Nghiên cứu hoạt tính gây độc một số dòng tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ ba loài san hô mềm sinularia nanolobata, sinularia leptoclados, sinularia conferta thu thập ở vùng biển trung bộ việt nam TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Ninh Thị Ngọc

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC MỘT SỐ DỊNG TẾ
BÀO UNG THƯ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ BA
LỒI SAN HƠ MỀM SINULARIA NANOLOBATA,
SINULARIA LEPTOCLADOS, SINULARIA CONFERTA THU
THẬP Ở VÙNG BIỂN TRUNG BỘ VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 9.42.01.16

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2021


Cơng trình được hồn thành tại: - Học Viện Khoa học và Công nghệ
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
- Viện Cơng nghệ sinh học
- Viện Hóa sinh biển
Người hướng dẫn khoa học 1: TS. Nguyễn Hoài Nam
Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Trần Mỹ Linh

Phản biện 1: PGS. TS. Nguyễn Đình Thắng
Phản biện 2: PGS. TS. Trần Thu Hương
Phản biện 3: TS. Bùi Thị Thúy Luyện

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Học
viện, họp tại Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa
học và Cơng nghệ Việt Nam vào hồi
giờ
, ngày
tháng
năm 2021 .

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học Viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Viện Công nghệ sinh học


1
MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, nhiều quốc gia đã khai thác các chất
có hoạt tính sinh học từ sinh vật biển nhằm phục vụ các nghiên cứu
tìm kiếm các loại thuốc chữa trị bệnh hiểm nghèo như: ung thư, viêm
gan, các bệnh về viêm nhiễm và do virus gây ra. Cho đến thời điểm
này đã có một số dược phẩm có nguồn gốc từ sinh vật biển đến được
tay người sử dụng, điển hình như Cytarabine, Vidarabine, Eribulin,
Trabectedin…Để có được thành quả này, các viện nghiên cứu trên
thế giới đã sàng lọc hoạt tính sinh học của hàng triệu hợp chất từ các
loài sinh vật biển, đồng thời đầu tư nguồn lực tài chính và thời gian

cho các giai đoạn nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng đối với các
hợp chất tiềm năng.
Với lợi thế sở hữu đường bờ biển dài trên 3.260 km cùng với rất
nhiều đảo và vịnh, Việt Nam có tiềm năng lớn lao trong việc khai
thác với nguồn tài nguyên sinh vật biển đa dạng, phong phú cả về
thành phần loài và trữ lượng. Tuy nhiên, cho đến nay các nghiên cứu
tìm kiếm các hoạt chất giá trị từ sinh vật biển Việt Nam hiện còn
chưa nhiều và hạn chế ở bước thử nghiệm hoạt tính in vivo và nghiên
cứu về cơ chế tương tác giữa thuốc và tế bào ung thư. Các nghiên
cứu hiện đang ở giai đoạn đầu so với các nuớc trong khu vực và lùi
xa so với các nước tiên tiến. Ngun nhân là do cịn một số khó khăn
như: việc khảo sát và thu thập mẫu sinh vật ở biển yêu cầu trang thiết
bị hiện đại, các hợp chất phân lập được từ sinh vật biển thường có
hàm lượng rất nhỏ, cấu trúc phức tạp, một số hợp chất dễ phân hủy
ngay trong q trình phân tích. Do đó, yêu cầu cấp thiết đối với nước
ta là cần phát triển nghiên cứu nhằm từng bước hệ thống về thành
phần hóa học và hoạt tính sinh học của những lồi sinh vật biển.


2

Chi Sinularia là một trong các chi san hô mềm được nhiều nhà
khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu. Cho đến nay đã có nhiều
cơng trình nghiên cứu về thành phần hóa học và các hoạt tính sinh
học của nhiều hợp chất phân lập từ các đối tượng san hô mềm thuộc
chi này. Tuy nhiên, các nghiên cứu đối với các lồi san hơ mềm
thuộc chi Sinularia như S. nanolobata, S. leptoclados, S. conferta ở
Việt Nam rất ít và hầu như chưa có nghiên cứu một cách hệ thống và
bài bản về các loài nêu trên. Xuất phát từ thực tế trên, tôi đã lựa chọn
đề tài luận án “Nghiên cứu hoạt tính gây độc một số dịng tế bào

ung thư của các hợp chất phân lập từ ba lồi san hơ mềm
Sinularia nanolobata, Sinularia leptoclados, sinularia conferta thu
thập ở vùng biển Trung Bộ Việt Nam”.
Mục tiêu của luận án:
- Xác định được thành phần hóa học của ba lồi san hơ mềm S.
nanolobata, S. conferta, S. leptoclados thu thập ở vùng biển Trung bộ
Việt Nam.
- Phát hiện được các hoạt chất có hoạt tính gây độc tế bào có trong
các lồi san hơ mềm nghiên cứu, định hướng ứng dụng cho các
nghiên cứu y sinh dược học.
Nội dung luận án bao gồm:
1. Xác định tên khoa học của ba lồi san hơ mềm thu thập ở vùng
biển Trung Bộ Việt Nam bằng chỉ thị phân tử
2. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ ba
lồi san hơ mềm S. nanolobata, S. conferta, S. leptoclados.
3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của các hợp
chất phân lập được.
4. Đánh giá cơ chế gây độc tế bào của một số hợp chất tiêu biểu.


