Đề cương ôn tập môn Công nghệ sinh học thực vật

ĐỀ CƯƠNG ÔN TẬP MÔN CÔNG NGHỆ
SINH HỌC THỰC VẬT
1. Kỹ thuật vi nhân giống cây trồng

- Nuôi cấy mô là q trình ni cấy vơ trùng invitro các bộ phận tách rời của thực
vật nhằm: nhân giống và cải thiện di truyền, sản xuất sinh khối cho các sản phẩm
hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo vệ những nguồn gen quý…
- Nhân giống invitro còn gọi là vi nhân giống là kỹ thuật được sử dụng trong q
trình ni cấy các bộ phận của thực vật trong điều kiện vơ trùng ở ống nghiệm
hoặc bình chứa.
- Vi nhân giống có điều kiện:
+ Có mảnh cắt nhỏ của thực vật.
+ Sạch vi sinh vật.
+ Được nuôi cấy vô trùng.
1. Các phương pháp nuôi cấy mô thực vật.
+ Ni cấy đỉnh phân sinh.
+ Phát sinh phơi vơ tính
+ Tạo mô sẹo (callus).
+ Nuôi cấy lát mỏng.
+ Vi ghép trong nhân giống.
+ Nuôi cấy túi phấn.
+ Nuôi cấy và dung hợp protoplast ở thực vật.
+ Chuyển nạp gen thực vật.


a. Ni cấy đỉnh phân sinh.
Q trình sinh trưởng gồm 3 giai đoạn:
1. Giai đoạn phôi sinh: trong các mô phân sinh đỉnh hình thành mầm cơ quan và sự
phân chia đầu tiên để tạo nên mô riêng biệt
2. Giai đoạn sinh trưởng: do q trình sinh trưởng nhanh chóng nên mầm cơ quan
đạt đến kích thước tối đa và trở nên hình dạng xác định.

3. Giai đoạn phân hóa tế bào: hóa gỗ vách tế bào. Các u lá xuất hiện, sau đó phát
triển thành mầm lá,
Ở mỗi nách lá đều có chồi nách. Chồi nách thực chất có cấu tạo khơng khác đỉnh
sinh trưởng của thân.
Q trình tổng hợp DNA của virus thực vật không xảy ra trong đỉnh sinh trưởng do
một số cơ chế không rõ. Nên mô đỉnh sinh trưởng là mô duy nhất sạch virus trong
một cây nhiễm virus. Do vậy, kỹ thuật này giúp cây con sạch virus.
Do vùng mô phân sinh quá nhỏ, kỹ thuật tách đỉnh sinh trưởng được thực hiện
dưới kính lúp. Các đỉnh sinh trưởng kích thước 0,1 đến 0,15mm sẽ tạo ra được
100% số cây con sạch bệnh và tỷ lệ này giảm dần đến kích thước 1 mm.
Mẫu càng nhỏ thì càng khó tái sinh cây con và khả năng sống sót cũng giảm.
Kích thước thường được sử dụng là 0.2 đến 1mm.
Ngoài ra, xử lý nhiệt cũng giúp loại bỏ virus ở đỉnh phân sinh. Hoặc một số hóa
chất diệt virus trong mơi trường ni cấy như ribavirein.


Khi tạo đủ rễ, cây con có thể dùng làm nguyên liệu để tạo dòng sạch bệnh phục vụ
cho sản xuất.
Môi trường nuôi cây: Cytokinin 0.05 – 0.5 mg/l, Auxin: 0.01 – 0.1mg/l.
b. Nuôi cấy mô thực vật bằng cách phát sinh phơi vơ tính.
- Phát sinh phơi vơ tính là q trình tạo phơi từ tế bào và mơ soma trong các hệ
thống nuôi cấy Invitro.
- Giai đoạn 1: chọn cây giống có vật liệu ni cấy thích hợp: tạo callus, tạo huyền
phù tế bào hoặc tạo protoplast.
- Giai đoạn 2: Cảm ứng khả năng tạo phôi trong các tế bào nuôi cấy
+ Chuyển tế bào cần cảm ứng vào mơi trường ni cấy có nồng độ auxin cao.
Loại Auxin thường dùng là 2,4-D hoặc hỗn hợp sữa dừa với nồng độ thấp NAA.
+ Sau 1, 2 tuần tế bào tiền phơi xuất hiện. Sau đó khối tế bào lớn lên, tiền phơi lớn
có thể chuyển sang mơi trường phân hóa. Các tế bào nhỏ hơn có thể cấy chuyền để
tiếp tục sản xuất phơi vơ tính.

