Tiểu luận Khảo sát sơ bộ các nhóm chất hữu cơ có trong phong lữ thảo

1

TIỂU LUẬN NGHIÊN CỨU

Khảo sát sơ bộ các nhóm chất hữu cơ
có trong Phong lữ thảo


2

MỤC LỤC


3

1. SƠ ĐỒ THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU
Gồm nghiên cứu mô tả cắt ngang và nghiên cứu thử nghiệm thể hiện qua
sơ đồ thiết kế nghiên cứu sau:

Thẩm định tên khoa học Phong lữ
thảoThu hái, chế biến, bảo quản dược
liệu Phong lữ thảo

Thu thập bọ gậyvà
muỗi Ae.aegypti

Trứng muỗi
Khảo sát sơ bộ các nhóm chất hữu cơ
thân, lá phong lữ thảo
Bọ gậy
Điều chế cao cồn 96%, cao phân đoạn

(n-hexan, ethyl acetat, nước) của cao cồn
96%, cất tinh dầu tổng hợp của thân, lá
Phong lữ thảo

Muỗi trưởng thành
F1

Thử tác dụng xua với
muỗi Ae.aegypti

Đánh giá tác dụng xua
muỗi

Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một
số hợp chất từ mẫu thử có tác dụng xua muỗi


4

Sơ đồ 2.3: thiết kế nghiên cứu
2. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU


Nghiên cứu xác định thành phần hóa học của Phong lữ thảo:

- Thẩm định tên khoa học Phong lữ thảo.
- Thu hái, chế biến, bảo quản Phong lữ thảo
- Khảo sát sơ bộ các nhóm chất hữu cơ thân, lá cây phong lữ thảo
- Điều chế cao cồn 96%, cao phân đoạn (n-hexan, ethyl acetat, nước) của
cao cồn 96%, cất tinh dầu tổng hợp của thân, lá cây Phong lữ thảo.

- Phân lập và xác định cấu trúc các thành phần hóa học trongthân, láPhong
lữ thảo.


-

Nghiên cứu đánh giá một số tác dụng sinh học: Thử và đánh giá tác
dụng xua muỗi với các mẫu thử được điều chế từ thân, lá phong lữ thảo.
Thu thập bọ gậy.
Nuôi bọ gậy.
Nuôi muỗi trưởng thành.
Cho đẻ trứng.
Nuôi bọ gậy F1.
Nuôi muỗi trưởng thành F1 bằng glucose 10 %.
Thử tác dụng xua muỗi với các mẫu thử được điều chế từ thân, lá
phong lữ thảo.

3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.


5

CHƯƠNG 1
1.1. Thẩm định tên khoa học.
- Quan sát và mơ tả đặc điểm hình thái thực vật, điều kiện sinh trưởng và
phát triển của cây Phong lữ thảo tại thực địa.
- Thu hái, làm tiêu bản mẫu cây và lưu giữ tiêu bản.
Xác định tên khoa học của cây trên cơ sở phân tích đặc điểm hình thái
thực vật, so sánh các khóa phân loại của thực vật chí Việt Nam, Trung Quốc
dưới sự hướng dẫn của chuyên gia thực vật.

1.2. Nghiên cứu thành phần hóa học.
1.2.1. Khảo sát sơ bộ các nhóm chất hữu cơ có trong Phong lữ thảo.
- Thực hiện các phản ứng định tính nhóm chất có trong dược liệu bằng các
phản ứng định tính trong ống nghiệm và sắc ký lớp mỏng[1],theo sách Thực tập
Dược liệu (phần định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học) – Bộ mơn
Dược liệu – Trường ĐH Dược Hà Nội.
+ Nhóm Alcanoid : Phản ứng với thuốc thử Mayer.
Phản ứng với thuốc thử Dragendorff.
Phản ứng với thuốc thử Bouchardat.
+ Nhóm Flavonoid: Phản ứng với Cyanidin.
Phản ứng với hơi NH3
Phản ứng với kiềm loãng.
Phản ứng với FeCl3 5%.
+ Nhóm Saponin: Hiện tượng tạo bọt.
Phản ứng Liebermann.
Phản ứng Baljet.
Phản ứng Legal.
Phản ứng Keller – Kiliani.
+ Nhóm Coumarin : Phản ứng mở đóng vịng lacton.


