Xác định môi trường tối ưu để thu sinh khối và enzyme của vi khuẩn bacillus subtilis, lactobacillus acidophilus thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (253.66 KB, 26 trang )
1
Phần 1. MỞ ĐÀU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, con người có xu hướng trở dần về với tính chất thiên nhiên
thơng qua việc sử dụng một số chất có hoạt tính sinh học hay các phương
pháp sinh học đế ứng dụng trong công nghiệp, nông nghiệp, cải thiện môi
trường và đế chữa bệnh. Lý do đơn giản là con người đã hiếu được mặt
trái khi sử dụng các chất hóa học, chất kháng sinh. Những chất này tuy có
hiệu quả nhanh chóng nhưng hậu quả mà nó mang lại rất lớn.
Trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản trước đây người ta thường
dùng những chất kháng sinh đế phòng và trị bệnh cho gia súc, gia cầm và
tôm, cá... Việc sử dụng kháng sinh trong một thời gian dài đã đế lại nhiều
hậu quả không mong muốn như sự kháng thuốc của vi khuẩn hoặc rối
loạn hệ vi sinh vật đường ruột làm bệnh tái phát nặng hơn và dẫn đến khó
điều trị hơn. Nghiêm trọng hơn sự tồn dư kháng sinh trong thịt dẫn đến
phẩm chất thịt giảm làm hạ giá thành sản phẩm, gây cản trở cho việc xuất
khẩu làm thiệt hại rất lớn trong chăn nuôi.
Đe khắc phục được tình trạng này, các nhà khoa học đã nghiên cứu sử
dụng trục tiếp những vi sinh vật sống, có lợi thường gọi là “probiotic”.
Ket quả đã chứng minh được lợi ích của những vi khuẩn có lợi này trong
việc phòng và điều trị một số bệnh trong chăn nuôi, thủy sản và cho cả
2
con người. Điều quan trọng là nó khơng đế lại những hậu quả hay di
chứng khi sử dụng như các loại hóa chất và thuốc kháng sinh.
Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tôi tiến hành đề tài “Xác
định môi trường tối ưu để thu sinh khối và enzyme của vi khuẩn
Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus. Thử nghiệm sản xuất chế
phẩm sinh học” để phục vụ trong chăn nuôi và thủy sản.
1.2.
MỤC ĐÍCH
Xác định được mơi trường tối ưu của vi khuẩn Bacillus subtilis và
Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong
chăn nuôi thú y và ni trồng thủy sản.
1.3.
U CẦU
1.3.1. Đổi vói Bacillus subtilis
S Thực hiện việc nuôi cấy Bacillus subtilis trên nhiều loại môi trường
khác nhau đế xác định xem môi trường nào làm cho vi khuẩn sinh
enzyme protease và amylase nhiều nhất.
S Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis .
s Kiếm tra chất lượng của chế phẩm vừa sản xuất và sau thời gian bảo
quản.
1.3.2. Đổi vói Lactobacillus acidophilus
Phân lập từ chế phẩm Antibio do Hàn Quốc sản xuất.
3
Tìm mơi trường nhân giống thích hợp cho sinh khối và tạo acid lactic cao
nhất. Sản xuất chế phẩm chứa vi khuẩn Lactobacỉllus acidophilus. Kiếm
tra chất lượng của chế phẩm vừa sản xuất và sau thời gian bảo quản
Phần 2. VẬT LIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIÊM
•••
2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THựC HIỆN
Khóa luận được thực hiện từ ngày 15/2/2005 đến 15/6/2005 tại phịng
thí nghiệm Vi Sinh khoa Công Nghệ Sinh Học trường đại học Mở Bán
Công thành phố Hồ Chí Minh.
2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN cứu
2.2.1. Giống vi khuẩn
• Bacillus subtilis ATCC - 6633 được cung cấp từ khoa Công Nghệ
Sinh Học trường Đại học Mở Bán Cơng thành phố Hồ Chí Minh.
• Lactobacỉllus acidophilus được phân lập từ chế phẩm Antibio do
Hàn Quốc sản xuất.
