Tổng quan về rotavirus và cách phát hiện rotavirus trong thực phẩm

Mục lục

1


I.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Rotavirus là một trong những nguyên nhân gây tiêu chảy cấp thường gặp ở trẻ em.
Có nguồn gốc là từ phân. Virus này phân bố rộng khắp trên tự nhiên, có thể xâm nhiễm
và bám vào thực phẩm của chúng ta gây bệnh cho cả con người và động vật.
Khơng chỉ có ở nước ta mà có khắp nơi trên thế giới với các nước phát triển và đang
phát triển. Theo thống kê ở Việt Nam có 56% số trẻ nhập viện do viêm dạ dày ruột cấp là
do nhiễm virusrota. Hàng năm, số trẻ chết do vi rút Rota chiếm từ 4-8% trong tổng số trẻ
dưới 5 tuổi bị chết vì mọi nguyên nhân. Ở các nước đang phát triển, hàng năm có khoảng
trên 125 triệu ca tiêu chảy do vi rút Rota ở trẻ em dưới 5 tuổi. Trẻ càng nhỏ càng có nguy
cơ nhiễm bệnh, thường hay gặp ở trẻ dưới 2 tuổi, đặt biệt là dưới 12 tháng. Đối với ca
bệnh nhẹ có triệu chứng nơn ói, tiêu chảy. Nặng thì có thể dẫn đến trụy mạch và tử phong
nếu không điều trị kịp thời. Hơn nữa đây là lồi có thời gian tồn tại ở mơi trường ngồi
và vịng đời khá lâu có khả năng sinh sản mạnh, chính vì thế có khả năng lấy nhiễm rất
cao. Nếu thực phẩm nhiễm virusrota sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến cơ thể chúng ta. Thấy
được tầm quan trọng của nó, nhóm mình đã nghiên cứu các đặc điểm tính chất và các kết
quả con số của lồi virus này thơng qua bài tiểu luận trình bày.
Mục đích của bài tiểu luận này để chỉ ra những số liệu về việc nhiễm virus từ các
bài nghiên cứu khác nhau, từ đó có những định hướng cho việc tìm hiểu và phát triển các
phương pháp xác định virus cũng như các phương pháp hạn chế virus trong thực phẩm và
cách tạo ra vaccince. Giúp người đọc hiểu rõ hơn về đặc điểm tính chất và cách phịng
ngừa để bảo vệ sức khỏe
II.
TỔNG QUAN

1. Giới thiệu

Rotavirus là một chi của virus ARN sợi kép trong gia đình Reoviridae. Rotavirus là
nguyên nhân phổ biến nhất của bệnh tiêu chảy ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ. Gần như mọi trẻ
em trên thế giới đều bị nhiễm vi rút rota ít nhất một lần khi được 5 tuổi. Khả năng miễn
dịch phát triển với mỗi lần nhiễm trùng, vì vậy các lần nhiễm trùng tiếp theo ít nghiêm
trọng hơn; người lớn hiếm khi bị ảnh hưởng.
Vi rút lây truyền qua đường phân-miệng . Nó lây nhiễm và thiệt hại các tế bào lót
ruột non và gây ra viêm dạ dày ruột (mà thường được gọi là "cúm dạ dày" mặc dù khơng
có liên quan đến cúm ).Ngồi ảnh hưởng đến sức khỏe con người, virus rota còn lây
nhiễm sang các động vật khác và là mầm bệnh cho vật nuôi.
2. Các loại virus rota

Có 9 lồi rotavirus, được gọi là A, B, C, D, F, G, H, I và J. Con người chủ yếu bị
nhiễm bởi các loài rotavirus A. Các loài A – I gây bệnh cho các động vật khác, loài H ở
lợn, D, F và G ở chim, I ở mèo và J ở dơi. Trong rotavirus A có các chủng khác nhau,
2


được gọi là serotype. Cũng như đối với vi rút cúm , một hệ thống phân loại kép được sử
dụng dựa trên hai protein trên bề mặt của vi rút. Các glycoprotein VP7 xác định týp huyết
thanh G và protease-Protein nhạy cảm VP4 xác định các kiểu huyết thanh P. Bởi vì hai
gen xác định loại G và loại P có thể được truyền riêng rẽ cho các vi rút thế hệ con cháu,
các tổ hợp khác nhau được tìm thấy. Một hệ thống định dạng gen toàn bộ đã được thiết
lập cho rotavirus A , được sử dụng để xác định nguồn gốc của các chủng khơng điển hình.
Tỷ lệ phổ biến của các loại G và P riêng lẻ khác nhau giữa các quốc gia và các năm. Có ít
nhất 32 loại G và 47 loại P nhưng trong các trường hợp nhiễm trùng ở người, chỉ có một
số sự kết hợp của loại G và P chiếm ưu thế. Đó là G1P, G2P, G3P, G4P, G9P và G12P.
3. Cấu trúc

Bộ gen của rotavirus bao gồm 11 phân tử chuỗi xoắn kép duy nhất của RNA
(dsRNA) với tổng số 18.555 nucleotide. Mỗi chuỗi xoắn, hoặc đoạn, là một gen , được
đánh số từ 1 đến 11 theo kích thước giảm dần. Mỗi gen mã cho một loại protein , ngoại
trừ gen 9, mã cho hai loại. RNA được bao quanh bởi một capsid protein ba lớp hình tam
giác . Các hạt virus có đường kính lên đến 76,5 nm và không được bao bọc.
Rotavirus là loại virus RNA sợi kép (dsRNA) khơng bao bọc có cấu trúc phức tạp
gồm ba capsid đồng tâm bao quanh bộ gen gồm 11 đoạn dsRNA. Các phân đoạn RNA
mã hóa sáu protein virus cấu trúc (VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 và VP7) và sáu protein
không cấu trúc (NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5 và NSP6). Các protein trong hạt virus
trưởng thành quyết định tính đặc hiệu của vật chủ, sự xâm nhập tế bào và các chức năng
của enzym cần thiết cho việc sản xuất các bản sao virus và chứa các biểu mô tạo ra các
phản ứng miễn dịch. Các protein không cấu trúc tham gia vào quá trình sao chép bộ gen
và đối kháng với phản ứng miễn dịch bẩm sinh (một vai trò đặc biệt đối với NSP1) và
bao gồm độc tố ruột của virus NSP4. Rotavirus giống như một bánh xe với các nan ngắn
và vành ngoài nhẵn. Cấu trúc này bao gồm lớp capsid bên trong (protein virus VP2), lớp
capsid giữa (VP6) và lớp capsid bên ngoài (VP7 và protein nhọn VP4). VP4 được phân
cắt theo phương pháp protein thành VP8* và VP5*. Protein cấu trúc VP2, các enzym
VP1 và VP3 và bộ gen virus tạo nên lõi virion. Protein lớp capsid giữa (VP6) xác định
các đặc tính của lồi, nhóm và phân nhóm. Lớp capsid bên ngồi bao gồm hai protein,
VP7 và VP4, tạo ra phản ứng miễn dịch ở vật chủ bị nhiễm, dẫn đến sản xuất các kháng
thể đặc hiệu với rotavirus. Dựa trên sự khác biệt về trình tự và kháng nguyên của VP6 đã
phân thành mười loài rotavirus khác nhau (A – J).

3


Hình 1. Cấu trúc của Rotavirus
•
•
•

a) Ảnh hiển vi của Rotavirus
b) Sơ đồ mặt cắt 3 lớp
c) Hồ sơ di chuyển điện di của 11 đoạn RNA sợi kép (dsRNA) của rotavirus
và các protein được mã hóa cho chủng virus SA11 simian

Rotavirus có mặt ở khắp nơi và lây nhiễm cho hầu hết mọi trẻ em trên toàn cầu từ 3–
5 tuổi. Sự tiến hóa của vi rút được thúc đẩy bởi sự tích tụ của các đột biến điểm và sắp
xếp lại bộ gen, có thể xảy ra sau khi nhiễm trùng kép các tế bào riêng lẻ bởi các chủng
virus A khác nhau, dẫn đến thế hệ con virus có sự kết hợp của các bộ gen của bố mẹ.
Nhiễm rotavirus gây ra các triệu chứng tiêu chảy, nơn mửa, khó chịu và sốt. Rotavirus
được thải ra với số lượng lớn trong phân trong các đợt tiêu chảy do rotavirus. Về quá
trình lây nhiễm, virus lây truyền chủ yếu qua đường phân - miệng, chủ yếu là tiếp xúc
giữa người với người.
Rotavirus lây nhiễm và sao chép trong các tế bào ruột trưởng thành, không phân chia
ở giữa và đầu nhung mao và trong các tế bào nội tiết ở ruột non, cho thấy rằng các loại tế
bào này biểu hiện các yếu tố cần thiết để lây nhiễm và sao chép hiệu quả. Tính nhạy cảm
của các tế bào ruột trưởng thành và các tế bào nội tiết ruột trưởng thành đối với nhiễm
trùng đã được chứng minh ở chuột, trong dòng tế bào nội tiết ruột đã biến đổi của người
và trong các mẫu cấy vi khuẩn đường ruột ở người. Sự gắn kết của rotavirus vào tế bào
vật chủ qua trung gian bởi protein capsid bên ngoài VP4.