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
Bao gồm phần tổng quan về các nghiên cứu trong nước và quốc tế về
việc khai thác các hợp chất tự nhiên từ sinh vật biển trong điều trị ung thu,
nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào ung thư, đặc điểm chung của san
hô mềm và chi Sinularia, về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của
san hơ mềm chi Sinularia
1.1. Thử nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư
1.1.1. Các dòng tế bào ung thư

1.1.2. Vai trò của các thử nghiệm sinh học trong tìm kiếm các hoạt chất
chống ung thư
1.1.3. Cơ chế diệt tế bào ung thư dựa trên apoptosis
1.1.4. Cơ chế diệt tế bào ung thư liên quan đến chu kỳ tế bào
1.2. Các hợp chất tự nhiên từ sinh vật biển trong điều trị ung thư
1.2.1. Tình hình nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thư có
nguồn gốc từ sinh vật biển
1.2.2. Tình hình nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính chống ung
thư từ san hô mềm của Việt Nam
1.3. Giới thiệu chung về san hô mềm
1.3.1. Đặc điểm của san hô mềm
1.3.2. Tổng quan về san hô mềm chi Sinularia
1.3.3. Ứng dụng các chỉ thị phân tử trong phân loại san hô mềm
1.3.4. Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ
các lồi san hơ mềm thuộc chi Sinularia
Thống kê các nghiên cứu đã công bố cho thấy các hợp chất phân
lập từ san hô mềm chi Sinularia chủ yếu bao gồm các hợp chất
sesquiterpen, diterpen và steroid. Nhiều hợp chất trong số này thể
hiện hoạt tính sinh học thú vị như hoạt tính gây độc tế bào, kháng


4

viêm, kháng khuẩn, kháng vi rút, bảo vệ thần kinh và chống oxy
hóa…

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu san hô mềm S. nanolobata Verseveldt, 1977 được thu thập ở

vùng biển Lăng Cô, tỉnh Thừa Thiên Huế, Việt Nam vào tháng 4 năm
2015.
Mẫu san hô mềm S. leptoclados Ehrenberg, 1834 được thu thập ở
vùng biển quanh đảo Cồn Cỏ, tỉnh Quảng Trị, Việt Nam vào tháng 5
năm 2016.
Mẫu san hơ mềm lồi S. conferta Dana, 1846 được thu thập ở
vùng biển quanh đảo Cồn Cỏ, tỉnh Quảng Trị, Việt Nam vào tháng 5
năm 2015.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Xác định tên khoa học của các mẫu san hô mềm bằng các
chỉ thị phân tử (msh1 và 28S RNA)
2.2.1.2. Khuyếch đại và xác định trình tự các đoạn ADN chỉ thị
Hình 2.5. Ảnh điện di sản
M

SN SLE SCO M

SN SLE

SCO

phẩm PCR nhân đoạn các
đoạn gen chỉ thị từ các mẫu
san hô mềm nghiên cứu. (A)
đoạn gen 28S rARN sử dụng
cặp mồi 28SF và 28SR. (B)
đoạn gen msh1 sử dụng cặp
mồi MSHF và MSHR. M:

A

B

GeneRulerTM
ladder

1kb

ADN


5

M 1 2

3 4

5

6 7

M 8

9 10 11 12 13 14 M 15 16 17 18 19 20 21

Hình 2.6. Ảnh điện di các sản phẩm PCR-colony từ một số khuẩn lạc sau khi biến
nạp vector pTZ57R/T gắn gen 28S rARN của các mẫu san hô mềm SN (giếng số 17), SLE (giếng số 8-14), SCO (giếng số 15-21). M: GeneRulerTM 1kb ADN ladder
M 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 M 35 36 37 38 39 40 41

42

Hình 2.7. Ảnh điện di các sản phẩm PCR-colony từ một số khuẩn lạc sau khi biến
nạp vector pTZ57R/T gắn gen msh1 của các mẫu san hô mềm SN (giếng số 22-28),
SLE (giếng số 29-35), SCO (giếng số 36-42). M: GeneRulerTM 1kb ADN ladder

2.2.1.3. Xác định lồi và phân tích đa dạng di truyền
2.2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất
2.2.2.1. Phân lập các hợp chất từ mẫu san hơ mềm S. nanolobata
Hình 2.8. Sơ
đồ phân lập
các hợp chất
từ

loài

nanolobata

S.


6

2.2.1.2. Phân lập các hợp chất từ mẫu san hô mềm S. leptoclados

Hình 2.9. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài S. leptoclados
2.2.1.2. Phân lập các hợp chất từ mẫu san hơ mềm S. conferta

Hình 2.10. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài S. conferta

7

2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất
2.2.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính và cơ chế gây độc tế bào
ung thư

