Xây dựng quy trình bradford phân tích protein tổng số huyết tương ở các bệnh nhân đái tháo đường type 2

z

[Date]


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

NGUYỄN NGỌC HỊA

XÂY DỰNG QUY TRÌNH BRADFORD PHÂN TÍCH
PROTEIN TỔNG SỐ HUYẾT TƯƠNG Ở CÁC BỆNH NHÂN
ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE 2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2021


1


z


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

NGUYỄN NGỌC HỊA

XÂY DỰNG QUY TRÌNH BRADFORD PHÂN TÍCH
PROTEIN TỔNG SỐ HUYẾT TƯƠNG Ở CÁC BỆNH NHÂN
ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE 2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH DƯỢC HỌC

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN: TS. VŨ THỊ THƠM
ThS. VŨ VÂN NGA

HÀ NỘI – 2021



LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp này là thành quả đánh dấu sự kết thúc 5 năm rèn luyện
miệt mài trên giảng đường Trường Đại học Y Dược – ĐHQGHN, là tiền đề trang bị
cho sinh viên chúng em những kỹ năng, kiến thức quý báu trước khi bước chân vào
con đường lập nghiệp. Vì vậy, nó có ý nghĩa vơ cùng to lớn đối với mỗi sinh viên.
Để hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này, ngồi những kỹ năng, kiến thức và sự
nỗ lực của chính mình, bản thân em cịn nhận được sự giúp đỡ tận tình từ các thầy
cô giáo, các giáo viên hướng dẫn cùng sự cổ vũ, động viên của gia đình, bạn bè.
Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến những người đã đồng hành cùng em
trong suốt chặng đường học vừa qua.
Lời đầu tiên, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến cô giáo TS. Vũ Thị
Thơm – Bộ môn Y Dược Học Cơ Sở đã luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất,
hướng dẫn và truyền thụ đến em niềm đam mê học tập, nghiên cứu y sinh.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô giáo Ths. Vũ Vân Nga – Giảng viên Bộ
môn Y Dược Học Cơ Sở, người đã luôn đồng hành, tận tâm hướng dẫn và chỉ dạy
những kiến thức, kỹ năng cần thiết, giúp đỡ em hồn thành khóa luận.

Em cũng xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến các cán bộ giáo viên bộ môn Y
Dược Học Cơ Sở và các thầy cô, cán bộ Trường Đại học Y Dược đã giúp đỡ, tạo
điều kiện thuận lợi nhất để em có thể hồn thành khóa luận này.
Em xin cảm ơn đề tài “Hợp tác nghiên cứu kỹ thuật định lượng một số
biomarker ở bệnh nhân bị bệnh võng mạc mắt do đái tháo đường”, mã số nhiệm vụ
NĐT.69/CHN/19 – Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã hỗ trợ
nghiên cứu này.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã ln
cổ vũ, động viên và khuyến khích em trong suốt chặng đường học tập vừa qua.
Xin chúc cho những điều tốt đẹp nhất luôn luôn đồng hành cùng cuộc sống
của mọi người.
Hà Nội, ngày 15 tháng 05 năm 2021
Sinh viên
Nguyễn Ngọc Hòa


LỜI CAM ĐOAN
Em tên là: Nguyễn Ngọc Hòa
MSSV: 16100085
Là sinh viên lớp QHY 2016 ngành Dược học
Em xin cam đoan đề tài: “Xây dựng quy trình Bradford phân tích protein tổng
số huyết tương ở các bệnh nhân Đái tháo đường type 2” là một cơng trình nghiên cứu
độc lập dưới sự đồng hướng dẫn của giáo viên hướng dẫn: TS. Vũ Thị Thơm và Ths.
Vũ Vân Nga – Bộ môn Y Dược Học Cơ Sở. Ngồi ra khơng có bất cứ sự sao chép của
người khác. Đề tài, nội dung báo cáo thực tập là sản phẩm mà em đã nỗ lực nghiên cứu
trong quá trình học tập tại trường Đại học Y Dược – ĐHQGHN. Các số liệu, kết quả
trình bày trong báo cáo là hồn tồn trung thực, em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm, kỷ
luật của bộ mơn và nhà trường đề ra nếu như có vấn đề xảy ra.

Hà Nội, ngày 15 tháng 05 năm 2021

Sinh viên

Nguyễn Ngọc Hòa

ĐTĐ
IFG
IGT
HbA1c
WHO
GDM
ADA
BN


OD
BL


DANH MỤC BẢNG

Tên bảng
Bảng 1.1. Tiêu chuẩn xét nghiệm bệnh ĐTĐ hoặc tiền ĐTĐ ở người
lớn khơng có triệu chứng theo Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ
(American Diabetes Association)
Bảng 1.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh ĐTĐ theo ADA 2020
Bảng 2.1. Vị trí tra mẫu chuẩn vào khay 96 giếng
Bảng 3.1. OD nền khay 96 giếng
Bảng 3.2. Tỉ lệ 1/10, OD đo được của protein chuẩn ở dãy nồng độ 0;
30; 60; 120; 240; 480 μg/mL
Bảng 3.3. Tỉ lệ 1/10, OD đo được của protein chuẩn ở dãy nồng độ 0;

120; 240; 480; 960; 1920 μg/mL
Bảng 3.4. Tỉ lệ 1/10, OD đo được của protein chuẩn ở dãy nồng độ 0;
240; 480; 960; 1920, 3840 μg/mL
Bảng 3.5. Sử dụng phương pháp kiểm định trị số P tính tốn giá trị pvalue cho phương trình đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240
μg/mL, ở tỉ lệ 1/10
Bảng 3.6. Tỉ lệ 1/20, OD đo được của protein chuẩn ở dãy nồng độ 0;
30; 60; 120; 240; 480 μg/mL
Bảng 3.7. Tỉ lệ 1/20, OD đo được của protein chuẩn ở dãy nồng độ 0;
120; 240; 480; 960; 1920 μg/mL
Bảng 3.8. Tỉ lệ 1/20, OD đo được của protein chuẩn ở dãy nồng độ 0;
240; 480; 960; 1920, 3840 μg/mL
Bảng 3.9. Sử dụng phương pháp kiểm định trị số P tính tốn giá trị pvalue cho phương trình đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240
μg/mL, ở tỉ lệ 1/20


