Nghiên cứu định lượng rebaudioside a trong cây cỏ ngọt và một số sản phẩm từ cây cỏ ngọt bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao hplc

664

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ...........................................................................................................
DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH .........................................................................................
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ..........................................................................
MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 3
1. Lý do chọn đề tài ................................................................................................. 3
2. Nhiệm vụ nghiên cứu .......................................................................................... 5
3. Đối tƣợng nghiên cứu.......................................................................................... 5
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................................ 5
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................................. 6
1.1. Giới thiệu về cây cỏ ngọt ................................................................................. 6
1.1.1. Giới thiệu ....................................................................................................... 6
1.1.2. Đặc điểm thực vật của cây cỏ ngọt .............................................................. 7
1.1.3. Các giai đoạn sinh trƣởng phát triển ............................................................. 8
1.1.4. Phân bố và tình hình trồng trọt ..................................................................... 8
1.1.5. Thành phần hóa học của cỏ ngọt ................................................................ 10
1.2. Tổng quan về rebaudioside A ........................................................................ 11
1.2.1. Tính chất vật lý............................................................................................ 11
1.2.2. Tính chất hóa học ........................................................................................ 12
1.2.3. Tính chất cảm quan ..................................................................................... 13
1.3. Một số sản phẩm đƣờng ăn kiêng trên thị trƣờng .......................................... 13
1.4. Những sản phẩm từ cỏ ngọt ở Việt Nam ....................................................... 16
1.5. Tổng quan về phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ................... 18
1.5.1. Khái niệm ................................................................................................... 18
1.5.2. Phân loại ...................................................................................................... 18
1.5.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo ..................................................................... 19
1.5.4. Pha động trong sắc ký pha đảo .................................................................... 20
1.5.5. Sơ đồ hệ thống HPLC ................................................................................. 21

CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................. 24
2.1. Phƣơng pháp lấy mẫu ..................................................................................... 24
2.2. Phƣơng pháp phân tích ................................................................................... 24
3


CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM ............................................................................ 25
3.1. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất ............................................................................. 25
3.2. Kỹ thuật thực nghiệm ..................................................................................... 25
3.2.1. Chuẩn bị hố chất phân tích ........................................................................ 25
3.2.2. Xây dựng đƣờng chuẩn ............................................................................... 26
3.2.3. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu ................................................................................ 26
3.3. Tiến hành phân tích trên máy ......................................................................... 28
3.4. Khảo sát đánh giá phƣơng pháp ..................................................................... 28
3.4.1.Đánh giá hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp ............................................... 28
3.4.2. Khảo sát độ lặp của phƣơng pháp ............................................................... 28
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 29
4.1. Xây dựng đƣờng chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của tỷ lệ diện tích peak
stevioside và rebaudioside A vào nồng độ ............................................................ 29
4.2. Phƣơng pháp xử lý kết quả............................................................................. 35
4.3. Đánh giá phƣơng pháp ................................................................................... 41
4.3.1. Đánh giá hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp .............................................. 41
4.3.2. Đánh giá độ lặp của phƣơng pháp ............................................................... 42
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................... 43
5.1. Kết luận .......................................................................................................... 43
5.2. Đề xuất ........................................................................................................... 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 52

4

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đồ án tại các phịng thí nghiệm Hố thực phẩm, khoa
Hố học, trƣờng Đại học Vinh, Trung tâm Kiểm định An toàn thực phẩm và mơi
trƣờng trƣờng Đại học Vinh, ngồi sự nỗ lục của bản thân, tơi cịn nhận đƣợc nhiều sự
giúp đỡ, chỉ bảo nhiệt tình của các thầy cơ giáo, kỹ thuật viên,… Tôi xin gửi lời cảm
ơn chân thành tới:
- Các thầy cơ giáo khoa Hố – những ngƣời đã tạo cho tôi nền tảng lý thuyết,
phƣơng pháp tiếp cận vấn đề để tơi có thể hồn thành chƣơng trình.
- Cán bộ, kỹ thuật viên Trung tâm thí nghiệm trƣờng Đại học Vinh.
- Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Lê Thế Tâm – Khoa Hoá học – trƣờng
Đại học Vinh đã tận tình hứng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình nghiên
cứu và hoàn thành đồ án này.
- ThS. Chu Thị Thanh Lâm đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt q trình
làm thí nghiệm, phân tích kết quả.
Trong suốt q trình thực tập và viết báo cáo do bản thân chƣa có nhiều kinh
nghiệm và kiến thức thực tiễn nên cịn có những sai sót. Kính mong nhận đƣợc sự
đóng góp ý kiến của các thầy cơ và các bạn để bài báo cáo này đƣợc hồn thiện hơn.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Nghệ An, tháng 12 năm 2013
Sinh viên
Lê Thị Thành

5


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Tình hình sản xuất và sử dụng cỏ ngọt ở một số nƣớc trên Thế giới. ............ 9
Bảng 1.2. Thành phần % các chất trong cây cỏ ngọt ............................................ 10
Bảng 1.3. Thành phần hoá học các chất tạo ngọt chính trong cây cỏ ngọt ........... 10

Bảng 1.4. Tính chất của một số pha động trong sắc ký lỏng ................................ 20
Bảng 4.1. Kết quả thí nghiệm xây dựng đƣờng chuẩn rebaudioside A ................ 29
Bảng 4.2. Kết quả thí nghiệm xây dựnng đƣờng chuẩn stevioside ....................... 29
Bảng 4.3. Kết quả phân tích rebaudioside A trong các mẫu ................................. 36
Bảng 4.4. Kết quả phân tích stevioside trong các mẫu ......................................... 36
Bảng 4.5. Kết quả thí nghiệm xác định hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp .............. 41
Bảng 4.6. Kết quả phân tích xác định độ lặp của phƣơng pháp. ........................... 42
Bảng 5.1. Kết quả phân tích hàm lƣợng stevioside và rebaudioside A ................ 43

