Nghiên cứu hoạt tính gây độc một số dòng tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ ba loài san hô mềm sinularia nanolobata, sinularia leptoclados, sinularia conferta thu thập ở vùng biển trung bộ việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG
NGHỆ VIỆ
NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ
--------------------

Ninh Thị Ngọc

NGHIÊN CỨU HOẠT
TÍNH GÂY ĐỘC MỘT
SỐ DỊNG TẾ BÀO UNG
THƯ CỦA CÁC HỢP
CHẤT PHÂN LẬP TỪ
BA LỒI SAN HƠ MỀM
SINULARIA
NANOLOBATA,
SINULARIA
LEPTOCLADOS,
SINULARIA CONFERTA


THU THẬP Ở VÙNG BIỂN
TRUNG BỘ VIỆT NAM

LUẬN ÁN

TIẾN SĨ SINH
HỌC

Hà Nội – 2021


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG
NGHỆ VIỆ
NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ
----------------------

Ninh Thị Ngọc

NGHIÊN CỨU HOẠT
TÍNH GÂY ĐỘC MỘT
SỐ DỊNG TẾ BÀO UNG
THƯ CỦA CÁC HỢP
CHẤT PHÂN LẬP TỪ
BA LỒI SAN HƠ MỀM
SINULARIA
NANOLOBATA,
SINULARIA
LEPTOCLADOS,

SINULARIA CONFERTA


ần
Mỹ
Lin
h

THU THẬP Ở VÙNG BIỂN
TRUNG BỘ VIỆT NAM
Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 9.42.01.16
Hà Nội – 2021
LUẬN ÁN
TIẾN SĨ SINH
HỌC

NGƯỜ
I
HƯỚN
G DẪN
KHOA
HỌC:
1.

T
S
.
N
g

u
y
ễ
n
H
o
à
i
N
a
m

2.

T
S
.
T
r


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận án này là cơng trình nghiên cứu của tơi dưới sự hướng
dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hoài Nam và TS. Trần Mỹ Linh. Các số liệu, kết quả
trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả

Ninh Thị Ngọc


ii

LỜI CẢM ƠN
Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa
học và Cơng nghệ Việt Nam, với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài VAST.TĐ.DLB.02/1618 và Nafosted 104.01–2013.31. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được

nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn
bè và gia đình.
Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Hoài Nam và TS. Trần Mỹ
Linh - những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn chỉ dạy cho tôi về mặt chuyên môn,
động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian
thực hiện luận án .
Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo và các đồng nghiệp phịng Dược liệu
biển - Viện Hóa Sinh biển đặc biệt là GS.VS. Châu Văn Minh về sự chỉ bảo, những
lời khun bổ ích và những góp ý q báu trong việc thực hiện và hồn thiện luận
án.
Tơi xin trân trọng cảm ơn Viện Hóa sinh biển, Viện Cơng nghệ sinh học và
Học viện Khoa học và Công nghệ đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tơi
trong q trình học.
Tơi xin trân trọng cảm ơn Phịng Tài nguyên sinh vật, Trung tâm Tiên tiến về
Hóa sinh hữu cơ - Viện Hóa sinh biển, Phịng Thử nghiệm sinh học – Viện Công
nghệ sinh học đã giúp đỡ tơi trong việc định lồi và thử hoạt tính.
Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới tồn thể gia đình,
bạn bè và những người thân đã ln ln quan tâm, khích lệ, động viên tơi trong
suốt q trình học tập và nghiên cứu.
Xin trân trọng cảm ơn!

Ninh Thị Ngọc


iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN …………………………………………………………….
LỜI CẢM ƠN…………………………………………………………...........
MỤC LỤC…………………………………………………………………….
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT…………………………............
DANH MỤC BẢNG………………………………………………………….
DANH MỤC HÌNH…………………………………………………………..
MỞ ĐẦU………………………………………………………………………
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN…………………………………………………
1.1.