Bảng 3.10. Sử dụng phương pháp kiểm định trị số P tính tốn giá trị
p-value cho phương trình đường chuẩn dãy nồng độ 0; 120; 240; 480;
960 μg/mL, ở tỉ lệ 1/20
Bảng 3.11. Vị trí tra mẫu protein chuẩn và mẫu thử vào khay 96 giếng
Bảng 3.12. OD đo được của khay 96 giếng gồm protein chuẩn và mẫu
BN
Bảng 3.13. Xử lý OD dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL BN
ĐTĐ để vẽ đường chuẩn
Bảng 3.14. Sử dụng phương pháp kiểm định trị số P tính tốn giá trị
p-value cho phương trình đường chuẩn BN ĐTĐ
Bảng 3.15. OD của mẫu protein BN ĐTĐ
Bảng 3.16. Nồng độ protein huyết tương trong mẫu đã pha loãng 300
lần (μg/mL)
Bảng 3.17. Nồng độ protein huyết tương trong mẫu BN ban đầu (g/L)
Bảng 3.18. Phần trăm độ lệch nồng độ protein đo bằng phương pháp

Bradford và bằng máy hóa sinh bán tự động tại BV E.


DANH MỤC HÌNH

Tên hình

Hình 1.1. Biểu đồ biểu diễn thành phần các protein trong huyết tương
Hình 3.1. Tỉ lệ 1/10, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240
μg/mL
Hình 3.2. Tỉ lệ 1/10, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 120; 240; 480;
960 μg/mL
Hình 3.3. Tỉ lệ 1/10, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 240; 480; 960;
1920
μg/mL
Hình 3.4. Tỉ lệ 1/10, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240
μg/mL sau phương pháp kiểm định trị số P
Hình 3.5. Tỉ lệ 1/20, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240
μg/mL
Hình 3.6. Tỉ lệ 1/20, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 960
μg/mL
Hình 3.7. Tỉ lệ 1/20, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 240; 480; 960;
1920 μg/mL
Hình 3.8. Tỉ lệ 1/20, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240
μg/mL sau kiểm định trị số P
Hình 3.9. Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL, ở tỉ
lệ 1/10 sau kiểm định trị số P
Hình 3.10. So sánh 2 đường chuẩn tối ưu nhất tại 2 tỉ lệ 1/10 và 1/20
Hình 3.11. Đường chuẩn định lượng protein huyết tương BN ĐTĐ

[Date]

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ.......................................................................................................... 1
Chương 1 - TỔNG QUAN....................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về Đái tháo đường................................................................... 2
1.1.1.

Dịch tễ bệnh ĐTĐ................................................................................. 2

1.1.2.

Khái niệm.............................................................................................. 2

1.1.3.

Triệu chứng và biến chứng.................................................................. 3

1.1.4.

Chẩn đoán............................................................................................. 3

1.1.5.

Phân loại............................................................................................... 6

1.2. Tổng quan về protein huyết tương người................................................. 7
1.2.1.

Khái niệm về huyết tương người.......................................................... 7

1.2.2.

Đặc điểm, thành phần, phân loại hệ protein huyết tương người........7

1.2.3.

Chức năng của các protein trong huyết tương.................................... 9

1.2.4.

Ý nghĩa của việc nghiên cứu hệ protein huyết tương........................10

1.3. Tổng quan các phương pháp định lượng protein.................................. 10
1.3.1. Phương pháp Western blot- Định lượng protein bằng phương pháp
kháng thể......................................................................................................... 11
1.3.2.

Định lượng protein bằng phương pháp khối phổ.............................. 11

1.3.3. Định lượng protein bằng phương pháp đo quang................................12
1.4. Tổng quan về phương pháp Bradford.................................................... 13
1.4.1.

Giới thiệu chung................................................................................. 13

1.4.2.

Cơ chế................................................................................................. 13

1.4.3.

Thuốc thử........................................................................................... 14

1.4.4.

Ưu điểm và hạn chế............................................................................ 14

Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........................15
2.1. Vật liệu nghiên cứu..................................................................................... 15
2.1.1.

Đối tượng nghiên cứu........................................................................ 15

2.1.2.

Địa điểm nghiên cứu.......................................................................... 16

2.1.3.

Hóa chất.............................................................................................. 16

2.1.4.

Thiết bị, dụng cụ................................................................................. 16

2.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................ 16

2.2.1.

Thu nhận mẫu máu từ bệnh nhân..................................................... 16

2.2.2. Phân lập huyết tương từ mẫu máu bệnh nhân, vận chuyển, bảo quản
và lưu trữ......................................................................................................... 16
2.2.3.

Tối ưu hóa quy trình thử nghiệm Bradford....................................... 17

2.2.4. Xác định nồng độ protein trong mẫu huyết tương bệnh nhân ĐTĐ
type 2 bằng phương pháp Bradford................................................................ 20
2.3. Phương pháp xử lý số liệu.......................................................................... 21
2.4. Đạo đức nghiên cứu.................................................................................... 21
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN............................................................... 22
3.1. Kết quả tối ưu hóa quy trình xác định hàm lượng protein trong mẫu
huyết tương bằng phương pháp Bradford....................................................... 22
3.2. Kết quả xác định hàm lượng protein trong mẫu huyết tương bằng
phương pháp Bradford...................................................................................... 33
3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả đo nồng độ protein huyết tương bằng
phương pháp Bradford...................................................................................... 39
3.4. Một số lưu ý................................................................................................. 40
3.5. Một số hạn chế của đề tài........................................................................... 41
KẾT LUẬN............................................................................................................ 42
KIẾN NGHỊ........................................................................................................... 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO


[Date]

