Phương pháp sắc kí lỏng cao áp

2/8/12
1
S!C K" L#NG
HI$U N%NG CAO
HIGH PERFORMANCE
LIQUID
CHROMATOGRAPHY
N&I DUNG
•  Ngun t!c
•  Các b" ph#n c$a HPLC
•  %ng d&ng c$a HPLC
1. NGUN T!C
•  Là phương pháp tách dựa trên 2 quá trình
•  * Hấp phụ
•  * Giải hấp phụ
•  Xảy ra liên tục giữa 2 pha:
•  * Pha tónh : thường là rắn hoặc lỏng
•  * Pha động : chất lỏng (một chất hoặc hỗn
hợp nhiều chất)
2. CÁC B& PH'N C(A HPLC
•  Ngu'n cung c(p pha )"ng
•  B*m cao áp
•  B" ph#n b*m m+u vào máy (b,ng tay/t- )"ng)
•  C"t s!c k.
•  /0u dò
•  B" ph#n ghi tín hi1u
2/8/12
2
Heä thoáng HPLC
Bình ch)a dung môi
gi*i ly c+t

2.1. Ngu,n cung c-p pha .+ng
2/8/12
3
Kh2 khí (degas)
•  M&c )ích: lo3i tr4 các b5t khí còn sót l3i
trong dung mơi pha )"ng
•  N6u pha )"ng còn sót b5t khí:
–  T7 l1 pha )"ng khơng )úng 8 th9i gian l:u
thay );i
–  B*m khơng hút ):<c dung mơi
2.1. Ngu,n cung c-p pha .+ng (tt)
•  Dung mơi dùng cho HPLC: h=n h<p 2 ho>c 4 lo3i
–  N:?c, )1m, methanol (MeOH), acetonitril (ACN), …
–  /" tinh khi6t cao (HPLC grade solvent), khơng l+n
b&i b@n, kh2 khơng khí (He, siêu âm, )
•  2 kiAu s2 d&ng pha )"ng trong vi1c giBi ly:
–  GiBi ly )*n n'ng )" (isocratic elution): lo3i và t7 l1
dung mơi khơng thay );i
–  GiBi ly n'ng )" tCng d0n tuy6n tính (gradient elution):
tính phân c-c c$a pha )"ng ):<c thi6t k6 )A tCng d0n
lên t4 t4 )Du )>n
Gradient trong sắc ký lỏng

•  Là sự thay đổi thành phần pha động trong quá trình
chạy theo những đònh hướng cụ thể
•  Mục đích :
– Nhằm tăng cường khả năng tách của các chất trên
cột.
•  Nguyên nhân :
•  + nhiều chất không thể tách được trên cột tách với

một thành phần pha động (do tương tác của các chất
cần tách với pha động và pha tónh giống nhau)
•  + Nếu thay đổi thành phần pha động: tương tác giữa
chất phân tích và pha tónh, pha động sẽ thay đổi. Vì
vậy sẽ tách được các chất.
2/8/12
4
BBng: m"t sE dung môi và tính ch(t c$a chúng
Tên dung môi Nhi/t .+
sôi (
0
C)
0+ nh1t
(mN.S.m
-2
)
B21c sóng h-p
thu UV (nm)
Pentan 36 0.24 210
Cyclohexan 69 0.98 210
Tetraclorua
carbon
77 0.97 265
Toluen 111 0.59 286
Diethyl ether 35 0.25 218
Chloroform 62 0.57 245
Dichloromethane 40 0.44 235
Tetrahydrofuran 66 0.55 220
N:?c 100 1.0 -
BBng: m"t sE dung môi và tính ch(t c$a chúng (tt)

Tên dung môi Nhi/t .+
sôi (
0
C)
0+ nh1t
(mN.S.m
-2
)
B21c sóng h-p
thu UV (nm)
2 – butanon 80 0.32 330
Acetone 56 0.32 330
1,4 – dioxan 107 1.44 215
Ethyl acetate 77 0.45 255
Diethylamine 115 0.33 275
Acetonitril 82 0.37 190
2 – propanol 82 2.50 210
Ethanol 78 1.20 210
Methanol 64 0.59 210
2/8/12
5
2.2. B*m cao áp
•  M&c )ích: b*m pha )"ng (dung môi) )i
xuyên ngang pha tFnh (c"t)
•  Ch(t li1u chGu ):<c dung môi hHu c*
•  3000 – 7000 psi ho>c 250 – 500 at (1 at =
0.98 bar)
•  B*m phBi t3o dòng liên t&c
•  L:u l:<ng b*m: 0.1 – 9.999 mL/phút
(th:9ng 0.5 – 4.0mL/phút)