6

+ Nhóm Tanin : Phản ứng với FeCl3 5%.
Phản ứng chì acetat 10%.
+ Nhóm Anthranoid: Phản ứng Borntrager.
+ Nhóm Acid hữu cơ: Phản ứng với Na2CO3.
+ Nhóm đường khử: Phản ứng với thuốc thử Felling A và B.
+ Nhóm chất béo: vết mờ trên giấy lọc.
+ Nhóm Sterol: Phản ứng Salkopski

Phản ứng Liberman.
+ Nhóm Caroten: Với H2SO4 đặc.
+ Polysaccharid: với thuốc thử Lugol.
+ Acid amin: Với thuốc thử Nihydrin.
+ Định lượng tinh dầu:
Dược liệu đã xác định độ ẩm. Tinh dầu được tách ra bằng phương pháp cất kéo
hơi nước, hàm lượng tinh dầu tính theo cơng thức sau:
HLT.D(%)=
Trong đó:

a: số ml tinh dầu thu được.
A: Khối lượng dược liệu đem định lượng.
X: Hàm ẩm của dược liệu

Kết quả được xử lý theo phương pháp thống kê.[5]
1.2.2. Chiết xuất, phân lập các hợp chất trong cây Phong lữ thảo.
- Chiết xuất các hoạt chất trong dược liệu bằng cồn công nghiệp. Cất
thuhồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn cồn toàn phần.
- Chiết xuất phân đoạn từ dịch chiết cồn tồn phần bằng các dung mơi có
độ phân cực tăng dần (n-Hexan, Ethyl acetat), thu được các phân đoạn tương
ứng, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình phân lập các chất.


7

- Phân lập các hợp chất trong mẫu cao dược liệu bằng sắc kí cột với chất
hấp phụ là silica gel, cỡ hạt 0,04 - 0,063mm hoặc sắc ký điều chế.Theo dõi các
phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng.
+ SKLM được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G
F254(Merck) (silica gel, 0.25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F 254 (Merck, 0,25

mm). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại có hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc
dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol.
+ Phân tích các phân đoạn bằng SKLM để lựa chọn dung môi phù hợp cho
việc phân tách các chất bằng sắc ký cột.
+ Sắc ký cột được tiến hành với chất phụ là silica gel pha thường (0,0400,063mm, Merck) vàsilica gel pha đảo YMC (30-50µm, FuJisilisa Chemical
Ltd.). Theo dõi các phân đoạn bằng SKLM.
- Xác định cấu trúc các chất phân lập được bằng việc phân tích các đặc
điểm hóa lý (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy) và dựa trên số liệu các phổ: phổ
hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân
(NMR).

Phong lữ thảo (thân, lá)

+Chiết 3 lần với EtOH 96%
+ Cất thu hồi dung môi.

Cao tổng


8

Bổ sung nước
Lắc với n-hexan

Bổ sung nước

Cao n-hexan
Dịch nước

Lắc với EtOAc

Cao nước
Cao EtAc

Chạy cột tinh chế

Chất tinh khiết
Sơ đồ 3.2:thiết kế nghiên cứu chiết xuất và phân lập chất tinh khiết từ thân, lá
củaPhong lữ thảo
CHƯƠNG 2
2.1. Nghiên cứu thử tác dụng xua muỗi Aedes aegypti.
2.1.1. Kỹ thuật thu thập muỗi và bọ gậỵ


Kỹ thuật thu thập muỗi:

-Tay phải cầm ống nghiệm, tay trái cầm đèn pin ( nơi sáng không cần đèn) đi nhẹ
nhàng để muỗi khỏi bay. Vừa đi vừu rọi đèn pin vào tường để soi muỗi. Đèn
thường cách tường 30cm, chiếu qua chiếu lại tránh kích thích ánh sáng trực tiếp
vào muỗi. Khi thấy muỗi, tay cầm ống nghiệm bằng ngón tay cái và ngón giữa
úp nhanh ống nghiệm lên muỗi, theo phản xạ muỗi bay vào ống. Lấy ít bơng để
lên miệng ống.Mỗi ống nghiệm chừng 4-5 con. Khi miếng bông cuối cùng cách