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ
3.1. Xác định lồi bằng chỉ thị phân tử
3.1.1. Giải trình tự tự đoạn gen 28S rARN và msh1 của 3 mẫu san
hơ mềm
- Trình tự nucleotit đoạn gen msh1 của mẫu SN với độ dài 639 bp,
bao gồm 190 A, 113 C, 121 G, 215 T
- Trình tự nucleotit đoạn gen msh1 của mẫu SLE với độ dài 639
bp, bao gồm 189 A, 113 C, 119 G, 218 T
- Trình tự nucleotit đoạn gen msh1 của mẫu SCO với độ dài 639
bp, bao gồm 189 A, 113 C, 122 G, 215 T
- Trình tự nucleotit đoạn gen 28S rARN của mẫu SN với độ dài
695 bp, bao gồm 139 A, 194 C, 228 G, 134 T
- Trình tự nucleotit đoạn gen 28S rARN của mẫu SLE với độ dài
709 bp, bao gồm 145 A, 197 C, 231 G, 136 T
- Trình tự nucleotit đoạn gen 28S rARN của mẫu SCO với độ dài
709 bp, bao gồm 144 A, 199 C, 228 G, 138 T
3.1.2. So sánh trình tự của 3 mẫu san hơ mềm bằng chương trình
BLAST
Kết quả phân tích trình tự đoạn gen msh1 và 28S rARN của các
mẫu nghiên cứu với các các trình tự tham khảo trên ngân hàng gen
quốc tế NCBI đã cho thấy các trình tự của gen chỉ thị của các mẫu
nghiên cứu có độ tương đồng cao với các trình tự tương ứng trên
ngân hàng gen, cụ thể:

8

- Trình tự đoạn gen msh1 của mẫu SN có độ tương đồng 100% so
với trình tự tương ứng (mã số FJ621451.1) của mẫu S. nanolobata
vourcher RMNH coel.38441 trên ngân hàng gen NCBI.
- Trình tự đoạn gen msh1 của mẫu SLE có độ tương đồng 100%
so với trình tự tương ứng (mã số KC542857.1) của mẫu S.
leptoclados vourcher ZMTAU:CO35308 trên ngân hàng gen NCBI.
- Trình tự đoạn gen msh1 của mẫu SCO có độ tương đồng 100%
so với trình tự tương ứng (mã số FJ621389.1) của mẫu S. conferta
vourcher NTM C13972 trên ngân hàng gen NCBI.
- Trình tự đoạn gen 28S rARN của mẫu SN có độ tương đồng
99,8% so với trình tự tương ứng (mã số KF915519.1) của mẫu
Sinularia sp. voucher RMNH:Coel.41326 trên ngân hàng gen NCBI.
- Trình tự đoạn gen 28S rARN của mẫu SLE có độ tương đồng
100% so với trình tự tương ứng (mã số KC542837.1) của mẫu S.
leptoclados voucher ZMTAU:CO34095 trên ngân hàng gen NCBI.
- Trình tự đoạn gen 28S rARN của mẫu SCO có độ tương đồng
99,6% so với trình tự tương ứng (mã số MF817932.1) của mẫu
Sinularia sp. trên ngân hàng gen NCBI.
Bảng 3.1. Kết quả phân loại các mẫu san hô mềm nghiên cứu dựa
vào phân tích độ tương đồng (%) trình tự các đoạn ADN chỉ thị (gen
28S rARN và msh1) của các mẫu nghiên cứu với các trình tự tham
khảo trên ngân hàng gen.
Ký
hiệu
mẫu
SN
SLE

SCO

Chỉ thị msh1
Loài
Sinularia
nanolobata
Sinularia
leptoclados
Sinularia
conferta

độ
tương
đồng

Chỉ thị 28S rARN
Loài

độ
tương
đồng

100%

Sinularia sp.

≥ 99.8%

100%

Sinularia
leptoclados

100%

100%

Sinularia sp.

≥ 99.6%

Kết luận
chung dựa
theo 2 chỉ
thị ADN
Sinularia
nanolobata
Sinularia
leptoclados
Sinularia
conferta


9

3.2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất
3.2.1. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ mẫu san hơ
mềm S. nanolobata
28
21

22

18

9

13

H

10
5

3

HO

4

17
16

14

1
2

26

24
23
29

12
11

19

20

25
27

OH

15

8

H
6

7

H

Hình 3.2. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ lồi S.
nanolobata
3.2.1. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ mẫu san hơ

mềm S. leptoclados

Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ lồi S.
leptoclados


10

3.2.1. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ mẫu san hơ
mềm S. conferta

28
22

21
18
12
13

11

19

20

24
23

26
25

27

17
16

14

9
1
8

10
3

5

6

HO

OH

Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ lồi S.
conferta
3.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập
được từ các mẫu san hô mềm
3.3.1. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất
phân lập từ loài S. nanolobata
Bảng 3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất
SN

Mẫu thử

KB

SKLU-1

SN 4

-

-

SN 6

-

-

SN 30

1,26±
0,20

2,07±
0,33

Elipticine*

HepG2
64,35±

7,00
1,95±
0,28

IC50 (µM)
MCFLNCaP
7

SKMel-2

-

-

-

-

-

-

2,36±
0,24

2,07±
0,28

1,46±
0,20

*: Đối chứng dương; “-“: Khơng có hoạt tính

HL-60
89,02±
9,93
33,53±
4,25
1,91±
0,37

SW480
71,02±
4,00
2,24±
0,16


11

Kết quả đánh giá 10 hợp chất SN cho thấy: Hợp chất mới SN 6
thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ở mức trung bình trên dịng 3 tế bào
HL-60, HepG2 và SW480 (IC50 từ 33.53-71.02 µM). Hợp chất SN 4
thể hiện hoạt tính gây độc yếu trên dịng tế bào HL-60. Các hợp chất
cịn lại khơng thể hiện hoạt tính.
3.3.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất
phân lập từ loài S. leptoclados
Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất SLE
Mẫu
thử