4


Hình 2. Chu trình nhân lên của Rotavirus
 Chu trình nhân lên của Rotavirus

Rotavirus gắn vào các thụ thể glycan khác nhau trên bề mặt tế bào chủ, tùy thuộc vào
chủng virus, thông qua tương tác với miền virus VP8* của VP4. Các sialoglycan được coi

là đối tác glycan quan trọng đối với VP8*. Các thụ thể được đề xuất khác cho sự xâm
nhập tế bào rotavirus bao gồm tích phân, protein sốc nhiệt 70 và các protein kết nối như
phân tử kết dính chức năng A, chất kết dính và protein nối chặt ZO-1. Sau khi liên kết
ban đầu, VP7 và miền VP5* của VP4 có thể tương tác với một số đồng thụ thể này, chúng
tập trung tại các nhóm lipid để làm trung gian cho sự xâm nhập của virus. Tùy thuộc vào
chủng virus rota, virus được nội bào hóa vào tế bào bằng các con đường nội bào phụ
thuộc clathrin hoặc không phụ thuộc clathrin và không phụ thuộc vào caveolin. Mức
canxi thấp bên trong endosome kích hoạt việc loại bỏ lớp capsid bên ngồi, lớp vỏ này
giải phóng hạt hai lớp có hoạt tính phiên mã (DLP) vào tế bào chất. MRNA của virus
được sử dụng để dịch mã hoặc làm khuôn mẫu để tổng hợp RNA trong quá trình sao chép
bộ gen; RNA sau đó được đóng gói thành các DLP mới trong viroplasms (cấu trúc
chuyên biệt bao gồm các protein tế bào và virus đòi hỏi các thành phần của các giọt lipid
để hình thành). Sự lắp ráp hạt ba lớp liên quan đến sự liên kết của các DLP mới được
hình thành với protein khơng cấu trúc 4 (NSP4), đóng vai trị như một thụ thể nội bào,
tiếp theo là sự nảy chồi của các DLP vào lưới nội chất (ER). Ngoài ra, NSP4 làm trung
gian làm tăng nồng độ canxi trong tế bào chất, cần thiết cho sự nhân lên của virus. Trong
5


ER, có thể quan sát thấy các hạt được bao bọc thống qua và các protein capsid bên ngồi
VP4 và VP7 được thêm vào các DLP. Sau đó, lớp vỏ này bị mất đi, các hạt vi rút trưởng
thành và các virion thế hệ con cháu được giải phóng khỏi tế bào thông qua ly giải tế bào
hoặc bằng cơ chế vận chuyển mụn nước không độc lập với Golgi trong tế bào biểu mô
phân cực.
4. Sự liên kết và xâm nhập vào tế bào biểu mô ruột của Rotavirus

Rotavirus lây nhiễm vào các tế bào ruột trưởng thành ở phần giữa và phần trên của
nhung mao của ruột non, cuối cùng dẫn đến tiêu chảy. Thông tin hiện tại chỉ ra rằng việc
xâm nhập vào tế bào của Rotavirus tạo thành một q trình nhiều bước. Các mơ hình gần
đây cho thấy rằng rotavirus tương tác đầu tiên với thụ thể axit sialic và sau đó với thụ thể

khơng phụ thuộc axit sialic. Người ta đã đề xuất rằng các thụ thể có thể là một phần của
các vi miền lipid và nhận ra các tích phân. Theo quan điểm của điều này và các thông tin
khác, hai giả thuyết đối lập đã được đưa ra về cách Rotavirus xâm nhập vào tế bào đích:
thơng qua xâm nhập trực tiếp hoặc dung hợp và thông qua Ca2+ phụ thuộc. Q trình
nội bào hóa phụ thuộc Ca2+ đại diện cho phương thức xâm nhập hấp dẫn nhất và dựa
trên thực tế là Rotavirus lây nhiễm được nội bào hóa với nồng độ Ca2+ rất thấp dẫn đến
dòng truyền Ca2+ từ các túi đến tế bào chất. Một khi nồng độ Ca2+ của endosome cân
bằng với tế bào chất, dưới mức quan trọng đối với sự ổn định của capsid bên ngồi, virus
sẽ mất các protein bên ngồi và sau đó ly giải với màng túi, cho phép virus thoát ra tế bào
chất
5. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu rotavirus

Việc nghiên cứu rotavirus có ý nghĩ rất quan trọng đối với ngành công nghiệp thực
phẩm và hơn thế nữa là đối với sức khỏe của con người, bởi vì rotavirus rất dễ lây lan từ
môi trường vào thực phẩm và chúng là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây ra
bệnh tiêu chảy cấp ở trẻ em. Việc nghiên cứu về rotavirus giúp ta biết được các tính chất,
cấu tạo và môi trường sống của rotavirus cũng như cơ chế hoạt động và khả năng sinh
sản, phát triển của chúng, từ đó có những nghiên cứu giúp phịng ngừa, chẩn đoán và
kiểm soát virus trong thực phẩm cũng như cơ thể con người. Những mục đích mà ta đạt
được trong q trình nghiên cứu rotavirus là:
•

Đảm bảo cho thực phẩm đạt chuẩn an tồn vệ sinh thực phẩm, có thể mang đi tiêu
thụ: Rotavirus là một loại virus rất dễ lây lan trong thực phẩm với nhiều tác hại và
hệ lụy nặng nề. Chúng có thể tồn tại trong thực phẩm từ trước khi chúng được đưa
vài nhà máy, và có khả năng tái nhiễm từ mơi trường bên ngồi thông qua các
khâu sơ chế và chế biến thực phẩm khi những khâu này được thực hiện mà không
đảm bảo về mặt an toàn vệ sinh thực phẩm. Việc nghiên cứu và kiểm nghiệm
rotavirus sẽ giúp ta biết được trong các loại thực phẩm đó có virus hay khơng và
liều lượng là bao nhiêu, cũng như khả năng ảnh hưởng đến sức khỏe con người

của chúng,... từ đó đưa ra được những phương pháp nhằm loại bỏ virus hoặc thay
6


đổi quy trình sản xuất để đảm bảo lượng virus có trong thực phẩm ln ở mức
thấp nhất, khơng đủ khả năng gây nguy hại cho sức khỏe con người. Đây cũng là
một trong những chỉ tiêu quan trọng cho các doanh nghiệp kinh doanh trong lĩnh
vực thực phẩm để có thể xuất sản phẩm của mình ra thị trường, đảm bảo sản phẩm
thực phẩm đủ tiêu chuẩn và độ an tồn đến tay người tiêu dùng.
• Nghiên cứu để phòng ngừa bệnh và tạo vaccine: Theo thống kê của Tổ chức Y tế
thế giới WHO, mỗi năm trên thế giới có khoảng 1,5 tỷ lượt trẻ dưới 5 tuổi mắc tiêu
chảy và 4 triệu trẻ chết vì bệnh này, trong đó 80% xảy ra ở trẻ dưới 2 tuổi. Nhiễm
Rotavirus gây tử vong cho 453.000 trẻ em dưới 5 tuổi trên thế giới mỗi năm và là
nguyên nhân gây tử vong hàng đầu tại các nước đang phát triển. Ở Việt Nam, hàng
năm tỷ lệ mắc tiêu chảy do virut Rota chiếm trên 50% trong tổng số trẻ em dưới 5
tuổi bị tiêu chảy và điều trị tại một số Bệnh viện Nhi. Trong đó có khoảng 5.300
đến 6.800 ca tử vong vì căn bệnh này, chiếm 8% - 11% tỷ lệ tử vong ở trẻ cùng độ
tuổi [Nguyen Van Man et al: Epidermiological profile and burden of rotavirus
diarrhea in Vietnam: 5 years of sentinel hospital surveillance, 1998-2003.J Infect
Dis 192 Suppl 1: S127-32]. Việc nghiên cứu về tính chất cũng như cơ chế hoạt
động và sự phát triển của rotavirus đã góp phần khơng nhỏ giúp tạo ra nhiều loại
vaccine điều trị bệnh do rotavirus gây nên, không chỉ giảm thiểu số lượng trẻ em
mắc bệnh và tử vong mà còn hỗ trợ giảm thiểu gánh nặng kinh tế khi mà chi phí
điều trị căn bệnh là vơ cùng tốn kém.
Tại sao phải nghiên cứu rotavirus bằng nhiều kỹ thuật khác nhau?
Việc nghiên cứu các loài vi sinh vật bằng nhiều kỹ thuật khác nhau giúp ta tìm ra các
biện pháp thích hợp để có thể sử dụng một cách có hiệu quả nhất vi sinh vật có lợi cũng
như các biện pháp tích cực nhằm ngăn ngừa các vi sinh vật có hại. Đối với rotavirus, việc
nghiên cứu chúng bằng nhiều phương pháp và kỹ thuật khác nhau sẽ giúp ta tìm ra được
phương pháp phù hợp nhất để nghiên cứu về hình thái, tính chất, cơ chế hoạt động, khả

năng sinh sản và phát triển,... của rotavirus, từ đó ta sẽ có cơ sở dữ liệu để tìm hiểu các
biện pháp phịng tránh và ngăn ngừa loại vi sinh vật có hại này có trong mơi trường thực
phẩm gây nguy hại và làm ảnh hưởng đến các chỉ tiêu an toàn thực phẩm cũng như để tạo
ra các loại vaccine giúp bảo vệ sức khỏe con người.
III.
CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ROTAVIRUS
1. Các yếu tố phơi nhiễm của Rotavirus đối với rau châu Á được tưới nước thải và

mơ hình xác suất gây bệnh
Ở vùng khan hiếm nước của các nước đang phát triển sử dụng nước thải để tưới rau
và các loại cây nông nghiệp. Việc này có thể gây ra việc nhiễm một số bệnh cho cơ thể,
như rotavirus chẳng hạn. Rotavirus là nguyên nhân hàng đầu gây tiêu chảy nặng ở trẻ sơ
sinh và trẻ nhỏ

7


. Bài nghiên cứu này sử dụng (QMRA) theo khuyến nghị của WHO để xác định xem
việc tưới cây bằng nước thải có đáp ứng các tiêu chuẩn sức khỏe hay khơng.
1.1 Chuẩn bị thí nghiệm.