- Giai đoạn 3: Phân hóa và sự thành thục của phơi vơ tính.
Sau khi tạo phơi vơ tính trong mơi trường auxin cao thì chuyển qua mơi trường
phân hóa có Nito cao và khơng chứa auxin. Phơi vơ tính xuất hiện từ các tế bào
đơn trong khối tế bào nuôi cấy, phát triển tính phân cực và tiếp theo là giống như
quá trình tạo phơi bình thường. Ta có thể bổ sung acid abscisic vào mơi trường sẽ
làm tăng tính đồng nhất và đẩy mạnh sự phát triển bình thường của phơi.
- Giai đoạn 4: Tạo cây con: Các phơi vơ tính thành thục sẽ được đưa lên thạch
khơng có chứa auxin nhưng có chứa cytokinin nồng độ thấp để tái sinh cây con
hoàn chỉnh.
- Giai đoạn 5: Đưa cây con ra vừa ươm. Sau khi có đầy đủ bộ phận: lá, rễ. Cần đưa
cây ra vườn ươm và chăm sóc như những cây con khác.
c. Nuôi cây mô thực vật bằng phương pháp tạo mô sẹo (callus).
- Mô sẹo: là khối tái sinh vô tổ chức từ mẫu.
2,4-D để trong tối dễ hình thành mơ sẹo.
- Khối Callus:


+ Tốc độ phân chia của tế bào lúc đầu là rất chậm, phải cần sự hỗ trợ của auxin
(tạo rễ).
+ Phase phân chia tế bào lại rất nhanh cùng với sinh tổng hợp nhanh chóng DNA,
RNA, Protein.
+ Tiếp theo ngừng từ từ tốc độ phân chia tế bào.
+ Phase phân hóa thành tế bào nhu mơ và tế bào mơ dẫn.
- Tỷ lệ Cytokinin/Auxin biễn diễn cho q trình tạo chồi/rễ của mơ sẹo. Nếu tỷ lệ
bằng nhau thì vừa tạo chồi và vừa tạo rễ.
d. Nuôi cấy mô thực vật bằng nuôi cấy lát mỏng.
e. Nuôi cấy mô thực vật bằng phương pháp vi ghép.
f. Nuôi cấy mô thực vật bằng phương pháp nuôi túi phấn.
g. Nuôi cấy và dung hợp protoplast ở tế bào thực vật.
Protoplast là tế bào mất đi lớp vỏ cellulose bằng cách xử lý dưới enzyme

cellulase. Nó chỉ cịn màng sinh chất bao quanh chất ngun sinh.
Lai vơ tính là q trình lai hai protoplast thành 1 nhờ PEG hoặc dung hợp nhờ
xung điện. Q trình này có thể hấp thu đại phân tử DNA, RNA, Protein, virus, vi
khuẩn, các cơ quan tử.
h. Chuyển gen ở Thực vật
- Nhờ VK Agrobacterium.
- Đặc điểm: vi khuẩn hình que, gram âm, có nhiều trong đất.
+ Họ Rhizobiaceae: tạo khối u ở thực vật.
+ Họ A. Rhizogenes: gây bệnh rễ tóc.
- Sinh học phân tử:
+ Có Plasmid Ti ở họ Rhizobiaceae có chiều dài từ 120 – 150 kb. Quyết định đặc
tính gây u. Trong khi đặc tính tương tự có ở Plasmid Ri ở họ A. Rhizogenes gây rễ
tóc.
+ Một phần DNA của Plasmid Ti và Ri được gọi là DNA T hay gọi là DNA vận
chuyển. Nó sẽ được gắn vào bộ gen của bộ gen thực vật sẽ làm xuất hiện khối u