2.3. B" ph#n tiêm m+u vào c"t
•  Ing chJa m+u (sample loop)
•  Dung tích c$a loop: 5 – 100 KL
•  Th$ công/t- )"ng
2.4. C"t s!c k. (pha tFnh)
•  N*i xBy ra quá trình phân tách
•  Thép không rL dài 10 – 30 cm, ø
trong
: 1 –
10mm

•  Di1n tích bêM m>t: 50-250 m
2
/g

•  Nguyên li1u nh'i c"t: h3t có l= r=ng siêu nhN
(microporous particle) v?i kích th:?c, d3ng và
)" r=ng khác nhau
– Silica: h3t có kích th:?c nhN, di1n tích bD m>t
l?n (200 – 300 m
2
/g) và chGu )-ng ):<c áp
su(t t:*ng )Ei cao
• Silica gel (pha thu#n)/silica gel )ã ):<c
silan hóa (pha )Bo)
– Alumine, zirconium, nguyên li1u trao );i ion
2.4. C"t s!c k. (pha tFnh) (tt)
2/8/12
6
2.4. C"t s!c k. (pha tFnh) (tt)

•  Ch(t có MW nhN (<500Da):
– Di1n tích bD m>t: 200 – 400 m
2
/g
– Kích th:?c l=: 50 – 100 Å
•  Protein, polysaccharide:
– O 300 Å
2.4. C"t s!c k. (pha tFnh) (tt)
2.4.1.Nguyên t!c c$a quá trình
s!c k. trong c"t

•  /Ei v?i m=i ch(t, s- l:u giH ):<c qui )Gnh
bPi 3 l-c F1, F2 và F3. trong )ó, F1 và F2
giH vai trò quy6t )Gnh, còn F3 là y6u tE Bnh
h:Png không l?n
•  F1: l-c giH ch(t phân tích trên c"t
•  F2: l-c kéo c$a pha )"ng )Ei v?i ch(t phân
tích ra khNi c"t
Ch!t phân tích A +B+C
Pha t"nh
Pha #$ng
F2
F3
F1

2/8/12
7
•  Nh: v#y, v?i các ch(t khác nhau thì F1 và
F2 là khác nhau nên sQ di chuyAn trong c"t
v?i tEc )" khác nhau và tách ra khNi nhau

khi ra khNi c"t
•  n6u n3p m+u phân tích g'm h=n h<p ch(t
phân tích A, B, C,… vào c"t phân tích thì
các ch(t A, B, C,… sQ ):<c tách ra khNi
nhau sau khi )i qua c"t
Minh h%a quá trình tách các ch!t A và B trong
c$t tách s&c k'


Th(i gian A
B
Pha
#$ng
2.4.1.Nguyên t!c c$a quá trình
s!c k. trong c"t
•  Pha tFnh là ch(t h(p ph&: s!c k. h(p ph& pha
thu#n ho>c pha )Bo
•  Pha tFnh là ch(t trao );i ion: s!c k. trao );i
ion
•  Pha tFnh là ch(t lNng: s!c k. phân bE/chi6t
•  Pha tFnh là gel: s!c k. gel/rây phân t$
Lo3i c+t Tính ch-t c4a h5p ch-t có th6
phân tích
C"t pha th:9ng, pha
)Bo, pha t3o nEi
MW < 2000, không mang )i1n tích,
phân c-c ho>c không phân c-c, hòa
tan trong dung môi hHu c*/n:?c
C"t trao );i ion MW < 2000, mang )i1n tích, hòa tan
trong n:?c