Các loại rau được sử dụng để thực hiện thí nghiệm ở Châu Á và trên thế giới, gồm
có: cải thìa, cải ngồng, cải rổ và xà lách
Thí nghiệm thực hiện tại một khu vườn chợ thương mại ở ngoại ô Melbourne,
Victoria, Úc, vào ngày 28/1/2013. Các loại rau được thu hoạch ngay sau khi tưới 30 phút
sẽ được vận chuyển đến phịng thí nghiệm để cân và được làm khô bằng máy quay rau
cùng với khăn giấy để loại bỏ nước trên bề mặt. Ba loại cải này được tách lá để đảm bảo
không bị đọng nước. Xà lách được cắt thành nhiều đoạn nhỏ trước
1.2 Thí nghiệm dựa theo mơ hình QMRA.

Các QMRA xác suất được xây dựng bằng cách sử dụng các yếu tố phơi nhiễm thử
nghiệm để mô phỏng các nguy cơ về sức khỏe con người đối với trẻ em từ việc tiêu thụ
mỗi loại rau quanh năm sau khi tưới tiêu bằng nước thải đã qua xử lý thứ cấp ở Bắc Kinh,
Trung Quốc.
Liều lượng rotavirus mà người tiêu dùng tiếp xúc được xác định bởi cơng thức:

Trong đó:
•
•
•
•
•
•

C là nồng độ rotavirus trong nước thải (đơn vị virus /L)
V là thể tích nước tưới mà cây trồng thu được (mL / g)
M là lượng rau tiêu thụ hàng ngày trên đầu người (g/người/ngày)
k là hằng số phân rã động học của vi rút tại ruộng (ngày-1)
W là sự giảm nồng độ vi rút thông qua rửa rau sau thu hoạch (đơn vị log10)
t là thời gian giữ lại giữa lần tưới nước thải cuối cùng sự kiện và thu
hoạch/tiêu thụ (ngày).

Phân phối hỗn hợp nồng độ rotavirus trong nước thải được xử lý thứ cấp được lấy từ
hai nghiên cứu theo dõi nồng độ virus tại sáu nhà máy xử lý nước thải đô thị khác nhau
trên khắp Bắc Kinh. Cả hai nghiên cứu đều sử dụng phương pháp luận tương tự: bổ sung
SiO2 và AlCl3 vào mẫu nước để xác định nồng độ các phần tử virus, sử dụng bộ dụng cụ
chiết xuất RNA Qiagen và khuếch đại virus rota thông qua phản ứng chuỗi polymerase
phiên mã ngược (PCR) với các đoạn mồi được thiết kế để nhắm vào gen VP7 của
rotavirus nhóm A. Nồng độ rotavirus truyền nhiễm là 1/1.000 bộ gen rotavirus.

8


Hiệu quả phục hồi không được báo cáo trong cả hai nghiên cứu vì vậy hiệu suất phục
hồi (60%)
Các cơng thức tính tốn để làm thí nghiệm:
-

Xác suất lây nhiễm cho ngày thứ k (pinf: mỗi người một ngày) được tính tốn bằng
cách sử dụng mơ hình đáp ứng liều beta-Poisson siêu đo::
pinf = 1 – 1F1 (α, α + β , - λ)
Trong đó:
1F1 là hàm siêu thị hợp lưu Kummer.
Giá trị cho các thông số phù hợp α và β (0,167; 0,191)
Xác suất bệnh tật có điều kiện sau khi nhiễm bệnh (pill; mỗi người mỗi ngày):
•
•

-

pill = pinfI
Trong đó: I là tỷ lệ người nhiễm vi rút rota bị bệnh.
-

Xác suất bệnh tật hoặc nhiễm trùng hàng năm cho mơ phỏng thứ j của mơ hình (p;
mỗi người mỗi năm [pppy]):

pk là xác suất bệnh tật hoặc nhiễm trùng cho lần lặp lại thứ k trong số 365 sư kiện
tiếp xúc hàng ngày ở lần thứ j trong số 1.000 lần mơ phỏng và trong đó các sự kiện được
giả định là độc lập.

-

Gánh nặng bệnh tật hàng năm (A; DALY pppy) đối với bệnh do vi rút rota được
ước tính là:
A=PDSF
Trong đó:
•
•
•

P là xác suất bệnh tật hàng năm
D là gánh nặng bệnh tật do virus rota
SF là tỷ lệ dân số nhạy cảm với bệnh này

Phân tích độ nhạy rất hữu ích để khảo sát ảnh hưởng của độ không đảm bảo và sự
thay đổi của các thông số đầu vào đối với xác suất đầu ra trong QMRAs. Nó thường liên
quan đến việc áp dụng các kỹ thuật tương quan hoặc hồi quy cho các mảng ghép nối của
các biến vào và ra, nhưng quá trình này phức tạp.
1.3 Kết quả

Cải ngồng gây ra rủi ro lớn nhất, cải thìa gây rủi ro nhỏ nhất trong bốn loại rau.
9


Xác suất lây nhiễm trung bình hàng năm dự đốn dao động: Cải thìa: 7,70×10−4/năm,
cải ngồng: 4,64×10−3/năm, Cải rổ: 2,67×10−3/năm, xà lách: 2,64×10−3/năm.
Vegetable
Bok choy
Choy sum
Gai lan

Lettuce

C

V

M

k Value

t

W

0.751***
0.763***
0.904***
0.845***

0.090***
0.121***
0.119***
0.097***

0.556***
0.504***
0.185***
0.385***

-0.029***

-0.008
-0.041***
-0.016

-0.142***
-0.166***
-0.197***
-0.177***

-0.208***
-0.230***
-0.271***
-0.239***

Bảng 1: Phân tích độ nhạy cho xác suất nhiễm trùng hằng ngày
1.4 Thảo luận
Đây là bài trình bày đầu tiên về các phép đo lưu giữ nước cho các loại rau ở châu Á
cũng như đánh giá rủi ro vi rút đầu tiên đối với việc tiêu thụ rau từ tưới nước thải ở Trung
Quốc. Cải rổ và cải ngồng thu được nhiều nước tưới nhất trong các loại rau được nghiên
cứu, nhưng tiêu thụ nước thải tưới cho cải ngồng có nguy cơ lớn nhất, cịn cải thìa thì có
ít nguy cơ nhất.

Hình 3: Xác suất tích lũy
Rủi ro từ tưới tiêu nông nghiệp bằng nước thải cần được quản lý, các hướng dẫn của
WHO về tái sử dụng nước thải cung cấp một cấu trúc để xây dựng các hướng dẫn tái sử
dụng cho từng quốc gia cụ thể và họ đã kết hợp phương pháp QMRA hoặc ngưỡng 10−6
DALY pppy vào hướng dẫn của mình. Tuy nhiên, việc giải thích ngưỡng khơng nên mang
tính chất quy định. Hướng dẫn của WHO nêu rõ rằng nếu gánh nặng bệnh tật tổng thể từ
các con đường phơi nhiễm khác là rất cao, nếu đặt ra một mức độ rủi ro có thể chấp nhận
được thấp hơn như 10−4 hay 10−5 thì việc sử dụng nước thải an toàn hơn.