Thử nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bà

1.1.1. Các dòng tế bào ung thư ……………………………………………………..
1.1.2. Vai trò của các thử nghiệm sinh học trong tìm kiếm các hoạt chất

chống ung thư ………………………………………
1.1.3. Cơ chế diệt tế bào ung thư dựa trên apoptosis ……………………………
1.1.4. Cơ chế diệt tế bào ung thư liên quan tới chu kỳ tế bào …………………..
1.2. Các hợp chất tự nhiên từ sinh vật biển trong điều trị ung thư ……..
1.2.1. Tình hình nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thư có nguồn gốc từ

sinh vật biển ……………………………………
1.2.2. Tình hình nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính chống ung thư từ san

hơ mềm của Việt Nam………………………………
1.3. Giới thiệu chung về san hô mềm ……………………………………..
1.3.1. Đặc điểm của san hô mềm …………………………………………………..
1.3.2. Tổng quan về chi Sinularia …………………………………………………..
1.3.3. Ứng dụng các chỉ thị phân tử trong phân loại san hơ mềm …………….
1.3.4. Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ
các lồi san hơ mềm thuộc chi Sinularia ………
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……...
2.1.

Đối tượng nghiên cứu …………………………

2.1.1.

Lồi san hơ mềm S. nanolobata …………………

2.1.2.

Lồi san hơ mềm S. leptoclados …………………

2.1.3.

Lồi san hơ mềm S. conferta …..…………………


iv
2.2.

Phương pháp nghiên cứu ………………………

2.2.1. Xác định tên khoa học của các mẫu san hô mềm …………………………
2.2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất ……………………………………….
2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất …………………..
2.2.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính và cơ chế gây độc tế bào ung thư…….
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ………………………………………..
3.1. Xác định lồi bằng chỉ thị phân tử ……………………………………….
3.1.1

Giải trình tự đoạn gen 28S rARN và msh1 của 3

3.1.2.

So sánh trình tự của 3 mẫu san hô mềm bằng ch

3.2.

Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của cá

3.2.1. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ mẫu san hô

mềm S. nanolobata…………………………………
3.2.2. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ mẫu san hô

mềm S. leptoclados…………………………………
3.2.3. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ mẫu san hơ

mềm S. conferta………………………………………
3.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được

từ các mẫu san hơ mềm……………………………

3.2.1. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập

từ lồi S. nanolobata………………………………
3.2.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập

từ lồi S. leptoclados………………………………
3.2.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập

từ loài S. conferta……………………………………
3.2.4. Nghiên cứu cơ chế gây độc tế bào ung thư của hợp chất SLE 27 và hợp

chất SCO 27…………………………………………
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU …………………….
4.1. Xác định lồi của các mẫu san hơ mềm dựa vào các trình tự ADN

chỉ thị…………………………………………………
4.2. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ S. nanolobata..
4.2.1. Hợp chất SN 8: 3β,4α-dihydroxyergosta-5,24(28)-diene (hợp chất mới)
4.2.2. Hợp chất SN 6: 24(S),28-epoxyergost-5-ene-3β,4α-diol (hợp chất mới )


v
4.2.3. Hợp chất SN 20: Nanolobatol B (hợp chất mới ) …………………………
4.2.4. Hợp chất SN 30: Nanolobatol A (hợp chất mới ) …………………………
4.2.5. Xác định cấu trúc của các hợp chất còn lại ………………………………..
4.2.6. Thống kê các hợp chất phân lập được từ loài S. nanolobata…………….
4.3. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ S. leptoclados..
4.3.1. Hợp chất SLE 10: Leptosteroid (chất mới) ………………………………..
4.3.2. Hợp chất SLE 21: 5,6β-epoxygorgosterol (chất mới)……………………..
4.3.3. Hợp chất SLE 27: Ergosta-5,24(28)-dien-3β,7β-diol……………………..

