Hoàn thiện kỹ thuật lai so sánh hệ gen aCGH trong chẩn đoán một số bất thường nhiễm sắc thể

TW jfcfc «s> «> *4:


LỜI CÁM ON

Vói lấm lỏng của một người học trị. bằng tắt ca sự kinh trọng vả biết ưn

sâu sic. em xin bây tó long cam ơn tới TS.BS. Vi Thị Hà - Giang viên Bộ

môn Y sinh học - Di truyền • Trường Dại học Y Hã Nội đà tận lính giúp dữ,
hướng dẳn. tạo diêu kiên tót nhát cho em trong quã uinh hoc tập vã nghiên

cứu dê hốn thành khóa luận nãy.
Em cũng xin được gui lời cam ơn tói cac thầy, cỏ Bớ mơn Y sinh học
Di truyền Trường Đại học Y Hả Nội dà giúp đỡ. chi bao tịn tinh; cảc bác sỳ

va anh chi nội trú tại Trung tâm tư vấn di truyền

Bệnh viộn Dại học Y Ha

Nội đà tạo điêu kiện thuận lợi cho em thu thập số liệu trong thời gian hoan

thành khoa hiýn.
Em xin chán thành câm ơn Ban Giám hiệu, phòng Đảo lạo Đai học, cac

phòng ban chức nâng cua Trường Dại học Y Hà Nội đà giúp đừ, tao diều kiện
thuân lợi cho em trong quá trmh nghiên cứu. học tộp đê có thê hồn thành

khóa ln.
Va ci cung, em xin danh nhùng lời ycu thương, cam ơn đến gia dính,

bạn bé đã ln ở bẽn khích lệ. động viên, ung hộ đê em trong suốt thời gian
thục hiên khóa luận nảy.

Há Nội. ngay 26 thang 5 năm 2021

Sinh Mèn

Dinh Thị MỊ Linh


LỜI C.XXI ĐOAN

Tôi lá Đinh Tliị Mỳ Linh, sinh viên Y6 chuyên ngành Bác sỳ đa khoa,

xin cam đoan khóa luận nay hỗn tồn do lõi thực hiện. Cac sổ liệu vả két qua
nghiên cưu hỗn tồn trung thục vã khách quan, chưa ũmg đưực cõng bó ờ

bát cư cơng trinh nghiên cữu não khác.
Hà Nội. ngày 26 thang 5 nm 2021
Siu 11V ten

Dinh Th M Linh

-w .ã* CN ôG


CHỦ VIÉT TÁT

aCGH

array Comparative Genomic Hybridization

BAC

Bacterial Artificial Chromosome

BTBS

Bất thường bấm sinh

cDNA

complementary DN’A

CNP

Copy Nunixn Polymorphism

CNV

Copy Number Variant

DNA

Deoxyribonucleic Acid

FISH

Fluorescence In Sim Hybridization

HI

Haploinsufficient

MFISH

Multicolor FISH

NST

Mu cm sac the

MLPA

Multiplex Ligation - dependent Prcbe Amplification

PTTT

Phát triên tàm thần

PTVĐ

Phái uièn vụn dộng

QF-PCR

Quantitive Fluorescence Polnnetase Chain Reaction

SKY

Spectral karyotyping

UPD

Uniparental disomy

vs

Variants ofuncertain significance

-w .ã* CN ôG


MỤC LỤC

DẠT VÁN DÉ________________ ___________________________

.1

CHƯƠNG I. TÔNG QUAN________________________________

3

1.1. Bầt thường bàm sinh......................................... .......................

3

1.1.1. Định nghía............ .................................... ....................... .

3

1.12. Nguyên nhãn gây ra bết thường bỉm sinh...... ................

3

1.13. Dich lẻbấi thươngbám sình.................... —.................

4

1.1.4. Một sổ bắt thưởng băm sinh.................... .......................

/

1.2. Nhiềm sác thê và bất thường nhiêm sác thê......... _................

8

1.2.1. Đinh nghía............ ........................................................... .

8

1.22. Bắt thường nhi vin sắc thê liên quan đền bầt thưởng bầm sinh...9

1.3. Chi đinh xét nghiêm phát Hộn bất thưởng NST—.................... .... 10
1.4. Các kỳ thuật phai hiện bát thương NST..........

II

1.4.1. Kỹ thuật lịp kâryotypê.............................

.... 1 I

1.4 2. Kỳ thuật lai huỳnh quang tọj chỏ............

.... 12

1.43. Ky thuụt định lương huỳnh quang PCR .

15

1.4.4. Kỷ thuụt MLPA..... .... ...............................

16

1.5. Kỳ thuật airay CGH....... ~...............................

18

1.5.1. Nguyên lý va quy trinh kỷ thuùt.............

.... 19

1.52. Phân loại array CGH................................

....21

1.53. Mô ta kết quá.... -....................................

.... 23

1.5.4. ƠII nhược <ỉicm cua phưimg pháp lai so s inh hệ gen aCGH.... 24
1.55. ng dng cua k thui aCOH................ ã ã ãããããã ôããããããããããããããããôãããằ 25

1.56. Biến d| sổ lưựng ban sao (CNVs)...........

25

CHƯƠNG 2.1)01 TƯỢNG VÀ PHI Om; pháp nghiên cút..-

29

2.1. Đổi tượng nghiên cứu....... ........... ...............................................

29

TW«S’ ■>


2.1.1. Tiêu chuàn chựnbênli nhãn..................... ....... ........................ 29

2.12. Cờ màu.............................................................

20

2.2. Thời man nghiên cửu.......... ............... ..........

29

2.3. Đia diêm nghiên cứu.................................................