10


Việc dùng nước thải để tưới rau là một phương pháp nhằm giúp bảo vệ mơi trường,
khi mà việc đó có thể làm giảm lượng nước thải ra mơi trường và giúp tiết kiệm lượng
nước sạch đang ngày càng khan hiếm, hơn nữa cịn giúp người nơng dân giảm chi phí
trồng trọt khi mà số tiền để chi tiêu cho nước sạch trồng rau là quá lớn. Tuy nhiên, sử
dụng nước thải sẽ mang lại rủi ro cao về các mầm bệnh, gây ảnh hưởng đến sức khỏe con
người với những chất bẩn và các loại vi sinh vật tồn tại bên trong đó. Vì vậy mà việc
nghiên cứu, xác định lượng rotavirus trong một số loại rau thông dụng khi tưới bằng nước
thải là một nghiên cứu có ích đối với sức khỏe con người. Từ nghiên cứu ấy, ta có thể thu
thập được những số liệu có ích, từ đó có thể tìm ra những loại rau phù hợp với phương
pháp này, hoặc tìm ra các biện pháp nhằm hạn chế lượng virus có trong nước thải tưới
rau, giúp phòng chống bệnh tiêu chảy cấp do virus mang lại nhưng vẫn đảm bảo được ý
nghĩa tiết kiệm chi phí và bảo vệ mơi trường của phương pháp dùng nước thải tưới rau
này.
2. Rotavirus nhóm A liên quan đến các đợt bùng phát tiêu chảy ở các trang trại nuôi

lợn con (xác định chủng virus rota ở heo mang kiểu gen VP7 mới, G26)
2.1 Khái quát
Rotavirus nhóm A (GARs) là một trong những nguyên nhân phổ biến nhất gây tiêu
chảy ở lợn con. Mặc dù một số kiểu gen G và P đã được xác định trong GAR của lợn.
Chúng tôi đã điều tra các đặc điểm phân tử của GARs đã gây ra bốn đợt bùng phát tiêu
chảy ở lợn con đang bú sữa trong một trang trại từ lứa đẻ đến lứa sau trong suốt một năm.
Việc xác định kiểu gen G và P của các GAR được phát hiện tại mỗi đợt bùng phát chứng
tỏ sự đa dạng di truyền trong trang trại này: G9P được phát hiện ở đợt bùng phát đầu tiên
và đợt thứ hai, G3P ở phần thứ ba, và G9P , G5P và P kết hợp với kiểu gen G không thể
chuyển đổi ở phần thứ tư.
Rotavirus nhóm A (GARs) có bộ gen bao gồm 11 đoạn RNA sợi đôi (dsRNA) được
bọc trong một capsid ba lớp. Các phân đoạn này mã hóa sáu protein cấu trúc (VP1-VP4,

VP6 và VP7) và 5 hoặc 6 protein không cấu trúc. Các protein capsid bên ngoài VP7 và
VP4, độc lập tạo ra các kháng thể trung hòa, xác định các kiểu huyết thanh G và P, và tạo
thành cơ sở của danh pháp nhị thức. Trước nghiên cứu này, ít nhất 25 kiểu gen G và 33
kiểu gen P đã được xác định ở người và động vật . Trong số đó, có ít nhất 11 kiểu gen G
và 13 kiểu gen P đã được mô tả ở lợn.
Tiềm năng gây bệnh từ động vật GARs là một mối quan tâm lớn. Các GAR với kiểu
gen G thường thấy ở lợn và gia súc đã được phát hiện trong các trường hợp tiêu chảy lẻ tẻ
và thành dịch ở quần thể người. Ngoài ra, một số kiểu gen G và P mới đã được xác định
gần đây ở động vật. GAR động vật được coi là một nguồn dự trữ tiềm năng cho sự đa
dạng di truyền trong GAR của người, và do đó việc nghiên cứu chúng là rất quan trọng
để hiểu được sự tiến hóa và sinh thái của GAR ở người.
2.2 Nghiên cứu
11


2.2.1

Mẫu phân tích

Dịch tiêu chảy bùng phát ở lợn sữa 4 lần trong khoảng thời gian từ tháng 2/2009 đến
tháng 3/2010 tại một trang trại lớn cho đến lứa đẻ với 4000 lợn nái ở tỉnh Miyazaki, Nhật
Bản. Tổng số 28 mẫu phân (một mẫu mỗi lứa, 5 đến 11 mẫu mỗi ổ dịch) được thu thập từ
trực trạng của lợn bị tiêu chảy chưa được điều trị bằng kháng sinh.
2.2.2

Kiểm tra vi khuẩn và ký sinh trùng

Kiểm tra vi khuẩn được thực hiện đối với Escherichia coli, Salmonella enterica và
Clostridium perfringens , và kiểm tra ký sinh trùng được thực hiện đối với Coccidia và
Cryptosporidium parvum , như đã mô tả trước đây.

2.2.3

Chiết xuất RNA

Các mẫu phân được pha lỗng với mơi trường thiết yếu tối thiểu của Eagle thành
huyền phù 10% và làm rõ bằng cách ly tâm ở 1 500 x g trong 10 phút. Phần nổi phía trên
được thu thập và RNA tổng số được chiết xuất từ 250 μL huyền phù phân bằng cách sử
dụng TRIzol LS. RNA tổng số thu hồi được lơ lửng trong 50 μL nước khơng có RNase /
DNase và được bảo quản ở -20 ° C cho đến khi sử dụng cho phản ứng chuỗi polymerase
phiên mã ngược (RT-PCR) và điện di trên gel polyacrylamide (PAGE).
2.2.4

Giải trình tự DNA và phân tích di truyền

Các amplicon của gen GAR VP7 và VP4 đã được tinh sạch bằng cách sử dụng Cột
HR MicroSpin S-400. Các sản phẩm PCR tinh khiết được sử dụng làm khn mẫu để giải
trình tự trên máy giải trình tự DNA tự động Applied Biosystems 3100 sử dụng hóa học
giải trình tự chu trình Dye terminator và giải trình tự từ cả hai hướng. Để xác định vùng
mã hóa hồn chỉnh của gen VP7 của dịng TJ4-1, các cặp mồi TJ4-1 494F (5'-GTA ACC
CAA TGG ACA TTA CAC TG-3 ') và TJ4-1 368R (5'-CTA CTG AAA ATG ATG CGA
TGT C-3 ') cũng được sử dụng làm mồi giải trình tự. Các trình tự được tập hợp, chỉnh sửa
và phân tích bằng phần mềm MEGA 4.
***Số gia nhập trình tự nucleotide
Các trình tự nucleotide được xác định trong nghiên cứu này đã được nộp cho
GenBank theo các số gia nhập sau:
•
•
•
•
•

•
•

TJ1-1 (VP7: AB611688, VP4: AB621582)
TJ2-1 (VP7: AB611689, VP4: AB621587)
TJ2-2 (VP7: AB611690, VP4: AB621583)
TJ3-2 (VP7: AB611692, VP4: AB621585)
TJ4-1 (VP7: AB605258, VP4: AB621586)
TJ4-3 (VP4: AB611691, VP4: AB621584)
TJ4-5 (VP7: AB611693, VP4: AB621588)
12


2.3 Kết quả

Các đợt bùng phát dịch tiêu chảy ảnh hưởng đến hầu hết số lợn con đang sinh ra từ
20% - 30% số lợn nái đang cho con bú sữa ,xảy ra vào các tháng 2,3,5 năm 2009 và tháng
3 năm 2010. Các dấu hiệu lâm sàng thường gặp bao gồm tiêu chảy nhiều nước và mất
nước kéo dài khoảng một tuần. Tỷ lệ tử vong dưới 5%.
Bùng phát
1
2
3
4

Tháng năm xảy
ra
2/2009
3/2009
5/2009

3/2010

Số lượng lợn
được lấy mẫu

Phạm vi (trung bình) của
Ngày tuổi
4-7
6-20
2-5
3-7

11
5
5
7

Gieo giống
1-7
1-8
1-1
1-3

Bảng 2 Số lượng, tuổi và lứa lợn
Hơn 80% mẫu được thu thập tại mỗi đợt bùng phát đều dương tính với GAR, được
xác định bằng RT-PCR nhắm mục tiêu VP7 và được liệt kê trong Bảng 3 . Một số ít mẫu
có chứa các tác nhân gây bệnh đường ruột khác: GBR, Isospora suis, Eimeria porci,
GCR. Những kết quả này chỉ ra rằng GAR là tác nhân gây bệnh đường ruột phổ biến nhất
liên quan đến các đợt bùng phát tiêu chảy lặp đi lặp lại và rất có thể là nguyên nhân.
Bùng phát

1

2

3

4

Tên mẫu
TJ1-1
TJ1-2
TJ1-3
TJ1-6
TJ1-7
TJ1-8
TJ1-9
TJ1-10
TJ1-11
TJ2-1
TJ2-2
TJ2-3
TJ2-4
TJ3-1
TJ3-2
TJ3-3
TJ3-4
TJ3-5
TJ4-1
TJ4-2
TJ4-3

TJ4-4
TJ4-5
TJ4-6

Loại điện tử
eI
eI
eI
- a)
eI
eI
eI
eI
eII
eI
eI
eII
eIII
eIII
eIII
eIII
eIII
eIV
eIV
eV
eV
eVI
eV
13

Sự kết hợp của kiểu gen G và P
G9
P
G9
P
G9
NS
nd b)
NS
G9
P
G9
P
G9
NS
G9
P
G9
P
G9
P
NS
P
NS
NS
NS
NS
NS
NS
G3