4.3.4. Xác định cấu trúc của các hợp chất còn lại………………………………...
4.3.5. Thống kê các hợp chất phân lập được từ loài S. leptoclados…………….
4.4. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ S. conferta.......
4.4.1. Hợp chất SCO 29: 7α-methoxygorgosterol (chất mới) ………….............
4.4.2. Hợp chất SCO 30: 7α-Methoxy-ergosta-5-ene-3β-ol (chất mới)………..
4.4.3. Hợp chất SCO 44: 3β-hydroxyergosta-4-en-6-one (chất mới)………….
4.4.4. Hợp chất SCO 42: ergost-24(28)-ene-3β,5α,6β-triol-3-acetate (chất
mới)………………………………………………………………………………
4.4.5. Hợp chất SCO 32: 3β-hydroxyergosta-4,24(28)-dien-6-one (chất mới)..
4.4.6. Hợp chất SCO 27: 24-methylenecholestane-3β,5α,6β-triol-6monoacetate……………………………………………………………………
4.4.7. Xác định cấu trúc của các hợp chất còn lại ………………………………..
4.4.8. Thống kê các hợp chất phân lập được từ loài S. conferta ……………….
4.5.

Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các

lập được……………………………………………………
4.5.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ

loài S. nanolobata…………………………………………
4.5.2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ

lồi S. leptoclados…………………………………………
4.5.3. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ

loài S. conferta………………………………………………
4.5.4. Nghiên cứu cơ chế chống ung thư của hợp chất SLE 27 và SCO 27……
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………………… 121

vi
TÍNH MỚI CỦA LUẬN ÁN ………………………………………………… 123
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ ………………..............

124

TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………….

126

PHỤ LỤC ……………………………………………………………………………..


vii

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
13

C-NMR

1

H- H COSY

1

1

H-NMR

5-EPA
6-OHDA
ADC
ATCC
A-549
CC
CD
COX-2
DEPT
DLAT
DLD-1
DMEM
DMSO
ADN
FBS
H2SO4
Hep-G2


HL-60
HMBC
HPLC
HR-TOF-MS
HSQC
IC50
IL-12
IL-6
iNOS
IR

LC-MS
LPS
LU-1
LysoPC
MCF-7
MDAMB435
MMAE
MMAF
MMP
MS
MTT


NF-κB
NOESY
PC
PI3K/Akt

PS
PTP1B
RAW264.7
SCO
SK-Mel-2
SLE
SN
SRB
TCA
TLC
TMS

x

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1

Thông

gốc từ

đoạn t
Bảng 1.2.

Một số

………
Bảng 2.1.

Các cặ

mẫu sa
Bảng 2.2.

Thành

Bảng 2.3.

Chu k

Bảng 3.1.

Kết qu

phân t

28S rA
Bảng 3.2.

Kết qu

Bảng 3.3.

Kết qu

Bảng 3.4.

Kết qu

Bảng 3.5.Kết quả đánh giá sự thay đởi hình thái tế bào ung thư phởi của

hợp c
Bảng 3.6.

Tỉ lệ t

bào un
Bảng 3.7.

Tỉ lệ t

bào un
Bảng 3.8.

Tỉ lệ (

(sub-G
Bảng 4.1.

Số liệu

Bảng 4.2.

Số liệu

Bảng 4.3.

Số liệu

Bảng 4.4.Số liệu phổ của hợp chất SN 30, tương tác chính trên HMBC …
Bảng 4.5.

Số liệu

Bảng 4.6.

Số liệu

Bảng 4.7.Số liệu phổ của hợp chất SLE 27, tương tác chính trên HMBC...

xi
Bảng 4.8.Số liệu phổ của hợp chất SCO 29, tương tác chính trên HMBC..
Bảng 4.9.Số liệu phở của hợp chất SCO 30, tương tác chính trên HMBC..
Bảng 4.10. Số liệu phở của hợp chất SCO 44, tương tác chính trên HMBC..
Bảng 4.11. Số liệu phổ của hợp chất SCO 42, tương tác chính trên HMBC..
Bảng 4.12. Số liệu phở của hợp chất SCO 32, tương tác chính trên HMBC..
Bảng 4.13. Số liệu phổ của hợp chất SCO 27, tương tác chính trên HMBC..


xii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1.

Q t

ngoại
Hình 1.2.

Các c

thư …
Hình 1.3.

Cấu t

Hình 1.4.

Các d

Hình 1.5.