2.2.2. Thiết bị - dụng cụ
• Thiết bị: tủ ấm, tủ sấy, giá đỡ ống nghiệm, nồi hấp autoclave, tủ
lạnh, giấy đo pH, kính hiển vi, cân, máy lắc, đường kế, bếp
điện ...
• Dụng cụ: ống nghiệm, que cấy, đĩa petri, pipet, micropipet, đầu
type vô trùng, que cấy trang, đũa thủy tinh, khăn giấy...
2.2.3. Hóa chất
• Các loại thuốc nhuộm: crystal violet, íuschin, lugol
• Thuốc thử kowac, methyl red, NaOH IN, HC1 IN, H 202 30%, dầu
soi kính, cồn...
• Dung dịch tinh bột 0,1%, dung dịch NaCl 0,1%, dung dịch iốt
0,02%, dung dịch casein 0,1%...
2.2.4. Mơi trường ni cấy
2.2.4.1.
Đối với Bacillus subtilis
• Mơi trường tăng sinh nutrient broth (NB)
• Mơi trường giữ giống và đếm số lượng tế bào nutrient agar (NA)
• Môi trường nhân giống cấpl: môi trường Frage, pepton - gelatin,
ri đường + 2 % tinh bột, Edward và mơi trường Nomura.
• Mơi trường sản xuất: bắp, đậu nành, bột sữa, bột mì...
2.2.4.2.
Đối với Lactobacỉllus acidophilus
• Mơi trường tăng sinh chọn lọc MRSB
• Mơi trường phân lập MRSA
• Mơi trường ni cấy và thử các phản ứng sinh hóa
• Mơi trường sản xuất: mơi trường sữa đặc có đường và mơi
trường sữa đậu nành.
2.3. PHƯƠNG PHÁP THÍ
NGHIỆM 2.3.1. Đổi vói
Bacillus subtilis
Giống gốc
Baciỉỉus subtiỉis
Nhuộm Grarn,
kiểm tra độ thuần
Tăng sinh
Môi trường NB
(nutrient broth)
5% giống
Môi trường
Nomura
Môi trường ri
đường
+2% tinh bột
Môi trường
Fragie
Môi trường
Edwards
Môi trường
pepton - gelatin
48 giờ, nhiệt độ phịng
Kiểm tra
SỐ lượng vi khuẩn
có trong lml
Hoạt độ enzyme
protease
Hoạt độ enzyme
amylase
Chọn môi trường tối ưu nhất
10 % giống
Môi trường
A
Môi trường
B
Môi trường
c
Môi trường
D
Chọn môi trường tối ưu nhất
Sản xuất chế phấm chứa
Bacillus subtilis
Bảo quản, kiếm tra
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đối với Bacillus subtilis
Môi trường
E
2.3.1.1. Khảo sát khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus
subtilis trên môi trường nhân giống cấp 1
Giống chứa Bacillus subtilis được tăng sinh trong mơi trường NB có
pH = 7 trong thời gian 24 giờ/37°c. Sau 24 giờ cho dung dịch tăng sinh
này vào từng loại môi trường: Edward, Nomura, Fragie, Rỉ đường + tinh
bột 2 %, và pepton-gelatin với các điều kiện khảo sát: nhiệt độ phòng, pH
= 7, lượng giống: 5% và thời gian nuôi cấy là 48 giờ.
Sau 48 giờ tiến hành kiếm tra số lượng tế bào vi khuẩn, hoạt độ enzyme
amylase và protease.
Từ kết quả kiếm tra số lượng và hoạt độ enzyme trên từng loại môi
trường chúng tôi chọn được môi trường nhân giống cấp 1 tối ưu nhất đế
tiếp tục nhân giống trên mơi trường nhân giống cấp 2. Thí nghiệm được
lập lại 3 lần.