P
NS
NS
G3
P
NS
NS
c)
G26
P
NS
NS
G9
P
NS
NS
G5
P
NS
NS


Bảng 3: Kiểu gen và sự kết hợp của kiểu gen G và P của các chủng GAR
Trong đó:
a) Mẫu âm tính với GAR bởi RNA-PAGE
b) Mẫu dương tính với GAR bằng RT-PCR, nhưng khơng thể xác định được
trình tự nucleotide.
• c) Kiểu gen VP7 (G) mới được xác định trong nghiên cứu này
•
•

Tất cả 11 phân đoạn của RNA bộ gen GAR đã được hình dung trong 22 mẫu trong số
28 mẫu được xử lý RNA-PAGE. Các kiểu di chuyển RNA này được phân loại thành 6
kiểu chủng vi khuẩn điện tử từ eI đến eVI (Hình 4). Một kiểu điện cực khác nhau đã được
quan sát thấy trong mỗi đợt bùng phát, như được tóm tắt trong Bảng 3. OSU là dòng
GAR của lợn tham chiếu với kiểu di chuyển RNA dài RNA-PAGE khơng tìm thấy mẫu
nào bị nhiễm nhiều hơn một dịng GAR

Hình 4: Các chủng vi khuẩn điện tử (eI đến eVI) của các chủng GAR
***Phân tích di truyền của gen GAR VP7 và xác định kiểu gen G mới:
Trình tự nucleotide của gen VP7 (933 bp, tương ứng với nucleotide từ 69 đến 1001
của gen VP7 của chủng lợn G5 OSU) đã được xác định thành cơng trong 15 mẫu. Phân
tích tìm kiếm BLAST và phân tích phylogenic của các gen VP7 này với 25 kiểu gen G đã
thiết lập đã dẫn đến việc phân loại 15 chủng GAR thành 4 kiểu gen: G9, G3, G5 và kiểu
gen G khơng thể phân loại (Hình 2a ).

14


Hình 5: Trình tự nucleotide từng phần của gen VP7
Viết tắt: Hu human,Po lợn, Bo bò, Si khỉ, Mu chuột, Eq ngựa, Ca chó, Bat dơi, Ch
gà, Ph chim trĩ, Pi chim bồ câu, và Tu gà tây.
11 chủng G9 với 8 chủng được phát hiện ở lần bùng phát đầu tiên, hai ở lần thứ hai
và một ở lần thứ tư (Bảng 5). Một cây sinh thực vật dựa trên sự chọn lọc các chủng G9
của người và động vậ . 11 chủng này tạo thành một nhánh riêng biệt có liên quan xa với
các chủng G9 ở người và lợn bao gồm G9 dịng III và VI (Hình 5b). Đặc điểm nhận dạng
nucleotide của 11 chủng là 99,4% đến 100% so với nhau, 90,6% đến 93,2% đối với các
dòng phân lập G9 của lợn Nhật Bản cũ JP16-3, JP32-4, JP13-3, JP35-7, JP3-6, JP29 -6,
và Hokkaido-14 thuộc dòng G9 VI, và 87,2% đến 93,8% đối với dòng G9 ở người và lợn
thuộc dòng G9 III và VI.

Hai chủng G3 TJ3-1 và TJ3-2, cả hai đều được xác định tại đợt bùng phát thứ ba, tạo
thành một nhánh riêng biệt có liên quan xa với các chủng G3 của lợn, bao gồm dịng I
(Hình 2c) . Đặc điểm nhận dạng nucleotit của gen VP7 của chúng là 100% so với nhau,
15


87,6% đến 91,6% đối với dòng G3 của lợn bao gồm dòng I, 87,3% đến 90,9% đối với
dòng G3 của người bao gồm dòng I, và 79,1% đến 82,4% đối với Các chủng G3 bao gồm
các dòng khác. Dòng phân lập G5 TJ4-5, được xác định ở lần bùng phát thứ tư, tạo thành
một nhánh riêng biệt có liên quan xa với các chủng G5 ở người và lợn bao gồm dịng III
(Hình 2d ). Đặc điểm nhận dạng nucleotide của gen VP7 của nó là 86,3% đến 90,3% so
với các chủng G5 bao gồm dòng III, 85,4% đến 87,4% cho dòng I và 85,3% đến 87,6%
cho dòng II.
Gen G không thể thay đổi TJ4-1, được xác định ở lần bùng phát thứ tư, khơng phân
cụm với bất kỳ trình tự tham chiếu nào từ nhóm 25 kiểu gen G (Hình 2a), đặc điểm nhận
dạng nucleotide của gen VP7 của nó là 93,1% so với 57vp7w, dịng G3 ở người không
phổ biến được xác định ở Thái Lan lên đến 80,5% đối với các chủng G3 khác và lên đến
78,8% đối với các chủng có kiểu gen G khác. Do đó, chúng tơi xác định đặc điểm của
chủng TJ4-1 bằng cách phân tích trình tự mã hóa hồn chỉnh của gen VP7, gen này dài
981 bp và bao gồm một protein dự đoán gồm 326 axit amin. Mức độ nhận dạng cao nhất
là với dòng G3 RRV (80,2% mức nhận dạng nucleotide và 87,5% mức độ nhận dạng axit
amin), với mức nhận dạng nucleotide và axit amin thấp hơn so với các chủng khác, tương
ứng từ 61,1% đến 78,1% và 57,2% đến 85,5%.
2.4 Thảo luận

Dựa trên vào nghiên cứu trên, có thể khẳng định GAR có thể truyền giữa lợn và
người, khiến lợn trở thành ổ chứa tiềm năng cho sự xuất hiện của các chủng GAR khác
thường hoặc mới lạ của người. Trên thực tế, chủng G26 mới tìm thấy gần giống nhất với
chủng 57vp7w ở người. Chủng 57vp7w được báo cáo là một chủng người hiếm gặp
G3P.Tổng hợp lại, những phát hiện này cho thấy rằng 57vp7w có thể là một phân loại lại

giữa lợn và người hoặc một dòng lợn.
Ở đây, chứng minh sự đa dạng di truyền của GAR có liên quan đến các đợt bùng phát
tiêu chảy lặp đi lặp lại ở heo con trong trang trại trong khoảng thời gian một năm. Sự đa
dạng di truyền như vậy trong một trang trại có thể đặt ra thách thức cho việc phát triển
các phương pháp hiệu quả phòng chống tiêu chảy do nhiễm GAR.
3. Ảnh hưởng của q trình axit hóa, lên men vi khuẩn và nhiệt độ về sự tồn tại đến

Rotavirus trong thức ăn dặm cai sữa
3.1 Khái quát
Rotavirus là tác nhân gây bệnh tiêu chảy cấp chủ yếu lây lan qua đường phân –
miệng. Các đối tượng từ người lớn đến trẻ em đều có khả năng nhiễm Rotavirus. Tuy
nhiên việc nhiễm Rotavirus thường gặp ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ hơn là ở thanh thiếu niên.
Ăn dặm là thời gian đặc biệt nguy hiểm đối với trẻ sơ sinh liên quan đến việc mất hoặc
làm giảm các đặc tính chống nhiễm trùng của sữa mẹ. Sự thay thế sữa mẹ bằng các loại
thực phẩm thường có năng lượng thấp và sự tiếp xúc của một hệ miễn dịch chưa trưởng
16


thành với các nguồn lây nhiễm trong môi trường. Người ta ước tính rằng 15-70% tổng số
các đợt tiêu chảy ở trẻ nhỏ là liên quan đến thức ăn.
Rotavirus có khả năng tồn tại bền vững trong môi trường. Chúng có thể sống nhiều
giờ trên tay và nhiều ngày trên các bề mặt cứng (sàn nhà, đồ chơi, vật dụng trong gia
đình...). Rotavirus lây lan chủ yếu qua đường tiêu hóa, tồn tại trên phân của người bệnh
và truyền nhiễm qua tiếp xúc với tay.
Việc lên men với vi khuẩn lactic là cơng nghệ đã được thiết lập, nhờ đó mà sự hư
hỏng và vi khuẩn gây bệnh bị ức chế. Các nghiên cứu về việc sử dụng quá trình lên men
lactic để cải thiện an toàn của thức ăn dặm đã mang lại kết quả đầy hứa hẹn. Sử dụng các
cơng thức ưu tiên có độ pH dưới 4 có tác dụng đáng kể lên các loại vi khuẩn.
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Mẫu

Virus: Simian rotavirus SA-11 được cung cấp bởi Khoa sinh học, Đại học Surrey. Nó
đã được tinh chế năm lần bằng cách hạn chế pha loãng và cấy vào các tế bào MA-104 và
được kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử để xác nhận danh tính của nó. Tế bào Các tế bào
được sử dụng thuộc dịng MA-104. Vi khuẩn Lactobacillus plantarum Nó được trồng
trong môi trường MR (Oxoid, London) được sử dụng làm nước dùng hoặc thạch ủ
aerobically ở 30°C qua đêm.
3.2.2

Chuẩn bị thức ăn dặm

Gạo Mỹ hạt dài, trấu, được xay thô trong một cái chày và cối. Huyền phù 5% và 10%
gạo xay trong nước cất được tạo thành các thể tích 100 ml và được hấp tiệt trùng
(10psig/10 phút).
3.2.3

