KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA ALKALOID

KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA
ALKALOID
I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT CHUNG
Các alkaloid (alcaloid) là những base hữu cơ thường dễ tan trong các dung môi hữu cơ
(như ether, benzen, cloroform, aceton, methanol, và ethanol…).
Đa số các alkaloid base thực tế không tan trong nước.
Một vài alkloid khơng có oxy tồn tại dưới trạng thái lỏng có thể tan ít trong nước.
Một số alkaloid dạng lỏng có thể bay hơi và lơi cuốn được theo hơi nước.
Một số alkaloid khơng có oxy ở dạng rắn có thể thăng hoa được ở áp suất thường.
Một số alkaloid có –OH phenol có thể tan một phần trong dung dịch kiềm mạnh.
Dưới dạng muối, các alkaloid thường tan được trong nước, cồn (ethanol, methanol) hay
hỗn hợp cồn nước; chúng không tan hoặc rất kém tan trong các dung môi hữu cơ kém phân
cực (ether, benzen, chloroform…)
II. TÍNH CHẤT CHUNG CỦA ALKALOID
Alkaloid thường là những base yếu, tan trong các dung môi hữu cơ, không tan trong nước.
Khi cho alkaloid tác dụng với acid sẽ thu được alkaloid dạng muối.
Các muối của alkaloid thường dễ tan trong nước. Các muối này dễ bị các chất kiềm vơ cơ
(NH4OH, NaOH) thậm chí cả cá muối khác (Na2CO3, đôi khi cả NaHCO3) đẩy ra khỏi
muối cho lại alkaloid ban đầu.
Alkaloid phản ứng với các thuốc thử chung (thuốc thử tạo tủa) tạo thành các muối khó tan
(dạng kết tinh hay vơ định hình) được ứng dụng trong định tính alkaloid.
Một số alkaloid hay nhóm alkaloid có thể cho màu sắc đặc trưng với một số thuốc thử được
gọi là thuốc thử đặc hiệu của alkaloid (thuốc thử tạo màu) ứng dụng trong định tính hoặc
làm thuốc thử phát hiện trong sắc ký.
III. KIỂM ĐỊNH CÁC ALKALOID
Trong kiểm định các dược liệu chứa alkaloid, ngoài các chỉ tiêu kiểm định chung cho mọi
dược liệu, người ta phải tiến hành định tính và định lượng các alkaloid trong dược liệu đó.
Có thể định tính alkaloid trực tiếp trong các mơ thực vật hay trên dịch chiết dược liệu. Để
định tính alkaloid trong vi phẫu thực vật, người ta quan sát tủa của alkaloid với thuốc thử
Bouchardat dưới kính hiển vi.

Đơi khi có thể định tính trực tiếp alkaloid trên mặt cắt dược liệu bằng thuốc thử đặc hiệu.
Để định tính alkaloid trong dịch chiết dược liệu, các thuốc thử chung, thuốc thử tạo màu
và sắc ký lớp mỏng là những phương pháp thường dùng.
Có nhiều phương pháp định lượng alkaloid trong dược liệu như phương pháp cân, phương
pháp thể tích, phương pháp quang phổ. Tùy trường hợp mà lựa chọn phương pháp thích
hợp. Cũng có thể kết hợp các phương pháp phân tách (thường là các phương pháp sắc ký)
với việc định lượng (thường là các phương pháp quang phổ) để định lượng riêng một hay
một vài alkaloid nào đó trong hỗn hợp alkaloid tồn phần.
Kết quả có thể được biểu thị bằng:
- % của alkaloid tồn phần có trong dược liệu (phương pháp cân trực tiếp).
- % cuả alkaloid tồn phần có trong dược liệu quy theo một alkaloid chính (phương pháp
cân gián tiếp, phương pháp chuẩn độ acid-base, phương pháp quang phổ).
- % của một alkaloid nào đó có trong dược liệu (phương pháp kết hợp sắc ký- quang phổ).
IV. CHIẾT XUẤT CÁC ALKALOID
Trong cây, alkaloid thường tồn tại dưới dạng muối hòa tan với acid hữu cơ hoặc vô cơ hay
dạng kết hợp với tanin. Người ta có thể chiết alkaloid ra khỏi nguyên liệu thực vật bằng
nhiều cách nhưng nhìn chung có thể quy về 2 cách chính là:
- Chiết alkaloid ra khỏi dược liệu dưới dạng alkaloid base bằng dung môi hữu cơ.
- Chiết alkaloid ra khỏi dược liệu dưới dạng muối bằng dung môi phân cực (nước, cồn, hỗn
hợp cồn nước đã được acid hóa).
Với một vài alkaloid đặc biệt, người ta có thể chiết xuất bằng cách:
- Phương pháp cất kéo lôi cuốn theo hơi nước (chiết xuất nicotin từ Thuốc lá).
- Phương pháp thăng hoa (chiết cafein từ Trà).
Dựa vào tính tan khác nhau của dạng base và dạng muối alkaloid trong các dung mơi, người
ta có thể loại phần nào các tạp chất ra khỏi dịch chiết trước khi định tính, định lượng hay
phân lập các alkaloid tinh khiết.
Các quy trình chiết dưới đây thường được sử dụng trong chiết xuất alkaloid từ nguyên liệu
thực vật dùng cho định tính alkaloid.
Ghi chú: thể tích dung mơi chiết, thời gian chiết trong các phương pháp trên có thể thay đổi tùy