2.3.1.2. Khảo sát khả năng tăng sinh khối và enzyme của Baciỉỉus
subtilis trên môi trường nhân giống cấp 2
Sau khi chọn lọc được môi trường nhân giống cấp 1 tốt nhất chúng tôi
tiến hành xác định môi trường nhân giống cấp 2 tối ưu nhất. Cách bố trí
thí nghiệm được thực hiện như sau:
Mơi trường sử dụng là mơi trường bán rắn được bố trí gồm 5 loại mơi
trường A, B, c, D và E có bổ sung CaCƠ3 2% để ổn định pH môi trường.
Tất cả các loại môi trường trước khi đem nuôi cấy đều được hấp khử
trùng ở 121°c trong 15-20 phút.
Lượng giống sử dụng ở môi trường nhân giống cấp 2 là 10% với độ ẩm
của môi trường là 60 - 65%, pH = 7. Từng loại môi trường được đặt trong
các khay bằng nhựa có kích cỡ 0,5 X 0,25 X 0,08 m, mỗi khay chứa 0,6
kg mơi trường. Trong q trình nuôi phải giữ ẩm cho môi trường bằng
cách phủ vải ẩm. Sau thời gian nuôi 72 giờ ở nhiệt độ phịng bắt đầu thu
hoạch sau đó đem sản phẩm này kiếm tra số lượng tế bào vi khuẩn và hoạt
độ enzyme amylase, protease.
Sau khi kiếm tra trên tất cả các loại môi trường A, B, c, D và E nhằm
tìm được mơi trường nhân giống cấp 2 nào cho sinh khối và hoạt độ
enzyme cao nhất đế tiến hành sản xuất. Mỗi mơi trường thí nghiệm được
lập lại 3 lần.
2.3.1.3. Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis
Sau khi tìm được mơi trường nhân giống cấp 2 tối ưu nhất chúng tôi
tiến hành sản xuất chế phẩm chứa Baciỉỉus subtilis. Cách thực hiện tương
tự như thí nghiệm 2.3.1.2.
Sau thời gian ni 72 giờ bắt đầu thu hoạch và đem sấy ở nhiệt độ 40 45°c trong 2 ngày sao cho sản phẩm khô hồn tồn. Sau đó đem đóng gói,
kiếm tra và bảo quản. Quy trình sản xuất được thực hiện theo sơ đồ 2.2.
Nước 60 - 65 %
so với nguyên liệu
Môi trường nhân
giống cấp 2 tối ưu
Khoáng hỗn
hợp
Hấp khử trùng 121 °c
trong 20 -25 phút
Làm nguội đến 37°c
Đổ lên khay
Giống Bacillus subtilis 10%
Nuôi 72 giờ ở nhiệt độ
phịng
Đánh tơi Sấy khơ
40 - 45°c
Xay mịn
Chế phẩm chứa Bacillus
subtilis
Đóng gói, kiếm tra và
bảo quản
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis
2.3.1.4. Kiếm tra số lượng tế bào vi khuẩn và hoạt độ enzyme Chế phẩm chứa Baciỉỉus
subtilis sau khi sấy khô tiến hành kiếm tra số lượng bằng phương pháp đếm khóm vi khuẩn
trên đĩa, hoạt độ enzyme amylase theo phương pháp Wolhgemuth, protease bằng phương pháp
Gross + Fuld và kiếm tra các chỉ tiêu trên sau thời gian bảo quản 10,20 và 30 ngày ở nhiệt độ
phòng.
2.3.2.
Đối với Lactobacillus acidophilus
Chế phẩm Antibio
(chứaZ,. acidophiỉus)
Phân lập
MRSA
Môi trường sữa đậu nành
Chọn khuấn lạc điến hình
MRSB tăng sinh (24 giờ /37°C)
Kiếm tra sinh hóa
Xác định Lactobacillus acidophilus
Mơi trường sữa đặc có đường
----------------^
24 giờ, nhiệt độ phịng
Kiểm tra
Số lượng vi khuấn có trong lml
Độ chua Theme tính ra lượng acid lactic
Chọn ra môi trường
tối ưu
Sản xuất chế phẩm chứa L. acidophilus
trên mơi trường tối ưu
Kiếm tra, đóng gói và
bảo quản
Sơ đồ 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đối với Lactobacillus
acidophilus
2.3.2.1. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Mầu phân lâp: sử
dụng chế phẩm Antibio chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus do Hàn
Quốc sản xuất.