ĐẶT VẤN ĐỀ
Đái tháo đường (ĐTĐ) là một trong những bệnh không lây nhiễm ảnh hưởng
lớn đến sức khỏe của người dân trên toàn thế giới, gây những tác động lớn đến toàn
thế giới ở thế kỷ XXI. Tại Việt Nam, hiện có tới 3,53 triệu người đang “chung sống”
với căn bệnh ĐTĐ, và mỗi ngày có ít nhất 80 trường hợp tử vong vì các biến chứng
liên quan [2, 7]. Trong đó, đa phần là ĐTĐ type 2, chiếm đến 90 – 95 % số lượng
bệnh nhân mắc phải.
Cùng với các tế bào máu, huyết tương đóng vai trị quan trọng trong sinh lý cơ
thể. Phân tích huyết tương lâm sàng là quy trình chẩn đốn phổ biến trong y học và các
dấu ấn sinh học huyết tương được sử dụng để phân loại bệnh nhân và hỗ trợ các quyết
định điều trị [15]. Định lượng protein huyết tương là một bước quan trọng để xử lý các
mẫu protein, phân lập và xác định đặc tính; đây là bước tiên quyết trước khi gửi protein
để phân tích và phân tách sắc ký, điện di hoặc hóa miễn dịch [8, 13]. Hiện nay, có rất
nhiều phương pháp dùng để định lượng nồng độ protein huyết tương, trong đó, các xét
nghiệm protein đo màu, chẳng hạn như xét nghiệm Bradford, xét nghiệm Lowry, xét
nghiệm axit bicinchoninic và xét nghiệm biuret … được sử dụng rộng rãi.
Mỗi thử nghiệm đều có những ưu điểm và nhược điểm liên quan đến độ nhạy,
tính dễ thực hiện, khoảng tuyến tính, độ chính xác và sự thay đổi giữa những phịng thí
nghiệm khác nhau [13]. Điểm mấu chốt là bất kỳ phương pháp nào được sử dụng để
định lượng nồng độ protein thì đều cần được hiệu chuẩn thường xuyên [19]. Phương
pháp Bradford phân tích protein là một phương pháp có thể thực hiện nhanh, ứng dụng
được ở nhiều nơi với các hóa chất, thiết bị cơ bản, chi phí thấp, có độ nhạy cao. Vì vậy,
chúng tơi tiến hành đề tài “Xây dựng quy trình Bradford phân tích protein tổng số
huyết tương bệnh nhân Đái tháo đường type 2” với hai mục tiêu:
1. Xây dựng được quy trình Bradford tối ưu định lượng nồng độ protein huyết

tương
2. Ứng dụng được quy trình để phân tích nồng độ protein ở các BN ĐTĐ type2

1

Chương 1 - TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Đái tháo đường
1.1.1. Dịch tễ bệnh ĐTĐ
Đái tháo đường là một bệnh khơng lây nhiễm đang có sự gia tăng nhanh
chóng tỉ lệ mắc và các biến chứng trên toàn cầu. Trên thế giới, năm 2015, ngoài 415
triệu người (độ tuổi từ 20- 79) đang mắc bệnh đái tháo đường, có 318 triệu người
trưởng thành bị rối loạn dung nạp glucose, khiến họ có nguy cơ cao mắc bệnh trong
tương lai [18]. Đến năm 2019, ĐTĐ đứng thứ 3 trong tổng số 10 nguyên nhân hàng
đầu gây tử vong và là nguyên nhân thứ tư gây tử vong ở phụ nữ [11].
Tại Việt Nam, năm 2015, ước tính có 3,5 triệu người trưởng thành từ 20–79
tuổi mắc ĐTĐ, là nguyên nhân gây ra 53.400 ca tử vong. Các nghiên cứu gần đây
đã báo cáo rằng tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường ở người trưởng thành Việt Nam từ
năm 2004 đến năm 2016 là 3,7–6,0% [18]. Mỗi ngày có ít nhất 80 trường hợp tử
vong vì các biến chứng liên quan ĐTĐ [2].
Dự báo, số người mắc bệnh có thể tăng lên 6,3 triệu vào năm 2045. Với những
số liệu nói trên, Việt Nam được xếp nằm trong 10 quốc gia có tỷ lệ gia tăng bệnh nhân
ĐTĐ cao nhất thế giới với tỷ lệ bệnh nhân tăng 5,5% mỗi năm. Tuy nhiên, theo Bộ Y tế
cả nước mới có chỉ có 29% người bệnh ĐTĐ được quản lý tại các cơ sở y tế, trong khi
số chưa được quản lý theo số liệu thống kê năm 2015 là 71% [2].

1.1.2. Khái niệm
Đái tháo đường (ĐTĐ) là tình trạng mạn tính xảy ra khi cơ thể sản xuất
không đủ insulin hoặc không thể sử dụng insulin, và được chẩn đoán dựa vào nồng
độ glucose máu. Insulin là một loại hormone được sản xuất trong tuyến tụy, có chức
năng vận chuyển glucose từ máu đi vào các tế bào của cơ thể để chuyển hóa thành
năng lượng. Việc thiếu hoặc hoạt động khơng hiệu quả của insulin ở một người bị
bệnh đái tháo đường có nghĩa là glucose vẫn lưu thơng trong máu nhưng không
được vận chuyển vào các tế bào. Theo thời gian, nồng độ cao của glucose trong máu

(được gọi là tăng đường huyết) gây ra tổn thương nhiều mô trong cơ thể, dẫn đến sự
phát triển của các biến chứng sức khỏe gây tàn phế và đe dọa tính mạng [7, 18].

2


1.1.3. Triệu chứng và biến chứng
Sự tăng đường huyết mạn tính của bệnh đái tháo đường có liên quan đến tổn
thương lâu dài, rối loạn chức năng và suy các cơ quan khác nhau, đặc biệt là mắt,
thận, thần kinh, tim và mạch máu [5].
Một số q trình có liên quan đến sự phát triển của bệnh đái tháo đường bao
gồm sự phá hủy tự miễn dịch của các tế bào β tuyến tụy dẫn đến việc bài tiết insulin
không đầy đủ hoặc do những bất thường dẫn đến sự kháng lại hoạt động của insulin
làm giảm phản ứng của mô đối với insulin tại một hoặc nhiều điểm trong con đường
hoạt động phức tạp của hormone. Hai yếu tố này thường cùng tồn tại ở cùng một
bệnh nhân [5].
Sự thiếu insulin hoạt động trên các mơ đích là cơ sở gây ra những bất thường
trong chuyển hóa carbohydrate, chất béo và protein trong bệnh đái tháo đường.
Các triệu chứng của tăng đường huyết rõ rệt bao gồm “4 nhiều”: đái nhiều,
uống nhiều, ăn nhiều, gầy sút cân nhiều và mờ mắt. Hậu quả cấp tính, đe dọa tính
mạng của bệnh nhân là tăng đường huyết với nhiễm toan ceton hoặc tình trạng tăng
thẩm thấu do tăng glucose máu.
Các biến chứng lâu dài của bệnh ĐTĐ bao gồm bệnh võng mạc với khả năng
mất thị lực; bệnh thận dẫn đến suy thận; bệnh thần kinh ngoại biên với nguy cơ loét
bàn chân, cắt cụt chi và khớp; và bệnh thần kinh tự trị gây ra các triệu chứng tiêu
hóa, sinh dục, tim mạch và rối loạn chức năng tình dục.
Bệnh nhân mắc ĐTĐ có tỷ lệ mắc bệnh tim mạch, động mạch ngoại biên và
mạch máu não do xơ vữa động mạch tăng. Tăng huyết áp và các bất thường về
chuyển hóa lipoprotein cũng thường thấy ở những người bệnh ĐTĐ.[5]
1.1.4. Chẩn đoán