Cấu t

Sinul
Hình 1.6.

Sơ đờ

tế bào
Hình 1.7.

Sơ đờ

qua c
Hình 1.8.

Cấu t

Sinul
Hình 1.9.

Cấu t

Sinul
Hình 1.10. Cấu trúc minh hóa mợt số hợp chất norcembranoid diterpen
phân
Hình 1.11.

Cấu t

Sinul
Hình 1.12.

Cấu t

từ ch
Hình 1.13.

Cấu t

từ ch
Hình 2.1.

Mẫu

Hình 2.2.

Mẫu

Hình 2.3.

Mẫu

Hình 2.4.Ảnh điện di ADN tởng số tách chiết từ các mẫu SN, SLE và

SCO…
Hình 2.5.

Ảnh đ

các mẫu

dụng cặ

mời MS

SLE, SC
Hình 2.6.

Ảnh điệ

khi biế

san hơ m

(giếng s
Hình 2.7.Ảnh điện di các sản phẩm PCR-colony từ mợt số khuẩn lạc sau

khi biến

hơ mềm

(giếng s
Hình 2.8.Sơ đờ phân lập các hợp chất từ mẫu san hô mềm S. nanolobata..
Hình 2.9.Sơ đờ phân lập các hợp chất từ mẫu san hơ mềm S. leptoclados..
Hình 2.10. Sơ đờ phân lập các hợp chất từ mẫu san hơ mềm S. conferta….
Hình 3.1.Mợt số hình ảnh về kết quả BLAST (so sánh) các trình tự gen

chỉ thị c
Hình 3.2.

Cấu trú

nanolob
Hình 3.3.

Cấu trú

leptocla
Hình 3.4.

Cấu trú

conferta
Hình 3.5.Hình thái tế bào A549 dưới tác đợng của SCO 27 ở các nờng đợ

khác nh
Hình 3.6.

Khả năn

chứng …
Hình 3.7.

Tác đợn

thời điể

đối chứ

pháp nh
Hình 3.8.Tác đợng của hợp chất SLE 27 ở nồng độ 10, 30 và 100 µM lên


hình

trạn
Hình 3.9.

Tác

thời

(C),

nhu
Hình 3.10.

Ảnh

chu

cyto

Nov
Hình 4.1.

Kết

Join

trìn

mẫu
Hình 4.2.

Kết

của

gen

liên
Hình 4.3.

Hợp

one
Hình 4.4.

Cấu

chín
Hình 4.5.

Mơ

Hình 4.6.

Cấu

hợp
Hình 4.7.

Cấu

chín
Hình 4.8.

Cấu

chín
Hình 4.9.

Cấu

Hình 4.10.

Cấu


Hình 4.11.

Cấu

Hình 4.12.

Cấu

hợp
Hình 4.13.

Các

Hình 4.14.

Cấu

SCO
Hình 4.15.

Cấu

SCO
Hình 4.16.

Cấu

SCO
Hình 4.17.

Cấu

SCO
Hình 4.18.

Cấu

SCO
Hình 4.19.

Cấu

Hình 4.20. Giá trị IC50 của hợp chất SLE 27 trên các dịng tế bào ung thư

thử
Hình 4.21.

Cấu

Hình 4.22.

Giá

Hình 4.23.

Cấu


1

MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, nhiều quốc gia đã khai thác các chất có hoạt tính
sinh học từ sinh vật biển nhằm phục vụ các nghiên cứu tìm kiếm các loại thuốc chữa
trị bệnh hiểm nghèo như: ung thư, viêm gan, các bệnh về viêm nhiễm và do virus
gây ra. Cho đến thời điểm này đã có mợt số dược phẩm có ng̀n gốc từ sinh vật
biển đến được tay người sử dụng, điển hình như Cytarabine, Vidarabine, Eribulin,
Trabectedin…Để có được thành quả này, các viện nghiên cứu trên thế giới đã sàng