Quy trình phân lâp:
lml
Đồng nhất
và pha
lỗng mẫu
10
lml lml
c
c
o
lml
lml
lml
c
o
o
..__
..
10-2 10-3 10-4
1
1 gam mẫu + 9ml
ddNaCl 9°/oo
10-5 10-6 10-7
n\
J
1_
\u
T
Môi trường phân lập
MRSA
J
Chọn khuấn lạc điến hình,
nhuộm Gram và thử các phản
ứng sinh hóa
Cấy giữ giống
Mơi trường giữ giống
MRSA
Sơ đồ 3.4. Quy trình phân lập vi khuẩn
Lactobaciỉỉus acidophiỉus Cách tiến hành
Chế phẩm Antibio (gói/lgam) hịa vào 9 ml nước muối sinh lý (nồng độ
9 700) sau đó lắc đều sao cho dung dịch trở nên đồng nhất ta được dung
dịch có nồng độ pha loãng 10"1 . Tiếp theo lấy lml dung dịch 10" 1 cho vào
9 ml dung dịch NaCl 9°/oo ta được dung dịch có nồng độ 10" 2. Tiếp tục
như thế cho đến khi được các dung dịch có nồng độ 10" 6, 10"7. Dùng
micropipet hút 0,2ml dịch khuẩn ở nồng độ 10" 6, 10"7 (mỗi nồng độ cho
vào 2 đĩa) trang đều trên mặt thạch chứa môi trường MRSA rồi đem ủ ở
nhiệt độ 37°c trong 24 giờ và chọn khuẩn lạc nghi ngờ (khuẩn lạc trịn
đều, nhơ lên và bên ngồi có
vòng trong) đem nhuộm Gram và cấy giữ giống. Những
khuẩn lạc nghi ngờ này đuợc tăng sinh trong môi trường
MRSB trong 24 giờ ở nhiệt độ 37°c để tiến hành thử các
phản ứng sinh hóa.
Xác đinh vi khuẩn Lactobacỉllus acidophilus
Vi khuẩn Lactobacỉllus acidophilus được xác định dựa trên các phương
pháp truyền thống như:
o Quan sát hình dạng tế bào khuẩn lạc và sự bắt màu khi
nhuộm Gram. o Thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa.
2.3.2.2.Khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn và độ chua Theme trên môi
trường sữa đặc có đường
Giống chứa Lactobacỉllus acidophilus sau khi phân lập được tăng sinh
trên môi trường MRSB trong thời gian 24 giờ ở 37°c. Sau đó cho lượng
giống 5% vừa tăng sinh này vào mơi trường sữa đặc có đường với từng
nồng độ sữa là: 15%, 20% và 25%. Sau thời gian nuôi 24 giờ, pH = 6,5 - 7
ở nhiệt độ phịng chúng tơi tiến hành kiếm tra số lượng tế bào vi khuẩn và
độ chua Theme của từng loại nồng độ.
2.3.2.3.Khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn và độ chua Theme trên môi
trường sữa đậu nành
Tương tự như ở thí nghiệm 2.3.2.2 sử dụng là 5% giống và môi trường
là sữa đậu nành với nồng độ đậu nành là 10%, 15% và 20% ứng với mỗi
nồng độ đậu chúng tôi khảo sát từng nồng độ đường cho vào là 0%, 10%,
15% và 20%. Những nồng độ này được ký hiệu như sau:
o Ở nồng độ 10% đậu có bổ sung từng hàm lượng đường là
0%,10%,15% và 20% được ký hiệu lần lượt là NAo, NAio, NA15,
NA20. o Tương tự ở nồng độ 15% đậu có: NB0, NB10, NB15 và NB20.
o Ở nồng độ 20% đậu có: NCo, NCio, NCi5 và NC20.