Chuẩn độ virus

Các độ pha loãng nối tiếp theo thập phân của mẫu trong mơi trường chuẩn độ virus
được cấy (50µl) vào bốn giếng nhân bản của một tấm microtiter chứa các đơn lớp tế bào
MA-104. Giếng đầu tiên và ba giếng cuối cùng của mỗi dãy được trùng với môi trường
chuẩn độ virrus không bị nhiễm làm đối chứng. Để ở nhiệt độ phịng trong 30 phút.
Ngồi ra, thêm 200µl mơi trường chuẩn độ virus được thêm vào mỗi giếng, các tấm được
bbịt kín bằng tấm nhựa tự kết dính, và được ủ ở 37°C trong 6 ngày trong tủ ấm thông
thường. Giếng đã được kiểm tra bằng kính hiển vi từ ngày thứ 3 của quá trình ủ và kết
quả chuẩn độ được đọc bằng hiệu ứng tế bào (CPE) vào ngày cuối cùng. Các giếng đã
được gọi là dương tính nếu có bất kỳ đặc điểm cytopathice nào của virus rota SA-11 đã
được nhìn thấy trên đơn lớp. Điểm kết thúc được tính bằng phương pháp của SpearmanKarber. Giá trị sau đó được biểu thị là một tỷ lệ của mức độ chủng virus được sử dụng.
3.2.4

Sự bất hoạt của vi rút bằng nhiệt
17


Ở mỗi lần lấy mẫu, 0,4 ml được lấy từ chai và chuyển sang một chai tương tự được
làm lạnh trước trong nước đá và được bảo quản ở 4°C trước khi chuẩn độ. Nơi virus bị
bất hoạt trong dung dịch tinh bột, huyền phù được ủ qua đêm ở 22°C với alpha-amylase
(Sigma) ở 500 đơn vị/ml mẫu sau khi xử lý- nhẩm và trước khi chuẩn độ. Thủ tục này
làm tăng rõ ràng hiệu giá vi rút bằng hệ số xấp xỉ 10
3.2.5

Axit khử hoạt tính của virus

Huyền phù virus trong mơi trường phát triển virus trong bình thủy tinh là được điều
chỉnh đến độ pH cần thiết. Mẫu (0,1ml) là được loại bỏ định kỳ và thêm vào đệm chuẩn
độ vi rút (0,9 ml) ở nhiệt độ phòng (22°C), vừa để làm mát và trung hòa mẫu và bảo quản
ở 4°C trước khi chuẩn độ.
3.3 Kết quả

Ở 30 và 40°C, vi rút ổn định trong ít nhất 24 giờ.Các tỷ lệ tử vong giảm rõ ràng theo
thời gian có lẽ khơng do một quần thể con của virus chịu nhiệt nhiều hơn kể từ khi virus
được làm sạch bằng cách hạn chế pha loãng để đảm bảo đồng nhất số lượng. Ở nhiệt độ
cao hơn, quá trình khử hoạt tính của vi rút diễn ra nhanh chóng với chu kỳ giảm 3,25 log
ở 60°C trong 5 phút và giảm chu kỳ 4,5 log trong 1 phút ở 70 °C. Khơng có tác dụng bảo
vệ khỏi ngun liệu thực phẩm rõ ràng khi SA-11 được làm nóng ở 60°C trong 5 phút
Mức giảm, liên quan đến các đối chứng không được xử lý, của rotavirus được ủ ở các
nhiệt độ khác nhau và ở pH giá trị điển hình của phạm vi thu được bằng quá trình lên
men lactic (3.3 và 4.0). Ở mọi nhiệt độ, virus nhạy cảm với nhiệt hơn ở pH trung tính, và
nhạy cảm nhất ở giá trị pH thấp hơn. Ở 30°C, virus tương đối ổn định. Sự tiếp xúc của
virus rota với dịch lọc nuôi cấy L. plantarum (Canh thang MRS, pH 3,5) ở 30 ° C cho kết

quả tương tự như môi trường phát triển vi rút được axit hóa nhân tạo với sự giảm log-0,5
đơn vị sau 23 giờ.
Mức độ lên men lactic của thức ăn dặm có thể kiểm sốt sự lây truyền vi rút rota phụ
thuộc rất nhiều về cách thức lên men được kết hợp vào thực phẩm hiện có thực hành
chuẩn bị và ơ nhiễm rotaviral ở giai đoạn nào được giới thiệu. Khi đun nóng ở pH gần
trung tính, rotavirus bị phân hủy rất nhanh ở sự hồ hóa điển hình nhiệt độ nung chảy (ví
dụ: 60 ° C), và hiệu ứng này không giảm thiểu do sự hiện diện của nguyên liệu thực
phẩm.Rotavirus thể hiện tính ổn định cao hơn rõ rệt so với mầm bệnh ở các giá trị pH
điển hình của quá trình lên men lactic thực phẩm.
Kết quả thu được khi rotavirus được ủ trong sự hiện diện của một môi trường nuôi
cấy hoạt động của L.plantarum và dịch lọc nuôi cấy không chỉ ra sự hiện diện của bất kỳ
chất kháng virus nào, chất chuyển hóa khác với axit hữu cơ. Khả năng gây chết tăng lên
khi rotavirus được đun nóng ở pH thấp cho thấy tác dụng bảo vệ của q trình lên men có
thể được cải thiện đáng kể nếu thức ăn dặm được hâm nóng trước khi tiêu thụ.
18


3.4 Thảo luận

Rotavirus có khả năng tồn tại bền vững trong môi trường, tùy vào nhiệt độ và pH
khác nhau thì sự phát triển củ nó cũng có sự khác biệt. Q trình axit hóa, lên men vi
khuẩn và nhiệt độ có ảnh hưởng đến sự tồn tại của Rotavirus trong thức ăn dặm cai sữa
cho trẻ em. Quan bài nghiên cứu, ta có thêm hiểu biết, từ đó có sự chú ý cũng như đặc
biệt kiểm tra chuẩn xác trong khác khâu sản xuất để tạo ra các sản phẩm khơng nhiễm
rotavirus, an tồn cho người sử dụng, cụ thể là đối tượng trẻ em, giúp giảm tỉ lệ nhiễm
cũng như tử vong do rotavirus.
4. Phát triển một phương pháp phục hồi Rotavirus từ bề mặt của rau
4.1 Khái qt

Simian rotavirus SA-11 được sử dụng làm mơ hình cho virus rota ở người, là được

hấp thụ trên rau diếp và tác dụng của các chất rửa giải khác nhau đã được thử nghiệm để
phục hồi nó. Sự phục hồi tối đa của virus rota xảy ra với dung dịch chiết xuất thịt bò 3%
ở pH 8,0 sau 5 phút Phơi bày. Nếu tiếp xúc lâu hơn thì khả năng phục hồi của virut vẫn
không tăng. Khả năng phục hồi của virus rota và virus bại liệt loại 1 (LSC) đạt trung bình
lần lượt là 80 và 65%. Phục hồi virus rota từ rau khơng lá thấp hơn, trung bình 44% đối
với cần tây, cà rốt và củ cải. Phương pháp này sẽ giúp chúng ta nhận biết được sự tồn tại
của virus rota.
Rotavirus có thể gây viêm dạ dày ruột đe dọa tính mạng ở con người và động vật.
Mặc dù chúng chủ yếu gây ra tiêu chảy ở trẻ em nhưng các đợt bùng phát nghiêm trọng
đã xảy ra ở người lớn (15). Rotavirus được bài tiết với số lượng lớn trong phân từ những
người bị nhiễm bệnh (9), và đã cách ly với nước bị ô nhiễm nước thải (13). Cây trồng
được tưới bằng nước thải thô hoặc đã qua xử lý có khả năng truyền rotavirus sang người
vì rotavirus có thể tồn tại trong q trình xử lý nước thải thông thường (13). Đặc biệt
quan tâm là các loại rau có thời gian sinh trưởng tương đối ngắn (rau diếp và củ cải) và
được ăn sống. Đã có một vài nghiên cứu về khả năng sống sót và phục hồi một số vi rút
đường ruột trên rau (1,8). Tuy nhiên, sự xuất hiện và tồn tại của vi rút rota mới chỉ được
nghiên cứu trong nước (13), và các phương pháp chưa đã có sẵn để phục hồi virus rota từ
rau. Nghiên cứu này được thiết kế để phát triển một phương pháp phục hồi vi rút rota từ
rau quả.
4.2 Nguyên liệu và phương pháp
4.2.1 Nuôi cấy tế bào

Dòng tế bào MA 104 (Sản phẩm sinh học MA, Bethesda, Md.), Là được sử dụng cho
các xét nghiệm vi rút rota và Khỉ xanh trâu (BGM) tế bào để xét nghiệm virus bại liệt.
Các tế bào được ni trong mơi trường thiết yếu tối thiểu (MEM, phịng thí nghiệm Flow
# 10-101-22) được bổ sung 8% huyết thanh bò thai, 0,075% natri bicarbonat, 100 U

19

penicilin / ml, 100 (JLg streptomycin / ml, 50 ( Đồ gá của gentamyc in / ml và 25 U của
mycostatin / ml.
4.2.2