29

2.4. Phương pháp nưhiên cữu.......................................... ........................ 29

2.5 Phương pháp liến hành.............................................

29

2.5.1. Phưcnia nhản lien hanh...................................

■>0

2.52. Các chi tiéu nglnen cứu.................................... ........................ 44

2.53. Xư lý sô lieu..................................................... ......................... 44
2.5 4. Đao đức nghiên cứu:. .

..........

........................ 44

2.6. Mị hĩnh nghiên cứu.................................................. ........................ 45
lí-CTNG 3. KÉT AI Ã XV.HIFX rửtĩ........................

.............................

4Á

3.1. KÍt qua rách chiết DNA vá do kiêm tra chẩi hiợng DNA tách chiết 46

3-2. Ket qua các bước kiểm dịuh sau phàn ứng phân doạn DNA bảng
enzyme. gắn huỳnh quang, lài DNA mỉu - chung... ------------------47
3.3 Hiên thi mòt số kêt quá cua kí thuật aCOH.............. ........................ 51

3 4. Đặc diem làm sàng của dổi tirợng nghiên cím..........

52

3.5. Plan lích kết qua bất thưỏng nhi cm sac the.

Chương 4. BÀN LVẠN ••I
4.1. Lý giai lý do tại sao chọn kỷ thuỳt aCGH trong phân tích bầl thường
nhiem sac the •••Ml • ••*•••••••••••••!•••• >ltll IMIIMMIIIIIIillKHMiMI

••••••••••• 3 '

4 2 Quy trinh kỳ thuật lai so sanh hộ gen (aCGHỊ....... ..........................59

4.3. Tỵ lộ phải hiộn bấi thường NSTbầng kỳ Ihuýt aCGH..................... ÓI
KÉTLUẠN____________________ ___ _______________________________ 64

KIẾN NGHI

65

TÀI LIỆU THAM KHAO

TWM*M«K> *4:

DANH MỤC BẢNG

Bang I. I. So sánh độ bao phu bộ gcn và độ phân giai cua mội sỗ kỳ thuật phát

hiện bàt thường NST.—................................

~............... 23

Bang 2.1. Thành phần Digestion Master Mix......................

35

Bang 22. Chuàn bị Label Master Mk............................

37

Bang 23. Thé rich mau vả lơng the tích hồn hợp máu đanh đẩu.................... 39

Bang 2.4. Bang đánh giá San lượng thu đưực va Hoai linh dịc ỉuõu cua lửng
loai huỳnh quang sau khi đanh dâu vả tinh sạch...........................40

Bang 2.5. Thánh phần Hybridization Master Mix...............

41

Bang 2.6. Ngưởng QC đánh giá tín hiộu lai

42

Bang 3.1. Kct qua do nồng độ vả dộ tinh sạch DNA cua 24 màu máu......... 46

Bang 32. KÌi qua đo nống độ vả dộ tinh sạch DNA cua 24 màu dịch ối

46

Bang 3.3. Dành giá chất lượng gắn huỳnh quang................

48

Bang 3 4 Đánh giâ chẨi lượng tin hiệu lai mầu màu.......... ............................ 50
Bang 3.5. Đánh giá chất lượng tin lũệu lai mầu ói............. ............................ 50
Bang 3.6. Đặc diem làm sàng cua đói lượng sau sinh.......... .......................... 52
Báng 3.7. Đàc diem lảm sàng cùa đoi lượng trước sinh..... ............................ 52

Bang 3.8.Ty lệ bẩt thường KST dược phát hiện bảng kỳ tbuật aCGH.......... 54

Bang 3.9. Phân loại cácCNV troogmìu máu................

55

Bang 3.10. Phân loại cac CNV trong mầu ôi..................

55

Bang 3.11. Ty lộ các CNV trong cá mỉu nghiên cửu......... ............................ 56
Bang 4.1. Ưu và nhược diêm cũa kí thuật aCGH so với tnột 80 kf thuật phát

hiội bài ihng NST khac • ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• '


DANH Mực HÌNH

HŨÚ1 1.1. Ti lệ các nguyên nhân Uĩ vong ỡtre sơ sinh lại Việt Nam

6

Hĩnh 12. Ti lỹ cãc nguyên nhãn lu vong ờtrc sau so sinh tại Việt Nam........ ỗ

Hĩnh 13. Ti lộ các nguyên nhãn lư vong ơtre dirới 5 ti lại Việt Nam........ 7
Hình 1.4. Cấu trúc nhiêm sác thề .........................................
Hĩnh 1.5. Sơ dô quy trinh thus hièn FISH •• •• • •••

9

••••• •••••••••••■ ••••••• 13

Hĩnh 1 -ó. Biêu thi kết qua cua kỳ thuãi QF-PCR........... .......

lổ

Hình 1.7. Các bước tiền hanh kỳ thuật MLPA...............

18

Hĩnh 1.8. So đồ thê hiện cảc bưHình 2.1. Tách chief DNA bâng kit QIAGEN.....................».......................... 34
Hình 22. Cách phân tích tin hiệu lai...............................

43

Hinli 3.1. Hình anh điện đi sán phàm phân đoạn DMA bang diện di trên gel

47

agaiose 0.8%

Hỉnh 3.2. Hình anh quét slide bảng phần mẻm Agilent SureSean Microairay

Hĩnh 3.4. Mất đoạn trên nhanh dả NSTsố 15...............

51

Hĩnh 33. Hình anh thèmNST sổ 13...

51

*4:


HOÀN TIIIẸN KỲ THUẬT I.Al so SÁNH Hf GKN aCCrll TRONG
CHAN ĐỐN MỘT SĨ BÁ I THƯỜNG NHIỀM SÁC THÈ

TĨM TẲT

Hiên nay. các kỳ thuật di truyền đà đạt được nhưng tiến bợ mới, độc biệt
như kỳ thuật lai so sánh hệ gen aCGH với độ phân gi ái cao trong phảỉi tích bất

thưởng vật chất di truycn ở niửc đý te bão

pliãn rư. Kỳ thuãt nảy khả phô

biển trẽn thề giới nhưng hiện con kha mới me ờ Việt Nam.