Sau thời gian nuôi cấy là 24 giờ, pH = 6,5 - 7 ở nhiệt độ phịng chúng
tơi tiến hành kiếm tra độ chua Theme và số lượng tế bào vi khuẩn.
2.3.2.4.Tiến hành sản xuất thử chế phẩm chứaLactobacỉllus
acidophilus
Từ kết quả khảo sát độ chua và số lượng vi khuẩn ở hai loại mơi trường
sữa đặc có đường và sữa đậu nành chúng tôi chọn được môi trường tối ưu
nhất đế tiến hành sản xuất thử chế phẩm chứa Lactobacỉllus acidophilus.
Sau 24 giờ nuôi trên môi trường tối ưu ở nhiệt độ phòng với lượng
giống cho vào là 5%. Chúng tôi bắt đầu thu hoạch và đem phối trộn với
bột đậu nành khô đã qua khử trùng (sấy 100°c trong 2giờ). Tỷ lệ phối trộn
là 1:1 sau đó đem sấy ở nhiệt độ 40 - 45°c trong 2 ngày sao cho sản phẩm
khơ hồn tồn. Sản phẩm này được xây mịn, đóng gói sau đó đem kiếm
tra và bảo quản ở nhiệt độ phòng.
2.3.2.5. Kiếm tra sản phẩm sau thời gian bảo quản Sản phẩm sau khi
sấy khô chúng tôi tiến hành kiếm tra số lượng tế bào vi khuẩn có trong 1
gam sản phẩm và sau thời gian bảo quản là 10 và 20 ngày bằng phương
pháp đếm số lượng tế bào sống trcn thạch.
2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
2.4.1. Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab release 13.20 đế so
sánh sự khác biệt giữa các mơi trường.
Đổi với thí nghiêm ừ~ên Bacillus subtilis
Môi truờng nhân giống cấp 1 và môi trường nhân giống cấp 2 chúng
tôi dùng dùng trắc nghiệm 1 yếu tố đế xem tác động của:
■ Môi truờng lên số lượng tế bào vi khuẩn
■ Môi truờng lên hoạt độ enzyme amylase
■ Mơi truờng lên hoạt độ enzyme
protease Đổi với thí nghiêm ừ~ên
Lactobacỉllus acidophilus
Mơi truờng sữa đặc có đường dùng trắc nghiệm một yếu tố đế xem
ảnh hưởng của nồng độ sữa lên số lượng và độ chua của L. acidophilus.
Môi truờng sữa đậu nành dùng trắc nghiệm hai yếu tố là nồng độ đậu
nành và hàm lượng đường trong sữa đậu nành đế:
■ So sánh sự khác biệt giữa từng nồng độ đậu và từng hàm
lượng đường lên số lượng và độ chua Theme của sữa.
■ Ảnh hưởng của nồng độ đậu và hàm lượng đường lên số
lượng và độ chua của sữa.
2.4.2. Biểu đồ
Biếu đồ được vẽ bằng phần mềm Excel phiên bản 2003.
Phần 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.
ĐÓI VỚI BACILLUS SUBTILIS
3.1.1.Kết quả về khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus
subtilis trên môi trường nhân giống cấp 1.
3.1.1.1. Khả năng tăng sinh khối
Bảng 3.1. Số lượng tế bào B. subtilis trên từng loại môi trường nhân giống
cấp 1
Môi Trường
Edward
Lặp lại (n)
Fragie
3
Nomur
a
3
3
pepton- Rỉ đường +
tinh
gelatin 2%
3
X(xio10 cfu/g)
SD
l,5667a
0,21455
l,3600b l,4267b
0,391
0,411
Cv%
13,69
28,78
28,83
bột 3
0,4537c
0,0773
l,9200d
0,2455
17,05
12,78
Ghi chủ : Chữ a, b, c, d chỉ sự khác biệt về mặt thống kê giữa
từng loại môi trường
3.1.1.2.