SLE 10
SLE 20
SLE 27
SLE 28
SLE 30
Elliptici
ne*

IC50 (µM)
KB

HepG2

MCF-7

34,95±
4,21

21,13±
0,70

38,92±
6,26

SKLU-1
51,80±
31,22

HL-60

62,07±
10,88
92,96±
8,29
19,03±
21,79±
17,29±
21,21±
13,45±
2,92
2,20
1,91
1,47
1,81
32,86±
39,54±
36,97±
49,13±
20,53±
3,46
4,90
2,24
4,74
2,26
82,80
± 3,65
1,79±
1,38±
1,34±
1,26±

1,91±
0,28
0,28
0,16
0,28
0,12
*: Đối chứng dương;” -“: Khơng có hoạt tính

SW480
28,65±
1,53
83,84
±3,72
14,4±
1,88
26,6±
1,59
2,03±
0,16

SKMel-2
59,35±
4,23
29,01±
3,21
33,87±
3,82
72,32
± 1,30
1,91±

0,20

LNCaP
64,12±
1,71
89,80±
3,34
17,13±
1,81
40,55±
3,63
1,95±
0,20

Kết quả đánh giá 15 hợp chất SLE cho thấy: 3 hợp chất SLE 10,
SLE 27 và SLE 28 (IC50 trong khoảng từ 1,78 đến 78,33 µM) thể
hiện hoạt tính gây độc tế bào trên 8 dịng tế bào ung thư thử nghiệm.
Hợp chất SLE 20 và SLE 30 thể hiện hoạt tính trên 2-3 dịng tế bào
ung thư thử nghiệm. Các hợp chất cịn lại khơng thể hiện hoạt tính.
3.3.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất
phân lập từ loài S. conferta
Kết quả đánh giá 12 hợp chất SCO cho thấy hợp chất SCO 27,
SCO 35 và SCO 37 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đáng kể trên cả


12

3 dòng tế bào ung thư thử nghiệm. Các hợp chất cịn lại khơng thể
hiện hoạt tính.
Bảng 3.4. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất

SCO
Mẫu thử
SCO 27
SCO 35
SCO 37
Etoposide *
Camptothecin*

A-549
3,64±0,18
78,73±2,11
27,12±1,69

IC50 (µM)
Hela
19,34±0,42
30,5±0,77
24,64±1,28
27,99±2,01

PANC-1
1,78±0,69
9,35±0,37
20,51±2,72
1,17±0,42

12,65±1,01

*: Đối chứng dương;

3.3.4. Nghiên cứu cơ chế gây độc tế bào ung thư của hợp chất SLE
27 và và hợp chất SCO 27
3.3.4.1. Nghiên cứu cơ chế gây độc tế bào ung thư của hợp chất
SCO27 trên tế bào ung thư phổi A549
a. Đánh giá tác động của SCO 27 đến sự thay đổi hình thái tế bào
ung thư
Hình 3.5. Hình thái tế
bào A549 dưới tác động
của SCO 27 ở các nồng
độ khác nhau và đối
chứng

dương

(camptothecin 5 µM).
Mũi tên chỉ các tế bào ở
trạng thái apoptosis

b. Đánh giá khả năng kích thích sản sinh enzym caspase 3 của
SCO27


13
Hình 3.6. Khả năng kích thích sản
sinh caspase 3 của SCO 27. sco-10
µM; sco-5 µM và sco-2,5 µM: các
mẫu phân tích được bổ sung SCO 27
ở các nồng độ tương ứng. Đối
chứng: mẫu phân tích khơng được
bổ sung hợp chất SCO 27.

Camptothecin: mẫu phân tích được
bổ sung camptothecin

c. Xác định khả năng cảm ứng apoptosis tế bào ung thư phổi A549
của SCO 27
Bảng 3.2. Tỉ lệ tế bào apoptosis dưới tác động của SCO 27 trên dòng
tế bào ung thư phổi A549
Mẫu thử
Control
SCO 27 - 5 µM
SCO 27 - 10 µM
Camptothecin5µM
A

C

Tỉ lệ tế
bào sống
(%)
89,08
88,50
83,33

Tỉ lệ tế bào
apoptosis
sớm (%)
3,89
4,90
4,76

Tỉ lệ tế bào
apoptosis
muộn (%)
5,18
5,72
8,93

Tỉ lệ tế
bào hoại
tử (%)
1,85
0,88
2,99

79,17

15,49

1,57

3,77

B

D

Hình 3.7. Tác động
của SCO 27 đến
quá trình apoptosis
tế bào A549 ở thời

điểm 24h tại các
nồng độ khác nhau
5 µM (C), 10 µM
(D), đối chứng âm
(A) và đối chứng
dương (B) sử dụng
phương
pháp
nhuộm
Annexin
V/P


14

3.3.4.2. Nghiên cứu cơ chế gây độc tế bào ung thư của hợp chất SLE
27 trên tế bào ung thư vú MCF-7
a. Đánh gá tác động của hợp chất SLE 27 lên sự thay đổi hình thái
tế bào ung thư
Hình 3.8. Tác động
của hợp chất SLE 27 ở
nồng độ 10, 30 và 100
µM lên hình thái tế bào
ung thư vú MCF-7.
Mũi tên chỉ các tế bào
ở trạng thái apoptosis.

b. Xác định khả năng cảm ứng apoptosis tế bào ung Độ
thưphóng
vú MCF-7

đại 10X và
của hợp chất SLE 27

20X.