Mục tiêu: hoán thiện kỳ thuật lai so sánh hộ gen trong phàn tich bẩt

thường nhiêm sác thè và mõ ta một số bẩt thường NST phát hiện được bằng

kỳ thuật lai 50 sánh hộ gen.
lỉắi tuưng và phượng pháp nghiên cứu: Mỏ ta cat ngang trẽn 24 mầu

mau va 24 mau dịch ái được thực hiýn kỹ thuật aCGH tại Bộ mon Y sinh học
Di truyền. Tnròng Đụi học Y Hả Nội.

Kvt qua nghiên cứu: Tất CJI cac màu đều du tiêu cbuãn dê phan lich kết

qua với ty lệ phat hiện các bất thường vật chốt di truyẽn NST lẽn tói 292%.

Ki-t luận: Hỗn thiện thanh cơng quy trinh kỷ thuật lai so sánh hộ gen
với nhiều bước thực hiên, vá sau mỏi bước đều có phương pháp kiêm chửng

dam bao quy trinh dưực thực hiên thanh cõng, chuih xác. piũt hiện bất thường
NST với tý lệ cao hơn vởỉ kỳ thuật nhiêm sảc thè dỗ thõng thưởng
Từ khóa: aCGH. lai so sánh hý gen, but thường nNcm sic the, chần

đoản trưúc sinh. nhiêm sac 111ề dồ.

nrdkn «s> ■>


I

DẠT VÁN DÊ

Bẩt Ihường nhiẻm sảo thỏ (NST) là những rối loạn về cấu tribe hoậc số
lượng cua mộ! hay nhi cu NST có thê xay ra trên NST thương hay NST giới
tinh hoặc ca hai. Nhiêu bắt thường NST dê lại hậu qua nặng nè như sây

(hai. ihai lưu hay lư vong sư sinh hoặc gây ra các bệnh lý di truyền, đạc
biệt là nguyên nhàn gảy ra bill thương bàm sinh (BTBS) [1]. Tuy nhiên

cũng có nhùng bat thướng NST không biêu hiện triệu chứng làm sáng

nhưng lai tniycn cho thè hộ sau NST bắt thường dó Vỉi co biéu hiện kiêu
hinh ở thế hệ sau.
Đa sỗ cãc BTBS hiộn nay đẻu chưa có phương phap điều tri đặc hiệu

mare* lại hiệu qua cao. Do đo. việc phát triền các phương pháp thảm dó chân
đcỂn trước sinh hay chân đôn các BTBS có liên quan đèn rỗi loạn vật chất di

truyền lá tri én vọng mới dang được tich cực dầu nr nghiên cửu phát tri en
nhẩm giam thiếu ti lõ màc bệnh, điều tri sôm và tư vẩn hịn nhốn gia đinh tìiêu

qua. luưi ché II lệ bênh di truyền cho các 111C hê sau.
Theo Tỏ chức Y te Thê giói, ước tinh có khống 6% tre em sinh ra với
BTBS trẽn tồn thế giới mịi nám. dần tới hãng trảm nghìn ca tư vong liên

quan [2]. Tại Việt Nam. theo thông tin từ Tông cục Dãn số - Ke hoạch hỏa

gia đinh, mỏi năm cõ khoáng him 40000 tré bi di tật bàm sinh, chiếm 1.5
2% Sũ tri mới sink số tri tứ vong do bất thường bãm sinh khoang lum 1700

tre ($]. Các bất thướng bãtn rinh lá nguyên nhài quan tiọug dàn đốn tứ vong
ở tré sơ sinh và tre nhô. bệnh môn rinh vả tàn tật; có nhùng lác dộng đáng kê
tói moi cá nhân, gia dinh, he thống châm sốc sức khoe vả tồn xà hội.
Xíợĩ sổ ngun nhản di truyền cua BTBS là do câc biến thè sổ lưựng ban

sao (CNV) được xác dinh bảng phương pháp lai sơ sánh hệ geu (aCGH). Giá

trị sàng lục cua aCGII như xél nghiệm đầu tay ờ tre em với nhiều BTBS đà


w5

dưực nhiều nghiên cữu vả dồng Ihuân thống qua [4| cững như là test dùng

trong chắn đoán trước sinh. Dữ kha Iiãng pliát hiện bẫt ihng trên tốn bộ bộ

gcn nên aCGH đã tạo la một cuộc each mạng ưaig chân đốn di truyền lảm
sang. Kỳ thuật aCGH khóng bị giới hạn ở một gen hoặc locus tại một thời
điểm, đặc biệt có giá trị trong trương hợp pliát hiện rói loạn hiốn gặp. Thêm

vào dó. aCGH đặc hiệu cùng rắt cỏ ích trong nghiên cứu cảc súng gen cụ thê.
Nổi mịt ùmg gen hụp được kiêm ưa. aCGH có độ jiiãn giai cực cao lới vơi
trâm cặp base có thê cỉto pbep pliat hiộn các bten the ma các phương pháp
phán ucb gen khác san có có the bo sót. Su ứng dụng đa dang của kỳ thuật
aCGH là rất lớn vả cổ thè cỏ nhiều ứng dụng cua aCGH được nghiên cứu
trong tương lai [5].