6


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình i. Tinh thể stevioside ...................................................................................... 5
Hình 1.1. Cây cỏ ngọt (đã trổ hoa) .......................................................................... 6
Hình 1.2. Cây cỏ ngọt (chƣa trổ hoa) ...................................................................... 6
Hình 1.3. Cánh đồng cỏ ngọt .................................................................................. 9
Hình 1.4. Nhóm steviol ......................................................................................... 11
Hình 1.5. Cơng thức hóa học của stevioside, gồm nhóm steviol liên kết với một
phân tử β – D – glucose và một sophorose .................................................................... 11
Hình 1.6. Sự liên kết của steviol và các carbohydrate để tạo thành
steviolmonoside, steviolbioside, stevioside và rebaudioside A .................................... 12
Hình 1.7. 104 Stevia .............................................................................................. 13
Hình 1.8. 105 Stevia .............................................................................................. 14
Hình 1.9. Stevia Extract trắng bột. ........................................................................ 14
Hình 1.10. Stevia Plus Fiber Packets. .................................................................. 15
Hình 1.11. Stevia dạng viên nén ........................................................................... 15
Hình 1.12. Chè Artiso – Cỏ ngọt........................................................................... 16
Hình 1.13. Chè sâm quy – Cỏ ngọt ....................................................................... 16
Hình 1.14. Chè ngọt. ............................................................................................. 17

Hình 1.15. Chè thảo mộc....................................................................................... 17
Hình 1.16. Lƣơng khơ Happy Life ........................................................................ 17
Hình 1.17. Sơ đồ hệ thống HPLC ......................................................................... 21
Hình 3.1. Sơ đồ chuẩn bị mẫu ............................................................................... 27
Hình 4.1. Đƣờng chuẩn biểu hiện mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ
rebaudioside A ............................................................................................................... 30
Hình 4.2. Sắc đồ chuẩn rebaudioside A nồng độ 10ppm ...................................... 30
Hình 4.3. Sắc đồ chuẩn rebaudioside A nồng độ 50ppm ...................................... 31
Hình 4.4. Sắc đồ chuẩn rebaudioside A nồng độ 100ppm .................................... 31
Hình 4.5. Sắc đồ chuẩn rebaudioside A nồng độ 250ppm .................................... 32
Hình 4.6. Sắc đồ chuẩn rebaudioside A nồng độ 500ppm .................................... 32
Hình 4.7. Đƣờng chuẩn biểu hiện mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ
stevioside ....................................................................................................................... 33
7


Hình 4.8. Sắc đồ chuẩn stevioside nồng độ 60ppm .............................................. 33
Hình 4.9. Sắc đồ chuẩn stevioside nồng độ 100ppm ............................................ 34
Hình 4.10. Sắc đồ chuẩn stevioside nồng độ 160ppm .......................................... 34
Hình 4.11. Sắc đồ chuẩn stevioside nồng độ 200ppm .......................................... 35
Hình 4.12. Sắc đồ mẫu cỏ ngọt khơ ...................................................................... 37
Hình 4.13. Sắc đồ mẫu cỏ cây ngọt tƣơi ............................................................... 37
Hình 4.14. Sắc đồ mẫu cành cây cỏ ngọt .............................................................. 38
Hình 4.15. Sắc đồ mẫu hoa cây cỏ ngọt ................................................................ 38
Hình 4.16. Sắc đồ mẫu lá cây cỏ ngọt ................................................................... 39
Hình 4.17. Sắc đồ mẫu cây cỏ ngọt tƣơi thêm chuẩn .......................................... 39
Hình 4.18. Sắc đồ mẫu bánh lƣơng khơ ................................................................ 40
Hình 4.19. Sắc đồ mẫu nƣớc lipovitan .................................................................. 40

8

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ACN: Acetonitrile.
DAD: Detector Diod Array.
HPLC : Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
HPLC/UV: Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao / tử ngoại.
MeOH: Methanol.
RSD : Độ lệch chuẩn tƣơng đối.
SKPB: Sắc ký phân bố.
SKPT: Sắc ký pha thƣờng.
SKPĐ: Sắc ký pha đảo.
THF: Tetrahydrofuran.
UBND: Uỷ ban nhân dân.
UV-VIS: Ultraviolet spectrophotometer – quang phổ tử ngoại khả kiến.

9


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH

CỘNG HÒA XÃ HỘ CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên : Lê Thị Thành
Mã số sinh viên

: 0952043561

Khóa

: 50

Ngành

: Công nghệ thực phẩm

1. Tên đề tài: Nghiên cứu định lượng rebaudioside A trong cây cỏ ngọt và một số sản
phẩm từ cây cỏ ngọt bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
2. Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp
- Nghiên cứu tính chất vật lý, hóa học của các chất ngọt trong cây cỏ ngọt.
- Nghiên cứu định lƣợng rebaudioside A bằng phƣơng pháp HPLC.
- Nghiên cứu hàm lƣợng rebaudioside A trong cây cỏ ngọt và một số mẫu thực phẩm
chứa đƣờng cỏ ngọt.
- Đƣa ra một số đề xuất về hƣớng sản xuất đƣờng cỏ ngọt trong tƣơng lai.
3. Họ tên cán bộ hƣớng dẫn

: ThS. Lê Thế Tâm

4. Ngày giao nhiệm vụ đồ án

: ngày tháng

5. Ngày hoàn thành đồ án

: ngày tháng năm 2013.

năm 2013.