Control:

đối

Bảng 3.3. Tỉ lệ tế bào apoptosis dưới tác động của SLEchứng
27 trên
dòng
âm – Tế bào
tế bào ung thư vú MCF-7
Mẫu thử
Control
SLE 27-10 µM
SLE 27-30 µM
SLE 27-100 µM

Tỉ lệ tế
bào sống
(%)
97,08
97,39
86,08
39,10

MCF-7 khơng bổ sung

Tỉ lệ tế bào
apoptosis
sớm (%)
0,67
1,15
1,72
3,71

Tỉ lệ tế bào
Tỉ lệ tế
hợp chất SLE
apoptosis
bào 27
hoại
muộn (%)
tử (%)
1,93
0,32
1,28
019
7,16
5,04
23,02
34,16

c. Đánh giá tác động của hợp chất SLE 27 đến chu kì tế bào ung thư
vú MCF-7
Bảng 3.4. Tỉ lệ (%) tế bào MCF-7 trong pha G0/G1, S, G2/M và
apoptosis (sub-G1) sau 48 giờ xử lí với hợp chất SLE 27
Mẫu thử

Control
SLE 27 - 10 µM
SLE 27 - 30 µM
SLE 27- 100 µM

Tỉ lệ tế bào ở các pha của chu trình phân bào (%)
Pha sub-G1
Pha G0/G1
Pha S Pha G2/M
0,54
41,21
41,22
14,81
0,23
36,57
33,41
17,78
0,76
40,59
27,19
15,86
10,24
66,08
15,96
4,42


15

Hình 3.10. Ảnh

hưởng của hợp
chất

SLE

27

(nồng độ 10; 30;
100 µM) đến
chu kì tế bào
MCF-7 ở thời
điểm 48h, sử
dụng hệ thống
Flow cytometer
Novocyte

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. Xác định loài của các mẫu san hơ mềm dựa vào các trình tự
DNA chỉ thị
Sau khi tách dịng và giải trình tự của các đoạn gen chỉ thị từ 3
mẫu san hô mềm, các trình tự DNA của Sinularia leptoclados
(MW077896,

MW077906);

Sinularia

conferta

(MW077897,

MW077907) và Sinularia nanolobata (MW077898, MW077908) đã
được đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế NCBI


16

Sinularia-abruptaMF817864
Sinularia-slieringsiMH516803
Sinularia-penghuensisJX991181
Sinularia-molestaJX991172
30 Sinularia-abrubtaFJ621374
Sinularia-abruptaJX991168
37
Sinularia-leptocladosKC542857
66 SLE
46 Sinularia-compactaFJ621384
Sinularia-bisulcaFJ621378
99
Sinularia-acutaFJ621375
46
Sinularia-verseveldtiKC542859
Sinularia-robustaFJ621473
Sinularia-diffusaFJ621399
Sinularia-sp.KF915757
64
Sinularia-abhishiktaeFJ621373
Sinularia-tumulosaFJ621482
50
Sinularia-siaesensisFJ621478

Sinularia-polydactylaKU230374
90 Sinularia-confertaFJ621389
99
43
SCO
Sinularia-peculiarisJX023274
64
Sinularia-ornataJX991173
Sinularia-nanolobataFJ621451
65
90 SN
Sinularia-brassicaKF915724
48

47

0.01

Hình 4.1. Kết quả phân tích chủng loại theo phương pháp NJ (NeighborJoining) trên MEGA6 của các mẫu san hơ mềm dựa vào đa hình trình tự
nucleotit đoạn gen msh1 của các mẫu nghiên cứu và các mẫu san hô mềm
liên quan trên ngân hàng gen NCBI. Các số đầu nhánh cây chủng loại là giá
trị Bootdtrap thể hiện độ tin cậy phân nhánh di truyền các trình tự và nhóm
trình tự

Phân tích chủng loại dựa trên 3 trình tự đoạn gen msh1 nghiên cứu
và 23 trình tự tham khảo trên NCBI. Kết quả trên hình 4.1 cho thấy
mẫu SLE có quan hệ di truyền tương đồng cao với lồi đã được cơng
bố trình tự trên ngân hàng gene quốc tế đó là Sinularia leptoclados
KC542857 (bootstrap 66%). Mẫu SCO có quan hệ di truyền tương
đồng cao với loài S. conferta FJ621389 (bootstrap 90%). Mẫu SN có

quan hệ di truyền tương đồng cao với các lồi S. nanolobata
FJ62621451 (bootstrap 90%).
Tương tự như thế, phân tích phát sinh chủng loại dựa vào trình tự
nucleotit đoạn gen 28S rARN được thực hiện trên 3 trình tự nghiên
cứu và 21 trình tự tham khảo trên NCBI. Kết quả cho thấy mẫu SLE


17

có quan hệ di truyền tương đồng cao với các lồi đã được cơng bố
trình tự trên ngân hàng gene thế giới đó là S. leptoclados KC542857,
S.

leptoclados

MF817912,

S.densa

KC542829,

S.