C"t s!c k. gel MW nhN ho>c l?n, không mang )i1n
tích, hòa tan trong dung môi hHu c*/
n:?c
2/8/12
8
2.4.2. C+t pha thu7n
(normal phase)
•  HPLC pha thu#n: s!c k. h(p ph&
– Pha )"ng: không phân c-c (hexane,
methylene chloride),
Pha tFnh phân c-c
– C* ch6 tách ch(t: phân bE các phân t2 ch(t
tan giHa dung dGch và s- h(p thu lên trên bD
m>t pha tFnh
•  Nguyên li1u nh'i c"t (s!c k. r!n lNng): silica
gel, alumni, graphite,…
2.4.2. C+t pha thu7n
(normal phase)
Phân tích các nhóm ch(t
•  Vitamin tan trong d0u (A, D, E, K)
•  Polyphenol
•  Carbohydrate
•  …
2.4.3. C"t pha )Bo
(reverse phase)
•  Silica ):<c bi6n );i thành d3ng không phân
c-c b,ng cách g!n các chu=i hydrocarbon
dài t4 8-18C.
•  Dung môi phân c8c: th29ng là h:n h5p
c4a n21c và m+t alcohol (methanol),

ACN, …
•  Các ch(t có c-c sQ di chuyAn nhanh h*n các
ch(t không c-c, do )ó sQ thoát ra ngoài c"t
tr:?c.
Reverse Phase Chromatography
Core Bead
Silica or Copolymer
Hydrocarbon Phase Coating
Hydrocarbon Phase Coating
can be different chain lengths
usually 18C, 8C or 2C
OH
OH
OH
OH
Free -OH groups
on Silica
2/8/12
9
Reverse Phase Chromatography
C 18
C 2 / C 18
End Capped
C 8
C 2
Strongly
Hydrophobic
Mildly
Hydrophobic
Weakly

Hydrophobic
How does it work?
C 4
Phân tích các nhóm ch(t
•  Protein th-c v#t
•  Vitamin: tan trong d0u và n:?c
•  Lipid
•  Ch(t chEng oxy hóa
•  H<p ch(t th*m (vanillin), s!c tE (carotenoid,
chlorophyll, anthocyanin)
2.4.3. C"t pha )Bo
(reverse phase)
2.5. /0u dò (detector)
•  B" ph#n phát hi1n các ch(t khi chúng ra khNi
c"t )A có thA )Gnh tính và )Gnh l:<ng
A = k.C
Trong )ó: A: tín hi1u )o ):<c
C: n'ng )" ch(t phân tích
K: h,ng sE th-c nghi1m c$a detector
)ã ch5n
•  Tín hi1u có thA là: )" h(p th& quang, c:9ng
)" phát x3, c:9ng )" hi1u )i1n th6, )" d+n
)i1n, )" d+n nhi1t,…
2/8/12
10
•  M=i lo3i )0u dò có 1 nguyên t!c ho3t )"ng
khác nhau, nh:ng )Du phBi )3t )6n m&c
)ích cuEi cùng b,ng m"t tín hi1u )i1n t2 và
tín hi1u này phBi tL l1 v?i m"t sE tính ch(t
c$a ch(t phân tích

–  VD: mJc h(p thu UV, chL sE khúc x3,…
•  MJc )" )áp Jng c$a )0u dò tL l1 v?i sE
l:<ng m=i ch(t phân tích hi1n di1n trong
h=n h<p m+u
2.5. /0u dò (detector) (tt)
/0u dò l. t:Png
•  /" bDn cao, không làm h: h3i m+u phân tích
•  Có )" nh3y cao và cho k6t quB có tính l>p lai
(reproducible)
•  Cho )áp Jng t:*ng )'ng )Ei v?i nhHng ch(t
phân tích có c(u trúc t:*ng )'ng
•  Không thay );i khi có s- thay );i nhi1t )" ho>c
áp su(t
•  Có th9i gian )áp Jng ng!n, )"c l#p v?i v#n tEc
dòng chBy c$a dung môi giBi ly
•  DR s2 d&ng
Phân lo3i )0u dò
•  Theo dõi 1 tính ch(t hóa h5c )>c tr:ng c$a các
ch(t (dung môi giBi ly không có tính ch(t này),
phát hi1n s- hi1n di1n c$a ch(t tan trong dòng
chBy: UV, huSnh quang
•  Theo dõi s- hi1n di1n c$a 1 khEi v#t ch(t trong
dung môi giBi ly: chL sE khúc x3, h,ng sE )i1n
môi
•  …
2.5.1. /0u dò )o h(p thu tia t2
ngo3i (ultraviolet detector)
•  H1 thEng )0u dò = ngu'n sáng + thi6t bG l-a
ch5n b:?c sóng + Eng quang )i1n (phototube)
+ Eng chJa dung dGch m+u phân tích