9

miệng ống 2 cm. Ghi nhãn: Địa điểm bắt, thời gian bắt ( giờ, ngày, tháng), người
bắt:
-Vị trí bắt muỗi:
+ Tùy theo đặc điểm sinh lý, sinh thái: sinh địa cảnh, vật chủ thích hợp,

nơi trú ẩn tiêu máu, nơi rình mồi để hút máu…của từng lồi muỗi mà xác định vị
trí bắt muỗi.
+ Thường tìm bắt muỗi ở nơi tối, ẩm như ngầm giường, ngầm tủ, ngầm
cầu thang, hay trong chuồng gia súc hoặc các lùm cây rậm rạp quanh nhà, bờ
rào, nơi kìn gió và có nước.
+ Có thể bắt muỗi khi muỗi mới nở từ quăng, muốn vậy phải bắt từ 5-6
giờ, tìm bắt muỗi trên mặt nước ở các vũng nước dụng cụ chứa nước.
-Dung mồi để bắt muỗi:
+ Mồi người: có thể bắt muỗi ở trong nhà hoặc ngồi nhà, thường mồi ở
những nơi kín gió. Người ngồi và vén quần lên trên đầu gối, tay cầm đèn pin soi
bắt muỗi.
+ Mồi động vật: Mắc màn trên một tấm ván hoặc tấm đan..nhốt động vật
vào lồng (khỉ, chuột…) đặt lồng vào trong màn và vén của màn lên cho muỗi
bay vào đốt động vật. Buông màn xuống bắt muỗi trong màn.


Kỹ thuật thu thập bọ gậy:

+Dùng đèn pin soi vào trong các DCCN và vợt bọ gậy. Lật ngược vợt ra khay
men có chứa nước sẵn để bắt. Dùng ống hút để hút bọ gậy tập trung vào lọ. Điều
tra bọ gậy ở hốc cây, hốc đá khó dùng vợt thì dùng ống hút có quả bóp cao su dài.
Hút nước trong hốc cây ra, đổ vào khay men để tìm bọ gậy.
+ Dùng vợt và ống hút thu thập bọ gậy, lăng quăng ở tất cả các DCCN trong nhà
và quanh nhà.
+ Cho bọ gậy bắt được vào bình nước sạch.
- Kỹ thuật ni bọ gậy:
+ Cho bọ gậy vào bocan chứa nước, đặt trong lồng có phủ màn che.
+ Cho thức ăn ni bọ gậy vào trong nước.

10

+ Chờ bọ gậy phát triển thành muỗi trưởng thành và đẻ trứng, phát triển thành bọ
gậy thế hệ F1, rồi thành muỗi thế hệ F1.
- Kỹ thuật nuôi muỗi:
+ Muỗi thế hệ F1 được bắt cho vào lồng nuôi muỗi.
+ Cho muỗi hút máu chuột nhắt trắng. [3]
2.1.2. Kỹ thuật thử tác dụng xua.
- Kỹ thuật tiến hành:
+Chuẩn bị muỗi: Muỗi cái (chọn muỗi cái dựa vào đặc điểm hình thể bên
ngồi) khoẻ, đủ chân, cánh, bay bình thường, cho vào lồng để muỗi ở nơi yên tĩnh
30 phút.
+ Bôi dược chất xua vào tay trái (từ cổ tay đến hết bàn ngón tay), thường có
2 người: một người theo dõi và một người thử.
+ Người thử cho hai tay vào lồng muỗi, tay trái có thuốc, tay phải đối chứng
( khơng có thuốc).
+ Mỗi khi cho đậu vào tay ( kể cả tay có thuốc hay tay ko có thuốc) người
thử nghiệm tung tay cho muỗi bay đi, người theo dõi đếm số muỗi đậu vào tay
và ghi vào sổ.
+ Mỗi giờ thử 15 phút, sau đó cả người và muỗi đều nghỉ, cứ tiếp tục cho
đến khi muỗi đậu vào hai tay bằng nhau là thuốc hết tác dụng.
Trên thực địa, có thể hai người cùng thử, một chân xoa thuốc ( xoa đều ra
cổ chân ra mu và ngón chân), một chân đối chứng khơng xoa thuốc. Khi nào có
số muỗi đốt hai chân ngang nhau thì thuốc hết tác dụng.
Để đánh giá tác dụng của muỗi mỗi loại thuốc theo giờ thử nghiệm, tính kết
quả theo hệ số giảm đốt K (Gladkix S.G, 1964).
K=×100
K: hệ số giảm đốt (%).
a: số muỗi đậu vào tay, chân khơng có thuốc.
b: số muỗi đậu vào tay, chân có thuốc.