<5 Việt Nam. âp dụng kỹ thuật aCGH cho chán dốn di truyền cịn khá

mởi mà, kỹ thuât đòi hoi thực hiện quy trinh phức lạp. nghièin ngặt; đòi hỏi

nhàn lực dược dào tụo chuyên sãu trong phân tích, giúi thích và lư vấn kềt qua

di truyền, cùng vởi việc iriẻn khai áp dụng cảc kỳ thuật mới đé nâng Câơ hiệu
qua chán đốn bất thường di truyẻn. chúng tôi thực hiộn đè tai: “lloàn thiện

kỹ thuật lui vo vánh hộ gen (1CGII) (rong chân đoán mội vồ bất thường

nhiỉni sác the” nhẩm cảc mục tiêu sau:
ỉ. Hồn thiên kỳ thtựií lai so sánh hệ gen (aCGHi ĩrong phàn lích biỉĩ
thướng NST.

2. .Võ tã mvt sổ bứi thường NSĨ phai hiịn đirợc bồng kỳ thuột lai Sữ

sánh hègen (aCGHh

TWM*M«K> «“ *4:


3

CHƯƠNG I
TỎNC quan
1.1. Bất thướng bâin sinh
Ỉ.1J. nịnh nghía

Theo định nghía của Tố chức Y tế Thể giới \VHO. bẩl thưởng bầm sinh
là các bất thưởng vỉ cầu tnk hoic chức nâng xay ra inrức sinh, cỏ thồ được

phat hiên trước sinh, ngay sau sinh boỊc ơ giai cloạu muộn hựn [6].

ỉ. 1~2. .Vguyjn nhân gáy ra bất thường bấm ĩỉnh

Cân nguyên cùa bất thường bám sinh hiên vần chua rô ràng nhưng dược
cho lả bênh da càn nguyên, bao gồm:

- Do di truyền: chi cm khoáng 10-30%. Nguyên nhãn di truyền dõng vai

tro quan trọng trong nhiêu bất thuởng bâm sinh. Bat thường bâm sinh cõ thê
là hậu quã của đột biên gen hoậc do di tniyên gen mà hóa bát thường. Hỏn
nhàn cặn huyết tăng ti lè nức các bẵi thưởng bấm sinh di truyền hiếm gốp vả

tâng gần gấp đôi ti lệ tư vong ờ trè MJ sinh và tre nhã các khuy Ct lứt tri tuê và

cac khuyết tật khác. .Một số dãn tộc (người Do Thai Aslxkeaazi hoác người
Phăn Lan) cõ ti lệ tưtmg đỗi cao các đột biến gen hicm gạp trong bệnh xơ

nang vá Haemophilia c.
- Do môi truồng: chiếm khoang 5-10%. Việc mẹ tiếp xúc với một số loụi
thuốc trữ sâu vã hóa chất khác, cùng như một số loại thuỗc nhắt đinh. rượu,
thuóc la vã bức xa trong thời ki có thai có thê làm làiìg nguy cơ thai nhi hoặc

tre Mí sinh bi anh hướng bơi cac bẩt thường bắm sinh Làm vice hốc sống

gần cãc bài đơ rác. hầm mo hoặc lõ luyện cùng là một ycu tố nguy cơ. dác
biợ khí người mợ tiếp xúc với cãc yếu tổ nguy cơ mịi trưởng khác hoặc thiếu

dinh dường.

TWM*M«K>

*4:


4

- Do nhiêm trùng: Các bênh nin cm trũng thởỉ ki thai sản như giang mai
va rubella ỉa nguyên nhân dáng ki* gảy la bất thường bẩm sinh ơ các nước có

ỉhu nhập tháp và uung binh.
- Do di truyền da nhãn tố (do sự lác dộng qua lại cưa yếu tố di truyền vã

môi trường): chiếm 20-35%.
- Nguyên nhân chưa rồ: chiêm khoáng 30’45% [ổ]. [7].
BTBS gảy ra bới nhiều nguyên nhún, củ khi đơn độc có khi phổi hợp vói

nhau, úệc xác dinh chỉnh xác cản nguyên gày BIBS hiũỉ lã thách thức chữ

ncn y học hiên dai. Trong các nguyên nhãn trẽn. BIBS gày ra bời yêu tố mỏi
trường xá nhiẻm trung có thỏ phịng tránh dược bang cách châm sóc tốt cho

phụ nữ trong dộ ti sinh dỏ. đặc biệt là dổi tượng phụ nừ cô thai: khám tiên

hòn nhân và điểu trị nhiêm trũng sớm kịp thời... BTBS do nguyên nhân bất
thường vạt chut đi truyền cỏn gây khó khán trong cơng lác chân đốn. Sự phát
triển cua y sinh học di truyền giup cho chân doán sớm BTBS ngay từ thin ki

hao thai và đưa ra dược Cac lư x án đi tiuyền hiộu qua nhảm giam bởt ti lẹ
mic. đĩèu tri s»’nn BTĐS.

/.4J. Dịch tễ lĩấi thường bảrti sinh

Theo WHO. BTBS ánh hương den 1 trong số 33 tre sơ sinh và dần den

khoang 3.2 triệu khuyết tật trẽn toan thề giới (S J. Theo nghiên cứu gánh nặng
bệnh tật toàn câu (GBD). BTBS lá nguyên nhàn gày ra 510400 ca tư vong
trên tồn the giới. chiêm 1% tơng số ca tư vong (6% sò ca tir vong ỡ tre sơ
sinh vi sau sơ sinh. 2.5% sổ ca lủ vong ờ trê từ 1-4 tuôi). dứng thứ 23 trong

tầt ca cãc nguyên lứiãn gãy tư vong [9].
Các cuộc điều tra dich tẻ học về cac BTBS ơ nhiều nơi trẽn thề giới với

các yếu tố môi trường, tinh trạng kinh tế xà hội. chưng tộc khac nhau có kha

năng cung cấp thõng tin quan trọng về ti lộ lưu hành. núi hình và các yéu tố
nguy cơ cũa BTBS ờ các khu vưc khác nhau. Theo Trong rám ki êm soảt vã