1.1.4.1. Đối tượng nguy cơ cao
“Tiền ĐTĐ” là một thuật ngữ thực tế được dùng để chỉ tình trạng rối loạn
đường huyết lúc đói (Impaired Fasting Glucose), rối loạn dung nạp glucose
(Impaired Glucose Tolerance) hoặc hemoglobin glycated (HbA1c) từ 6,0% đến
6,4%, mỗi loại đều khiến người bệnh có nguy cơ cao phát triển bệnh ĐTĐ và các
biến chứng của bệnh [4].

3


Nên theo dõi tình trạng cơ thể thường xuyên để sàng lọc và chẩn đoán sớm
ĐTĐ. Các thử nghiệm chẩn đoán xác định ĐTĐ nên được xem xét và thực hiện ở
các đối tượng sau:
Bảng 1.1. Tiêu chuẩn xét nghiệm bệnh ĐTĐ hoặc tiền ĐTĐ ở người lớn
khơng có triệu chứng theo Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (American
Diabetes Association)[4]
1.

Thử nghiệm nên được xem xét ở người thừa cân hoặc béo phì (chỉ
2

2

số khối cơ thể BMI ≥25 kg / m hoặc ≥23 kg / m ở người Mỹ gốc Á) người
lớn có một hoặc nhiều yếu tố nguy cơ sau:
•

Người thân cấp một như cha, mẹ, anh, chị, em ruột mắc bệnh ĐTĐ

Chủng tộc / dân tộc có nguy cơ cao (ví dụ: Người Mỹ gốc Phi,

Người Latinh, Người Mỹ bản địa, Người Mỹ gốc Á, Người dân đảo Thái Bình
Dương)
•

•

Tiền sử bệnh tim mạch

•

Tăng huyết áp (≥140/90 mmHg hoặc đang điều trị tăng huyết áp)

Mức cholesterol HDL <35 mg / dL (0,90 mmol / L) và / hoặc
mức triglyceride > 250 mg / dL (2,82 mmol / L)
•

•

Phụ nữ mắc hội chứng buồng trứng đa

•

nang Khơng hoạt động thể chất

Các tình trạng lâm sàng khác liên quan đến kháng insulin (ví dụ:
béo phì nặng, acanthosis nigricans)
•

Bệnh nhân tiền ĐTĐ (HbA1c ≥5,7% [39 mmol / mol], IGT,
hoặc IFG) nên được kiểm tra hàng năm.

2.

Những phụ nữ được chẩn đoán mắc ĐTĐ thai kỳ (Gestational
Diabetes Mellitus) nên làm xét nghiệm suốt đời ít nhất 3 năm một lần.
3.

4.

Đối với tất cả các bệnh nhân khác, xét nghiệm nên bắt đầu từ 45

tuổi.
Nếu kết quả bình thường, việc thử nghiệm nên được lặp lại tối
thiểu trong khoảng thời gian 3 năm, có cân nhắc việc thử nghiệm thường
xuyên hơn tùy thuộc vào kết quả ban đầu và tình trạng rủi ro.
5.

4


1.1.4.2.

Chẩn đốn xác định ĐTĐ

Trừ khi có chẩn đốn lâm sàng rõ ràng (ví dụ: bệnh nhân đang trong cơn khủng
hoảng tăng đường huyết hoặc có các triệu chứng cổ điển của tăng đường huyết và
đường huyết tương ngẫu nhiên ≥200 mg / dL [11,1 mmol/L]), chẩn đoán yêu cầu hai
kết quả xét nghiệm bất thường từ cùng một mẫu [21] hoặc trong hai mẫu thử nghiệm
riêng biệt. Nếu sử dụng hai mẫu thử nghiệm riêng biệt, thì thử nghiệm thứ hai, có thể là
lặp lại thử nghiệm ban đầu hoặc thử nghiệm khác, được thực hiện ngay lập tức.

Bảng 1.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh ĐTĐ theo ADA 2020 [4]
Đường huyết lúc đói ≥126 mg/dL (7,0 mmol/L). Bệnh nhân nhịn ăn,
(khơng nạp calo trong ít nhất 8 giờ) *
1.

HOẶC LÀ
Glucose huyết tương thời điểm sau 2 giờ làm nghiệm pháp dung nạp
glucose đường uống ≥200 mg/dL (11,1 mmol/L). Thử nghiệm phải được thực hiện
theo mô tả của WHO, sử dụng một lượng đường chứa tương đương 75 g glucose
khan hòa tan trong nước *.
2.

HOẶC LÀ
3.

HbA1c ≥6,5% (48 mmol / mol) *
HOẶC LÀ

Ở một bệnh nhân có các triệu chứng cổ điển của tăng đường huyết,
glucose huyết tương ngẫu nhiên ≥200 mg/dL (11,1 mmol/L).
4.

* - Trong trường hợp khơng có triệu chứng kinh điển của tăng glucose huyết

(bao gồm tiểu nhiều, uống nhiều, ăn nhiều, sụt cân không rõ nguyên nhân),
chẩn đốn địi hỏi hai kết quả xét nghiệm bất thường từ cùng một mẫu hoặc
trong hai mẫu xét nghiệm riêng biệt.