Vinh, ngày tháng năm 2013.
Chủ nhiệm bộ môn

Cán bộ hƣớng dẫn

(Ký, ghi rõ họ tên)

(Ký, ghi rõ họ tên)

Ngƣời duyệt
(Ký, ghi rõ họ tên)

10


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH

CỘNG HÒA XÃ HỘ CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên : Lê Thị Thành
Mã số sinh viên

: 0952043561

Khóa

: 50

Ngành
: Cơng nghệ thực phẩm
Cán bộ hƣớng dẫn : ThS. Lê Thế Tâm
Cán bộ duyệt
:
1. Nội dung nghiên cứu, thiết kế
2. Nhận xét của cán bộ hƣớng dẫn
Ngày tháng năm 2013
Cán bộ hƣớng dẫn
(Ký, ghi rõ họ tên)
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Bốn ngàn năm trƣớc đây, ngƣời Ai Cập đã thích ăn đồ ngọt trong mật ong, trái
chà là. Trong lăng mộ vua Toutankhamon đã thấy có chất ngọt glycerrhizin phát xuất
từ cây cam thảo.Vào thời đại này, con ngƣời sử dụng nhiều loại thức ăn, nhiều chất
kích thích với liều dùng quá cao hoặc quá thƣờng xuyên nên đã phát sinh sự lệ thuộc,
phá hủy sức khỏe. Đơi lúc những chất này cịn tác dụng phần nào lên hệ thần kinh hay
các cơ quan khác của cơ thể: cà phê, thuốc lá, rƣợu, muối….và đƣờng.
Ngày nay, trên thế giới con ngƣời tiêu thụ khoảng 100 tấn đƣờng hàng năm vì
tính chất rẻ tiền, bùi miệng, đƣờng lại rất cần thiết cho việc phát dục của cơ thể. Tuy
nhiên, đƣờng cũng có những mặt trái của nó, vì cung cấp nhiều năng lƣợng nên nó có
thể làm cho cơ thể béo phì mặc dù khơng phải dùng quá độ. Trong miệng, các vi
khuẩn có thể chế tạo ra các axit tác dụng lên răng. Vì vậy, để tránh lên cân, hƣ răng,
cũng nhƣ các bệnh nhân mắc chứng đái đƣờng, ngƣời ta buộc lòng phải kiêng cử hoặc
dùng đƣờng ít lại, kiêng kẹo, kiêng kem, bỏ chè, bỏ nƣớc ngọt hay tốt hơn là dùng một
chất thay thế. Chất này phải cung cấp ít năng lƣợng hoặc có độ ngọt cao hơn để có thể
sử dụng lƣợng ít hơn. Đồng thời, những chất này phải thỏa mãn điều kiện không đƣợc
11

phân hủy trong miệng khi có nƣớc miếng tác dụng và nhất là không biến đổi trong
môi trƣờng axit nhƣ đƣờng.
Hiện nay, trên thị trƣờng đã có rất nhiều sản phẩm hóa học tạo vị ngọt có thể
dùng để thay thế đƣờng (saccharin, sodium cyclamate, sucralose, acesulfame
potassium, phổ biến nhất là chất aspartame). Những chất này khơng có tính dinh
dƣỡng, đặc biệt là có vị ngọt cao gấp cả trăm lần so với đƣờng nhƣng lại cho rất ít
calorie chỉ có khoảng 2,2 calo cho mỗi gói nhỏ trong khi chỉ một muỗng cafe đƣờng
đã sinh ra tới 16 calo. Các chất hóa học này xuất hiện hầu hết trong các loại thức ăn và
thức uống hằng ngày. Mặc dù chúng rất rẻ và tiện dụng nhƣng ngƣời ta rất e ngại rằng
chúng sẽ ảnh hƣởng về lâu về dài đến sức khỏe. Qua một số nguyên cứu về tác hại của
chúng thì saccharin đã bị cấm sử dụng ở một số quốc gia vì thí nghiệm cho thấy nó tạo
ung thƣ bàng quang ở loài chuột.
Đối với những ngƣời mắc bệnh phenylketonuria thì khơng nên dùng aspartame.
Đây là bệnh di truyền rất hiếm thấy, trong đó vì sự lệch lạc của một gene của cơ thể
không sản xuất đƣợc enzyeme khử bỏ chất phenylalanine. Khi ăn vào, aspartame sẽ
phân thành aspartid acid và phenylalanine, chất này tích tụ trong não sẽ gây tổn hại
cho hệ thần kinh trung ƣơng và có thể chết.
Trƣớc các nguy hại này của chất hóa học, tâm lý chung của ngƣời tiêu dùng là
muốn tìm lại các sản phẩm thực phẩm từ thiên nhiên. Trong nhóm các chất tạo vị ngọt
từ thiên nhiên thì đƣờng có trong cây cỏ ngọt ngày càng đƣợc nhiều ngƣời chú ý đến.
Đƣờng cỏ ngọt ngày càng đƣợc sử dụng phổ biến và rộng rãi trên toàn thế giới. Nghiên
cứu cho thấy có 4 hợp chất chính tạo vị ngọt trong cỏ là stevioside (5 – 10%),
rebaudioside A (2 – 4%), rebaudioside C (1 – 2%) và dulcoside A (0,5 – 1%).
Trong những năm gần đây, cây cỏ ngọt đã đƣợc đƣa vào trồng và sử dụng ở một
số khu vực Việt Nam. Các thành phần trong cây cỏ ngọt là nguyên liệu đƣợc sử dụng
chủ yếu trong công nghiệp thực phẩm và y dƣợc học. Trên thị trƣờng Việt Nam đã có
nhiều sản phẩm đƣờng cỏ ngọt đƣợc sử dụng nhƣ thực phẩm ăn kiêng, thực phẩm chức
năng,… .