5

phòng ngứa dich bệnh Hoa kỳ (CDCX lai Mỳ BTBS đưực ghi nhận khoảng 2-

5*4 tổng so tic sinh ra sồng [10]. o các nước Trung Dơng, nơi hịn nhãn cân

hưyct kha phờ bicn. ti lệ mac cãc di tật bầm sinh lởn được bão cao la 2-2.5%
ti lệ cao nhất la 7% dưọc ghi nhận toong các cuộc hỏn nhãn cận huyết. ớ cháu

Phi. một số nghiên cứu hiểm hoi về dị tật bám sinh đà bác cáo ti lộ mác bệnh

lần lưựt lá 1.5% và 2.5% ớ Ai Cập và Đóng Phi (Kenya và Uganda) (II). Ti
lõ BTBS ỡ các nước châu Á dà dược chứng minh la khác nhau với II lú BTBS

được báo cáo ư Án Độ là 2.5% va 0 Trang Quốc la 1.3% [12]. (13Ị. Tụi khu
vực Đông Nam A. BTĐS lá nguyên nhản gây ra khoang 90000 ca tư vong ỡ

trc sơ sinh mỏi năm [8],
Theo thông tin từ Tông cục Dân số - Ke hoạch hóa gia đinh, mỏi nâm
Việt Nam có khoang lum -10000 trê bi dị tật bàm sinh, chiếm 1.5

2% sổ trẻ

mới sinh; sổ trà lư vong đo bẩi iliuong bâtn sinh khoang hơn 1700 ire [2J.

Theo thống kẽ cua WHO. tạj Việt Nam, ti lộ tù xong do BTBS theo
nguyên nhản ở tre sơ sinh la 22,67% (dưng thứ 2 sau đe non); ơ trc sau iơ

sinh la 21,84% (đứng thứ nhàt); ỏ tít dưói 5 tuối lả 22.26% (đứng thứ 2 sau
dé non) (Hình 11,1.2,1.3>[14], [15]. [16],

*4:


Ó

9M !■*■-

MU«M wMwl k«<*

MỄỀỂ

Hinli 1.1. n lộ các nguyên nliárt từ vong ứ trê sư sinh tợi liệt .Xam

(Nguồn: Tà chức Y lề Thễgiởụ

Hình 1.2. Ti lệ các nguyên nhân lữ vong ừ trê sau sư sinh tại I 7ft Nam
(Nguồn. Tố chác Ỵtểthếgiữí)

TWM*M«K>

*4:


7

Hinỉi JJ. Tì If các nguyên nỉtùtt từ vong ờ trê đưởi 5 tuồi tạỉ I ift Nam

(Nguồn: Tồ chức Y lê thể gùrì)
ỉ. IN. Một sổ but thường bẩm sinh
Chậm phát triên tâm thần (PTTT). chậm phãt triẽn vận dộng (PTVD) vã

các bấi thường bính thái lù các B I BS có cán nguyên di truyền khá cao. Tùy
vâo phưong pháp phai hiện bâi thưởng NST và đối lưụng nghiên cửu mà cho

tỷ lệ khâc nhau. Một nghiên cứu trên 633 bệnh nhi vói chàm PTTT vãboặc

chậm PTVĐ, hẩng phương pháp aCGH đã phái hiện 20.06% các trường hụp
mang CNV gây bệnh (17). Trong khi đó. bảng phương pháp lập karyotype
trẽn 395 bênh nhi với chậm phát triền vả/hoặc bat thường hĩnh thái có bao

glim ca hội chứng Down (ty lệ phát hiện bắt thường NST trisomy 21 rất cao)
cho kết qua karyotype bộnh lý là 61.1% nhung loựĩ ttir các trường hợp có

trisomy NST sổ 21 thi tỷ lộ nãy côn 7.4% 1 ỉ 8].
Dè phát hiện và chân đoàn một tre cố bất ihường phát triền thường qua
nhiều bưtk. Bưóc dằu tiên là giàni sát (surveillance); thu thâp vả tông hợp
thõng tin về tiền trinh phát triền cua tre dựa trẽn tiền sư. quan sãt cua cha mẹ

hoặc người chăm sóc khác đơng thín thâm khảm định kỹ theo chiều dọc vã


8

liên tuc theo tlwi gian. Tiếp theo là sàng loc bảng những lest riêu chuẩn ngân,

thường là những lieu chuẩn đánh giả các mốc dụt dược theo tùng thời kì phát
tnẽn cua trê. Ci cung lá q trinh chẩn đốn, ỡ giai đoan nay cõ thề thực

hicn một sổ xét nghiệm thich họp, xét nghiệm VC di truyền hục hoặc chun

hóa. chán đốn hình anh hục hộ thần kinh. Idem tra tàm than kinh cùng như
tham vắn chuyên gia [ 19],

Ti ong khi đó, đê phát hicn các các BTBS trước sinh chu yếu thòng qua
cac xét nghiệm cận làm sàng Siêu âm dược coi như phương pháp không xàm

lẩn hiệu qua đẽ sáng lọc RTBS, đặc biệt lả các bầt thương về cầu trúc. Nhưng
các xẽt nghiộm xâm lấn mũi đư^xr coi là tiêu chuẩn váng trang chân đoán
trước sinh [20Ị. Sau khi có két qua xét nghiệm, nhiệm vụ cua lư ván di truyẻn
lã võ cùng quan trụng. Tư ván nhầm giúp các cụp vụ chống lụa chọn quyết

đinh đúng din VC kết cục thai ki bằng cách cung cẩp thông tin đầy đu, chi tiết

VC bicu hiện lam sang và tiên lượng cua cac bầt thưởng phat hiện được,

thường lả các bất thường VC NST: (1) sự biên dối kiêu gen

Id ill tính rắt da

dạng thay đơi phụ thuộc vảo mức độ khiếm khuyết di truyền: (2) sv thay dơi
về kiêu hình

sư ticn triẽn cua mật trường hợp có thè khác nhau rất nhiều,

ngay cá giữa những người củng mang một bât thưừng NST |21).
1.2. Xhicnt sác the và hất thướng nhiêm sắc (hè

Ỉ.2.I. Dịnh Nghỉu

Nhiẻin S3C thê (NST) la cẩu true dạng sợi nầm trong nhân cua tề bao

dộng vát va thực l ật. Mỏi nhiêm sổc thê dược cầu tao tù protein và I pliãn tư
acid deoxyribonucleic (ONA).