5

1.1.5. Phân loại
Việc chẩn đoán rõ một trường hợp mắc ĐTĐ nhóm nào là một việc khơng dễ
dàng vì có những trường hợp có sự chuyển biến, nên với nhiều bệnh nhân chỉ có thể
đưa ra thơng tin định nhóm ở thời điểm khám khi đó. Ví dụ như một bệnh nhân mắc
ĐTĐ thai kì, sau sinh tiếp tục tăng đường huyết và có thể chuyển chẩn đốn thành
ĐTĐ type 2 [4].
Phân loại ĐTĐ được Hiệp hội ĐTĐ Hoa Kỳ (ADA) trình vào năm 1997 và
được WHO phê chuẩn và sử dụng đến thời điểm này. Dựa trên cơ chế bệnh sinh,
ĐTĐ được phân thành 3 thể chính:
•

Đái tháo đường type 1

Trước đây ĐTĐ type 1 còn được gọi với các thuật ngữ như ĐTĐ phụ thuộc
insulin hoặc ĐTĐ khởi phát ở tuổi vị thành niên. Thể bệnh này chỉ chiếm 5–10%
những người mắc bệnh ĐTĐ. Nó là kết quả của sự phá hủy tự miễn dịch của tế bào
beta đảo tụy, do sự tương tác giữa tính nhạy cảm di truyền, miễn dịch rối loạn và
các yếu tố môi trường [24]. Ở dạng bệnh ĐTĐ này, tốc độ phá hủy tế bào β khá
nhanh ở các bệnh nhân ít tuổi, đặc biệt là trẻ em và thanh thiếu niên, nhiễm toan
ceton có thể là biểu hiện đầu tiên của bệnh. Do tế bào beta bị phá hủy, bệnh nhân
không cịn hoặc cịn rất ít insulin, vì vậy, sử dụng insulin là điều trị bắt buộc.
•

Đái tháo đường type 2

ĐTĐ type 2 chiếm 90–95% những người mắc bệnh ĐTĐ, trước đây được gọi
là bệnh ĐTĐ không phụ thuộc insulin hoặc bệnh ĐTĐ khởi phát ở người lớn. Thể
bệnh này và các biến chứng của bệnh là những ví dụ điển hình về các bệnh đa
nguyên và phức tạp do sự tương tác giữa nhiều yếu tố di truyền và môi trường [24].

Những người bệnh không xảy ra sự phá hủy tự miễn dịch của tế bào β mà họ thiếu
insulin tương đối và tình trạng đề kháng insulin. Do đó, sự bài tiết insulin bị khiếm
khuyết ở những bệnh nhân này và khơng đủ để bù đắp cho tình trạng kháng insulin.
Tình trạng kháng insulin có thể cải thiện khi giảm cân và / hoặc điều trị bằng thuốc
làm giảm đề kháng insulin nhưng hiếm khi được phục hồi trở lại bình thường.
•

Đái tháo đường thai kỳ (GDM)

GDM đã được định nghĩa là bất kỳ mức độ không dung nạp glucose nào khi
khởi phát hoặc ghi nhận đầu tiên trong thời kỳ mang thai. Định nghĩa được áp dụng
cho dù tình trạng này có kéo dài sau khi mang thai hay không và không loại trừ khả

6


năng khơng dung nạp glucose khơng được phát hiện có thể đã xảy ra trước hoặc bắt
đầu đồng thời với thời kỳ mang thai.
1.2. Tổng quan về protein huyết tương người
1.2.1. Khái niệm về huyết tương người
Máu là một mô lỏng bao gồm khoảng 55% chất lỏng được gọi là huyết tương
và 45% tế bào máu. Ba loại tế bào chính trong máu là hồng cầu, bạch cầu và tiểu
cầu. 92% huyết tương bao gồm nước và 8% còn lại bao gồm protein, chất chuyển
hóa và ion.
Huyết tương của người khỏe mạnh thường là dịch màu vàng nhạt, trong suốt
và thay đổi theo tình trạng sinh lý trong cơ thể, ví dụ như sau khi ăn, huyết tương có
màu vàng đậm hơn và sẽ nhạt đi thành vàng chanh sau khoảng vài giờ sau đó.
Cùng với các tế bào máu, huyết tương đóng vai trị quan trọng trong sinh lý
cơ thể. Phân tích huyết tương lâm sàng là quy trình chẩn đoán phổ biến trong y học
và các dấu ấn sinh học huyết tương được sử dụng để phân loại bệnh nhân và hỗ trợ

các quyết định điều trị [15].
Huyết tương có thể được tách ra khỏi máu tồn phần bằng q trình ly tâm,
tức là quay máu tồn phần với chất chống đông máu trong máy ly tâm. Huyết tương
nhẹ hơn, vì vậy nó tạo thành lớp màu vàng phía trên, trong khi các tế bào máu dày
đặc hơn rơi xuống phía dưới. Huyết tương thu được được đơng lạnh trong vòng 24
giờ để bảo tồn chức năng của các yếu tố đông máu và các globulin miễn dịch. Huyết
tương được rã đơng trước khi sử dụng và có thời hạn sử dụng 1 năm [15].
Thành phần huyết tương thường bao gồm:
•

Chất đơng máu, chủ yếu là fibrinogen, hỗ trợ q trình đơng máu

Các protein huyết tương, chẳng hạn như albumin và globulin, giúp
duy trì áp suất thẩm thấu keo ở khoảng 25 mmHg
•

Các chất điện giải như natri, kali, bicarbonat, clorua và canxi giúp duy
trì độ pH trong máu
•

Các globulin miễn dịch giúp chống lại nhiễm trùng và các lượng nhỏ
khác nhau của các enzym, hormone và vitamin
1.2.2. Đặc điểm, thành phần, phân loại hệ protein huyết tương người
•