Nếu K = 100%
: tác dụng của thuốc xua muỗi rất tốt.
K ≥ 50%
: có tác dụng xua muỗi.
K< 50%
: khơng có tác dụng xua.[3]
2.6. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU.


11

Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh học,
sử dụng công cụ Data analysis của Microsoft Excel.
-

Kết quả thí nghiệm được hiển thị bằng trị số trung bìnhcộng/trừ độ lệch

-

chuẩn (M ± SE).
Đánh giá, so sánh thống kê giữa các lơ thí nghiệm bằng phương pháp T testStudent. Sự khác nhau có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
3.1. THẨM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC.
- Tiến hành thu hái mẫu đầy đủ thông tin về cây, hoa, lá, cành để giám định tên
khoa học của dược liệu nghiên cứu.
- Văn bản xác định tên khoa học.
3.2. NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC.
3.2.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong thân,lá cây Phong lữ
thảo bằng phản ứng hóa học.

3.2.2. Các cao chiết xuất cồn 96% và cao phân đoạn của dịch chiết cồn 96%
từ thân,lá cây Phong lữ thảo, tinh dầu tổng.
3.2.3. Phân lập và xác định cấu trúc một sốhợp chất trong mẫu thử có tác
dụng xua muỗi thân, lácây Phong lữ thảo.
3.3. NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC.
- Thử tác dụng xua muỗi của các mẫu thử được điều chế từthân, lá câyPhong
lữthảo.
3.4. BÀN LUẬN.
3.4.1. Về việc chọn đề tài và mục tiêu của đề tài.
Phong lữ thảo có tên khoa học là Pelargonium hortorum Bailey thuộc họ
Mỏ hạc (Geraniaceae), theo các tài liệu cho thấy ở nước ta Phong lữ thảo chưa
được nghiên cứu ở góc độ y học hiện đại cả tác dụng dược lý và thành phần hóa
học cũng như khơng có ghi nhận nào chú ý một số tính chất rất độc đáo là Phong


12

lữ thảo khơng những là cây hoa đẹp lại có thể làm sạch mơi trường đất có kim
loại nặng và có tác dụng xua đuổi muỗi, làm thuốc trị viêm tai giữa…Nhu cầu
đặt ra là cần có những nghiên cứu có giá trị khoa học để làm sáng tỏ thành phần
hóa học, tác dụng sinh học và giá trị sử dụng của cây thuốc này.
Kiểm soát muỗi là một vấn đề quan trọng trong thời đại ngày nay với số
lượng ngày càng tăng của các bệnh truyền qua muỗi. Trong lịch sử thế giới,
nhiều người đã chết vì các bệnh lây truyền qua muỗi hơn tất cả các cuộc chiến
tranh.Bệnh sốt xuất huyết Dengua ở Việt Nam ngày càng gia tăng trong những
năm gần đây, vai trò truyền bệnh chủ yếu là muỗiAedes aegypti. Trong khi đó,
vấn đề kiểm sốt và phòng chống muỗi đã chứng minh là hiệu quả cao trong
phòng chống các bệnh truyền qua muỗi.[15]
Việc sử dụng các dược chất được chiết xuất từ thực vật đã thực sự có
tác dụng trong phịng chống muỗi, hơn nữa chúng lại không độc cho người, động

vật và môi trường. Để góp phần phịng chống muỗi và các bệnh do muỗi truyền
chúng tôi tiến hành đề tài:“Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng
xua đuổi muỗi Aedes aegypticủa Phong lữ thảo (Pelargonium hortorum Bailey)”.
Để góp phần vào những nghiên cứu sâu rộng về thành phần hóa học và tác dụng
sinh học của cây Phong lữ thảo.
3.4.2. Về thẩm định tên khoa học.
Về tên khoa học:Phong lữ thảocó tên khoa học là Pelargonium hortorum
Bailey thuộc họ Mỏ hạc (Geraniaceae). Cây thường trồng với tên trên là loài lai
củaloài thứ nhất là Pelargonium zonale L’ Hérit. Ex Soland vàloài thứ hai là
Pelargonium inquinans Ait.Từ hai loài được trồng này, người ta đã tạo ra lồi lai
có dạng màu của lồi thứ nhất, có hoa gần với loại thứ hai, ra hoa gần như liên
tục trong mùa khô. Bây giờ thì sự lai giống đã đến khó phân biệt sự gần gũi với
tổ tiên nào hơn. Do vậy , hiện nay có nhiều nịi khác nhau do lai tạo.[2]