Trong các thành phần hoá học tạo vị ngọt trong cây cây cỏ ngọt thì stevioside và
rebaudioside A là các hợp chất tạo độ ngọt chính. Để xác định chính xác hàm lƣợng
các loại đƣờng trong cỏ ngọt và một số sản phẩm thực phẩm, tôi chọn đề tài ‘‘Nghiên

12


cứu định lƣợng rebaudioside A trong cây cỏ ngọt và một số sản phẩm từ cây cỏ
ngọt bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)’’.

Hình i. Tinh thể stevioside.
2. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Nghiên cứu khảo sát hệ dung mơi thích hợp để chiết tách hỗn hợp các hợp chất
trong cây cỏ ngọt và một số sản phẩm.
- Nghiên cứu việc định lƣợng stevioside và rebaudioside A bằng phƣơng pháp
HPLC.
- Xác định hàm lƣợng stevioside và rebaudioside A trong cây cỏ ngọt và một số
sản phẩm thực phẩm.
- Đề xuất việc sản xuất và sử dụng stevioside và rebaudioside A trong đời sống.
3. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu là dịch chiết từ cây cỏ ngọt (thân cành, hoa, lá) và các sản
phẩm chế biến từ cỏ ngọt nhƣ lƣơng khô, nƣớc giải khát lipovitan.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài.
Kết quả nghiên cứu là nguồn tham khảo cho những nghiên cứu sản xuất
stevioside và rebaudioside A từ cây cỏ ngọt.

13


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về cây cỏ ngọt
1.1.1. Giới thiệu [2]
- Tên thƣờng gọi: Cỏ ngọt hay cỏ đƣờng, cỏ mật,cỏ cúc.
- Tên khoa học: Stevia rebaudiana .

Hình 1.1. Cây cỏ ngọt.

Hình 1.2. Cây cỏ ngọt.

(đã trổ hoa)

(chƣa trổ hoa)

* Phân loại khoa học
- Giới : Plantae
- Bộ : Asterales
- Họ : Asteraceae
- Tông : Eupatorieae
- Chi : Stevia
* Phân loại theo lồi
Cỏ ngọt có khoảng 240 lồi có nguồn gốc từ vùng Nam Mỹ, Trung Mỹ, Mexico
và một vài tiểu bang miền nam Hoa Kỳ .
Một số loài cỏ ngọt tiêu biểu sau : Stevia eupatoria, Stevia ovate, Stevia
plummerae, Stevia rebaudiana, Stevia salicifolia, Stevia serrata.
Tuy nhiên các nhà khoa học đã khảo sát trên 184 loài cỏ ngoạt thì có khoảng 18
lồi đã cống hiến chất ngọt nhƣng trong 18 loài này Stevia ribaudiana là loài cho chất
ngọt nhiều nhất.
14

* Nguồn gốc cây cỏ ngọt
Có nguồn gốc từ thung lũng Rio Monday nằm ở đông bắc Panama Trung Mỹ.
Vào thế kỉ 16, các thủy thủ ngƣời Tây Ban Nha đã từng đề cập đến loại thảo mộc
này nhƣng đến năm 1888, các nhà thực vật học ngƣời Paraguay là Mises Santiago
Bertoni mới phân loại và chính thức đặt tên gọi nó là Stevia rebaudianoa Bertoni.
Từ ngàn năm nay, thổ dân Guarani ngƣời Paraguay đã dùng loại thảo mộc này để
làm dịu ngọt các loại thức ăn, nƣớc uống có tính đắng và cũng dùng để trị một số bệnh
béo phì, tim mạch, cao huyết áp.
1.1.2. Đặc điểm thực vật [2], [3], [4]
Thân cành:
Cỏ ngọt có dạng thân bụi thân trịn có nhiều lơng, mọc thẳng.Chiều cao thu hoạch
là 50 – 60 cm, tốt đạt 80 – 120 cm, thân chính có đƣờng kính đạt 2,5 – 8 mm. Cỏ ngọt
phân cành nhiều, khi ra hoa mới phân cành cấp 2, cấp 3. Cành cấp 1 thƣờng xuất hiện
từ các đốt lá cách mặt đất 10 cm. Thông thƣờng, cây cỏ ngọt cho 25 – 30 cành. Tổng
số cành trên cây có thể đạt 140 cành. Thân non màu xanh, già màu tím nâu, có hệ thân
mầm phát triển mạnh.
Lá:
Mọc đối thành từng cặp hình thập tự, mép lá có từ 12 – 16 răng cƣa. Lá hình
trứng ngƣợc. Cây con gieo từ hạt có 2 lá mầm trịn tới cặp lá thứ tƣ mới có răng cƣa ở
mép lá. Lá trƣởng thành dài khoảng 50 – 70mm, rộng 17 – 20 mm, có 3 gân song
song, lá màu xanh lục, trên thân có 70 – 90 lá.
Hoa:
Hoa tự, nhóm họp dày đặc trên đế hoa, trong đó có 4 – 7 hoa đơn lƣỡng tính. Mỗi
hoa đơn hình ống có cấu trúc gồm một đế hoa với 5 đài màu xanh, 5 cánh tràng màu
trắng khoảng 5 mm, các lá bắc tiêu giảm, nhị 4 – 5 dính trên tràng có màu vàng sáng,
các chỉ nhị rời cịn bao phấn dính mép với nhau. Bầu hạ 1 ơ, 1nỗn, vịi nhụy mảnh
chẻ đơi, các nhánh hình chỉ cao hơn bao phấn do đó mà khả năng tự thụ phấn thấp
hoặc khơng có.
Quả và hạt:
Quả và hạt của cây cỏ ngọt nhỏ, thuộc loại quả bế, khi chín màu nâu thẫm, 5 cạnh

dài từ 2 – 2,5 mm. Hạt có 2 vỏ hạt, có phơi, nhƣng nội nhũ trần nên tỉ lệ này mầm
thấp.
15