Khả năng sinh enzyme amylase và protease Bảng 3.2. Hoạt độ
enzyme amylase và protease trên từng loại môi trường nhân giống cấpl
Môi trường
Enzyme
Edward
Fragie
Lặp lại (n)
Amylas X(W0/ml)
SD
e
Cv%
3
8a
3
16b
0
0
0
0
Lặp lại (n)
3
3
Protease X (Hđp/ml)
SD
Cv%
8a
0
0
13,33b
4,6188
34,64
Nomur
pepton Rỉ đường +
a
-
3
26,67c
9,2376
2% tinh bột
3
3
a
10,67
265d
4,6188
0
34,63
43,28
0
3
3
3
16b
0
0
32c
0
0
128d
0
0
Qua kết quả khảo sát số lượng tế bào/ml, hoạt độ enzyme amylase,
protease trên môi trường nhân giống cấp 1 chúng tôi nhận thấy rằng
môi trường ri đường có bố sung 2% tinh bột là mơi trường tối ưu nhất
trong 5 loại môi trường khảo sát. Từ đây chúng tôi quyết định chọn môi
trường này là môi trường nhân giống cấp 1 thích hợp nhất đế sử dụng
cho môi trường nhân giống cấp 2.
3.1.2.
Kết quả về khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus
subtilis trên môi trường nhân giống cấp 2
3.1.2.1. Khả năng tăng sinh khối
Bảng 3.3. Số lượng tế bào B. subtilis trên từng loại môi trường nhân
giống cấp 2
Môi Trường
Lặp lại (n)
X (x 1010 cfu/g)
SD
Cv%
3.1.1.2.
A
3
B
3
155,33
345,67a
126,595 b55,229
36,62
35,55
c
D
E
3
11,3
3
3
C
Ố8
1,362
11,98
13,26c
1,623
12,24
12,74c
2,619
20,56
Khả năng sinh enzyme amylase và protease
Bảng 3.4. Hoạt độ enzyme amylase và protease trên môi trường nhân
giống cấp 2
Qua bảng 3.3 và 3.4 chúng tơi nhận thấy ở mơi trường A và B có sự
tương đồng về khả năng sinh enzyme amylase và protease. Tuy nhiên khi
xét đến khả năng tạo sinh khối thì môi trường A là môi trường tối ưu nhất.
Từ kết quả khảo sát số lượng và hoạt độ enzyme trên môi trường A, B, c,
D và E, chúng tôi quyết định chọn môi trường A làm môi trường sản xuất
thích họp nhất đế sản xuất chế phẩm chứa B. subtilis.
3.1.3. Kết quả kiểm tra sổ lượng B. subtilis và hoạt độ enzyme sau khi
sản xuất chế phẩm
Số lượng tế bào vi khuẩn : 58,9 X 1
o10 cfu/g Hoạt độ amylase: 160
Wo/ml Hoạt độ protease: 80 Hđp/ml
3.1.4. Kết quả kiểm tra chế phẩm chứa Bacillus subtilis sau thời gian
bảo quản
Bảng 3.5. Ket quả kiếm tra chế phẩm Baciỉỉus subtilis trong thời gian bảo
quản
Chế độ
Thời điểm
bảo quản
kiểm tra
10
(ngày)
bào (xio9 cfu/g)
118
(W0/ml)
160
protease
80
(Hđp/ml)
20
88,9
160
80
30
68,9
160
80
Nhiệt độ
thường
Số lượng tế Hoạt độ amylase
Hoạt độ
Quy đối hoạt độ enzyme amylase và protease sang đơn vị
quốc tế. Hoạt độ amylase là 160 W0/g -6576 Ul/ml Hoạt
độ protease là 80 Hđp/ml - 572,8 Ul/ml
iỉ
o
M
.
<ọ
700
600
500
400
0
589
10
20
30 Thời gian (ngày)
M Số lượng
300
200
100
0
118 oo Q
^ 8 8 9 68.9
111
Biểu đồ 3.1. Sổ lượng vi khuẩn Bacillus subtilis sau thòi gian bảo quản
3.2.