lọc hoạt tính sinh học của hàng triệu hợp chất từ các lồi sinh vật biển, đờng thời
đầu tư ng̀n lực tài chính và thời gian cho các giai đoạn nghiên cứu tiền lâm sàng
và lâm sàng đối với các hợp chất tiềm năng.
Với lợi thế sở hữu đường bờ biển dài trên 3.260 km cùng với rất nhiều đảo
và vịnh, Việt Nam có tiềm năng lớn lao trong việc khai thác với nguồn tài nguyên
sinh vật biển đa dạng, phong phú cả về thành phần loài và trữ lượng. Tuy nhiên, cho
đến nay các nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất giá trị từ sinh vật biển Việt Nam hiện
còn chưa nhiều và hạn chế ở bước thử nghiệm hoạt tính in vivo và nghiên cứu về cơ
chế tương tác giữa thuốc và tế bào ung thư. Các nghiên cứu hiện đang ở giai đoạn
đầu so với các nuớc trong khu vực và lùi xa so với các nước tiên tiến. Ngun nhân
là do cịn mợt số khó khăn như: việc khảo sát và thu thập mẫu sinh vật ở biển yêu
cầu trang thiết bị hiện đại và chuyên gia giàu kinh nghiệm, các hợp chất phân lập
được từ sinh vật biển thường có hàm lượng rất nhỏ, cấu trúc phức tạp, một số hợp
chất dễ phân hủy ngay trong q trình phân tích. Do đó, hiện nay yêu cầu cấp thiết
đối với nước ta là cần phát triển nhiều nghiên cứu nhằm từng bước hệ thống về
thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của những lồi sinh vật biển.
Chi Sinularia là mợt trong các chi san hô mềm được nhiều nhà khoa học trên
thế giới quan tâm nghiên cứu. Cho đến nay đã có nhiều cơng trình nghiên cứu về
thành phần hóa học và các hoạt tính sinh học của nhiều hợp chất phân lập được từ
các đối tượng san hô mềm thuộc chi này. Tuy nhiên, các nghiên cứu đối với nhiều
loài san hô mềm thuộc chi Sinularia như S. nanolobata, S. leptoclados, S. conferta ở
Việt Nam rất ít và hầu như chưa có các nghiên cứu mợt cách hệ thống và bài bản về
các loài nêu trên. Xuất phát từ thực tế trên, NCS đã lựa chọn đề tài luận án “Nghiên
cứu hoạt tính gây độc một số dịng tế bào ung thư của các hợp chất


2
phân lập từ ba lồi san hơ mềm Sinularia nanolobata, Sinularia leptoclados,
sinularia conferta thu thập ở vùng biển Trung Bộ Việt Nam”.
Mục tiêu của luận án:

- Xác định được thành phần hóa học của ba lồi san hơ mềm S. nanolobata, S.

conferta, S. leptoclados thu thập ở vùng biển Trung bợ Việt Nam.
- Phát hiện được các hoạt chất có hoạt tính gây đợc tế bào có trong các lồi san

hô mềm nghiên cứu, định hướng ứng dụng cho các nghiên cứu y sinh dược học.
1. Xác định tên khoa học của ba lồi san hơ mềm thu thập ở vùng biển Trung Bộ

Việt Nam bằng chỉ thị phân tử
2. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ ba lồi san hơ mềm S.

nanolobata, S. conferta, S. leptoclados.
3. Đánh giá hoạt tính gây đợc tế bào ung thư in vitro của các hợp chất phân lập

được.
4. Đánh giá cơ chế gây độc tế bào của một số hợp chất tiêu biểu.


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Thử nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư
1.1.1. Các dòng tế bào ung thư
Lịch sử nghiên cứu ung thư và việc thành lập các dịng tế bào ung thưcó liên
quan chặt chẽ với nhau [1]. Nhiều nhà nghiên cứu đã tìm hiểu các cơ chế phức tạp
biến đổi từ một tế bào bình thường thành tế bào ung thư. Năm 1951, những cải tiến
trong việc xác định các yêu cầu sinh hóa đối với sự phát triển của các tế bào sinh lý
và biến đổi đã cho phép Tiến sĩ George Otto Gey tại Bệnh viện Johns Hopkins thành
lập dòng tế bào ung thư đầu tiên và nổi tiếng từ người, được đặt tên là HeLa [2].
Tên “HeLa” là từ viết tắt của Henrietta Lacks, một phụ nữ trẻ da đen bị ảnh hưởng