Rễ:
Rễ của cây gieo từ hạt ít phát triển hơn so với cành giâm. Hệ rễ chùm lan rộng ở
đƣờng kính 40 cm và có độ sâu từ 20 – 30 cm, hệ rễ phát triển tốt trong điều kiện đất
tơi xốp, đủ ẩm. Cỏ ngọt là cây lâu năm có thân rễ khỏe, mọc nơng từ 0 – 30 cm tùy
thuộc vào độ phì nhiêu, tơi xốp và mực nƣớc ngầm của đất.
1.1.3. Các giai đoạn sinh trƣởng phát triển [4], [7]
1.1.3.1. Thời kì nảy mầm
Sau khi gieo hạt 9 – 10 ngày thì mọc, nhiệt độ thích hợp cho nảy mầm từ 20 –
250C, ẩm độ từ 60 – 85%. Nhiệt độ dƣới 150C, hạt không nảy mầm, trên 350C hạt sẽ
chết. Hạt nảy mầm sau 50 – 60 ngày mới đủ khỏe để cấy ra ruộng. Cây con mọc từ hạt
yếu. Sản xuất cây con bằng cành giâm sau 5 – 10 ngày cành giâm bắt đầu ra rễ, rút
ngắn thời gian ở vƣờn ƣơm xuống còn 14 – 20 ngày. Điều kiện giai đoạn giâm cành:
nhiệt độ từ 25 – 300C, ẩm độ từ 70 – 80%.
1.1.3.2. Thời kì trƣởng thành
Sau giai đoạn cây con, cỏ ngọt bắt đầu phát triển nhanh, có thể cắt lứa đầu sau
khi trồng đến 30 – 45 ngày. Nhiệt độ thích hợp thời kỳ này là 15 – 300C, độ ẩm 70 –
75%, nhiệt độ < 50C cây sẽ chết.
1.1.3.3. Thời kỳ ra hoa
Cây cao từ 50 – 60 cm thì ra hoa, nếu thâm canh tốt có thể cao tới 80 cm mới ra
hoa. Cỏ ngọt là cây phản ứng với ánh sáng nên thƣờng ra hoa từ tháng 6 – 10 dƣơng
lịch, từ tháng 10 – 12 cỏ ngọt chỉ cao từ 15 – 20 cm đã ra hoa. Do đó, thời kì này cần
tăng số lần thu hoạch.
1.1.4. Phân bố và tình hình trồng trọt [5], [7]
1.1.4.1. Phân bố
Cỏ ngọt đƣợc trồng chủ yếu ở Paraguay, Brazil, Nhật Bản và Trung Quốc.

Chúng đƣợc nhập vào nƣớc ta từ năm 1988 trồng thử nghiệm. Hiện nay, cỏ ngọt đã
thích ứng với những vùng khí hậu khác nhau của nƣớc ta, sinh trƣởng tốt tại Sông Bé,
Lâm Ðồng, Ðắc Lắc, Hà Nội, Hà Tây, Hồ Bình, Vĩnh Phú, n Bái.

16


Bảng 1.1. Tình hình sản xuất và sử dụng cỏ ngọt ở một số nƣớc trên Thế giới
[7].
Nguồn cỏ ngọt (tấn)

1982

Sản
lƣợng
(tấn)
70

Nhật
Bản
200

Hàn
Quốc
30

Đài
Loan
200

Trung
Quốc
200

Các nƣớc
khác
70

1983

1000

300

30

150

450

70

1984

1400

200

0

200

1000

0

1985

1600

200

0

150

1200

50

1986

1500

200

0

150

1100

50

1987

1700

200

0

200

1300

100

Năm

1.1.4.2. Tình hình trồng trọt nƣớc ta
Hiện nay, cỏ ngọt đƣợc trồng rất nhiều và diện tích ngày càng đƣợc ngƣời dân
mở rộng ở huyện Khoái Châu của tỉnh Hƣng yên. Điển hình là ở xã An Vĩ – địa
phƣơng trồng nhiều cỏ ngọt nhất ở huyện này, diện tích trồng cỏ ngọt đã lên đến gần
25 ha. Gần đây, trên địa bàn tỉnh Bắc Giang, Công ty Cổ phần Stevia Ventures và
Trung tâm Nghiên cứu Giống
và Phát triển cây trồng Hà Nội
(Viện Dƣợc liệu) phối hợp với
Sở Khoa Học và Cơng Nghệ
Bắc Giang, UBND xã Nội

Hồng (huyện n Dũng) đã tổ
chức hội nghị triển khai dự án
cây cỏ ngọt với kế hoạch là mở
rộng diện tích vùng nguyên liệu
cỏ ngọt để đáp ứng thị trƣờng

Hình 1.3. Cánh đồng cỏ ngọt

xuất khẩu.

