Công nghệ sinh học hiện đại (lai phân tử)

PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ


NỘI DUNG
I. CƠ SỞ CỦA SỰ LAI PHÂN TỬ
II. CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ
1. Lai trong pha lỏng
2. Lai trong pha rắn
3. Lai tại chỗ
III. TỔNG KẾT KHÁI QUÁT VỀ 3 PHƯƠNG PHÁP LAI

2


I
CƠ SỞ CỦA SỰ LAI PHÂN TỬ


1. Khái niệm về “nhiệt độ nóng chảy” của DNA
- Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên một
nhiệt độ vượt q “nhiệt độ nóng chảy” (Tm) thì hai
mạch sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết
hydro nối liền hai mạch.

Đường cong TM
4


2. Các nhân tố ảnh hưởng đến “nhiệt độ nóng chảy” của DNA

- Ảnh hưởng của các thành phần base trong phân tử DNA

- Ảnh hưởng của độ dài đoạn DNA
- Ảnh hưởng của các điểm bắt cặp sai lệch
- Ảnh hưởng của môi trường phản ứng

5


3. Khái niệm về lai phân tử

- Sau khi hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau dưới tác động của Tm, sự bắt cặp sẽ không xảy ra nếu nhiệt độ
phản ứng hạ xuống đột ngột.
- Lúc đó phân tử DNA sẽ tồn tại trong môi trường ở dạng mạch đơn dưới một cấu hình khơng gian vơ trật tự.
Ngược lại, nếu sau khi hai mạch tách rời, nhiệt độ được giảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, hai
mạch sẽ bắt cặp trở lại.
-> Hiện tượng này được gọi là sự lai phân tử (molecular hybridization).

6


4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lai phân tử

- Nồng độ DNA và thời gian phản ứng
- Nhiệt độ
- Độ dài của trình tự
- Lực ion

7


II

CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ


“

Các phương pháp lai phân tử rất đa dạng, cơ bản có
thể chia thành 3 nhóm lớn :
- Lai trong pha lỏng
- Lai trên pha rắn
- Lai tại chỗ

9


1. Lai trong pha lỏng
a. Nguyên tắc:
- Các trình tự bổ sung (các mạch đơn) nằm trong môi trường lỏng là 1 dung dịch đệm.
- Sự lai phân tử này chỉ xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ
môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ.

10


b. Phân tích định lượng các phân tử lai:
- Có 3 phương pháp thường dùng
+ Phương pháp dùng quang phổ kế
+ Phương pháp dùng Nuclease S1
+ Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite

11

DNA mạch đôi hấp thu ánh
sáng yếu hơn DNA mạch đơn

PHƯƠNG PHÁP
DÙNG QUANG
PHỔ KẾ

Hiệu ứng siêu sắc

12


Là 1 enzyme có khả năng thủy
giải các nucleic acid mạch đơn

PHƯƠNG PHÁP
DÙNG NUCLEASE
S1
Sản phẩm: oligonucleotides hoặc
nhóm nucleotides 5’ phosphoryl

13


Là những tinh thể phosphate
calci

PHƯƠNG PHÁP

SẮC KÍ TRÊN
HYDROXYLAPATI
TE
Sử dụng các mồi đánh dấu để
lai với DNA, RNA hoặc các
Protein

14


c. Các ứng dụng của phương pháp lai trong dung dịch:
- Tính được tỉ lệ % các trình tự giống nhau ở 2 lồi gần nhau.
- Phân tích các trình tự lặp lại.
- So sánh kích thước các bộ gen khơng chứa trình tự lặp lại.
* Ưu và nhược điểm của lai trong pha lỏng:
- Ưu điểm: hiệu quả của q trình lai cao, q trình phân tích và định lượng các phân tử lai chính xác.
- Nhược điểm: quy trình làm phức tạp, khó thực hiện; khó tách các phân tử lai ra khỏi q trình; có thể xảy ra sự tái bắt cặp
giữa hai mạch của cùng một phân tử.

15


2. Lai trên pha rắn
a. Nguyên tắc:
- Cùng nguyên tắc với lai trên pha lỏng.
- Điểm khác biệt là 1 trong 2 trình tự bổ sung (trình tự đích, trình tự cần tìm) được
cố định trên một giá thể rắn (màng nitrocellulose hay nylon).

16

* Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp lai trên pha rắn:
- Ưu điểm: + Thao tác dễ dàng.
+ Tách trực tiếp ADN hay ARN gốc ở dung dịch thuốc thử.
+ Ngăn sự tái bắt cặp giữa 2 mạch của cùng một phân tử.
- Nhược điểm: + Phân tích định lượng các phân tử lai kém chính xác.
+ Hiệu quả thấp.
+ Vận tốc lai trên pha rắn < 10 lần so với vận tốc lai

trên pha lỏng do một phần các nucleic acid được cố

định trên giá thể bị che khuất, khơng tiếp xúc được với các trình tự bổ sung.

17


b. Ứng dụng của các phương pháp lai trên pha rắn:
- Lai trên pha rắn có rất nhiều ứng dụng, hiện nay có 4 phương pháp cơ bản đó là:
+ Southern blot
+ Northern blot
+ Western blot
+ Dot (slot) blot
- Nổi bật lên 3 phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất là phương pháp Southern, Northern và Dot blot.

18


* SOUTHERN BLOT:

Mục đích

Phương pháp này dùng để định vị những trình tự đặc biệt trên DNA
bộ gen, hay những DNA kích thước nhỏ như DNA plasmid, phage,…

19

Sơ đồ lai Southern blot.


Các bước thực hiện Sounthern Blot

20


* NORTHERN BLOT:

Mục đích :
nhằm xác định kích thước và hàm lượng của
1 mRNA đặc trưng trong 1 hỗn hợp RNA.

21

Sơ đồ lai Northern blot


Các bước thực hiện Northern Blot

Bước 1: tách chiết và biến tính
Bước 2: thẩm tích
Bước 3: lai với mẫu dị (probe) có đánh dấu phóng xạ
Bước 4: phóng xạ tự chụp

22


* WESTERN BLOT:

Là quá trình proteinprotein kết hợp đặc
hiệu với nhau. Thường sử dụng Antibody
protein có gắn phóng xạ hoặc gắn lưu
huỳnh để phát hiện protein

Mục đích : dùng để phát hiện protein

23

Sơ đồ lai WESTERN BLOT


24


SOUTHERN BLOT

ĐIỂM KHÁC NHAU CỦA
3 PHƯƠNG PHÁP
NORTHERN BLOT

WESTERN BLOT

25