bởi ung thư biểu mô cổ tử cung, từ đó tế bào HeLa được tạo ra. Sự ra đời của dịng
tế bào HeLa có thể coi là mợt cợt mốc quan trọng khác trong lịch sử sinh học tế bào,
đờng thời nó đã mở ra những hướng mới trong lĩnh vực nghiên cứu ung thư. Bắt đầu
từ sự ổn định của chúng, các tế bào HeLa đã tạo thành ví dụ đầu tiên về “bệnh ung
thư ở người trong ống nghiệm”. Dịng tế bào HeLa rất ởn định và tăng sinh mạnh –
điều này dẫn đến việc chúng dễ nhiễm chéo vào nhiều dòng tế bào khác cũng được
sử dụng trong nghiên cứu. Sự tăng sinh ổn định của dịng tế bào HeLa và đặc tính
dễ bị nhiễm virus bại liệt nên đến năm 1954, Jonas Salk đã phát triển mợt loại
vacxin phịng bệnh bại liệt bằng việc sử dụng các tế bào HeLa.
Ngày nay, các dòng tế bào ung thư đã được sử dụng rộng rãi cho các mục
đích nghiên cứu và được chứng minh là mợt cơng cụ hữu ích để tìm hiểu về mặt di
trùn của các bệnh ung thư, thực tế cho thấy chúng là mợt mơ hình tuyệt vời cho
việc nghiên cứu các cơ chế sinh học gây ra căn bệnh này [3]. Nghiên cứu ứng dụng
các dòng tế bào ung thư đã cho phép tìm hiểu thơng tin về sự tăng hoặc giảm sự
biểu hiện của các gen liên quan và các con đường truyền tín hiệu trong tế bào ung
thư [4]. Hơn nữa, việc sử dụng mơ hình tế bào là cơ sở cho sự phát triển và thử
nghiệm các loại thuốc chống ung thư hiện đang được sử dụng [5, 6] và cũng là một
phương pháp thay thế cho cấy ghép khối u đợng vật trong thử nghiệm hóa trị liệu
[7]. Trên thực tế, việc sử dụng mơ hình tế bào in vitro trong nghiên cứu ung thư là
rất quan trọng để điều tra các con đường di truyền, di truyền ngồi gen
(epigenetics), sự tăng sinh, q trình tự chết (apoptosis) và sự tiến triển của ung thư,


4
từ đó giúp xác định được các chỉ thị phân tử tiềm năng [4, 8] và sàng lọc, tối ưu hóa
các phương pháp điều trị ung thư [6, 9]. Các kết quả nghiên cứu trong các dòng tế
bào ung thư thường được ngoại suy cho các khối u in vivo [8] và tầm quan trọng của
nó như là các mơ hình thử nghiệm thuốc và nghiên cứu dịch mã đã được nhiều công
ty y sinh và dược phẩm công nhận [5]. Các dòng tế bào ung thư khác nhau thể hiện
các phản ứng đa dạng với các loại thuốc chống ung thư gây đợc tế bào, ví dụ như