«“ *4:


9

H'uih 1.4. Cấu ữủc nhiễm sic thê

Đè một sinh vật pliát triẽn và hoụl động bính thường, các lể bao phai liên

tục phàn chia đê tạo ra cãc tế báo mới đẽ thay thẻ các tế bão giá. tề báo hư
hông. Trong quả trinh phân chia te bào. điều cần thiết là DNA vàn cỏn

nguyên vẹn vố phân chiu đồng đều ghra các tế bào. Nhiêm sÃc the là một phẩn
quan trụng trong quâ trinh dam bao DMA được sao chép vi phàn phổi chỉnh

xác trong phần lớn các lần phan chia tế bảo. Tuy nhiên sai lầm vẫn xây ra
trong những trường họp hiểm hả [22]. [23].

ơ người bính thường có 46 NST, bao gơm 22 cặp NST thường vã 2 NST
giỏi ánh. đối với nam lã XY. nừ là XX.

1.2.2. Bắi thường nhỉầìi sắc thê tiỉn iỊuan dền bui ihưửng bùm đnh

Có rầt nhiều dạng bát thường nhiêm sắc thê nhưng cử thê chia thành 2
loã chỉnh sau:
- Bắt thưởng sỗ lượng NST: thuimg xây ra do sư thắt bại iraig phản chia

NST. dản lới tế bào thiếu boậc thửa NST. Các giao tư vói nhùng bẩt thường
nay có thê dẫn tới tinh trạng hội chứng Down (47 NSTl. hôi chững Turner (45


10

NST). Cốc dang phổ biền của lối loạn bất thưởng NST lã: thề tam bội, thê tam

nỉncrn. thế dim bội. thê kliani.

- Bẩt thường cầu tnic NST:
+ Màt đoạn: hội chimg Wolf-Hirschhom gảy ra bời tnầi đoạn tĩẽn nhảnh

ngản NST 4
- Lập đoạn; bỹnh Charcot-Marie-Tooth có thẻ do sv sao chép gen mà
hoa protein ngoại vi myelin 22 (PMP 22) trẽn NST 17

- Chuyên đoạn: trong chuyên doạn Robertsonian, ĩo.in bộ 1 NST gắn

vào VỊ trí lâm động cua NST khác. điều này chi xay ra ở NST 13. 14. 15. 21

vả 22
* Đao đoạn: xay ra khi I doạn NST bị dirt gày, đao ngược và gấn lại. do

đó vật Chat di truyền bị dao ngược [24]. [25].

1.3. Chi định xét nghiệm phát hiện bất thường NST

Các kỳ thuật pỉxãt hivài trường hợp sau;
• Sảng lọc sơ sinh.

-Chân đốn trước sinh; loại xet nghiệm này dược chi dinh cho cac cịp
vợ cbịng có nguy cơ sinh con b| rối loạn di truyẻn cao. Có thê lấy mau mơ de
xẽt nghiêm thõng qua chọc ối boặc sinh thiết gai rau.

-Chán đoán ngưởi mang gen bệnh: xét nghiệm giúp càc cặp vợ chồng
phai hiện minh có mang gen bệnh Lining Va nguy cơ di truyền cbo thê hộ sau
như di truyền alen lận trong bệnh xơ nang, thiểu mảu hồng cầu lùiili liềm,

bệnh Tay-Sachs... Các xét nghiệm nãy thương dưực chi dinh cho nhùng cã
nhàn có tiền sử gia dính tnẳc cãc bệnh di truycn hoặc những nguờỉ dãn tục

thiêu số có nguy cơ cao mấc bộnh lỹ di truy ẽn cụ thê. N’cu ca bố mẹ đều dược


II

Idem ưa. xét nghiêm cỏ klìâ rủng cung cấp thơng tin nguy Cữ sinh con mủc
bệnh di truy ền cua mộc cập vợ ch^ng

-Chan đốn và theo dơi liên lượng đáp ứng điêu ưị một sổ bệnh di
tiuycn.

- Dư đoán khuynh hường cả thè có the mắc bênh trước khi bải đầu cõ

trku chưng. Các xẽt nghiêm náy dậc biẻt có ích dồi vói những cã nhan cõ ti en
sư gia dính về một bộnh cụ thè va bệnh đó có sần biỳn pháp can thiệp dè ngàn
chán sự khơi phát cua bênh hoỊc giam mức dộ trầm trọng cua bộnh. Xét
nghiệm bất thường NST cỏ the xãc định dược các bất thương kìm tâng nguy

cơ mẩe một bệnh cụ thê. ví dụ như ung thư [26].

1.4. Các kỳ thuật phát hiện bầt thướng NST
Kỹ thuật lộp karyotype

Karyotype là hĩnh anh thè hièn sổ lượng vả hình dáiẹ cùa nhiem sẩc the
trong nhãn te bào. Trong karyotype. các nhiêm sầc the đưựv sấp xếp vã dinh

sỗ thứ tư theo kích thước, tứ lém nhãt den nho nhất.
Quy trinh lập karyotype: các te bào được nuôi cay và thu được nhiễm sảc
the tại kỳ giữa (metaphase) cua quà trinh phân bào. sau đó nhiêm sắc the sè
dược nhuộm với hóa chất thích hợp đế quan sát [27Ị.