Mỗi lứa cỏ, nếu chăm sóc tốt chỉ khoảng 1 tháng là cho thu hoạch. Tuy nhiên,
nhiều hộ có kinh nghiệm trồng cỏ ngọt cho biết, cỏ ngọt địi hỏi cả cơng chăm sóc, vốn
đầu tƣ về phân bón, thuốc bảo vệ thực vật và kỹ thuật canh tác nên chi phí cho trồng
cỏ ngọt cũng cao hơn nhiều so với trồng lúa. Đất trồng cỏ phải đánh luống cao, có rãnh
chứa nƣớc và thốt nƣớc, đủ độ ẩm thƣờng xuyên nhƣng không đƣợc ngập úng.
17


Nên nếu giá thu mua cao thì ngƣời dân lãi cao, nếu giá xuống thấp cộng với năng
suất giảm thì sẽ lãi ít hoặc thua lỗ. Chỉ cần những rủi ro nhỏ nhƣ: nắng dài ngày thiếu
nƣớc tƣới, mƣa vài ngày khơng tiêu nƣớc kịp là có thể bị mất trắng. Mặt khác, việc
trồng và mua bán cỏ ngọt tại Khoái Châu vẫn ở dạng tự phát, tiêu thụ sản phẩm dựa
vào tƣ thƣơng, giá cả biến động theo thị trƣờng nên dù hiện nay giá cao nhƣng bấp
bênh, đầu ra khơng ổn định.
1.1.5. Thành phần hóa học của cỏ ngọt
Bảng 1.2. Thành phần % các chất trong cây cỏ ngọt [6], [7].
Chất

Thành phần %

Protein

6,2%

Lipit

5,6%

Carbohydrates tổng số

52,8%

Stevioside

15%

Các chất hoà tan trong nƣớc

42%

Thành phần hóa học của cỏ ngọt rất phức tạp, có hàng chục glycoside khác nhau
và sau đây là các chất tạo ngọt chính trong của cỏ ngọt :
Bảng 1.3. Thành phần hố học các chất tạo ngọt chính trong cây cỏ ngọt [7].
CTCT
Hợp chất

CTPT
R1

R2

Độ ngọt

Hàm

so với

lƣợng

glucose

(%)

Stevioside

C38H60O18

G

G–G

150- 300

9.1

Steviol

C20H30O3

H

H

-

-

-

H

G–G

100- 125

-

Rebaudioside A

C44H70O23.3H 2º

G

G- G- G

200- 400

3.8

Rebaudioside B

C38H60O18.2H2O

H

G- G- G

300- 500

-

Rebaudioside C

C44H70O22.3H2O

G

G- G- Rh

50- 120

0.6

Rebaudioside D

-

G–G

G- G- G

200- 300

-

Dulcoside A

-

G

G – Rh

50- 120

0.3

Stevioboside

18


1.2. Tổng quan về stevioside và rebaudioside A [3], [10]
1.2.1. Tính chất hố học
Stevioside và hợp chất tƣơng tự rebaudioside A là các dạng diterpene glycoside
(diterpene: các đồng đẳng của terpene hay tecpinen C6H16) có chứa 20 nguyên tử
Carbon và có 4 nhánh là nhóm methyl đƣợc tìm thấy trong lá của cây Stevia
rebaudiana.
Những chất ngọt này là các glycoside, thƣờng có chung nhóm phi đƣờng là
steviol (glycoside là một phân tử gồm một gốc đƣờng liên kết với một nhóm phi

đƣờng). Liên kết với nhóm phi đƣờng steviol là các carbohydrate, số lƣợng các
carbohydrate và vị trí các liên kết này giúp phân biệt các chất ngọt steviol glycoside
khác nhau, cũng nhƣ liên quan đến các tính chất cảm quan riêng của mỗi chất.

Hình 1.4. Nhóm Steviol.
Phân tử Stevioside gồm nhóm steviol liên kết với một glucose (bằng liên kết β)
và phần còn lại là một glucose-glucose disaccharide (hai phân tử β-D-glucose liên kết
với nhau bằng liên kết 2-1, hay cịn đƣợc gọi là sophorose).

Sophorose
Hình 1.5. Cơng thức hóa học của stevioside, gồm nhóm steviol liên kết với một phân tử
β – D – glucose và một sophorose.
19


Ngƣời ta nhận thấy stevioside ngồi vị ngọt cịn có hậu vị đắng. Vài dạng chất
ngọt tƣơng tự khác đã đƣợc nhận biết (có ít nhất tám loại steviol glycoside), tuy nhiên
chúng chƣa đƣợc nghiên cứu rõ và không cho lợi ích thƣơng mại cao bằng stevioside
và rebaudioside A.
Steviol glycoside có thể đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp HPLC sử dụng nƣớc/
acetonitrile C2H3N là chất tách rửa.

Hình 1.6. Sự liên kết của steviol và các carbohydrate để tạo thành
steviolmonoside, steviolbioside, stevioside và rebaudioside A.
1.2.2. Tính chất vật lý.
Stevioside là chất tạo ngọt bền vững. Một nghiên cứu chi tiết đã kiểm tra tính bền
vững của chất tạo ngọt này cho thấy, chúng có tính ổn định khi tiến hành kiểm tra
trong acid phosphoric carbonate và trong các loại nƣớc giải khát có chứa acid citric.
Sau hai tháng cất giữ ở 370C, ngƣời ta đã xem xét những sự thay đổi có thể xảy ra,
nhƣng khơng có biến đổi nào đƣợc ghi nhận đối với các sản phẩm nƣớc giải khát đƣợc

lƣu trữ tại nhiệt độ phòng, kết quả tƣơng tự khi lƣu trữ với nhiệt độ thấp hơn trong
vòng 5 tháng bằng cách phơi nắng trong 1 tuần thì stevioside hồn tồn bền vững .
Đặc biệt, Stevioside khơng tạo calorie, không lên men và rất ổn định ở nhiệt độ cao
198oC (388oF ), không trở nên xạm màu, và cũng không trở thành đƣờng caramel đặc
kẹo.
20


