GIẢI TRÌNH TỰ DNA DNA SEQUENCING

GIẢI TRÌNH TỰ DNA
DNA SEQUENCING

TS. BS. Đỗ Thị Thanh Thủy


1. GIẢI TRÌNH TỰ DNA
Giải trình tự DNA là một thí nghiệm cho kết
quả thứ tự sắp xếp các nucleotide trong
đoạn DNA đó.
Vd:
5’CGGCTAGCAGTCTCGCGGGGGCACGCCCAAATCTC
CAGGCATTGAGCGGGTTTGATCCAAGAAAGGACCCGG
TCGTCCTGGCAATTCCGGTGTACTCACCGGTTCCGCA
GACCACTATGGCTCTCCCGGGAGGGGGGATCCTGGA
GGCTGCACGACACTCATACTAACGCCATGGCTAGACG
CTTAATAGAACAANAAA3’


2. HAI PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ DNA
Phương pháp hố học giải trình tự DNA
của Maxam & Guilbert (1977)
Nobel hóa học 1980 (phương pháp giải trình tự)
Walter Gilbert

Phương pháp enzyme giải trình tự của
Frederick Sanger (1977)
Nobel hố học 1958 (cấu trúc protein: Insulin)
Nobel hóa học 1980 (phương pháp giải trình tự)

2.1. GIẢI TRÌNH TỰ DNA BẰNG PP HĨA HỌC
1. Đánh dấu một đầu của đoạn DNA bằng gốc phospho
đồng vị phóng xạ (32P).
2. Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu 32P bằng hóa chất làm
biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide
trên đoạn DNA



32P

ATCG

32P

ATCGCCAG

32P

ATCGCCAGTTG

32P

ATCGCCAGTTGTACCAG

Sau khi xử lý bằng
piper

Trình tự gen ban
đầu

32P

ATC

32P

ATCGCCA

32P

ATCGCCAGTT

32P

ATCGCCAGTTGTACCA


Tập hợp kết quả thu được ở tất cả các ống nghiệm,
thu được các đoạn polynucleotid dài ngắn hơn kém
nhau 1 nucleotid, từ đó xác định được trình tự của
DNA mạch khuôn.


3. Điện di mẫu DNA đã xử lý trong 4 ống nghiệm này trên 4
hàng của một gel polyacrylamide biến tính

Autoradiography

2.2. GIẢI TRÌNH TỰ DNA BẰNG PP ENZYM
Dựa trên nguyên tắc dùng enzyme polymerase để tạo
sợi bổ sung từ mồi cho sợi khn, nhưng do trong
ống phản ứng có thêm các ddNTP, nên mỗi khi men
polymerase kéo nhầm ddNTP vào thì sợi bổ sung sẽ
bị chặn lại và kết quả là sẽ có các sợi bổ sung với độ
dài khác nhau.

dNTP

ddNTP


Mồi được đánh dấu

Bốn phản ứng polymer hoá
xảy ra trong 4 ống riêng biệt

Tỉ lệ dNTP và ddNTP
= 100 : 1


2.2 Phương pháp Sanger


2.2 Phương pháp Sanger

ddTTP

MỒI ĐÁNH DẤU PHÓNG XẠ P35
A
T

Sequence 5’ to 3’
C
G
G
G
C
G
T

C

G
T
3’
C
G
C
A
G
T
C
C
T
A
G
C

T
T
A
G
C
G
G 5’

Áp gel điện di lên phim (mồi đánh dấu bằng phóng
xạ hay bằng hoá quang), các vạch điện di trên gel
sẽ hiện trên phim.


ĐÁNH DẤU ddNTP
Automated sequencer
1. Gắn ddNTP ngẫu
nhiên, khi xảy ra,
p/ứng ngừng.
2. Vì nhiều copy của
DNA đích được tạo
đồng thời, nên các
sản phẩm DNA
được tổng hợp mới
của tất cả các kích
thước đều hiện diện
với tận cùng là các
ddNTP

Sequence-specific
primer

GIẢI TRÌNH TỰ BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN

1. Dùng gel polyacrylamide biến
tính, có độ phân giải cao, có
thể phân biệt các đoạn DNA
khác nhau chỉ 1 nucleotid.
2. Gel polyacrylamide thường
chứa urea (tác nhân làm biến
tính DNA)


3. KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ
Bước 1: Tinh sạch sản phẩm PCR loại bỏ nucleotide,
primer thừa

Sản phẩm PCR
On to sequencing….

PCR
+ DNA đích
+ Taq polymerase
+ Mồi và dNTPs
+ PCR buffer, etc….

Sản phẩm PCR tinh sạch
+ nước

Đo nồng độ DNA bằng máy:

Size (kb)/10 = concentration (ug/ul)
hay ước lượng qua điện di


Bước 2: Phản ứng chu kỳ giải trình tự
(cycle sequencing reaction)

denaturation

Product
extension

Primer annealing

PCR machine

Tủa sản phẩm giải trình tự
loại bỏ ddNTP thừa
(BigDye Terminator Kit)


Bước 3: Điện di trên máy giải trình tự
1. Mỗi ddNTP được gắn một màu khác nhau.
2. Sản phẩm PCR được phân loại dựa trên kích
thước (khác nhau 1 nt), khi chạy qua khu vực
phát hiện sẽ được phân tích nhờ chùm tia laser
và bộ phận detector.
3. Dữ liệu được ghi nhận gồm cường độ huỳnh
quang thu được và màu sắc của mỗi đoạn DNA.
4. Trình tự của đoạn DNA được đọc theo chiều 5’

đến 3’, từ trái sang phải.




Automated DNA Sequencing with Fluorescent Dyes

Mỗi ddNTP có một màu khác nhau, ddTTP đỏ, ddGTP đen,…


4. HIỆU QUẢ P/ỨNG GIẢI TRÌNH TỰ
1. Tối ưu hóa phản ứng PCR phải thật sự hoàn chỉnh
2. Chất lượng và nồng độ DNA đích
3. Mồi đặc hiệu với nồng độ thích hợp
4. Sản phẩm PCR phải tinh sạch
5. Phải xác định đúng hàm lượng mồi và sản phẩm
PCR tinh sạch cho p/ứng chu kỳ giải trình tự


Hệ thống giải trình tự Trugene
Siemens Medical Solutions Diagnostics


CEQ 8000 (Beckman Coulter)


CÁC HỆ THỐNG GIẢI TRÌNH TỰ TỰ ĐỘNG

ABI 3130

ABI 3130 XL

4 Cappilaries

16 Cappilaries


ABI 3730


5. PYROSEQUENCING
Mostafa Ronaghi và Pal Nyrén tại Royal Institute of Techology ở Stockholm 1990s.

Peaks in pyrogram reflect nucleotide sequence

=pyrophosphate

= pyrophosphate

Giải trình tự bằng phương pháp tổng hợp, khơng điện di
~500 MB on one plate, in just a few hours.