Virus

Vì những khó khăn trong q trình tăng trưởng và khảo nghiệm của con người
rotavirus, phương pháp được phát triển bằng cách sử dụng virus rotavirus SA-11, có hình
thái giống hệt con người rotavirus và chia sẻ nhiều kháng ngun, vật lý và hóa học tính
chất. Trước đây, nó đã được sử dụng như một mơ hình để phát triển các phương pháp
phát hiện virus rota ở người trong nước (13). Rotavirus SA-11 được cung cấp bởi H. H.
Malherbe (11) và được nuôi cấy trong tế bào MA 104. Các mẫu vi rút đã được pha loãng
trước khi thử nghiệm trong dung dịch muối đệm Tris có chứa 1,58 g Trizmabase / L, 4,09
g NaCl / L, 0,18 g KC1 / L, 0,028 g NajPOVL, 0,10 g dextrose / L, 100 U penicillin / ml,
100 (Jig streptomycin / ml và 25 U mycostatin / ml.
Các mẫu vi rút được định lượng bằng xét nghiệm mảng bám, sử dụng MA 104 tế bào
và lớp phủ thạch được bổ sung trypsin (ICN, PLAIN VIEW, N.Y.) 15 (jLg / ml và DEAEdextran 100 M.g / ml (12).
4.2.3

Rau

Rau diếp, cần tây, cà rốt và củ cải tươi cho phịng thí nghiệm các nghiên cứu thu
được từ các cửa hàng tạp hóa địa phương ở Tucson, Arizona. Xà lách, cần tây, cà rốt cắt
nhỏ mảnh có diện tích bề mặt khơng lớn hơn 10 cm2 trước khi thêm huyền phù vi rút vào
bề mặt của chúng. Củ cải đã được sử dụng như một rễ củ hoàn chỉnh.
4.2.4

Chất rửa giải

Bốn chất rửa giải vi rút thường được sử dụng để rửa giải vi rút đường ruột từ các bề

mặt đã được kiểm tra khả năng khôi phục vi rút từ rau. Các chất rửa giải này là chiết xuất
thịt bò 3% (GIBCO, Grand Island, N.Y.), canh 3% tryptose phosphat (TPB) (DIFCO
Phịng thí nghiệm, Detroit, Michigan), đệm glycine 0,05 M (BioRad, Richmond,
California) và nước cất. Tất cả rửa giải mơi trường được hịa tan trong nước cất. Giá trị
pH của những chất rửa giải được điều chỉnh đến mức thích hợp với 1/ V natri hiđroxit.
4.2.5

Rửa giải vi rút từ rau quả

Hai mươi gam rau được cho vào bình và 100 ml huyền phù vi rút SA-11 (chứa 103
đến 104 PFU / ml trong bộ đệm Tris) đã được thêm vào. Điều này sau đó đã bị rung
chuyển một cách máy móc trong 20 phút để cho phép vi rút hấp phụ và chất lỏng bên trên
đã được gạn lọc. Một mẫu được lấy từ phần đã gạn để xác định số lượng vi rút chưa được
hấp thụ. Sự rửa giải của vi rút được hấp thụ vào rau diếp đã được đánh giá ngay lập tức
bằng cách trộn 50 ml mỗi chất rửa giải với rau diếp trong các khoảng thời gian khác nhau
lên đến 60 phút. Eluents đã ngay lập tức được trung hịa, lọc qua màng lọc kích thước lỗ
0,2 n m, và thử nghiệm. Tồn bộ quy trình được trình bày trong Hình 1. Cần tây, cà rốt và
20


củ cải cũng được đánh giá về virus rota phục hồi với chiết xuất thịt bò 3% ở pH 8.0 và
thời gian tiếp xúc trên phút.
4.2.6

Phân tích dữ liệu

Số lượng vi rút được hấp thụ bởi một chế phẩm rau nhất định được ước tính bằng sự
khác biệt giữa số lượng vi rút hiện diện trong chất cấy ban đầu đã được thêm vào rau và
số lượng vi rút trong chất lỏng phía trên gạn lọc. Lượng vi rút được rửa giải từ một chế
phẩm rau bị ô nhiễm được biểu thị bằng phần trăm trong số đó được ước tính là đã được

hấp thụ. Dữ liệu được phân tích bằng cách phân tích phương sai nhiều chiều với thử
nghiệm và sao chép đĩa nuôi cấy (14). Sự chuyển đổi của dữ liệu tới arcsin Vpercent /
100 được sử dụng để đáp ứng các yêu cầu phân tích phương sai thích hợp (16). Để thuận
tiện, một số phân tích đã được thực hiện bằng máy tính DEC-10 (Trung tâm Máy tính Đại
học Arizona) sử dụng chương trình FACTAN (14). Giới hạn độ tin cậy (CL).
Cho 1 ml huyền phù virut + 99 ml đệm tris khuấy đều trong vòng 10 phút sau đó
thêm 20g rau vào để lắc đều trong vòng 20 phút nổi trên mặt là mẫu virut sau đó thêm 50
ml dung dịch rửa giải (pH 8, 9, 10) sau đó lắc và lấy mẫu theo đúng thời gian và chu kỳ
và Trung hòa đến pH 7,2, được lọc thơng qua màng kích thước lỗ 0,2 jjim lọc và bảo
quản ở - 20 ° C cho đến khi khảo nghiệm. Đây là quy trình đánh giá khả năng phục hồi
virus rota từ rau.
4.3 Kết quả

Ảnh hưởng của dung dịch rửa giải và độ pH đối với sự phục hồi của rotavirus Bốn
chất rửa giải thường được sử dụng để phục hồi vi rút đường ruột từ các bộ lọc và các bề
mặt rắn khác đã được đánh giá cho phục hồi vi rút từ rau diếp. Các chất rửa giải được
đánh giá là 3% chiết xuất từ thịt bò, 3% TPB, 0,05 M đệm glycine, và nước cất. Chúng
được đánh giá ở pH 8 và 9 sau Thời gian tiếp xúc 10, 30- và 60 phút và ở pH 10 sau 5, 10
và 15 phút. Lượng vi rút rửa giải từ rau diếp ở pH 8 và 9 phụ thuộc vào loại chất rửa giải,
cũng như thời gian tiếp xúc.
Xử lý rau diếp khi bị ô nhiễm bằng các chất rửa giải này “ở pH 10 được phân tích
riêng biệt kể từ thời gian tiếp xúc đã giảm xuống còn 5, 10 và 15 phút. Phần trăm phục
hồi của vi rút bị hấp phụ nói chung thấp hơn so với vi rút được phân phát ở pH 8 và 9.
Tương tác hai chiều giữa thời gian và dung dịch rửa giải là đáng kể. Ở pH 10, ảnh hưởng
của việc tăng tiếp xúc với vi rút sự phục hồi ít rõ rệt hơn so với ở pH 8 và 9. Điều này có
lẽ phản ánh sự nhạy cảm ban đầu của virus rota đến bất hoạt ở pH 10”. “Phân tích
phương sai được thực hiện theo sang giai thừa 2 nhân tố với phép thử và sao chép mẫu.”
Thời gian tiếp xúc với dung dịch rửa giải ngắn hơn đã được đánh giá sử dụng chiết
xuất thịt bò và TPB ở pH 8. Hơn đáng kể virus được phục hồi bằng cách sử dụng chiết
xuất thịt bò với thời gian 5 phút ngắn hơn so với các kết hợp điều trị khác. Tương tác

đáng kể giữa các dung dịch rửa giải và thời gian tiếp xúc cho thấy rằng sau 20 phút tiếp
21


xúc, sự phục hồi của vi rút ở pH 8,0 thấp hơn ở 5 và 10 phút và về cơ bản giống nhau đối
với chiết xuất thịt bò và TPB. Sự phục hồi tối ưu của virusrota xảy ra ở pH 8,0 với
soluton chiết xuất từ thịt bò sau khi tiếp xúc 5 phút. Sự tái tạo của virus rota từ cần tây, cà
rốt và củ cải là thấp hơn đáng kể so với rau diếp và trung bình là 44%. Phục hồi tối ưu
virus bại liệt từ rau diếp cũng xảy ra sau thời gian tiếp xúc 5 phút với đường tiết bị và
trung bình là 65% .
4.4 Thảo luận