1.2.3. Tính chất cảm quan.
Lá cây Stevia rebaudiana tƣơi và bột khô từ loại cây này đƣợc xác định là có độ
ngọt gấp 10 – 15 lần so với đƣờng mía. Hợp chất tinh chế từ cây Stevia rebaudiana, có
dạng bột trắng, chứa 85 – 95% steviosides, ngọt hơn đƣờng mía từ 200 – 300 lần. Cả
dạng bột khơ từ cây và dạng bột tinh chế đều có một hậu vị đắng nhẹ (do chứa chủ yếu
là stevioside), đồng thời cho cảm giác giống tính chất của cam thảo.
Mặc dù nhiều cố gắng từ rất sớm để nhân giống và phát triển rộng cây Stevia
rebaudiana không thành công nhƣng những nỗ lực đáng kể ở Nhật cuối cùng cũng cho
kết quả khả quan. Ngày nay, cây Stevia rebaudiana đƣợc trồng từ rễ và đƣợc trồng
thƣơng mại rộng khắp ở nhiều quốc gia, gồm Nhật Bản, Đài Loan, Hàn Quốc, Trung
Quốc và Brazil. Thành phần của steviol glycoside phụ thuộc vào nguồn cây trồng,
nhƣng trong đa số các trƣờng hợp, stevioside là dạng chiếm ƣu thế hơn. Do stevioside
có một hậu vị đắng dễ nhận thấy, nên chất làm ngọt này chƣa đƣợc chấp nhận ở một số
thị trƣờng, và trong nhiều năm chỉ phổ biến ở một thị trƣờng vừa phải.
1.3. Một số sản phẩm đƣờng ăn kiêng trên thị trƣờng [7]
Trên thị trƣờng hiện nay có các loại sản phẩm đƣờng đƣợc chế biến từ chiết xuất
stevioside của cây cỏ ngọt nhƣ sau:
1.3.1. Thuốc thay thế đƣờng trắng cho ngƣời béo phì
Tên gọi: Thuốc số 104 stevia.
Cơng dụng:
Hạ đƣờng huyệt cho bệnh nhân bị bệnh tiểu
đƣờng. Ngoài ra, sản phẩm này cịn có tác dụng

là giảm sự thèm ăn đƣờng, ăn tinh bột và nhờ vậy
mà hiện nay stevia đang rất thịnh hành với các
bệnh nhân tiểu đƣờng hoặc những ngƣời muốn
xuống cân.
Sản phẩm này không những đƣợc ƣa
chuộng tại Mỹ mà cịn nhiều nƣớc khác trên thế
giới.
Hình 1.7. 104 Stevia.

21


1.3.2. Tinh chất bột thay thế đƣờng
Tên gọi: 105 stevia
Công dụng:
- Sản phẩm này cũng có cơng dụng
giống nhƣ sản phẩm 104 stevia nó thay thế
đƣờng trắng đối với ngƣời béo phì.
- Giảm thiểu sự thèm ăn đƣờng, ăn
tinh bột.
- Dùng cho các bệnh nhân tiểu đƣờng
hoặc những ngƣời muốn xuống cân .
Hình 1.8. 105 stevia.
1.3.3. Stevia Extract trắngbột (25 g)
Thành phần: 100% chất chiết từ stevia
nguyên chất trong đó có tối thiểu là 90%
stevioside (gồm 40% rebaudiosde A).
Đặc điểm:
- Sản phẩm này rất ngọt khơng có dƣ vị
đắng khi sử dụng ít.

- Stevia Extract có nhiệt độ ổn định và
an tồn cho bệnh nhân tiểu đƣờng vì khơng
có calore, khơng carbohydrats và khơng
hypoglycemics.
- Có chất lƣợng tinh khiết cao.
- Đƣợc Kosher chứng nhận.
- Stevia extract đƣợc sử dụng cho các loại
bánh nƣớng và các nhu cầu của nấu ăn.

22

Hình 1.9. Stevia Extract trắng bột.


1.3.4. Stevia Plus Fiber Packets
Mơ tả: Dạng gói nhỏ cho vào hộp giấy,
trong hộ có 100 gói nhỏ, mỗi gói nhỏ có
trọng lƣợng gram.
Đặc điểm:
- Có vị và chất lƣợng cao nhất trong các
loại đƣờng stevia.
- Hoàn toàn tự nhiên khơng có chất
nhân tạo.
- Khơng calore, khơng glycemic, khơng
aspartame,…
- Khơng đƣờng tinh chế, khơng

Hình 1.10. Stevia Plus Fiber Packets.

maltodextrin, khơng saccarin.

- An tồn cho bệnh nhân tiểu đƣờng vì khơng có carbohydrate và có chứa chất
xơ.
-Tuyệt vời cho nấu ăn và khơng ngọt giống đƣờng hóa học.
- Đƣợc Kosher chứng nhận.
1.3.5. Stevia dạng viên nén:
Đặc điểm:
Đây là chất ngọt tự nhiên, đƣợc bào
chế dƣới dạng viên thuốc herboagar.
Stevia có dạng gần đƣờng và đang đƣợc sử
dụng nhƣ một dạng thay thế đƣờng và chất
ngọt nhân tạo. Sử dụng stevia tinh khiết,
duy trì các điều kiện vệ sinh tiêu chuẩn
làm cho sản phẩm này rất hữu ích cho tất
cả các cá nhân có ý thức và giúp y tế trong
việc quản lý các bệnh.
Cơng dụng:
- Tiểu đƣờng: giúp kích hoạt các tế
bào của tuyến tụy tiết insulin.

Hình 1.11. Stevia dạng viên nén.

- Nhiều hơn đồng thời làm tăng dung
23


nạp glucose ở bệnh nhân tiểu đƣờng.
- Cao huyết áp.
- Chống sâu răng.
- Giảm cân.
- Điển hình cho da mụn và các bệnh khác.