Protein huyết tương đại diện cho một phần quan trọng của proteome người.
Nồng độ protein trong huyết tương người bình thường rơi vào khoảng 60-70 g/L.
Người ta ước tính rằng huyết tương có thể chứa tới 40.000 loại protein khác nhau,
7

mỗi loại có một chức năng hoặc một bộ chức năng cụ thể, mỗi loại nằm dưới sự
kiểm soát di truyền riêng biệt và mỗi loại có sự thay đổi nồng độ cụ thể trong các
điều kiện sinh lý và bệnh lý khác nhau. Nồng độ bình thường của protein huyết
tương bao gồm một phạm vi rất rộng từ vài microgam đến vài gam trên 100 mL
huyết tương. Các protein huyết tương có chức năng như các enzym, chất ức chế
proteinase, kháng thể, yếu tố đông máu, thành phần bổ thể, tiền chất kinin và các
chất vận chuyển hormone, vitamin, kim loại, lipid và các chất khác cần thiết cho
chức năng bình thường của cơ thể [3]. Trong đó, một số protein hàm lượng cao
chiếm đến 99% protein tổng số như Albumin, IgG, transferrin, lipoprotein…

Hình 1.1. Biểu đồ biểu diễn thành phần các protein trong huyết tương
[22]
Các protein cấu thành nên hệ protein huyết tương có thể được phân loại theo
chức năng thành ba lớp khác nhau.
Lớp đầu tiên chứa nhiều protein có vai trị chức năng trong máu.
Chúng bao gồm albumin huyết tương người (chiếm khoảng một nửa protein tổng
số); apolipoprotein, có vai trị quan trọng trong vận chuyển lipid và cân bằng nội
môi; các protein giai đoạn cấp tính của phản ứng miễn dịch bẩm sinh; và các protein
đơng máu.
•

Lớp thứ hai là các protein rị rỉ mơ khơng có chức năng chun dụng
trong tuần hồn. Ví dụ như các enzym như aspartate aminotransferase (ASAT) và
alanin aminotransferase (ALAT), được sử dụng để chẩn đoán các bệnh gan, hay
troponin tim.
•

8

Lớp thứ ba là các phân tử tín hiệu như hormone protein nhỏ (ví dụ,
insulin) và cytokine, thường có lượng rất thấp ở trạng thái ổn định và được điều
chỉnh khi cần thiết [12]
•

1.2.3. Chức năng của các protein trong huyết tương
Các protein trong huyết tương đóng vai trị rất quan trọng trong quá trình sinh lý
và bệnh lý xảy ra trong cơ thể người [15]. Dưới đây là một số chức năng tiêu biểu:

Chức năng miễn dịch: bao gồm các Ig và các bổ thể tham gia vào các
quá trình bảo vệ cơ thể như thực bào, phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên, giúp hệ
miễn dịch nhận biết và tiêu diệt các tác nhân lạ như vi khuẩn hoặc virus…
•

Cung cấp dinh dưỡng: Protein huyết tương là nguồn chính cung cấp
dinh dưỡng cho cơ thể khi được yêu cầu.
•

Chức năng xúc tác: Enzyme xúc tác cho các phản ứng sinh học từ đơn
giản đến phức tạp trong các q trình sinh lý và bệnh lý của cơ thể
•

Chức năng điều hịa: Những protein này tuy có hàm lượng nhỏ, nhưng
chúng vai trò rất quan trọng trong cơ thể, bao gồm các hormone, các cytokine, các
protein ức chế đặc hiệu enzyme… Nhìn chung, các protein này có thời gian lưu
hành trong huyết tương khá ngắn. Chúng được tiết ra để điều hịa các phản ứng, sau
đó được pha lỗng để làm giảm nồng độ xuống mức hoạt động không hiệu quả.
•

Áp suất thẩm thấu và cân bằng nước: Protein huyết tương giúp cân
bằng áp suất thẩm thấu vào khoảng 25 mm Hg. Albumin huyết tương chủ yếu chịu
trách nhiệm cho chức năng này vì trọng lượng phân tử thấp và lượng định lượng so
với các protein khác. Tuy nhiên, trong tình trạng mất protein như trong các bệnh
thận, một tỷ lệ lớn nước di chuyển đến các mơ có thể gây ra phù.
•

Chức năng đệm: Protein huyết tương đóng vai trị quan trọng trong
việc duy trì độ pH của cơ thể, bằng cách thực hiện q trình asampholytes.
•

Vận chuyển lipid: Một trong những chức năng quan trọng nhất của
protein huyết tương là cung cấp lipid và các chất hòa tan lipid trong cơ thể. Các axit
béo và bilirubin được vận chuyển chủ yếu bởi albumin, trong khi cholesterol và
phospholipids được chuyển bởi các lipoprotein, globulin cũng vận chuyển các
vitamin tan trong chất béo.
•

9


Vận chuyển các muối phức hợp khác: Protein huyết tương cũng giúp
vận chuyển các kim loại và các chất khác, ví dụ như thyroxine, v.v.
•

Ngồi ra, trong huyết tương cịn có các sản phẩm rị rỉ mơ: Đây là những
protein thường hoạt động trong các tế bào nhưng có thể được giải phóng vào huyết
tương do hậu quả của sự chết hoặc tổn thương mô. Những protein này là những dấu
hiệu chẩn đoán quan trọng nhất, được ứng dụng rất nhiều trong y học chẩn đoán và
theo dõi điều trị, ví dụ như creatine kinase hoặc myoglobin được sử dụng trong chẩn

đoán nhồi máu cơ tim
1.2.4. Ý nghĩa của việc nghiên cứu hệ protein huyết tương
Protein là cỗ máy phân tử chịu trách nhiệm thực hiện hầu hết các chức năng
xúc tác và cấu trúc, cũng như nhiều tín hiệu của cơ thể sống. Do đó, phép đo protein
mang lại nhiều cơ hội để phát hiện và xác định đặc điểm của các trục trặc phân tử
liên quan đến bệnh tật và sự tiến triển của nó như biểu hiện ở từng bệnh nhân. Do
máu và huyết tương là những mẫu bệnh phẩm lâm sàng chiếm ưu thế áp đảo để
phân tích phân tử thường quy, các phân tử hiện diện trong máu có tiềm năng chẩn
đốn rộng nhất. Trong đó, protein thường có ý nghĩa lâm sàng lớn nhất. Protein
cung cấp một bức tranh tồn cảnh về tình trạng hiện tại của bệnh nhân.
Các xét nghiệm protein hiện tại cung cấp nhiều thơng tin lâm sàng, bao gồm
chẩn đốn xác định các biến cố cấp tính. Ví dụ: troponin tim được giải phóng vào
máu sau nhồi máu cơ tim, dự đoán nguy cơ bệnh tật (Protein phản ứng C (CRP)
tăng trong bệnh mạch vành) và phát hiện bệnh tái phát (thyroglobulin trong ung thư
tuyến giáp di căn sau khi cắt bỏ tuyến giáp) [6]
Những thành công này đã làm dấy lên hy vọng về các xét nghiệm chẩn đoán
lâm sàng mới và cải tiến cho nhiều chỉ định bệnh và do đó, đã góp phần khẳng định
ý nghĩa của việc nghiên cứu, phát hiện ra các dấu ấn sinh học protein huyết tương