ĐÓI VỚI LACTOBACILLusACIDOPHILus
3.2.1. Đặc điểm của Lactobacillus acidophilus
3.2.1.1. Quan sát đại thể
Trên mơi trường thạch đĩa MRSA khuẩn lạc có dạng tròn, nhỏ, ở giữa dày và
đục hơn mép bên ngồi, xung quanh khuẩn lạc có vịng trong. Sau 48 giờ ở tâm
khuẩn lạc có màu hơi vàng, đường kính khuẩn lạc từ 1 - 2 mm.
3.2.1.2. Quan sát vi thể
Qua quan sát trên kính hiến vi chúng tơi nhận thấy vi khuẩn có dạng hình
que, hai đầu trịn, kích thước trung bình từ 0,6 - 0,9 X 1,5-6 pm. Chúng tồn tại
dạng đơn, cặp đôi hay đôi khi tạo chuỗi ngắn, bắt màu tím (Gram dương) và
khơng có bào tử.
3.2.1.3. Đặc điểm sinh hóa
Bảng 3.6. Kết quả thử phản ứng sinh hóa của
Lactobacỉllus acidophilus
Phản ứng
Indol
VP
MR
Citrat
Nitrat
Di động
Catalase
Khả năng đơng vón
Kết quả
+
+
Lên men
đường
Lactose
Sucrose
Glucose
Manitol
Rabinose
Kết quả
+
+
+
-
sữa
Từ kết quả 3.2.1.1, 3.2.1.2 và 3.2.1.3 chúng tôi kết luận chủng vi khuẩn
nghi ngờ được phân lập từ chế phẩm đó là vi khuẩn Lactobacỉllus
acidophilus.
3.2.2. Kết quả kiểm tra sổ lượng L. acidophilus và độ chua Therne trên
từng loại môi trường
3.2.2.1. Trên môi trường sữa đặc có đường
Bảng 3.7. Khả năng tạo độ chua củaL. acidophilus trên mơi trường sữa đặc có
đường
Nồng độ sữa
Lặp lại (n)
15 %
3
20%
3
X (g/lOOml)
0,8233a 0,9420b
l,169c
SD
0,045
0,046
0,059
25 %
3
Bảng 3.8. Số lượng củaL. acidophiỉus trên mơi trường sữa đặc có đường.
Nồng độ sữa
15%
20%
25%
3
3
3
ll,017b
21,967c
3,350
Lặp lại (n)
X{ xio9 cíu/ml) 8,83a
SD
0,317
1,086
Cv%
3,59
9,86
15,25
Qua bảng 3.7 và 3.8 chúng tơi nhận thấy nồng độ sữa càng cao thì khả năng
tạo độ chua và sinh khối của vi khuẩn L. acidophilus càng nhiều. Độ chua và số
lượng tế bào vi khuẩn cao nhất ở mơi trường có nồng độ sữa 25%.
3.2.2.2.Trên môi trường sữa đậu nành
Bảng 3.9. Khả năng tạo độ chua của L. acidophilus trên môi trường sữa đậu
nành.
\ NỒNG
10%
X
\^Ộ KET NAo NA, NA,
LQUẢ
ẶP N.
LẠI 3 0 3 5 3
NA20
15 %
NBo NB, NB1
20%
NB2 NCo NC, NC,
3
3 03 53
0
3
NC20
3 03 53
3
(N)
1,0 1,27 1,3 1,4
1,
1,2
1,
1,7 1,1 1,41 1,6
1,
X
5
0
7
6
0
8
(GBOOM
0,04 2
1
3
5
0,04 1
7
Bảng 3.10. Số lượng của Lactobacỉllus acidophilus trên môi trường sữa
đậu nành.