các dịng tế bào ung thư ṛt kết có khả năng kháng lại các loại thuốc liên kết với
ADN trong khi các dòng tế bào ung thư vú hoặc bệnh bạch cầu thì lại nhạy hơn
[10].
Việc sử dụng bảng dịng tế bào (cell line panel) là mợt cơng cụ hữu ích để thử
nghiệm thuốc chống ung thư. Sự phát triển các bảng dịng tế bào ung thư này được
khởi xướng cho nhóm NCI60 (Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ với 60 dòng tế bào
ung thư) nhằm khắc phục việc sử dụng các mơ hình đợng vật để thử nghiệm thuốc
chống ung thư [7]. Sau đó, Nakatsu và cợng sự (2005) đã thành lập mợt nhóm
nghiên cứu gờm 45 dịng tế bào ung thư (JFCR-45) từ các bộ phận khác nhau (vú,
gan và dạ dày) để xác định các gen liên quan. Họ cũng cố gắng tìm hiểu cơ chế hoạt
đợng của các loại thuốc này để phân loại. Nghiên cứu này liên quan đến phương
pháp tiếp cận thông tin sinh học tích hợp sử dụng các mảng cADN, đã tiết lợ nhiều
gen ứng cử viên liên quan đến độ nhạy đối với các loại thuốc hóa trị liệu [6]. Gần
đây, Garnett và các đồng nghiệp (2012) đã sàng lọc một bảng gờm hàng trăm dịng
tế bào ung thư (đại diện cho phần lớn sự đa dạng về loại mô và di truyền của bệnh
ung thư ở người) với 130 loại thuốc đang được nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm
sàng và xác minh rằng các gen ung thư bị đột biến có liên quan đến phản ứng của tế
bào với các loại thuốc được sử dụng phổ biến nhất. Kết quả này như mợt hờ sơ sinh
dược học về các dịng tế bào ung thư giúp định hướng các chiến lược điều trị ung
thư hợp lý hơn [11].
1.1.2. Vai trò của các thử nghiệm sinh học trong tìm kiếm các hoạt chất chống
ung thư
Thử nghiệm sinh học (bioassay) là những thử nghiệm được thiết kế để phân
tích tác đợng sinh học của một hợp chất bằng cách sử dụng các hệ thống sinh học
phù hợp như tế bào, mô, vi khuẩn, động vật, thực vật.... Thử nghiệm sinh học được
định nghĩa là mợt sự tính tốn để xác định nờng đợ hay đánh giá hiệu lực của một


5
tác nhân vật lý, hóa học hay sinh học bằng việc đo lường, kiểm chứng mức đợ phản

ứng của thí nghiệm trên hệ sinh học phù hợp dưới điều kiện tiêu chuẩn khi so sánh
với một chất chuẩn. Thử nghiệm sinh học theo nghĩa rợng là quy trình để xác định
mối quan hệ giữa một tác nhân với ảnh hưởng mà tác nhân này tạo ra trên cơ thể
sống
Thử nghiệm sinh học có vai trị quan trọng trong những chương trình kiểm
sốt việc phát triển và sản xuất các dược phẩm sinh học chất lượng một cách hiệu
quả. Thử nghiệm sinh học có thể chia thành nhiều loại và các mức độ khác nhau dựa
trên đối tượng sinh học được sử dụng như các chủng vi sinh vật, tế bào ni cấy, các
loại mơ có ng̀n gốc từ con người và đợng vật, thậm chí trên tồn bợ cơ thể động
vật [12]. Tuy nhiên, dựa vào đặc điểm kỹ thuật sử dụng có thể chia thành 4 nhóm
lớn như sau: Các phép thử in vitro, các phép thử in vivo, các phép thử ex vivo và các
phép thử xenograph
Các phép thử sinh học in vitro có vai trị quan trọng trong việc định hướng
phân tách các thành phần có hoạt tính từ nhiều ng̀n tự nhiên khác nhau. Vì vậy,
phát triển hệ thống sàng lọc in vitro các dịch chiết hay hợp chất sạch nhằm phát hiện
ra các loại thuốc mới hoặc các chất dẫn đường là một chiến lược quan trọng trong
tiến trình tìm kiếm ng̀n dược phẩm mới.. Các phép thử sinh học được lựa chọn
dựa vào bản chất và hoạt tính sinh học cần đánh giá của hợp chất thử. Các phép thử
sinh học in vitro được chia thành 2 loại: phép thử dựa trên mơ hình nuôi cấy tế bào
(cell-based assays) và phép thử dựa vào cơ chế (mechanism-based assays) [13].
a. Phép thử dựa trên mô hình ni cấy tế bào (cell-based assays)
Mơ hình ni cấy tế bào là thuật ngữ được dùng để nói đến những thử
nghiệm dựa trên việc sử dụng tế bào sống, bao gồm những phép thử đánh giá ảnh
hưởng của chất hay nhóm chất nghiên cứu đến sinh lý của tế bào bao gờm những
thay đởi về hình thái và sự phát triển của chúng. Thử nghiệm dựa trên tế bào miêu tả
khá chính xác mơ hình của sự sống bởi tế bào được xem là đơn vị sống nhỏ nhất
nhưng hoàn chỉnh nhất của thế giới sinh vật. Trong hệ thống nuôi cấy tế bào in vitro,
thuật ngữ “gây độc tế bào” (cytotoxicity) dùng để chỉ khả năng làm thay đởi hình
thái, tốc đợ sinh trưởng hoặc làm chết tế bào của hợp chất thử hoặc tác nhân thử
[14]. Các phép thử gây độc tế bào là phương pháp hữu hiệu nhất trong việc sàng