2/8/12
11
2.5.1. /0u dò )o h(p thu tia t2
ngo3i (ultraviolet detector) (tt)
•  Lúc khPi )0u: ):9ng nDn = 0
•  Dung môi mang ch(t phân tích: ch(t phân
tích h(p thu UV khi6n cho s- h(p thu c$a
dòng dung môi thay );i, Eng quang )i1n
làm xu(t hi1n m"t peak trên s!c k. )'
2.5.1. /0u dò )o h(p thu tia t2
ngo3i (ultraviolet detector) (tt)
•  Nh:<c )iAm:
– M"t sE lo3i h<p ch(t h(p thu UV kém:
barbiturat, thuEc tr4 sâu
– /Gnh lu#t Beer-Lambert có gi?i h3n, chL
tuy6n tính trong khoBng hTp vD n'ng )"
2.5.2. /0u dò m3ng diod quang
(photodiode array spectrophotometer)
•  Quét (scanning) m"t cách liên t&c quang ph;
h(p thu c$a m"t ch(t phân tích )ang hi1n di1n
trong dòng chBy c$a dung môi giBi ly
2/8/12
12
Toàn ph; ánh sáng sau khi )i xuyên ngang qua Eng chJa
m+u ):<c 1 máy nhiRu x3 ánh sáng toàn ph; tán x3 thành
nhHng b:?c sóng )*n, các b:?c sóng )*n này ):<c t#p
trung vào 1 m3ng diod quang (m=i diod nh#n 1 b:?c
sóng khác nhau, )" phân giBi 1,2nm)
Khi tia sáng truyDn )6n diod quang, nhHng dòng )i1n
MiliA ):<c phát sinh

2.5.3. /0u dò phát huSnh quang
(flourescence detector)
•  H(p thu bJc x3 c$a 1 b:?c sóng và h1 quB là
phát ra bJc x3 có b:?c sóng dài h*n có tính
phát huSnh quang
2.5.3. /0u dò phát huSnh quang
(flourescence detector)
•  H(p thu bJc x3 c$a 1 b:?c sóng và h1 quB là
phát ra bJc x3 có b:?c sóng dài h*n có tính
phát huSnh quang
–  EtBr, Acridine orange, flourescein, clorua dansyl
•  Nh3y h*n )0u dò UV, có thA phát hi1n h<p ch(t
P hàm l:<ng 1ng/ml
•  Có tính ch5n l5c cao h*n (chL cho peak khi m+u
phân tích là h<p ch(t huSnh quang)
•  Vitamin, aflatoxin, hydrocarbon th*m
2.5.4. /0u dò chL sE khúc x3
(Refractive index detector)
•  ChL sE khúc x3 = v#n tEc ánh sáng trong chân
không/v#n tEc ánh sáng trong môi tr:9ng
•  >1
2/8/12
13
•  1 tia sáng )i ngang qua 2 Eng, ):<c cho t#p
trung vD 1 m>t phUng nh3y sáng. Khi cB hai
ngCn chJa )Du có chJa pha )"ng tinh khi6t, vG
trí c$a tia t?i trên bD m>t cBm quang ):<c xem
nh: là )iAm )Ei chJng (=0)
•  Khi pha )"ng chJa h<p ch(t giBi ly v4a ra khNi

c"t, chL sE khúc x3 c$a 1 ngCn chJa sQ thay );i,
tia sáng bG l1ch và tia khúc x3 c$a nó sQ ch3m
)6n m>t phUng nh3y sáng P 1 vG trí khác, làm
cho bút ghi vQ 1 tín hi1u
2.5.4. /0u dò chL sE khúc x3
(Refractive index detector) (tt)
•  Vu )iAm:
– Thông d&ng vì t(t cB các h<p ch(t )Du có
chL sE khúc x3 )>c tr:ng riêng (tính ch(t
v#t l. c$a h<p ch(t), vì v#y hi6m khi g>p
tr:9ng h<p m"t dung dGch chJa h=n h<p
h<p ch(t mà không ghi ):<c tín hi1u nào
– Không làm h: h3i m+u phân tích
2.5.4. /0u dò chL sE khúc x3
(Refractive index detector) (tt)
•  Nh:<c )iAm
– /" nh3y trung bình (1ppm m+u trong
dung môi)
– Không phân tích ):<c h<p ch(t P d3ng
v6t
– Nh3y cBm v?i s- thay );i nhN vD nhi1t )"
– Không s2 dung gradient dung môi
– …
2/8/12
14
2.5.4. /0u dò chL sE khúc x3
(Refractive index detector) (tt)
Phân tích các nhóm ch(t
•  carbohydrate
•  lipid