thuộc vào dược liệu và phương tiện sử dụng.


1. Chiết bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm (Phương pháp 1)
Bột dược liệu (5g)
- Kiềm hóa bằng NH4OH đậm đặc (vừa đủ ẩm)
- Chiết nóng bằng 20-30ml CHCl3
(đun nóng nhẹ/BM 10 phút, lọc hoặc chiết bằng Sohxlet)

Dịch chiết CHCl3
H2SO4 2% (5ml x 2 lần)

Dịch chiết nước acid

Định tính bằng thuốc thử chung
Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu

NH4OH đậm đặc → pH 10
Chiết bằng CHCl3 (10ml x 2-3 lần)

Dịch chiết CHCl3

Định tính bằng phương pháp sắc ký

Bốc hơi tới cắn khơ

Cắn alkaloid base

Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu

2. Chiết bằng nước acid (Phương pháp 2)
Bột dược liệu (5g)

Làm ẩm bột dược liệu 10 phút.
20ml dung dịch H2SO4 2%
Đun BM 15 phút, lọc (2 lần x 20ml)

Dịch chiết nước acid

NH4OH đậm đặc → pH 10
CHCl310ml x 2 lần

Dịch chiết CHCl3

Định tính bằng phương pháp sắc ký
Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu

H2SO4 2% (5ml x 2 lần)

Dịch chiết nước acid

Định tính bằng thuốc thử chung
Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu


3. Chiết bằng cồn acid (Phương pháp 3)
Bột dược liệu (5g)
Làm ẩm bột dược liệu 10 phút.
20-30ml cồn có 5% acid (sulfuric, hydrochlorid,

acetic)
Đun hồi lưu/BM 10 phút, lọc.

Dịch chiết cồn acid
- Trung hòa đến pH 5-6 (nếu cần)
- Bay hơi cồn trên bếp cách thủy đến cắn
- Hòa tan cắn trong nước nóng (10mlx 2
lần), lọc

Dịch chiết nước acid

Định tính bằng thuốc thử
chung
Định tính bằng thuốc thử đặc
hiệu

NH4OH đậm đặc → pH 10
Chiết bằng CHCl3 (10ml x 2-3 lần)

Dịch chiết CHCl3
Chiết với H2SO4 2% (5ml x 2 lần)

Dịch chiết nước acid

Định tính bằng phương pháp
sắc ký
Định tính bằng thuốc thử đặc
hiệu

Định tính bằng thuốc thử

chung
Định tính bằng thuốc thử đặc
hiệu


BÀI 1
ĐỊNH TÍNH ALKALOID TRONG DƯỢC LIỆU
BẰNG PHẢN ỨNG HĨA HỌC VÀ SẮC KÝ LỚP MỎNG
Mục tiêu
Sau khi thực hành, sinh viên phải:
- Chiết được alkaloid ra khỏi dược liệu bằng các phương pháp thích hợp.
- Xác định được alkaloid trong dịch chiết dược liệu bằng các thuốc thử chung.
- Phát hiện được alkaloid trong dược liệu bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.
I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
1. Định tính alkaloid bằng thuốc thử chung
Để phát hiện alkaloid trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học, thơng thường người ta
chiết alkaloid ra khỏi cơ quan thực vật bằng phương pháp chiết thích hợp rồi dùng các
thuốc thử để phát hiện và đánh giá sơ bộ sự có mặt của chúng trong dược liệu. Tùy theo
phản ứng mà sử dụng dịch chiết thích hợp. Các phản ứng với thuốc thử chung thường được
thực hiện với muối alkaloid trong môi trường nước acid.
Các thuốc thử chung cho với các alkaloid một tủa vơ định hình có màu sắc khơng đặc trưng
thay đồi tùy theo thuốc thử. Với một số thuốc thử, tủa này có thể tan lại tỏng một lượng
thuốc thử thừa.
Trong những điều kiện quy định về lượng dược liệu, lượng dung mơi, cách chiết và thuốc
thử sử dụng có thể dựa vào mức độ tạo tủa, lượng thuốc thử sử dụng để đánh giá sơ bộ hàm
lượng alkaloid trong nguyên liệu.
Các thuốc thử thường dùng là Bouchardat,Valse-Mayer, Dragendroff, Bertrand, Hager và
acid tanic.
2. Định tính alkaloid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM)
SKLM được sử dụng như một phương pháp phát hiện sự có mặt, đồng thời đánh giá sơ bộ