abrupta

KC542822, S.australiensis KC542825, Sinularia sp. MF817932
(bootstrap 100 %). Mẫu SCO có quan hệ di truyền tương đồng cao
với các lồi đó là S. bisulca KC542826, S. slieringsi MK333594, S.
penghuensis KC542842, S. robusta KC542843, S. verseveldti
KC542845, S. eilatesis KC542832, S. corpulentissima KC542827, S.

maxima KC542839 (bootstrap 100%). Mẫu SN có quan hệ di truyền
tương đồng cao với các loài Sinularia sp. KC915519 và S.
polydactila KF915515 (bootstrap 98%).
Như vậy, tổng hợp các kết quả so sánh trình tự các đoạn gen chỉ
thị msh1 và 28S của 3 mẫu san hơ mềm được trình bày ở Bảng 3.1.
Mẫu SN được xác định thuộc loài S. nanolobata, mẫu SLE được xác
định thuộc loài S. leptoclados, mẫu SCO được xác định thuộc loài S.
conferta. Kết quả này cũng hoàn toàn tương đồng với kết quả xác
định loài dựa trên phân tích các đặc điểm hình thái các mẫu san hơ
mềm nghiên cứu do GS.TS Đỗ Công Thung - Viện Tài ngun mơi
trường biển thực hiện. Điều này đã góp phần khẳng định vai trò hỗ
trợ hiệu quả của các chỉ thị phân tử trong công tác phân loại đối với
một số nhóm sinh vật biển như san hơ mềm.
4.2. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ lồi S.

nanolobata
Từ lồi san hơ mềm S. nanolobata đã phân lập được 10 hợp chất.
Trong đó

bao gồm: 4 hợp chất mới được đặt tên là: 24(S),28-

epoxyergost-5-ene-3β,4α-diol

(SN

6),

3β,4α-dihydroxyergosta-

5,24(28)-diene (SN 8), nanolobatol B (SN 20), nanolobatol A (SN

30) và 6 hợp chất đã biết: 16α-Hydroxysarcosterol (SN 3),


18

sarcophytosterol (SN 4), sinularianin B (SN 10), sinularianin D (SN
11), Cholesta-5,24(28)-dien-3β-ol-7-one (SN 16), dissesterol (SN
17). Các hợp chất phân lập được có cấu trúc thuộc lớp chất sterol và
sesquiterpen
4.3. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ lồi S.

leptoclados
Từ lồi san hơ mềm S. leptoclados đã phân lập và xác định cấu
trúc của 15 hợp chất: tất cả 15 hợp chất đều thuộc lớp chất sterol,
trong đó có 2 hợp chất mới được đặt tên là: Leptosteroid (SLE 10),
5β,6β-epoxygorgosterol (SLE 21) và 13 hợp chất đã biết:
sarcophytosterol (SLE 13), Ergosta-24(28)-en-3β-ol (SLE 19),
Ergosta-5,22,24(28)-trien-3β-ol (SLE 20), 3β,4α-Dihydroxyergosta5,24(28)-die (SLE 22), Ergosta-5,24(28)-dien-3β-ol-7-one (SLE 23),
7-oxogorgosterol (SLE 25), Ergosta-5-en-3β-ol-7-one (SLE 26),
Ergosta-5,24(28)-dien-3β,7β-diol (SLE 27), Ergosta-5-en-3β,7β-diol
(SLE 28), 7β-hydroxygorgosterol (SLE 29), Ergosta-5,24(28)-dien3β,7α-diol (SLE 30), Ergosta-5-en-3β,7α-diol (SLE 31), 7αhydroxygorgosterol (SLE 32).
4.4. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ loài S.

conferta
Từ loài san hô mềm S. conferta đã phân lập và xác định cấu trúc
của 12 hợp chất: tất cả 12 hợp chất đều thuộc lớp chất sterol, trong đó
có 5 hợp chất mới được đặt tên là: 7α-Methoxygorgosterol (SCO
29), 7α-Methoxy-ergosta-5-ene-3β-ol (SCO 30), 3β-Hydroxyergosta4-ene-6-one

(SCO 44), 3β-Hydroxyergosta-4,24(28)-diene-6-one

(SCO

24-methylenecholestane-3β,5α,6β-triol-3-monoacetate

32),

(SCO 42) và 7 hợp chất đã biết: 3β-Hydroxy-24-methylenecholest-5en-7-one

(SCO

26),

24-methylenecholestane-3β,5α,6β-triol-6-


19

monoacetate (SCO 27), 7-methoxyergosta-5,24(28)-diene-3 -ol
(SCO

31),

24-methylenecholestane-3β,5α,6β-triol

(SCO

35),

Ergosta-3β,5α,6β-triol (SCO 37), 3β,7α-Dihydroxyergosta-5,24(28)dien (SCO 34.1) và (24S)-ergost-5-en-3β,7α-diol (SCO 34.3).