1.4. Các sản phẩm từ cỏ ngọt ở Việt Nam [8]
1.4.1. Chè Artiso – Cỏ ngọt
- Thành phần: lá, thân và rễ artiso, cỏ ngọt
và hƣơng liệu tự nhiên.
- Công dụng: làm nƣớc giải khát, mát gan,
thông mật, giải độc, an thần, hạ cholesterol.
- Do trung tâm cây thuốc Đà Lạt sản xuất.
Hình 1.12. Chè Artiso – Cỏ ngọt
1.4.2. Chè sâm quy – Cỏ ngọt
- Thành phần: sâm ngọc linh, tam
thất, đƣơng quy, thục địa, táo, long nhãn,
ngũ gia bì và cỏ ngọt.
- Cơng dụng: bổ huyết, tăng lực, tiêu
hóa, tiêu độc, giải nhiệt, giúp giảm tiêu
đƣờng, ngủ ngon.
- Do trung tâm cây thuốc Đà Lạt
sản xuất.
Hình 1.13. Chè sâm quy – Cỏ ngọt.
1.4.3. Chè Stevin
- Thành phần: lá dừa cạn (Folia vincae roseae), cúc hoa (Flores chrysangthemi
sinensis), hoa hịe (Flores sopharae japonica) và cỏ ngọt.
- Cơng dụng: tăng sức đàn hồi, làm bền vững thành mạch máu, có tác dụng lƣu
thơng khí huyết, chống nhiễm xạ.
- Do xí nghiệp Dƣợc phẩm trung ƣơng 2, Hà nội sản xuất.

24


1.4.4. Chè ngọt Sweet tea
- Thành phần: chè đen và cỏ

ngọt.
- Công dụng: làm đồ uống
giải nhiệt.
- Do nhà máy chè Kim Anh
sản xuất.
Hình 1.14. Chè ngọt.
1.4.5. Chè thảo mộc Sweet herbtea
- Thành phần: chè đen, cỏ ngọt
(đƣợc chế biến theo quy trình lên
men)
- Cơng dụng: làm đồ uống giải
nhiệt .
- Do nhà máy chè Kim Anh sản
xuất.
Hình 1.15. Chè thảo mộc.
Ngồi ra cịn nhiều loại chè giải nhiệt đƣợc kết hợp với cỏ ngọt nhƣ nhân trần – cỏ
ngọt, thảo quyết minh – cỏ ngọt, hoa hòe – cỏ ngọt, …
1.4.6. Lƣơng khô Happy Life
Thành phần : Bơ thực vật, hạt
điều, cỏ ngọt, sữa bột gầy.
Cơng dụng: thích hợp cho
ngƣời mắc bệnh tiểu đƣờng, béo
phì, ngƣời có bệnh tim mạch, cao
huyết áp phải kiêng đƣờng kính.
Do Cơng ty 22 – Tổng cục
Hậu Cần – Bộ quốc phịng sản xuất.

Hình 1.16. Lƣơng khô Happy Life.
25

1.5. Tổng quan về phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [1], [8]
HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phƣơng pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trƣớc đây gọi là phƣơng
pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography).
1.5.1. Khái niệm
Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967 – 1968 trên cơ
sở phát triển và cải tiến từ phƣơng pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phƣơng pháp
chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã đƣợc
phân chia dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một
chất mang đã đƣợc biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phƣơng
pháp này ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao,
khả năng định lƣợng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy
nhiệt.
Phạm vi ứng dụng của phƣơng pháp HPLC rất rộng, nhƣ phân tích các hợp chất
thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm,
dƣợc phẩm, môi trƣờng…
1.5.2. Phân loại
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, ngƣời ta chia
HPLC thành 4 loại:
- Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography).
- Sắc ký phân bố (partition chromatography).
- Sắc ký ion (ion chromatography).
- Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).
Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) đƣợc ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích
đƣợc những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất
ion có khối lƣợng phân tử khơng quá lớn (< 3000).
SKPB đƣợc chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tƣơng đối giữa pha tĩnh và
pha động: sắc ký pha thƣờng – SKPT (normal phase chromatography) và sắc ký pha
đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography).

* Sắc ký pha thƣờng:
- Pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động. Pha tĩnh loại này sẽ có ái
lực với các hợp chất phân cực.
26


- SKPT dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử
lƣợng khơng lớn lắm.
- Trong pha thƣờng, chất kém phân cực ra trƣớc, chất phân cực ra sau.
- Dung môi rửa giải là các dung môi kém phân cực nhƣ n - hexan, benzen, ete
dầu hỏa,...
* Sắc ký pha đảo:
- SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân cực hơn pha
động.
- Phƣơng pháp này dùng phân tích các hợp chất từ khơng phân cực đến phân cực.
Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân
tích bằng SKPĐ.
- Trong pha đảo, chất phân cực ra trƣớc cịn chất kém phân cực ra sau.
- Dung mơi sử dụng trong SKPĐ là các dung môi phân cực, trong đó dung mơi
nƣớc đóng vai trị quan trọng mà lại rẻ tiền. Do đó, SKPĐ đƣợc ứng dụng nhiều và
phổ biến hơn SKPT.
1.5.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo
Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ đƣợc gắn lên
chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:
- Pha tĩnh đƣợc giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký
lỏng – lỏng (liquid – liquid chromatography).
- Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase
chromatography).
Trong quá trình sử dụng, ngƣời ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ƣu điểm
hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau:

+ Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng – lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất
mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích.
+ Do pha tĩnh của sắc ký lỏng – lỏng dễ tan trong pha động nên ngƣời ta không
thể ứng dụng phƣơng pháp rửa giải gradient dung mơi.
Vì vậy, ngƣời ta thƣờng chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết và
phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này.

27