NỒNG
ĐỘ
LẶP LẠI
(N)
X (X
10%
NA NA10 NA15
0
3
3
3
NA2
0
3
15%
NB NB NB15
3
0
3
NB20
3
10
3
20%
NC NC, NC15
O3
03
NC20
3
3
1,0 1,12 I,
1,4
3,6 5,6 7,31 7,99 3,61 6,04 7,59 8,09
93 6
5
0
1010CFÙ/G
37
8
6
3
0,19 0,35 6
0,15
3
9
Qua bảng 3.9 và 3.10 cùng với kết quả xử lý thống kê chúng tôi nhận thấy
nồng độ đậu và hàm lượng đường có ảnh hưởng đến khả năng tạo độ chua và số
lượng tế bào của vi khuẩn L. acidophilus. Độ chua và số lượng đạt cao nhất ở
môi trường NC20. Tuy nhiên sau khi xử lý thống kê cho thấy khơng có sự khác
biệt giữa mơi trường NB15 và NC20 (P = 0,1113) hayNB15 vàNB20 (P = 0,1520).
Như vậy xét về mặt kinh tế ở môi trường NB 15 là môi trường cho hiệu quả kinh
tế cao.
Từ kết quả xử lý ở trên chúng tôi quyết định chọn môi truờng NBi5 làm môi
trường sản xuất chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus.
3.2.3. Kết quả sản xuất thử và kiểm tra chế phẩm chứa Lactobacillus
acidophilus
Bảng 3.11. Số lượng vi khuẩn L. acidophilus sau thời gian bảo quản
Thời gian
Số lượng (xio6
0
38
ngày
10
4,15
ngày
20 ngày
2,83
cfu/g)
Qua bảng 3.11 chúng tôi nhận thấy số lượng vi khuẩn giảm nhiều nhất vào
10 ngày đầu và giảm dần sau thời gian bảo quản.
Thời gian (ngày)
Biểu đồ 3.2. Số lượng vỉ khuẩn Lactobacillus acidophilus sau thời gian
bảo quản
Chế phẩm chứa B. subtiỉis và L. acidophiỉus sau khi đóng gói
Phần 5. KẾT LUÂN VÀ ĐÈ NGHI
••
5.1. KẾT LUẬN
5.1.1. Đối với Bacillus subtilis
Trong số 5 loại môi trường nhân giống cấp 1 là Edward, Nomura, Fragie, Rỉ
đường có bố sung 2% tinh bột và pepton-gelatin, chúng tôi ghi nhận được mơi
trường ri đường có bố sung 2% tinh bột là mơi trường có khả năng cho sinh
khối và hoạt độ enzyme amylase và protease cao nhất, với số lượng tế bào là
19,2 X 109 cfu/ml, hoạt độ amylase là 256 (W0/ml) vàprotease là 128 (Hđp/ml).
Môi trường A là môi trường nhân giống cấp 2 có khả năng cho sinh khối và
hoạt độ enzyme amylase, protease cao nhất, với số lượng tế bào là 345,67xl0 10
cfu/g, hoạt độ amylase là 160 (W0/ml) vàprotease là 80 (Hđp/ml).
Sau khi sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis có số lượng tế bào 589 X
109 cfu/g, hoạt độ amylase là 160 (W0/ml) vàprotease là 80 (Hđp/ml).
Sau thời gian bảo quản 10, 20 và 30 ngày ở nhiệt độ thường chúng tôi nhận
thấy số lượng tế bào có giảm nhưng hoạt độ enzyme amylase và protease không
thay đối.
5.1.2. Đổi với Lactobacillus acidophilus
Trên môi trường sữa đặc có đường, độ chua và số lượng tế bào tăng dần khi
nồng độ sữa tăng dần. số lượng vi khuẩn và độ chua cao nhất ở nồng độ 25%
sữa và có số lượng tế bào 21,96 X 109 cfu/ml và độ chua l,1093g/100ml.
Đối với môi trường sữa đậu nành số lượng và độ chua cao nhất ở môi
trường NB15. Số lượng tế bào 73,1 X 109 cfu/ml và độ chua l,6g/100ml.
Chế phẩm chứa Lactobacỉllus acidophilus sau khi sản xuất có số lượng tế
bào 38 X 106 cfu/g. Sau thời gian bảo quản số lượng tế bào giảm nhanh vào 10
ngày đầu sau đó giảm dần sau thời gian bảo quản.