hoặc rễ tóc. Nhờ đặc tính này mà chúng ta có thể ứng dụng plasmid Ti và Ri làm
vector chuyển gen để thay đổi tính trạng di truyền của thực vật mà chúng ta muốn.
3. Các phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật
- Nuôi cấy mô tế bào là tách rời tế bào thực vật trong môi trường dinh dưỡng tựa
như cơ thể sống, giúp tế bào phân chia, biệt hóa thành mơ, cơ quan, tăng trưởng
thành cây hồn thiện. Những kỹ thuật này dùng để nuôi cấy những tế bào, mô hay
những cơ quan thực vật trong điều kiện vô trùng.
- Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô
đều là các thuật ngữ miêu tả những cách thức nuôi cấy những bộ phận thực vật
trong ống nghiệm cùng môi trường và điều kiện vô trùng. Môi trường trong ống
nghiệm có chứa những thành phần dinh dưỡng như muối khống, vitamin, những
hormone sinh trưởng và đường.
Cơng cụ dùng trong q trình ni cấy mơ tế bào thực vật

Để ni được mơ tế bào thực vật thì địi hỏi phải có phịng ni cấy với điều kiện
mơi trường vơ trùng và một vài điều kiện thiết yếu theo mỗi giống cây giống khác
nhau.
Phịng ni cấy mơ cần có tủ cấy và một vài dụng cụ thủy tinh như: Ống đong,
pipet, bình tam giác, cốc thí nghiệm, ống nghiệm, lọ thủy tinh, phễu, bình đun mơi
trường.
Cơng cụ sử dụng trong ni cấy gồm có: Dao, kéo, phanh, đĩa cấy, … Hết thảy đều
làm từ thép không gỉ, chiều dài tùy vào độ dài của bình và ống nghiệm ni cấy.
Những cơng cụ được khử trùng bằng nồi hấp tiệt trùng hay đốt nóng kỹ trước lúc
sử dụng.
Mọi cơng cụ dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật phải đảm bảo đạt tiêu chuẩn,
có nguồn gốc, xuất xứ rõ ràng.
Những bước, quy trình ni cấy mơ tế bào thực vật
Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy


Chọn cây mẹ đạt chuẩn cây giống để làm nguyên liệu nhân giống. Chú ý chọn cây
mẹ có các phẩm chất vượt trội, sạch bệnh và hơn hết nên chọn cây trồng trong nhà
kính hay cây được trồng theo tiêu chuẩn đặc biệt.
Thời điểm chọn mẫu cấy: Lấy vào giai đoạn tăng trưởng mạnh nhất của cây mẹ.
Tạo thể nhân giống in vitro
Mẫu nuôi được cấy trong môi trường đặc biệt để tạo thể nhân giống in vitro. Gồm
hai thể nhân giống in vitro: Thể chồi, thể cắt đốt. Tạo thể nhân giống in vitro căn
cứ theo đặc điểm nhân giống ngồi tự nhiên của cây trồng.
Nhân giớng in vitro
Nhân giống mẫu cấy từ các thể chồi. Môi trường nuôi cấy thông thường giống với
môi trường tạo thể chồi, thỉnh thoảng nồng độ chất tăng trưởng giảm thấp để phù
hợp cho quá trình nhân giống kéo dài. Cây nhân giống in vitro có tình trạng sinh lý
trẻ và được duy trì trong thời gian vơ hạn.
Tái sinh cây hồn chỉnh in vitro

Cây giống cấy mô được nuôi dưỡng và tăng trưởng trong ống nghiệm cho đến lúc
đủ tiêu chuẩn về kích thước và đặc tính để có thể tăng trưởng tốt trong điều kiện tự
nhiên.
Chuyển cây con in vitro sang vườn ươm
Cây con cấy mô đạt yêu cầu về chiều cao, rễ lá phát triển hoàn chỉnh sẽ được đưa
đi thuần dưỡng trong nhà lưới nhằm thích nghi với mơi trường tự nhiên.