Một số kỳ thuật nhuộm bảng đê lẠp karyotype: bâng G. bing R. bàng c.

bàng Q. bảng T và nhuộm bạc, trong đỏ kỹ thuật nhuộm bing G được sứ dụng

phẻbỉến.
Kỳ ilRiât nhuộm bâng G: nhuộm Giemsa sau quá trinh thủy phân nhiêm
sắc the bâng trypsin. Nó tạo ra một loạt các dai băng sắng tổi; vũng tối thưởng
lã 1-ũng dỊ nhiễm sắc, giàu AT. Vùng sáng thường lã vũng nguyên nhicm sắc.

«“ *4:


12

giàu GC. Phương pháp nảy thường luo ra 300-400 bàng trang bộ NST người
bính thường [28].

Kỹ thuật lập karyotype cỏ ưu diêm la quy trinh đơn giãn, được sư dụng
rộng rài với hệ thống danh pháp dĩ truyền tế bảoquồc tc (international system

of cytogenetic nomenclature (ISCNii [29]. Thêm vào dỏ kỳ thuật cho phép

đánh giã cũng lúc toàn bộ bộ NST. xác định dược các độr biền sồ lượng vã
cẩu trúc cua NST. nó có thê xãc đinh được dột bicn NST không càn bảng

(thừa, thểu NST. thê tam nhiêm...) và đột biển NST cân bảng (đao đoạn,
chuyển đoạn...) trong khi cảc pinning pháp phán tich NST khác gặp khó khàn
trong phát hiện các đột bicn NST cân bàng này [30].

Bén cạnh những iru đicm trẽn, lập karyotype cũng tồn tại nhiều giới hạn.

Do phản tích karyotype ơ kỷ gi ùa cua quá trinh phân bào khi nuôi cấy tè bào

nên kểt qua thường khơng có sớm hon 7-14 ngây sau khi lấy mầu [31]. Quy
trinh thực hiên có nhiồu hước phái làm thủ cịng, khơng cổ chi số kiêm Sôỏt

chài lượng nên ket qua phụ thuộc rắt nhiêu vào kỹ nâng cua người lãm tiêu

ban và người đục kết quá. giam tinh khách quan cua xét nghiêm [30J. Độ
phàn giíú thắp, thơng thường cho phép phát hiện bất thưởng NST trong

khoang 5-10Mb (Mb: megabase. lMb= 1.000.000 bases), đối khi có thê phảt
hiên sự bất thướng khoang 3 Mb phụ thuộc vào 'úng gen hên quan vahoậc
điểu kiện xét nglũỳm. Cốc trương hụp bất thường nhi cm sic the nhơ hơn kích
thước trẽn sè khùng đưuục phát hiộn gay bo sót chấn đốn [29]. Khơng thê

phat hiện ra hội chưng di truyền unipaiental disomy (UPD) (30j.
1.4J. Kỳ thuật lai huỳnh quang tụi chỗ (FISH: Khtơreicence In Sỉtu

Hybridization)


13

Kỷ thuãĩ lai huỳnh quang tai chồ (FISH) lã một kỳ thuâi di tniyền tể bão
phan tư sư dụng các đoan do (probes) huỳnh quang lien kct bó sung với một

trinh tự nucleic acid nhát đinh cũa NST.

H'utii 1.5. Sơ dề qity trinh thực hifn FISH
Có 3 loại đầu dó được sư dụng rộng răi trong các phông thi nghiệm di

troyền lam sàng, mơi loại có một úng dụng khac nhau. các 1031 dầu dó nay
củng có thè sư dựng kèt h<*p tions kin xác định các bát thưong NST phức tựp:
• Dầu dó tốn bộ NST (Wbolechromosome pointing

WCP): giải mẳ

các bất thường di ĩniyẻn te bào, dùng đe lai viri loàn bộ NSTqua tàm
- Dầu (lỏ định lượng làm động (Centromeric enumeration probes CEPs): lai với các tanh lự lặplại cua vệ tinh alpha (hoặc beta) trong cac vũng

tâm động cụ thê cua mồi NST vã dược dũng đê đêm NST.
- Dầu dò xác dinh locus đặc hiệu (Locus-specific identifier

LSI

probes): xác định cãc bỉit thmmg NST nhất định (27].

So vái kỹ thuật lụp karyotype. FISH cổ một ưu dicm đảng ke la nó cỏ the
dược img dụng ưong các tế bảo khơng phân chia, do dó tạo diều kiện thuận
lọi cho việc khao sát trục ĩièp NST trong các chê phàm tế bao hoc vá các phân

mõ. Thêm vảo đó. màu xet nghiêm cỏ thê lã NST ớ kỵ giữa hốc trong nhàn ớ

TWM*M«K> «“ *4:


14

té bào gian kỳ nén cổ thè kỉũtig lốn thôi gian nuỏi cấy lể báo vả có thể thu
được kết qua sởm trong vong 24-48 giỡ. Do các đầu dô DNA được gần huỳnh

quang V kích thước 10Ơ 800 Kb (1Kb = 1000 bases) nen FISH cõ độ phán
giái cao vá cho phép sang lọc nhanh các bẩt thường sồ lượng NST. FISH cơn
có kha nâng xác định sự tốn Tặ cua các bất thường nhiêm sắc Thê nho hoặc ân

ờ những bính nhản có dịng võ tinh nho (minor clones). MỘ1 lượng lớn tề bão

cờ the dược đanh giá với cĩù phi phịng thí nghiệm lng đỗi re hơn so vởi kỳ
thuật karyotype.