4.5. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất
phân lập được
4.5.4.1. Nghiên cứu cơ chế gây độc tế bào ung thư của hợp chất
SCO27 trên tế bào ung thư phổi A549
a. Đánh giá tác động của SCO 27 đến sự thay đổi hình thái tế bào
ung thư
Kết quả phân tích hình thái của tế bào ung thư phổi A549 (hình
3.5) cho thấy các tế bào ở mẫu xử lý với SCO 27 đã xuất hiện ở hiện
tượng apoptosis ở một số tế bào với đặc điểm đặc trưng về thay đổi
hình thái tế bào như: tế bào co đặc, nhân phân mảnh. Số lượng tế bào
apoptosis tăng lên khi tăng nồng độ chất thử SCO 27 từ 2,5 đến 10
µM. Mẫu đối chứng dương (camptothecin) hoạt động ổn định, tế bào
sau xử lý cũng có nhân bắt thuốc nhuộm có màu sáng, tròn và đồng
nhất. Như vậy, hợp chất SCO 27 đã tác động làm thay đổi hình thái
tế bào, đây là cơ sở để tiến hành những nghiên cứu tiếp theo để xác
định khả năng gây apoptosis tế bào của hợp chất này.
b. Đánh giá khả năng kích thích sản sinh enzym caspase 3 của
SCO27
Kết quả hình 3.6 cho thấy, mẫu SCO 27 có khả năng cảm ứng tế
bào A549 sản sinh caspase 3. Hoạt tính này chỉ thể hiện rõ ở nồng độ
10 µM với số lần kích thích tăng 1,74 lần so với đối chứng âm Chất
đối chứng dương camptothecin hoạt động ổn định trong thí nghiệm
với hoạt tính caspase 3 ở nồng độ 5 µM là 2,86 lần so với đối chứng
âm (P<0,05). Như vậy, hợp chất SCO 27 có nhiều tiềm năng cho các


20

nghiên cứu tiếp tục theo định hướng kháng ung thư. Đến nay, chưa
có tài liệu nào cơng bố về khả năng kích hoạt enzym caspase 3 của

hợp chất SCO 27.
c. Xác định khả năng cảm ứng apoptosis tế bào ung thư phôi A549
của SCO 27
Dưới tác động của hợp chất SCO 27, tỉ lệ tế bào apoptosis sớm, tế
bào apoptosis muộn và tế bào hoại tử tăng lên, mức độ tăng này tỉ lệ
thuận với nồng độ SCO 27 trong mẫu thử. Ở nồng độ 10 µM SCO
27, tỉ lệ tế bào ở giai đoạn apoptosis muộn và tế bào hoại tử đều tăng
lên so với đối chứng (control). Ở tế bào đối chứng, tỉ lệ tế bào
apoptosis muộn chỉ chiếm 5,18 % tuy nhiên quần thể tế bào này tăng
lên đến 8,93 % dưới tác động của SCO 27 nồng độ 10 µM. Khi nồng
độ mẫu thử giảm xuống 5 µM, tỉ lệ tế bào apoptosis sớm là 4,90 % và
apoptosis muộn là 5,72 %, tỉ lệ tế bào hoại tử là 0,88 %. Như vậy hợp
chất SCO 27 thể hiện khả năng gây chết tế bào thông qua quá trình
apoptosis.
4.5.4.2. Nghiên cứu cơ chế gây độc tế bào ung thư của hợp chất SLE
27 trên tế bào ung thư vú MCF-7
a. Đánh gá tác động của hợp chất SLE 27 lên sự thay đổi hình thái tế
bào ung thư
Phân tích hình thái tế bào MCF-7 dưới kính hiển vi soi ngược cho
thấy sự thay đổi rõ rệt về hình thái sau 48 h xử lí với hợp chất SLE
27 ở các nồng độ 10, 30 và 100 µM. Các mẫu tế bào biểu hiện rõ rệt
các đặc điểm của quá trình apoptosis như mật độ giảm, sự co lại của
tế bào, sự cô đặc của nhiễm sắc thể (hình 3.8). Từ đó có thể đưa ra
kết luận, hợp chất SLE 27 đã tác động làm thay đổi hình thái tế bào
ung thư vú MCF-7. Đây là cơ sở để tiến hành những nghiên cứu tiếp
theo về cơ chế gây độc tế bào ung thư của hợp chất này.


21

b. Xác định khả năng cảm ứng apoptosis tế bào ung thư vú MCF-7
của hợp chất SLE 27
Phân tích flow cytometry cho thấy sau khi xử lý với SLE 27, tỷ lệ
tế bào ở giai đoạn apoptosis sớm, apoptosis muộn và tế bào hoại tử
đều tăng lên so với đối chứng (Control). Ở nồng độ 100 µM, chỉ có
39,10 % tế bào sống, giảm đi đáng kể so với mẫu đối chứng là 97,08
%. Trong khi đó, tỷ lệ tế bào tự chết tăng lên 26.73 % (bao gồm
23,02 % apoptosis muộn và 3,71 % apoptosis sớm) (Hình 3.9). Khi
nồng độ mẫu thử giảm xuống 30 µM, tỉ lệ tế bào apoptosis sớm là
1,72 % và apoptosis muộn là 7,16 %, tỉ lệ tế bào hoại tử là 5,04 %.
Như vậy hợp chất SLE 27 đã thể hiện khả năng gây chết tế bào thơng
qua q trình apoptosis.
c. Đánh giá tác động của hợp chất SLE 27 đến chu kì tế bào ung thư
vú MCF-7
Kết quả phân tích (Hình 3.10) cho thấy, tỷ lệ tế bào ở pha G0/G1
tăng tỷ lệ thuận với nồng độ hợp chất SLE 27 (từ 30 µM lên 100
µM). Cụ thể, ở nồng độ 10 µM, tỷ lệ tế bào pha G0/G1 là 36,57 %, ở
nồng độ 30 µM, tỷ lệ tế bào pha G0/G1 là 40,59 % và ở nồng độ 100
µM, tỷ lệ tế bào pha G0/G1 cao nhất, đạt 66,08 %. Ở cả 3 nồng độ
thử nghiệm, hợp chất SLE 27 tác động chủ yếu tới tỷ lệ tế bào ở pha
G0/G1. Trong khi đó, tỷ lệ tế bào ở pha S và pha G2/M lại giảm dần,
tỷ lệ nghịch với nồng độ hợp chất SLE 27. Có thể giải thích hiện
tượng này là dưới tác động của hợp chất SLE 27, một lượng lớn các
tế bào đã không trải qua giai đoạn sao chép ADN (pha S) và nguyên
phân (Pha M). Như vậy, hợp chất SLE 27 đã có vai trị bắt giữ chu kì
tế bào ung thư vú MCF-7 ở pha G0/G1. Đây là một tác động mới liên
quan hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hợp chất SLE 27 và chưa
từng được báo cáo trước đây.