thành phần alkaloid của dược liệu khi sử dụng các hệ dung mơi thích hợp. Tiến hành sắc
ký song song với 1 alkaloid chuẩn còn cho phép nhận định sự có mặt của một alkaloid nào
đó trong dược liệu. SKLM còn hữu dụng trong việc xác định 1 dược liệu khi sắc ký so sánh
với dược liệu chuẩn.
Pha tĩnh: trong định tính alkaloid bằng SKLM thường dùng silicagel G, F254, GF254.
Các pha tĩnh khác như nhôm oxyd, silicagel pha đảo đôi khi cũng được dùng.


Dung môi khai triển
Dung môi khai triển cho sắc ký alkaloid thường là hỗn hợp của 2 hay 3 dung môi hữu
cơ; thường từ phân cực yếu tới phân cực trung bình (như hexan, benzen, ether ethylic,
cloroform, dicloromethan, ethyl acetat). Có thể sử dụng thêm các dung mơi hữu cơ có
tính kiềm (pyridin, dimethyl formamid, diethylamin, triethylamin) hoặc một lượng nhỏ
các kiềm vô cơ (thường là amoniac đặc) bằng cách pha thẳng vào hệ dung môi hay
bằng cách để bão hịa khí quyển trong bình sắc ký.
Đơi khi, các dung môi phân cực mạnh hơn như butanol, ethanol, methanol, nước, các
acid như acid acetic, acid formic cũng được dùng đối với alkaloid phân cực mạnh.
Mẫu thử
Mẫu thử thường là alkaloid base hay hỗn hợp alkaloid base tồn phần, được hịa tan
trong các dung mơi ít phân cực và dễ bay hơi như cloroform, ether…
Các dung dịch alkaloid muối (pha trong EtOH, MeOH) cũng có thể được sử dụng khi
dung mơi khai triển là các hệ dung môi phân cực mạnh, thường có thêm acid.
Phát hiện vết
Để phát hiện vết alkaloid trên bản sắc ký người ta thường phun (hoặc nhúng) với thuốc
thử Dragendroff. Các alkaloid sẽ cho các vết màu đỏ cam trên nền màu trắng.
Các cách phát hiện thông thường như soi đèn UV (254nm và 365nm) hoặc hơ trong
hơi iod cũng được dùng như là phương pháp bổ sung nhưng không đặc hiệu.
Ghi nhận kết quả
Ghi nhận số lượng các vết quan sát được trên sắc đồ về màu sắc với các phương pháp
phát hiện Rf và tỉ lệ tương đối của các vết alkaloid trong hỗn hợp.

Rf của 1 chất A được định nghĩa là tỷ số giữa đoạn đường di chuyển của chất A (lA) và
đoạn đường di chuyển của dung mơi (lO) tính từ mức xuất phát của mẫu thử

Trị số Rf luôn < 1,00 và ln có đúng hai số lẻ (ví dụ 0,08; 0,72…)
Trong những điều kiện sắc ký nhất định, giá trị Rf của 1 chất là một trong những đặc trưng
của chất đó trong hệ dung mơi đã sử dụng. Tuy nhiên, do giá trị R f phụ thuộc vào khá
nhiều yếu tố (bản chất, bề dày và độ hoạt hóa của pha tĩnh, pha động, mức độ bão hịa dung
mơi, độ ẩm và nhiệt độ của môi trường…) nên người ta còn sử dụng giá trị Rx ổn định hơn
để biểu thị đặc trưng của chất ấy.


Rx của một chất A so với chất quy chiếu X được định nghĩa là tỷ số giữa đoạn đường di
chuyển của hóa chất A (lA) và đoạn đường di chuyển của chất quy chiếu X (lX) trong cùng
1 điều kiện (cùng 1 bản sắc ký)

Khác với Rf, trị số RX có thể > 1,00 và cũng chỉ lấy 2 số lẻ.
Chất quy chiếu thường được dùng trong sắc ký alkaloid là quinin, khi đó Rf của một
alkaloid so với quinin được ghi là RQ.
II. THỰC HÀNH
1. Dược liệu
- Bình vôi
- Lá sen
- Tâm sen
2. Chiết xuất alkaloid
Chiết 3 dược liệu thuộc 3 phương pháp dưới đây để thực hiện phản ứng định tính bằng các
thuốc thử chung.
- Bình vơi: chiết alkaloid bằng dung môi hữu cơ (phương pháp 1). Lấy dịch chiết nước acid
để định tính với thuốc thử chung của alkaloid, dịch CHCl3 dùng để SKLM.
- Lá sen: chiết bằng nước acid (phương pháp 2). Lấy dịch chiết nước acid lần 2 (sau giai
đoạn cloroform) để định tính với thuốc thử chung của alkaloid, dịch CHCl3 dùng để SKLM.