mới.
1.3. Tổng quan các phương pháp định lượng protein
Có nhiều phương pháp để định lượng hàm lượng protein trong mẫu. Trên
thực tế một phương pháp với ưu điểm tuyệt đối không tồn tại: các phương pháp sẽ
đều có ưu điểm và nhược điểm. Việc lựa chọn một phương pháp thích hợp sẽ phụ
thuộc vào bản chất của protein có trong mẫu, vào độ tinh khiết của dịch chiết, vào
độ nhạy và độ chính xác cần thiết và tốc độ mong muốn. Các phương pháp thường

10

được sử dụng để xác định nồng độ protein là: phương pháp đo quang, khối phổ và
phương pháp kháng thể.
1.3.1. Phương pháp Western blot- Định lượng protein bằng phương pháp
kháng thể
Western blot là kĩ thuật rất quan trọng dùng trong sinh học phân tử và tế
bào, mục đích là tách và xác định một protein cụ thể từ một hỗn hợp gồm nhiều
protein phức tạp[7]. Western blot thường được sử dụng trong nghiên cứu để phân
tách và xác định protein. Trong kỹ thuật này, một hỗn hợp các protein được phân
tách dựa trên trọng lượng phân tử thông qua điện di trên gel. Những kết quả này
sau đó được chuyển đến một màng tạo ra một dải cho mỗi protein. Sau đó, màng
được ủ với các kháng thể nhãn đặc trưng cho protein quan tâm.
Kháng thể không liên kết bị rửa sạch chỉ để lại kháng thể liên kết với protein
quan tâm. Vì các kháng thể chỉ liên kết với protein cần quan tâm, nên chỉ có thể
nhìn thấy một dải. Độ dày của dải tương ứng với lượng protein hiện có; do đó đo
độ dày dải được dùng để định lượng protein hiện có[14].
Mặc dù Western blot là phương pháp đơn giản, dễ thao tác nhưng có thể
phát sinh nhiều vấn đề dẫn đến kết quả không như mong muốn. Các vấn đề có thể
bao gồm: dải bất thường hoặc khơng mong muốn, khơng có dải, dải mờ hoặc tín
hiệu yếu, nền cao trên vết mờ và vết loang lổ hoặc khơng đồng đều. Ngồi ra, sử
dụng kháng thể, kháng nguyên hoặc chất đệm cũng có thể gây ra một vài sai sót
trong kết quả đo. Nếu một kháng thể khơng phù hợp được sử dụng, kể cả chính
hoặc phụ, thì dải sẽ khơng hiển thị. Nồng độ của kháng thể cũng phải phù hợp; nếu
nồng độ quá thấp, tín hiệu có thể khơng nhìn thấy được. Cần đảm bảo rằng các bộ
đệm được sử dụng trong suốt quá trình chạy đều mới và khơng bị nhiễm bẩn[14]
1.3.2. Định lượng protein bằng phương pháp khối phổ
Khối phổ là một kỹ thuật phân tích có thể cung cấp cả thơng tin định tính
(cấu trúc) và định lượng (khối lượng phân tử hoặc nồng độ) về các phân tử chất
phân tích sau khi chúng chuyển đổi thành ion[17]
Cơ sở của khối phổ đối với các hợp chất hóa học (chủ yếu là các chất hữu
cơ) là sự bắn phá các phân tử trung hịa thành các ion mang điện tích (+) hoặc (-),

hoặc các mảnh ion, các gốc bằng các phân tử mang năng lượng cao, theo như sơ đồ
sau:

11


ABC D + e

ABCD+ + 2e

>95%

ABCD2+ + 3e

ABCD
3+
+ 4e
Quá trình ion hóa
này cần năng lượng bắn
phá khoảng 10eV, sự phá
vỡ này còn phụ thuộc vào
cấu tạo chất, năng lượng
và phương pháp sử dụng.
Ion phân tử có số khối
m/e. Phương pháp khối
phổ chính là phương pháp
nghiên cứu các chất bằng
cách đo chính xác số khối
đó [17].
Khối phổ là một

trong những phương pháp
nhạy cảm nhất trong hóa
học phân tích, và ứng dụng
của nó trong proteomics đã
nhanh chóng được mở rộng
sau khi giải trình tự bộ gen
người. Khối phổ hiện nay là
phương pháp tiếp cận chủ
đạo để xác định và định
lượng protein và các biến
đổi sau vận chuyển, ở quy
mô nhỏ hoặc trong tồn bộ
proteome với độ chính xác
cao[16]. Tuy nhiên, phương
pháp này hiện vẫn ít được
sử dụng tại Việt Nam do
yêu cầu về kỹ thuật và giá
thành cao.
1.3.3. Định lượng
protein bằng


phương pháp đo
quang
Khi chiếu một chùm
sáng có bước sóng phù hợp đi
qua một dung dịch chất màu,
các phân tử hấp thụ sẽ hấp thụ
một phần năng lượng chùm
sáng, một phần ánh sáng

truyền qua dung dịch. Xác
định cường độ chùm ánh sáng
truyền qua đó ta có thể xác
định được nồng độ của dung
dịch. Đây là nguyên tắc chung
của các phương pháp đo
quang giúp định lượnh nồng
độ protein có trong mẫu.
Sự hấp thụ ánh sáng
của dung dịch tuân theo định
luật Bouger-Lambert-Beer:
Khi chiếu một chùm bức xạ
đơn sắc (cường độ bức xạ
ban đầu là I0) đi qua một lớp
dung dịch có bề dày l và có
nồng độ là C, thì cường độ
bức xạ I sau khi đi qua dung
dịch bị giảm đi do quá trình
hấp thụ, phản xạ, tán xạ…
Độ hấp thụ quang của một
dung dịch đối với một chùm
sáng đơn sắc tỷ lệ thuận với
độ dày truyền quang và
nồng độ chất tan trong dung
dịch.
Cơng thức: A = ɛ x l
xC
Trong đó: A là độ
hấp thụ quang của dung
dịch tại bước sóng λ, l là độ

dày
truyền
quang
C là
nồng
độ
mẫu
(mol/
L) ɛ là
hệ số
hấp
thụ
phân
tử hay
hệ số
tắt
phân
tử
(L/mo
l*cm)

d, Kjendahl, Lowry, Smith
và Warburg-

12

C
ác
phương

pháp
được sử
dụng
rộng rãi
nhất để
phân
tích
hàm
lượng
protein
là các
xét
nghiệm
của
Biuret,
Bradfor