13

Tuy nhiên theo “ Từ điển cây thuốc Việt Nam” Võ Văn Chi thì đưa ra tên
cây là Phong lữ có tên khoa học là Pelargonium hortorum Bailey thuộc họ
Phong lữ (Geraniaceae). Các tài liệu tôi tham khảo chủ yếu là tài liệu về lồi
Pelargonium hortorum Bailey.
3.4.3. Về hóa học.
- Về định tính: Sơ bộ xác định nhóm hoạt chất chính có trong thân , lá của
cây Phong lữ thảobằng phương pháp hóa học [1]. Ưu điểm của phương pháp đơn
giản, dễ thực hiện, cho kết quả nhanh.
- Điều chế các mẫu thử để thử tác dụng xua muỗi từ đó làm cơ sở để phân
lập một số hợp chất chính trong mẫu thử có tác dụng nhằm định hướng sau này
nghiên cứu sâu hơn tạo sản phẩm ứng dụng trong xã hội.
3.4.4. Về tác dụng sinh học.
- Kết hợpvới phần nghiên cứu hóa học để tìm kiếm phân đoạn có hoạt tính

cũng như hợp chất chính từ phân đoạn có hoạt tính định hướng cơ sở cho các
nghiên cứu ứng dụng sau này.

KIẾN NGHỊ VỀ VIỆC NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
-

Nghiên cứu quy trình phân lập các chất đã tìm ra với hiệu suất cao .
Tiến hành thử tác dụng dược lý của chất đã phân lập được.


14

Tiếp tục nghiên cứu xác định thành phần hóa học của cây Phong lữ thảo và

-

tiến hành thử tác dụng dược lý của các chất phân lập được từ Phong lữ thảo.
-

Nghiên cứu chiết xuất nhóm hoạt chất có tác dụng sinh học và phối hợp với

-

một số dược liệu để bào chế dạng cream xua đuổi côn trùng. .
Nghiên cứu, chế tạo ra phương pháp pha chế thuốc, đo lường khả năng có
thể gây chết, tiến hành những thí nghiệm về hiệu quả diệt trừ côn trùng gây
hại ở những giai đoạn phát triển khác nhau của chúng, so sánh, đối chiếu với
các thuốc có tính năng xua đuổi côn trùng khác hiện đang được bán trên thị
trường,

THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU.
Kế hoạch triển khai.

1.1.

TT

Thời gian

1

8/2015 - 10/2015

2

9/2015 - 01/2016

Nội dung công việc

Dự kiến địa điểm
nghiên cứu
Viết đề cương và bảo vệ -Trung tâm đào tạo
đề cương.
nghiên cứu Dược, Học
viện Quân y.
Trồng cây, chăm sóc, thu - Trung tâm đào tạo
hái, chế biến và nghiên nghiên cứu Dược, Học


15

cứu về thực vật.

3

10/2015
04/2016

4

01/2016
06/2016

5

01/2016
10/2016

– Nghiên cứu thành phần
hóa học, chiết xuất hợp
chất tự nhiên có tác dụng
xua muỗi trong dược
liệu.
– Nghiên cứu đánh giá tác
dung xua đuổi muỗi.

- Trung tâm đào tạo
nghiên cứu Dược, Học
viện Quân y.
- Viện Dược liệu TW.

-Trung tâm đào tạo
nghiên cứu Dược, Học
viện Quân y.
-Khoa Ký sinh trùng –
côn trùng, Học viện
Quân y.
– Viết luận văn và bảo vệ - Học viện quân y.
luận văn.

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1)
2)

viện Quân y.
- Trường Đại học Dược
Hà Nội.

TS. Phạm Văn Minh.
TS. Hoàng Việt Dũng.