Rotavirus nhạy cảm với tăng độ kiềm, và sự rửa giải và phục hồi của virus tương lai
ở pH 8,0 bị ảnh hưởng mạnh bởi sự lựa chọn của chất rửa giải và thời gian tiếp xúc.
Rotavirus là nguyên nhân chính gây tiêu chảy ở trẻ em ngồi ra có thể gây ra bệnh đe dọa
tính mạng ở người lớn. Chúng đã được coi là một nguyên nhân chính gây nên tiêu chảy ở
một số nghiên cứu, và đã gây ra nhiều đợt bùng phát bệnh viêm dạ dày ruột từ nước trên
tồn thế giới. Chúng tơi đã điều tra ít nhất một vụ bùng phát từ thực phẩm probable do
virútrota gây ra, nhưng chưa có phương pháp phát hiện chúng trong thực phẩm. Nghiên
cứu này cung cấp các phương pháp phát hiện virusrota trên thực phẩm và những phương
pháp này hiện đang được sử dụng để nghiên cứu sự xuất hiện của virus rota trên rau được
tưới bằng nước thải, thời gian sống sót trên rau, tồn tại ở bề mặt thực phẩm, và trong quá
trình điều tra về sự bùng phát thức ăn của dạ dày-ruột
5. Nghiên cứu về bệnh đường ruột truyền nhiễm ở Anh: các yếu tố nguy cơ liên

quan đến rotavirus nhóm A ở trẻ em
5.1 Khái quát
Hơn 140 triệu trẻ em trên toàn thế giới bị viêm dạ dày ruột rotavirus mỗi năm. Đây là
nguyên nhân hàng đầu gây tử vong do tiêu chảy ở trẻ em ở các nước thu nhập thấp và
trung bình. Nghiên cứu bệnh đường ruột truyền nhiễm (IID) ở Anh cho thấy rotavirus

nhóm A là nguyên nhân phổ biến nhất của IID ở trẻ em dưới 5 tuổi. Mục đích của bài báo
để xác định các yếu tố nguy cơ mắc bệnh đường ruột truyền nhiễm (IID) do rotavirus
nhóm A ở trẻ em dưới 16 tuổi.
5.2 Phương pháp

Nghiên cứu này báo cáo về việc điều tra các yếu tố nguy cơ tiềm ẩn đối với IID bị
nhiễm rotavirus trong cộng đồng ở Anh. 70 tình nguyên viên được lựa chọn từ khung
nghiên cứu thực hành chung của Hội đồng. Tuyển dụng thực hành so le trong vòng 18
tháng và mỗi thực hành được thu thập dữ liệu trong một năm. Các biểu hiện của IID được
sử dụng trong nghiên cứu là: những người có phân lỏng hoặc nơn mửa đáng kể kéo dài
dưới 2 tuần, trong trường hợp không có ngun nhân, khơng lây nhiễm đã biết trước đó
có thời gian không triệu chứng là 3 tuần. Tất cả các trường hợp của IID đã được yêu cầu
kiểm tra phân.

22


Trong các trường hợp thành phần nhóm dưới 16 tuổi trình bày với IID đã được tuyển
dụng vào nghiên cứu, cha mẹ hoặc người giám hộ của họ được yêu cầu hoàn thành bảng
câu hỏi về yếu tố nguy cơ và một mẫu phân đã được đăng lên Leeds Public
HealthLaboratory (PHL), nơi các mẫu được thử nghiệm cho một loạt các sinh vật toàn
diện, bao gồm rotavirus. Bảng câu hỏi có các mục về các yếu tố xã hội, chỗ ở, du lịch,
tiếp xúc với những người bị IID và thực phẩm. Bảng câu hỏi đã được hoàn thành trước
khi kết quả điều tra phân được biết đến.

Bảng 4 Các yếu tố trong phân tích được đưa vào cho trẻ dưới 16 tuổi
Một phân tích được thực hiện trên 139 cặp dưới 16 tuổi, trong đó đã trả lời một
bảng câu hỏi về yếu tố nguy cơ. Phân tích được thực hiện bằng cách sử dụng STATA .
Các biến nghi ngờ có liên quan đến nguy cơ nhiễm rotavirus trên cơ sở giả thuyết trước
đó đã được phân tích. Đối với trẻ em dưới 16 tuổi, bao gồm tầng lớp xã hội, du lịch, bơi

lội, chỗ ở, ăn uống và tiếp xúc với những người có IID (Bảng 1); đối với trẻ em dưới 5 và
đối với trẻ sơ sinh khi cho ăn. Phân tích ban đầu khơng có sự thay đổi, và sau đó được
điều chỉnh các yếu tố chỗ ở (sở hữu, thuê tư nhân, hội đồng thuê, số phịng trong hộ gia
đình) và tiếp xúc với những người có IID và tiêu thụ thực phẩm. Tầng lớp xã hội, các yếu
tố trung gian được cho là có ảnh hưởng gián tiếp đến việc tiếp xúc với rotavirus (ví dụ:
chỗ ở, du lịch) và các yếu tố trực tiếp như tiếp xúc với người bị IID hoặc tiêu thụ thực
phẩm. Để cho phép khả năng của các hiệp hội có thể được tìm thấy do nhiều thử nghiệm,
chúng chỉ được coi là đáng kể ở mức dưới 1%. Các hiệp hội giữa mức độ quan trọng từ
1% - 5% được coi là đường biên giới và cũng được báo cáo. Phân tích ở trẻ sơ sinh ban
đầu khơng biến đổi, sau đó được điều chỉnh để tiếp xúc với những người chỉ có IID, vì số
lượng nhỏ. Trong trường hợp này, các hiệp hội đã được thực hiện ở mức 5% vì khơng có
nhiều thử nghiệm. Các phân số được quy về dân số (PAF) tính bằng cơng thức:

23


Trong đó:

P’ là tỷ lệ các trường hợp trong nhóm tiếp xúc.
OR là tỉ số chênh lệch.

5.3 Kết quả

Sự phân bố tuổi của tất cả các trường hợp được kiểm sốt dưới 16 tuổi có phân được
thử nghiệm rotavirus được trình bày ở Bảng 2. Trong số này, dữ liệu được trình bày trên
139 cặp phù hợp, trong đó cả trường hợp được kiểm soát. 12% các cặp ở cộng đồng. 123
cặp dưới 5 tuổi, trong đó có 39 trẻ sơ sinh. Có sự chậm trễ trung bình 24 ngày giữa việc
tuyển dụng các trường hợp và kiểm soát của họ; 60% kiểm sốt được tuyển dụng trong
vịng 1 tháng sau trường hợp của họ và 80% trong vòng 2 tháng. Sự phân bố của các
trường hợp đạt đỉnh điểm giữa các tháng 1 và tháng 4.

Bảng 5
Tuy nhiên, một mối liên hệ đáng kể đã được tìm thấy giữa loại chỗ ở và nhiễm
rotavirus (Bảng 3). Thuê chỗ ở tăng nguy cơ gấp năm lần. Nguy cơ sống trong chỗ ở cho
thuê đã giảm khi điều chỉnh số phòng. Một số rủi ro của nhà thuê có thể được tính bằng
cách có chỗ ở ít phịng hơn. Có sự gia tăng nguy cơ liên quan đến tiếp xúc với người khác
bị viêm dạ dày ruột, không nhất thiết phải trong gia đình. Điều chỉnh tầng lớp xã hội và
chỗ ở không ảnh hưởng đến nguy cơ liên quan đến tiếp xúc với người bệnh. Du lịch nước
ngoài làm tăng rủi ro, nhưng khơng có ý nghĩa thống kê; chỉ có năm trường hợp đã đi du
lịch nước ngồi. PAF để sống trong chỗ ở hội đồng thuê là 12% và PAF để tiếp xúc với
người bệnh là 48%. Do đó, 40% các trường hợp phát sinh khơng thể được giải thích bởi
hai biến số này ở trẻ em dưới 16 tuổi.

24


Bảng 6 Các yếu tố nguy cơ mắc IID với rotavirus nhóm A trong phân ở người dưới 16
tuổi
5.4 Thảo luận

Đây là một trong số ít các nghiên cứu mơ tả các yếu tố nguy cơ nhiễm rotavirus ở
trẻ em, cả trong cộng đồng. Kết quả cho thấy ở trẻ em dưới 16 tuổi, có nguy cơ mắc viêm
dạ dày ruột rotavirus tăng lên rõ rệt liên quan đến loại chỗ ở, đặc biệt là nhà ở hội đồng
thuê và nhà ở có ít phịng và tiếp xúc với những người khác bị viêm dạ dày ruột.
IV.

KẾT LUẬN

Trong thực phẩm vẫn cịn rất nhiều vi sinh vật có hại, chúng ảnh hưởngtoiws chất
lượng thực phẩm và sức khỏe con người. Trong đó đặc biệt là có rotavirus là một loại khá

nổi trội. Rotavirus là nguyên nhân chính gây tiêu chảy ở trẻ em ngồi ra có thể gây ra
bệnh đe dọa tính mạng ở người lớn. Chúng đã được coi là một nguyên nhân chính gây
nên tiêu chảy, và là một trong số các loại vi rút gây viêm dạ dày ruột đã bùng phát từ các
nước trên toàn thế giới. Qua các bài nghiên cứu đã có những đóng góp quan trọng về
chuẩn đốn loại viusrota từ đó kịp thời ngăn chặn rotavirus cắt khỏi lây lan. Virus Rota
lây nhiễm rất mạnh, trẻ có thể nhiễm ở giai đoạn rất nhỏ và bệnh có thể để lại hậu quả
nặng nề. Chính vì thế, điều quan trọng của các bậc cha mẹ là cần phải bảo vệ cho trẻ càng
sớm càng tốt trước khi trẻ có nguy cơ bị virus Rota tấn cơng. Nhưng đến nay vẫn chưa có
phương pháp phát hiện chúng trong thực phẩm. Nghiên cứu này cung cấp các phương
25