Christian. Tuy nhiên, nhiều tác giả khuyến nghị thử nghiệm đo quang phổ của
Bradford (1976) vì nhiều ưu điểm của nó nếu so sánh với các phương pháp khác.
1.4. Tổng quan về phương pháp Bradford
1.4.1. Giới thiệu chung
Định lượng hàm lượng protein tổng số thường là một bước quan trọng và phổ
biến đối với nhiều ứng dụng trong nghiên cứu hóa sinh nói chung và thực hành
phịng thí nghiệm lâm sàng thông thường. Trước khi bắt tay vào bất kỳ loại phân
tích protein nào, điều quan trọng là phải định lượng chính xác lượng protein trong
mẫu. Hiện nay có rất nhiều cơng cụ phân tích khác nhau (quang phổ, sắc ký, phân
cực, v.v.), được phát triển để xác định protein tổng số nhưng phương pháp đo quang
vẫn được sử dụng rộng rãi.
Phương pháp đo quang phổ định lượng protein là phương pháp sử dụng

quang phổ UV và quang phổ khả kiến để xác định nhanh chóng nồng độ của
protein, so với chất chuẩn. Trong trường hợp cần đo nhiều mẫu, và, hoặc khối lượng
và nồng độ mẫu bị hạn chế, có thể sử dụng các chế phẩm của thuốc nhuộm
Coomassie hay còn được gọi là phương pháp Bradford. Phương pháp Bradford là
một phương pháp phổ biến vì tính nhanh chóng, độ nhạy và độ đặc hiệu tốt.
1.4.2. Cơ chế
Thuốc nhuộm thường được dùng trong phương pháp Bradford là Coomassie
Brilliant Blue G-250. Cơ chế cơ bản của xét nghiệm là sự liên kết của thuốc nhuộm
ở pH axit bằng tương tác tĩnh điện với các axit amin cơ bản được proton hóa (lysine,

arginine và histidine) và bằng các liên kết kỵ nước với các axit amin thơm
(phenylalanine, tyrosine, tryptophan) [8].
Trong môi trường axit, khi chưa liên kết với protein, Coomassie Brilliant
Blue G-250 có màu đỏ, hấp thu ánh sáng mạnh nhất tại bước sóng 470nm. Liên kết
của thuốc nhuộm với protein, tạo ra phức hợp protein-thuốc nhuộm hấp thụ ánh
sáng mạnh ở bước sóng 595 nm [9]. Q trình liên kết thuốc nhuộm hầu như hoàn
thành trong khoảng 2 phút với độ ổn định màu tốt trong 1 giờ [8]. Xác định nồng độ
protein được thực hiện bằng phép đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm.
Thơng thường, các dung dịch tiêu chuẩn của albumin huyết tương bò
(Bovine Serum Albumin) được sử dụng để tạo đường chuẩn của độ hấp thụ so với
nồng độ khối lượng. Giả sử chất phân tích-protein phản ứng theo cách tương tự như
tiêu chuẩn BSA, thì có thể xác định được nồng độ chưa biết [10].
13


1.4.3. Thuốc thử
Hòa tan 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 trong 50 mL etanol 95% và
thêm 100 mL axit photphoric 85% trong khi khuấy liên tục. Khi thuốc nhuộm đã
hòa tan, cho vừa đủ 1 lít nước cất. Thuốc thử bền đến một tháng ở nhiệt độ phòng;
tuy nhiên, để bảo quản trong thời gian dài, nên giữ ở 4°C, nếu xuất hiện kết tủa, lọc

trước khi sử dụng [8].
1.4.4. Ưu điểm và hạn chế
1.4.4.1. Ưu điểm
•

Các ưu điểm của xét nghiệm Bradford bao gồm dễ sử dụng, độ nhạy

tương đối và thuốc thử có giá thành thấp, hoạt động ổn định trong thời gian dài. Hơn
nữa, thể tích thuốc thử có thể được giảm bớt và phép thử có thể được thực hiện trong

đĩa 96 giếng.
Độ hấp thụ của dung dịch màu ổn định trong 60–90 phút ở nhiệt độ
phịng. Xét nghiệm có thể được sử dụng với nhiều loại protein và polypeptit có
trọng lượng phân tử lớn hơn 3000 và có thể phát hiện dưới 1,0 μg protein[20]
1.4.4.2. Hạn chế
•

Ngồi những ưu điểm kể trên, phương pháp Bradford cũng tồn tại một vài
hạn chế như sau:
Thuốc nhuộm Bradford Coomassie Brilliant Blue G-250 làm ố các cuvet
hoặc các giếng, do đó, các cuvet hoặc giếng chỉ nên được sử dụng một lần duy nhất
và bỏ đi sau khi làm thí nghiệm.
Sự liên kết thuốc nhuộm phụ thuộc vào hàm lượng axit amin cơ bản có thể
khác nhau giữa các protein.
Một vấn đề khác đối với phương pháp này là các dung dịch protein đậm đặc
có thể tạo thành kết tủa khi tiếp xúc với thuốc thử nhuộm. Nếu điều này được quan
sát thấy, dung dịch protein cần được pha loãng để xác định nồng độ protein.
Hơn nữa, phương pháp này cũng phá hủy protein, có nghĩa là một khi mẫu
protein đã phản ứng với thuốc nhuộm, thì protein khơng thể được sử dụng cho các
xét nghiệm khác.

14