6
lọc phát hiện những phân tử thuốc mới phân lập từ nguồn tự nhiên cũng như thuốc
tổng hợp.
Với sự thành công vượt bậc trong việc phân lập và nuôi cấy in vitro thường
qui các dòng tế bào khác nhau, hàng loạt các thử nghiệm sinh học dựa trên mơ hình
tế bào đã được thiết lập. Những phép thử này thường liên quan đến tương tác giữa tế
bào và thuốc, dùng để đo độ độc tế bào, đánh giá khả năng giết chết hay kìm hãm sự
phát triển của tế bào nuôi cấy. Với hướng nghiên cứu này, mỗi phân đoạn tách chiết
chứa các hợp chất hóa học đều được thử nghiệm sơ bợ về hoạt tính và chỉ những
phân đoạn nào thể hiện hoạt tính sinh học mới được lựa chọn để nghiên cứu sâu
hơn. Chu trình phân tách và thử nghiệm được lặp lại cho đến khi chất sạch có hoạt
tính mong muốn được phân lập. Hạn chế của loại thử nghiệm này là sự tương quan
giữa hoạt tính gây đợc tế bào trong mơ hình thử nghiệm in vitro với in vivo. b. Phép
thử dựa vào cơ chế tác động (mechanism-based assays)
Phép thử dựa vào cơ chế liên quan đến việc đánh giá những hoạt tính cụ thể
của thuốc theo hướng tác động cụ thể của một enzym, ADN hay thụ thể (receptor)
đặc trưng. Đây là phương pháp hữu hiệu cho nghiên cứu phát hiện thuốc, dùng để
tìm kiếm các tác nhân chống u tiềm năng với cơ chế đặc trưng theo cách thức chọn
lọc. Ưu điểm chính của phép thử này khi mợt hợp chất có hoạt tính được thử
nghiệm thì cơ chế hoạt đợng của nó sẽ được giải thích rõ ràng.
Enzym đóng vai trị quan trọng trong chu kì tế bào và được coi là đích tương
tác hấp dẫn của các phân tử thuốc. Rất nhiều các cơng trình nghiên cứu cho thấy họ
enzym caspase đóng vai trị trung tâm trong việc trùn tín hiệu apoptosis xảy ra
trong các sinh vật đa bào. Các caspase tḥc nhóm enzym protease. Trong tế bào
sống, các enzym caspase được giữ ở dạng không hoạt động bởi các protein trên bề
mặt tế bào. Khi một tế bào tiếp xúc với các tác nhân như hóa trị liệu, bức xạ hoặc
các tín hiệu gây chết thì chức năng của các protein này bị khóa và kích hoạt caspase
khởi phát q trình tự chết. Do vậy các nhà nghiên cứu hiện nay đang tập trung theo

hướng sàng lọc các hoạt chất có khả năng điều trị ung thư theo cơ chế cảm ứng và
kích hoạt q trình apoptosis bởi họ enzym này. Cho đến nay đã xác định được 15
loại caspase, chia thành 2 nhóm chính là caspase gây viêm và caspase liên quan đến
apoptosis (gồm caspase 2, 3, 6, 7, 8, 10, 15). Trong đó caspase 3, 7 tham gia vào q
trình cắt mợt số protein mở đầu cho q trình apoptosis của tế bào. Việc xác