- Tâm sen: chiết bằng cồn acid (phương pháp 3). Lấy dịch chiết nước acid (trong thực tập,
lấy dịch chiết nước acid ở giai đoạn đầu tiên) để định tính với thuốc thử chung của alkaloid,
dịch CHCl3 dùng để SKLM.
Ghi chú: các phương pháp chiết, lượng dung mơi hóa chất dùng để làm ẩm, để chiết cho từng dược
liệu có thể thay đổi tùy thuộc vào loại dược liệu và điều kiện thực tế.

3. Định tính alkaloid bằng thuốc thử chung
Lấy 5 ống nghiệm nhỏ, cho vào mỗi ống nghiệm 2ml dịch chiết nước acid.
Cho riêng rẽ vào mỗi ống nghiệm 3 giọt thuốc thử lần lượt là Bouchardat, Valse-Mayer,
Dragendroff và Hager, một ống giữ làm ống chứng. Lắc đều, quan sát và nhận định kết
quả. Nếu cần có thể cho thêm 1-2 giọt thuốc thử nữa.
Nhận định kết quả


(-)

Dung dịch vẫn trong

(+)

Dung dịch đục mờ nhưng không lắng xuống

(++) Dung dịch đục, có tủa lắng xuống sau vài phút
(+++) Có tủa lắng xuống ngay. Dung dịch đục sau khi thêm giọt thuốc thử thứ 2
(++++)

Có tủa nhiều

4. Định tính alkaloid bằng phương pháp SKLM
Chuẩn bị bản mỏng

Có hai loại: bản mỏng tự tráng và bản mỏng tráng sẵn. Hiện nay, bản mỏng tráng sẵn được
sử dụng phổ biến.
Với bản mỏng tráng sẵn, dùng bàn cắt hoặc kéo cắt thành những miếng có kích thước thích
hợp (2,5 x 10cm), khơng cần sấy hoạt hóa.
Chuẩn bị dung mơi và bình sắc ký
Bình sắc ký được rửa sạch và sấy nhẹ đến khơ. Lót lịng trong bình bằng giấy lọc.
Nhỏ lên trên miếng giấy lọc này 3-4 giọt NH4OH đậm đặc rồi lót dung mơi sắc ký vào bình
(lớp dung mơi này cao khoảng 0,5cm).
Đậy nắp kín (nếu cần, có thể thoa 1 ít vaseline trên miệng bình), đặt ở nơi phẳng, để yên
trong ít nhất 30 phút trước khi triển khai.
Các hệ dung môi sử dụng
S1 = benzen : aceton (1:4)
S2 = CHCl3 : MeOH : NH4OH (50:9:1)
Đưa mẫu lên bản mỏng, triển khai và phát hiện
Dùng mao quản chấm lên mỗi bản sắc ký 2 vết, tuần tự từ trái sang phải là 2 dung dịch
alkaloid base toàn phần trong cloroform của Bình vơi và Tâm sen.
Các vết chấm này phải nhỏ, gọn (nên chấm thành vạch 1mm x 3mm), thẳng hàng và cách đều
nhau, vết nọ cách vết kia ≥ 0,5cm;cách 2 mép bên ≥ 0,5cm và cách mép dưới khoảng 1,5cm.
Tùy theo nồng độ dịch thử mà chấm với số lần thích hợp, sao cho sau khi triển khai và phun
thuốc thử các vết không quá mờ, khó phát hiện và cũng khơng q đậm, làm các vết to, chồng
lấn lên nhau.


Đặt bản mỏng vào bình sắc ký, đậy kín nắp và để yên (các vết chấm phải nằm cao hơn lớp dung
mơi). Khi dung mơi chạy cịn cách mép trên khoảng 0,5cm, lấy bản mỏng ra, dùng bút chì đánh
dấu mức dung môi, để khô tự nhiên hay sấy nhẹ cho hết dung môi.
Phát hiện các vết trên sắc đồ lần lượt bằng cách:
- Soi dưới đèn UV 254nm và 365nm.
- Phun (hoặc nhúng nhanh) thuốc thử Dragendroff (trong tủ hốt!)
Vẽ sắc ký đồ khi phát hiện bằng UV 245nm và thuốc thử Dragendroff.

Ghi nhận lại màu sắc của các vết trong UV 365nm và sau khi phun thuốc thử Dragendroff.
Tính Rf của các vết màu với thuốc thử Dragendroff. Ghi nhận xét.