22

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Nghiên cứu xác định tên khoa học:
Tên khoa học của 3 mẫu san hô mềm nghiên cứu S. nanolobata, S.
conferta, S. leptoclados thu ở vùng biển Trung bộ Việt Nam đã được
xác định bằng phân tích trình tự của hai chỉ thị phân tử (gen msh1 và
gen 28S rRNA) sau khi phân tích đặc điểm hình thái.
2. Nghiên cứu về thành phần hóa học:
Sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký và các phương pháp phổ
hiện đại đã phân lập và xác định cấu trúc 37 hợp chất từ ba lồi san
hơ mềm S. nanolobata, S. conferta, S. leptoclados. Trong đó, có 11
hợp chất mới. Cụ thể:
- Từ loài S. nanolobata đã phân lập và xác định cấu trúc 10 hợp
chất (SN) bao gồm 4 hợp chất mới và 6 hợp chất đã biết. Các hợp
chất này thuộc lớp chất sesquiterpen và steroid
- Từ loài S. leptoclados đã phân lập và xác định cấu trúc của 15
hợp chất thuộc nhóm steroid, trong đó có 2 hợp chất mới và 13 hợp
chất đã biết
- Từ loài S. conferta đã phân lập và xác định cấu trúc 12 hợp chất
thuộc lớp chất steroid, trong đó có 5 hợp chất mới và 7 hợp chất đã
biết
3. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học
- Đã tiến hành đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư trên 8
dòng tế bào ung thư ở người: KB, LNCaP, SK-LU-, SK-Mel-2,
HepG2, MCF-7, HL-60, SW480 của 10 hợp chất SN và 15 hợp chất
SLE. Kết quả cho thấy: Hợp chất SLE 10, SLE 27, SLE 28 thể hiện
hoạt tính gây độc tế bào trên 8 dòng tế bào, SLE 20 và SN 6 thể hiện

23

hoạt tính trên 3 dịng tế bào, SLE 30 thể hiện hoạt tính trên 2 dịng tế
bào và SN 4 thể hiện hoạt tính trên 1 dịng tế bào.
- Đã tiến hành đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư trên 3
dòng tế bào ung thư ở người: A-549, PANC1, Hela của 12 hợp chất
SCO. Kết quả cho thấy cả 3 hợp chất SCO 27, SCO 35 và SCO 37
thể hiện hoạt tính tốt trên cả 3 dịng tế bào ung thư thử nghiệm.
4. Nghiên cứu cơ chế gây độc tế bào ung thư của 2 hợp chất SCO
27 và SLE 27 cho thấy:
- Hợp chất SCO 27 gây độc tế bào ung thư theo cơ chế cảm ứng
apoptosis trên tế bào ung thư phổi A549 thông qua kích hoạt sản sinh
caspase 3 và thể hiện bằng sự thay đổi hình thái tế bào như cơ đặc
hoặc phân mảnh nhân tế bào và , tăng tỷ lệ tế bào apoptosis sớm,
apoptosis muộn.
- Hợp chất SLE 27 gây độc tế bào ung thư theo cơ chế cảm ứng
apoptosis trên tế bào ung thư vú MCF-7 bằng cách thay đổi hình thái
tế bào như cơ đặc hoặc phân mảnh nhân tế bào, tăng tỷ lệ tế bào
apoptosis sớm, apoptosis muộn. Ngồi ra, hợp chất này cịn gây độc
tế bào bằng cách bắt giữ chu kì tế bào ở pha G0/G1, từ đó ngăn cản
sự phân chia của tế bào ung thư.
KIẾN NGHỊ
Từ các kết quả nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào và cơ chế tác
động của các hợp chất phân lập từ các lồi san hơ mềm S. nanolobata, S.
conferta, S. leptoclados chúng tôi nhận thấy: SCO 27 và SLE 27 là hai
hợp chất tiềm năng trong việc nghiên cứu và phát triển thuốc điều trị
ung thư vú và ung thư phổi. Vì vậy cần có những nghiên cứu sâu hơn
về cơ chế gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư khác nhau ở
cấp độ in vivo để làm rõ cơ chế tác động của các hợp chất đó.