 
RI UV/VIS Fluor MS
Response Universal Selective Selective Selective
Sensitivity
4
microgram
5 nanogram 3 picogram 1 picogram
Linear
Range
10 10 10 10
Flow
Sensitive
Yes No No Yes
Temp.
Sensitive
Yes No No No
L;A CH<N DETECTOR
2.6. B" ph#n ghi tín hi1u
•  Th6 h1 cW: vQ s!c k. )', th9i gian l:u, S
peak
,
chiDu cao peak
•  Th6 h1 m?i: ph0n mDm l:u thông sE: tính
)Ei xJng, h1 sE phân giBi, x2 l., tính toán
theo yêu c0u
CHXN /IYU KIZN S[C K\
2/8/12
15
CHXN /IYU KIZN S[C K\
•  C"t

•  Pha )"ng
•  Lo3i detector
•  ThA tích b*m m+u
•  Nhi1t )", )" nh3y c$a detector, b:?c sóng
phân tích
C"t s!c k.
C"t s!c k.
•  Lo3i pha tFnh
–  C"t pha thu#n
–  C"t pha )Bo
–  …
•  Kích th:?c c"t
C"t s!c k. (tt)
•  C"t pha thu#n: silica gel trung tính
2/8/12
16
C"t s!c k. (tt)
•  C"t pha thu#n: silica gel trung tính
–  Dùng )A tách các ch(t không phân c-c hay ít
phân c-c
–  BD m>t ho3t )"ng có chJa các nhóm –OH phân
c-c :a n:?c
–  VD: c"t Lichrosorb Si40, Si60
–  Pha )"ng: dung môi không phân c-c (methanol,
benzen,…)
C"t s!c k. (tt)
•  C"t pha )Bo: silicagel )ã alkyl hóa
C"t s!c k. (tt)
•  C"t pha )Bo: silicagel )ã alkyl hóa
–  Tách các ch(t không phân c-c, ít phân c-c, các

ch(t phân c-c có thA t3o c>p ion
–  Trên bD m>t ho3t )"ng: các nhóm –OH )ã bG
alkyl hóa (thay th6 -H b,ng m3ch C thUng/
vòng)
–  VD: c"t Lichrospher RP 8
–  Pha )"ng: dung môi phân c-c (MeOH, ACN,
n:?c, dung dGch )1m, h=n h<p dung môi-)1m)
Pha )"ng
2/8/12
17
Pha )"ng
•  Thành ph0n và t7 l1, pH, tEc )" dòng, nhi1t
)",… n6u là ch:*ng trình r2a giBi isocratic
•  Thành ph0n và t7 l1, pH, tEc )" dòng, nhi1t
)", và ch:*ng trình dung môi… n6u là
ch:*ng trình r2a giBi gradient
Pha .+ng ph*i th=a các yêu c>u
•  Tr* v?i pha tFnh
•  Hòa tan ):<c các ch(t phân tích (phBi r2a
c"t b,ng dung môi phù h<p )A không làm
t$a các ch(t có trong c"t/pha )"ng có s]n
trong c"t)
–  VD: )1m phosphate r2a ngay b,ng ACN hay
MeOH sQ gây k6t t$a trên c"t
•  PhBi bDn vHng theo th9i gian
•  Có )" tinh khi6t cao
•  Nhanh )3t cân b,ng trong quá trình s!c k.
Pha .+ng ph*i th=a các yêu c>u
•  PhBi phù h<p v?i lo3i )0u dò
–  VD: dung môi không ):<c h(p th& quang n6u

s2 d&ng UV-VIS
3. ?NG D@NG C(A HPLC
•  Tách acid nucleic
•  Tách các d:<c ph@m
•  Tách các steroid
•  Tách các vitamin
•  Tách các ch(t bBo v1 th-c v#t
•  Tách các ch(t bBo quBn th-c ph@m
•  Tách các hydrocarbon d0u mN
•  Acid amin, các ch(t d^o hóa, phenol,
sulfonat hHu c*, glucyde,…
2/8/12
18