng enzim
Dịch hóa ngun liệu phụ: Sử dụng chế phẩm Termamyl 120L
Bổ sung chế phẩm ngay từ khi hòa bột gạo: thủy phân tinh bột sống, enzim phụ là protease.
Không cần giai đoạn hạ nhiệt độ sau khi nâng tới nhiệt độ hồ hóa của gạo: enzim chịu nhiệt.
Kiểm soát nồng độ ion Ca trong nước hòa bột: độ bền hoạt lực enzim.
Liều lượng sử dụng: 0,5 kg/tấn nguyên liệu phụ.
Đường hóa: pH khối dịch được điều chỉnh pH = 5,5


Dừng ở T = 52oC cho protease của malt thủy phân protein giải phóng ra peptit và axit amin.
Với chất lượng malt kém hoặc sử dụng tỷ lệ nguyên liệu thay thế cao có thể bổ sung chế
phẩm Neutrase 0,5L. Liều lượng 0,3 – 0,5 kg/tấn malt.
Trong công đoạn này để giảm thời gian lọc dịch đường có thể sử dụng chế phẩm Cereflo
200L nhờ độ nhớt của khối dịch giảm. Liều lượng 0,5 – 2 kg/ tấn malt.
Dừng ở T = 65oC cho b-amilase của malt thủy phân tinh bột để tạo đường lên men maltose.
Các dextrin phân tử lượng cao đượctạo ra ở giai đoạn này.
Dừng ở T = 72oC cho a-amilase thủy phân nốt tinh bột và các dextrin vừa được tạo thành trở

thành dextrin phân tử lượng thấp.
Lên men
Bổ sung chế phẩm Malturex 200L giảm được thời gian lên men 5 – 7 ngày. Liều lượng 1 – 2
kg/ 1000 lít dịch đường. Có 03 phương pháp bổ sung Malturex:
Trộn chung vào thùng men giống và bơm vao thiết bị lên men.
Trộn trực tiếp tren đường ống dẫn dịch đường lạnh vao thiết bị lên men.
Trộn chung với dịch đường trước khi vào máy lạnh nhanh.
Nếu chất lượng dịch đường kém có thể sử dụng chế phẩm Fungamyl 800L vào giai đoạn này
để tăng hiệu suất lên men. Liều lượng 2 – 5 g/ hl.
Cải thiện quá trình lọc bia và tránh đục bia sử dung chế phẩm Finizym. Liều lượng 0,5 – 1,0
kg/ 1000 lít bia.