Tuy nhiên, hạn chẽ chinh cua FISH la nõ chi pha: hiên cãc sai lệch VC

Cẩu tróc hoảc $ố lượng nhiẻm sic thê CM thê tại vị tri cụ thè. vi vậy nhừng bấl
thường nhiêm sàc thê liên quan den các vừng khác có thỏ bị bo qua. khơng có

sần đoụn dơ cho lất ca các NST. Một số mắt đoạn nho vã khơng thưởng gập

có thể bi bó SĨT. phụ thuộc váo dọ dặc hiệu cua doạn dò huỳnh quang. FISH
han chế trong phat hiện một số mằi đoạn nhô trong một IV hội chứng di

truyền như hội chung Angelman. hội chúng Prader-Willi, hói chứng Sơtos.
hội chứng Snith-Magcnis... Không phát hiện được cốc dột biến nho. đaọ

đoạn NST. hụi chững đi truyền uniparental disomy. Do quy trinh kỳ thuủt nên
FISH côn gảy ra sự chổng lấp tín hiệu trên vi trường, gảy khỏ khán trong
nhận đinh két qua và nhiêu [27]. [29]. [30]. [31], [32]. [33]. [34].
Dè giam bót sụ chong lấp tín hiệu, Multicolor FISH (MFISH) va
Spectral karyoty ping (SKY). hai cõng nghê huynh quang đa sầc đù dược phát
triền, la phương pháp tạo karyotype phó sư dụng thuóc nhuộm huỳnh quang
liên két với câc vùng cụ thổ cứa nhiêm sắc thê. Bang cách sứ dụng một loụt

các đầu dò dặc hiệu VỚI các lượng thuốc nhuộm khác nhau, cac cặp nhiễm sảc

thê khac nhau thê hiện các đác diêm phô riêng biệt. Các khác biệt nhẹ vẽ mau
sắc. không Thê phát hiện bằng mãt người, được phát hiộn bơi một chương
trinh máy linh vá sau đỏ thay đôi lại máu sằc dê dẻ phán biệt từng cặp nhiễm


15

sảc die. Kcl q lã mót hình anil kỳ thuũi số chứ không phái ptiirn. với đầy đu

mau sic. Vice ghep cộp cua các nhiêm sầc thẻ đơn gian hơn vi các cập lương
dong có mau giồng nhau vã cac hiện tượng sai lệch và trao đổi cheo NST dẻ

nhận Viet hon. Ngoải ra. karyotype phô đà được sư dụng dế pỉiãt hiện các
chuyên vị không thê nhận ra bang phán tích karyotype truyền thống.

/.4J. Kỳ thuật định lượng huỳnh quang PCR fQF-PCR: Quantitative
Fluorescence PCR)
Kỹ thuật QF-PCR sư dụng đoan mồi có gan huỳnh quang de khuếch dụi

ễc vùng STR (short tandem repeat sequences: cổc trinh tụ lạp tiếp nói ngăn).

Các vũng STR được khuếch đại sè tụo ra các san phàm PCR huỳnh quang
khác nhau vả dược đinh lượng bang điện di mao quan trẽn hộ thống rnáy
sequencing ABI. Kct qua sẽ hiên thi bảng các dinh [35].

Một mảu lưỡng bội bính thường cơ sự dong góp cua hai trong sô các
nhiễm sic the được khao sát. Hai alen cưa một diêm danh dáu dặc hiệu cua

nhiễm sác thề đưục phải hiện dưới dạng hai đinh Iheo ty tệ 1:1 khi chát dành

dâu lá d| hợp tứ và là mội đmh khi chát đánh dấu là dỡng hựp tư (có các alen

cúng chiều dải). Việc pint hicu một alenbơ sung dưới dạng ba dinh theo ty lệ
1:1:1 hoộc hai dinh theo ty lộ 2:1 '1:2 cho thây sự hiện dĩẽn cua một b.ui sao

đánh dâu bỏ sung có the tương ững với một nhiễm sác thê bổ sung, như trong
trường hợp cùa tam nhiễm. Đối tượng là dồng hợp tư hoặc đơn tính đơi với

một diêm đánh dấu cụ thê sê chi hiên thi một dinh (binh 1.6) [36].


lú

Duoovc

\----------------------

-------------

0
A

o
A
A

A i

Tncomic

-

------------------- \

đ

A
J{

o

\-------------

_________ /


.

ã

-J

f ôôcka ncrra aitea* rrto * 11

__

ã

Trt&omtc

0

o

o

C----- AAA
nto ■ 1 1:1

fjCKtaO »wrr»c

------------

------------•'

Un»n1ormativ<^^^

c*ra <MrpOT 1 >, Ỉ o 5 a*M ««

<

Hình 1.6. Biêti thị két q cua kỹ thuật QF-PCR

Kỳ thuật QF-PCR mang lọi ưu diêm phát hiện các rối loạn số lượng
nhiễm sắc thê chinh (NST 13. 18. 21, X vã Y) trong vài gjỏ sau khi thu thập

cãc màu (thưởng trong võng 48h). Do tự động hóa quy ninh nén cho phép xẻr

nghĩộni só lượng màu lởn vôi chi phi thấp.
Nhược diêm cưa kỹ thuật QF’PCR là không phát hicn dược các bất

thường sô lượng của NST khác Víi đột biên câu true NST. một 50 trường họp
kham: khơng cho phép đánh giá tốn bộ bộ NST [37].

1.4.4. Kỳ ỉhitậỉ Mỉ.p.-i (Muiripừx ĩ-ỉgtoit dependent Prữỉte .-impỉỹĩcatìon)

TWM*M«K>

*4: