Nghiên cứu một số đặc tính sinh học và tối ưu điều kiện nuôi cấy kích thích chủng bacillus licheniformis sinh tổng hợp đa enzyme (amylase, cellulase, protease) cao

LỜI CẢM ƠN!
Trong suốt quá trình thực hiện đề tài này em đã nhận đƣợc những sự giúp
đỡ nhiệt tình từ thầy giáo viên hƣớng dẫn, các chị, các bạn cùng gia đình. Để có
đƣợc kết quả nhƣ ngày hơm nay, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Vũ
Văn Hạnh – ngƣời đã trực tiếp chỉ bảo, hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi
nhất trong suốt q trình thực hiện đề tài này.
Bên cạnh đó em cũng xin gửi lời cảm ơn đến TS. Vũ Kim Dung đã tạo điều
kiện cho em đƣợc thực tập Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn Lâm Khoa Học
và Cơng nghệ Việt Nam. Cơ đã tận tình giải đáp những thắc mắc, những khó khăn
trong suốt q trình em thực hiện đề tài.
Cũng xin gửi lời cám ơn đến các chị, các bạn hiện là cán bộ công nhân viên
chức thuộc phòng các chất chức năng sinh học – Viện Công nghệ sinh học – Viện
Hàn Lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ, tận tình chỉ bảo tạo điều
kiện thuận lợi cho em hồn thành khóa luận tốt nghiệp.
Em cũng xin cám ơn gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ, là chỗ dựa vức
chắc cho em an tâm thực hiện đề tài này.
Do thời gian có hạn, năng lực cịn nhiều hạn chế nên khó tránh khỏi
những thiếu sót. Vì vậy, em kính mong nhận đƣợc sự chỉ bảo và những ý kiến
góp ý của q thầy cơ, bạn bè và bạn đọc để bài báo cáo đƣợc hoàn thiện hơn.
Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2018
Giáo viên hƣớng dẫn
PGS.TS Vũ Văn Hạnh

Sinh viên thực hiện


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
B. licheniformis

Bacillus licheniformis

CS

Cộng sự

VN

Việt Nam

DD

Dung dịch

MT

Môi trƣờng

KĐT

Khơ đậu tƣơng

KLTN

Khóa luận tốt nhiệp

PTN

Phịng thí nghiệm

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cơ chế tác động của amylase lên tinh bột

5

Hình 1.2. Cơ chế tác động của cellulase lên endocellulose

8

Hình 1.3. Vi khuẩn B.licheniformis (A) và trong giai đoạn bào tử (B)

18

Hình 1.4. Khuẩn lạc B. licheniformis hình thành trong mơi trƣờng
thạch máu trên đĩa peptri
Hình 1.5. Khuẩn lạc B. licheniformis hình thành trong mơi trƣờng
thạch đĩa (nhiệt độ 22oC)

19

Hình 1.6. Khuẩn lạc B. licheniformis hình thành trong mơi trƣờng
thạch đĩa (nhiệt độ 37oC)

20

Hình 3.1. Khuẩn lạc B. licheniformis hình thành trong mơi trƣờng
thạch LB.

37

Hình 3.2. Hình dạng tế bào của chủng B.licheniformis

37

Hình 3.3. Kết quả đo giá trị mật độ quang (OD) của glucose ở bƣớc
sóng 540nm

38

Hình 3.4. Kết quả đo giá trị mật độ quang (OD) của cellulose ở bƣớc
sóng 540nm

38

Hình 3.5. Kết quả đo giá trị mật độ quang (OD) của tyrosine ở bƣớc
sóng 660nm

39

Hình 3.6. Ảnh hƣởng độ ẩm (%) và giống (%) đến hàm lƣợng amylase

41

Hình 3.7. Ảnh hƣởng độ ẩm (%) và giống (%) đến hàm lƣợng cellulase

42

Hình 3.8. Ảnh hƣởng độ ẩm (%) và giống (%) đến hàm lƣợng protease

42

Hình 3.9. Mẫu thu môi trƣờng HT sau lên men theo từng giờ

45

Hình 3.10. Vịng phân giải tinh bột của amylase thu trên MT HT
nồng độ pha lỗng 500, 1000, 2000 lần

46

Hình 3.11. Vòng phân giải CMC của cellulase thu trên MT HT nồng
độ pha lỗng 500, 1000, 2000 lần

46

Hình 4.2. Vịng phân giải casein của protease thu trên MT HT nồng
độ pha loãng 500, 1000, 2000, 3000 lần

46

19


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

25

Bảng 2.2. Tỉ lệ bổ sung các chất dựng đƣờng chuẩn glucose

30

Bảng 2.3. Tỉ lệ bổ sung các chất dựng đƣờng chuẩn maltose

31

Bảng 2.4. Tỉ lệ bổ sung các chất dựng đƣờng chuẩn tyrosine

31

Bảng 2.5. Tỉ lệ bổ sung các chất dung xác định hoạt độ amylase

32

Bảng 2.6. Tỉ lệ bổ sung các chất dùng xác định hoạt độ cellulase

32

Bảng 2.7. Ảnh hƣởng tỉ lệ cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp đa
enzyme

33

Bảng 2.8. Ảnh hƣởng của nguồn muối khoáng đến khả năng sinh tổng
hợp đa enzyme

34

Bảng 2.9. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng
hợp đa enzyme

35

Bảng 2.10. Ảnh hƣởng sau khi sấy đến hàm lƣợng enzyme

35

Bảng 3.1. Ảnh hƣởng tỉ lệ cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp đa
enzyme

40

Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của nguồn muối khoáng đến khả năng sinh tổng
hợp đa enzyme

44

Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng
hợp đa enzyme

44

Bảng 3.4. Ảnh hƣởng sau khi sấy đến hàm lƣợng enzyme

45

Bảng 3.5. Số lƣợng khuẩn lạc thu đƣợc sau khi nuôi cấy ở các nồng độ 47
tƣơng ứng

1

MỤC LỤC
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU.............................................................5
1.1. Tổng quan về enzyme...................................................................................................... 5
1.1.1. Giới thiệu về enzyme................................................................................................ 5
1.1.1.1. Giới thiệu về amylase.............................................................................................5
1.1.1.2. Giới thiệu về cellulase............................................................................................6
1.1.1.3. Giới thiệu về protease............................................................................................ 6
1.1.2. Tính chất................................................................................................................... 7
1.1.2.1. Tính chất amylase.................................................................................................. 7
1.1.2.2. Tính chất cellulase................................................................................................. 7
1.1.2.3. Tính chất protease.................................................................................................. 8
1.1.3. Ứng dụng.................................................................................................................9
1.1.3.1. Ứng dụng amylase................................................................................................. 9
1.1.3.2. Ứng dụng cellulase.................................................................................................9
1.1.3.3. Ứng dụng protease............................................................................................... 10
1.1.4. Nguồn thu nhận enzyme......................................................................................... 10
1.1.4.1. Nguồn thu nhận amylase......................................................................................11
1.1.4.2. Nguồn thu nhận cellulase.....................................................................................11
1.1.4.3. Nguồn thu nhận protease......................................................................................12
1.1.5. Một số môi trƣờng ni cấy kích thích vi sinh vật sinh enzyme (amylase,
cellulase, protease)............................................................................................................13
1.1.6. Một số nghiên cứu về enzyme (amylase, cellulase, protease) trên thế giới và trong
nƣớc 15
1.1.6.1. Nghiên cứu enzyme amylase............................................................................... 15
1.1.6.2. Nghiên cứu enzyme cellulase...............................................................................16
1.1.6.3. Nghiên cứu enzyme protease............................................................................... 16
1.2. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus licheniformis...............................................................17
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu về loài......................................................................................17

1.2.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố.......................................................................... 17
1.2.3. Đặc điểm hình thái.................................................................................................. 17
1.2.4. Bào tử và khả năng tạo bào tử.................................................................................18
1.2.4.1. Bào tử...................................................................................................................18
1.2.4.2. Khả năng tạo bào tử............................................................................................. 18
1.2.5. Đặc điểm sinh hóa...................................................................................................19
1.2.6. Bộ gen..................................................................................................................... 21


1.2.7. Bệnh học................................................................................................................. 21
1.2.8. Ứng dụng.................................................................................................................22
CHƢƠNG II. MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................24
2.1. Mục tiêu nghiên cứu.......................................................................................................24
2.2. Nội dung nghiên cứu......................................................................................................24
2.3. Vật liệu nghiên cứu........................................................................................................ 24
2.3.1. Vi sinh vật................................................................................................................... 24
2.3.3. Hóa chất.................................................................................................................. 24
2.3.4. Thiết bị và dụng cụ..................................................................................................25
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu...............................................................................................25
2.4.1. ...............................................................................................................................25
2.4.1.1. Phƣơng pháp hoạt hóa B. licheniformis...............................................................26
2.4.1.2. Phƣơng pháp giữ giống và bảo quản...................................................................26
2.4.1.3. Phƣơng pháp nhuộm Gram..................................................................................26
2.4.2. Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc..............28
2.4.3. Nghiên cứu sinh tổng hợp đa enzyme từ chủng B. licheniformis........................... 29
2.4.4. Phƣơng pháp thu nhận, chiết tách và xác định hoạt tính enzyme.......................... 29
2.4.5. Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng của các yếu tố lí hóa, dinh dƣỡng đến khả
năng sinh tổng hợp enzyme của chủng Bacillus licheniformis.........................................33
2.4.6. Phƣơng pháp thu thập và xử lý số liệu................................................................... 35
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................................... 37

3.1. Một số đặc điểm sinh học của Bacilus licheniformis..................................................... 37
3.2. Ảnh hƣởng của các yếu tố tới quá trình sinh tổng hợp enzyme.................................... 38
3.2.1. Dựng đƣờng chuẩn................................................................................................. 38
3.2.1.1. Dựng đƣờng chuẩn glucose.................................................................................38
3.2.1.2. Dựng đƣờng chuẩn maltose.................................................................................38
3.2.1.3. Dựng đƣờng chuẩn tyrosine................................................................................ 39
3.2.2. Ảnh hƣởng của các yếu tố đến sinh tổng hợp enzyme...........................................39
3.3. Xác định mật độ tế bào bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc...........................................47
CHƢƠNG IV. KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ.............................................................................. 48
4.1. Kết luận.......................................................................................................................... 48
4.2. Kiến nghị........................................................................................................................48
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................................3


LỜI MỞ ĐẦU
Trong lĩnh vực cơng nghệ sinh học thì công nghệ sản xuất enzyme là một
ngành khá quan trọng. Enzyme là chất xúc tác sinh học không những xúc tác cho
các phản ứng xảy ra trong cơ thể sống, mà sau khi tách khỏi hệ thống sống, ở
những điều kiện nhất định chúng vẫn giữ đƣợc những hoạt tính xúc tác (Phạm Thị
Trân Châu và cs, 2007). Vì vậy, việc nghiên cứu và ứng dụng các sản phẩm của
enzyme đã đƣợc rất nhiều quốc gia triển khai, đặc biệt là các nƣớc phát triển nhƣ
Mỹ, Đức, Nga, Trung Quốc... đã đem lại lợi nhuận rất lớn. Ở Việt Nam, công nghệ
enzyme đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vức nhƣng chƣa thực
sự phát triển. Các sản phẩm thƣơng mại có nguồn gốc enzyme vẫn chủ yếu theo
con đƣờng nhập nội vào VN với giá thành rất cao. Enzyme amylase, cellulose và
protease là nhóm enzyme đƣợc ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực nhƣ
công nghệ sản xuất rƣợu bia, công nghệ thực phẩm, y học, sản xuất thức ăn chăn
ni… Vai trị chủ yếu của enzyme amylase, cellulase, protease chính là thủy
phân tinh bột, cellulose và thủy phân liên kết peptide trong protein. Những
enzyme này đƣợc trích ly từ các nguồn động vật, thực vật, vi sinh vật, vừa mang

nguồn gốc tự nhiên vừa không độc với con ngƣời nên rất đƣợc ƣa chuộng và sử
dụng rộng rãi. Trong ba nguồn kể trên sản xuất enzyme từ vi sinh vật là tối ƣu
hơn cả, nguồn gốc dễ kiếm, dễ phân lập, số lƣợng tăng nhanh trong một thời gian
ngắn, môi trƣờng tăng sinh sản xuất enzyme dễ kiếm, rẻ tiền (Nguyễn Đức
Lƣơng, 2008). Do đó tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu một số đặc tính sinh học
và tối ưu điều kiện ni cấy kích thích chủng Bacillus Licheniformis sinh tổng
hợp đa enzyme (amylase, cellulase, protease) cao” nhằm tạo nguồn sản phẩm
enzyme dồi dào, có chất lƣợng tốt phục vụ cho chăn nuôi.


CHƢƠNG I. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Tổng quan về enzyme
1.1.1. Giới thiệu về enzyme
Enzyme (hay còn gọi là men) là chất xúc tác sinh học có thành phần cơ bản
là protein.
Trong quá trình sống của sinh vật xảy ra rất nhiều phản ứng hóa học, với
một hiệu suất rất cao, mặc dù ở điều kiện bình thƣờng về nhiệt độ, áp suất, pH. Sở
dĩ nhƣ vậy vì nó có sự hiện diện của chất xúc tác sinh học đƣợc gọi chung là
enzyme. Nhƣ vậy, enzyme là các protein xúc tác các phản ứng hóa học. Trong các
phản ứng này, các phân tử lúc bắt đầu của quá trình đƣợc gọi là cơ chất, enzyme
sẽ biến đổi chúng thành các phân tử khác nhau. Tất cả các quá trình trong tế bào
đều cần enzyme. Enzyme có tính chọn lọc rất cao đối với cơ chất của nó. Hầu hết
phản ứng đƣợc xúc tác bởi enzyme đều có tốc độ cao hơn nhiều so với khi khơng
đƣợc xúc tác. Có trên 4000 phản ứng sinh hóa đƣợc xúc tác bởi enzyme. Hoạt
tính của enzyme chịu tác động bởi nhiều yếu tố. Chất ức chế là các phân tử làm
giảm hoạt tính của enzyme, trong khi yếu tố hoạt hóa là những phân tử làm tăng
hoạt tính của enzyme.
1.1.1.1. Giới thiệu về amylase
Amylase là một hệ Enzyme rất phố biển trong thế giới sinh vật. Các
enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử

trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nƣớc (Trần Bích Lam và cs, 2009).

Hình 1.1. Cơ chế tác động của amylase lên tinh bột


Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và
dextrin. Các enzyme amylase có trong nƣớc bọt (cịn đƣợc gọi là ptyalin), trong
dịch tiêu hóa của ngƣời và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm
men và vi khuẩn. Trong nƣớc bọt của ngƣời có ptyalin nhƣng ở một số loại động
vật có vú thì khơng có nhƣ ngựa, chó, mèo... Ptyalin bắt đầu thủy phân tinh bột từ
miệng và q trình này hồn tất ở ruột non nhờ amylase của tuyến tụy (còn đƣợc
gọi là amylopsin). Amylase của malt thủy phân tinh bột lúa mạch thành
disaccharide làm cơ chất cho quá trình lên men bởi nấm men. Amylase là một
trong những loại enzyme đƣợc ứng dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y tế, và
nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt là trong ngành cơng nghiệp thực phẩm (Trần
Bích Lam và cs, 2009).
1.1.1.2. Giới thiệu về cellulase
Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật. Vì vậy, nó có mặt trong
mọi loại rau quả, nguyên liệu, phế liệu của các ngành trồng trọt, lâm nghiệp. Tuy
nhiên ngƣời và động vật không có khả năng phân hủy cellulose. Nó chỉ có giá trị
làm tăng tiêu hóa, nhƣng với một lƣợng lớn nó trở nên vơ ích hay cản trở tiêu
hóa. Cellulase là phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose thơng qua việc
thủy phân các liên kết β 1-4 -glucoside trong cellulose thành đƣờng (Barkalow và
cs, 2014).
Cellulase là enzyme đƣợc sản xuất chủ yếu bởi nấm, vi khuẩn và protozoa
xúc tác cho sự tan tế bào, sự phân hủy cellulose và một số polysaccharide liên
quan (Worthington Biochemical Corporation, 2014).
Chế phẩm cellulase thƣờng dùng để tăng chất lƣợng thực phẩm, trộn cùng
thức ăn gia súc hoặc tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật.
1.1.1.3. Giới thiệu về protease

Protease (cịn đƣợc gọi là proteinase hay peptidase) (EC.3.4) là nhóm
Enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết peptide (-CO~NH-) trong các
phân tử polypeptide, protein và một số cơ chất khác tƣơng tự thành các amino
acid tự do


hoặc các peptide phân tử thấp. Trong cùng một phản ứng, các protease khác nhau có
các hƣớng xúc tác khác nhau.
1.1.2. Tính chất
1.1.2.1. Tính chất amylase
Amylase nƣớc bọt (ptyalin): Chức năng phân giải tinh bột thành maltose và
dextrin. Nó phân giải các phân tử tinh bột lớn khơng hịa tan thành tinh bột hòa
tan (amylodextrin, erythrodextrin, achrodextrin), tạo ra các đoạn tinh bột nhỏ hơn
và cuối cùng là maltose. Ptyalin hoạt động trên các mối liên kết α (1,4) glycosidic
thẳng. Amylase nƣớc bọt bị bất hoạt trong dạ dày bởi acid dạ dày. Trong dịch vị
có pH 3,3, ptyalin bị bất hoạt hồn tồn trong vịng 20 phút ở 37°C. Ptyalin cho
vào pH 3.0 sẽ bất hoạt hoàn toàn trong 120 phút, tuy nhiên, bổ sung tinh bột ở
mức 0,1% sẽ có 10% các enzym cịn hoạt động, và bổ sung tƣơng tự tinh bột đến
nồng độ 1,0% sẽ có khoảng 40% enzym hoạt động lại ở 120 phút (Trần Định Toại,
Nguyễn Thị Văn Hân, 2005).
Amylase tuyến tụy: amylase tụy phân cắt ngẫu nhiên các liên kết α (1-4)
glycosidic của amylose tạo ra dextrin, maltose, hoặc maltotriose. Nó thơng qua
một cơ chế chuyển đổi với việc giữ cấu hình anomeric (Nguyễn Hữu Chấn, 1983).
1.1.2.2. Tính chất cellulase
Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất nhƣ carboxylmethyl
cellulose (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulose (HEB). Cellulase cắt liên kết β -1,4
- glucosid trong cellulose, lichenin và các β - D - glucan của ngũ cốc. Bởi vì các
phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, việc tách cellulose là tƣơng đối khó
khăn so với sự phân hủy các polysaccharides khác nhƣ tinh bột (Barkalow và cs).
Độ bền nhiệt và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau. Cellulase hoạt động ở pH

từ 3-7, nhƣng pH tối thích trong khoảng 4-5. Nhiệt độ tối ƣu từ 40-50oC. Hoạt tính
cellulase bị phá hủy hoàn toàn ở 80oC trong 10-15 phút.
Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó nhƣ glucose,
cellobiose và bị ức chế hoàn toàn bởi Hg. Ngoài ra, cellulase còn bị ức chế bởi các


ion kim loại khác nhƣ Mn, Ag, Zn nhƣng ở mức độ nhẹ (Nguyễn Hữu Chấn,
1983).


Trọng lƣợng của enzyme cellulase thay đổi từ 30-11 Kda.

Hình 1.2 Cơ chế tác động của cellulase lên endocellulose
Ba loại phản ứng đƣợc xúc tác bởi cellulase:
1. Sự tan vỡ của các tƣơng tác khơng tƣơng bào có trong cấu trúc vô định của
cellulose (endocellulase)
2. Sự thủy phân của các đầu xích để phá vỡ polymer thành các đƣờng nhỏ
hơn (exocellulase)
3. Sự thủy phân disaccharides và tetrasaccharides thành glucose (betaglucosidase) (Nguyễn Đức Lƣơng, 2008).
1.1.2.3. Tính chất protease
Những protease trong họ S8A đều có một domain bảo thủ với 7 nếp gấp β
đƣợc bao bọc bởi 9 vòng xoắn α. Trung tâm hoạt động của enzyme này là bộ 3
amino acid truyền thống của serine proease theo thứ tự là Asp-His-Ser. Nhóm
serine protease là nhóm peptidase lớn nhất và đƣợc phát hiện ở mọi giới sinh vật
nhƣ: eukaryote, prokaryote, archaea và virus. Những enzyme này đều có chung
một cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân thơng qua hai bƣớc chính (Barrett, 1994):
a) Bƣớc 1, acyl hóa: hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine
với nguyên tử cácbon trong nhóm cácboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của
nhóm imidazole từ histidine.
b) Bƣớc 2, khử acyl hóa: phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử H2O

theo chiều ngƣợc lại của bƣớc một. Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của


gốc - OH từ serine cho nhóm amine để tái sinh lại enzyme (Nguyễn Hữu Chấn,
1983).


1.1.3. Ứng dụng
1.1.3.1. Ứng dụng amylase
Trong tiêu hóa: Enzyme amylase phân giải carbonhydrat có trong thực
phẩm nhằm cung cấp năng lƣợng cho hoạt động của cơ thể. Sản phẩm chứa men
tiêu hóa dành cho trẻ sơ sinh và trẻ em, kích thích tiêu hóa, chống suy dinh dƣỡng,
một số sản phẩm nhƣ: minigadine, trymo, calcinol_RB, calcinol 1000...
Trong y dƣợc: Nguồn: vi khuẩn Bacillus subtilis
Ƣu điểm: bền hơn trong môi trƣờng acid của dạ dày so với diastase
(amylase) lấy từ động vật và vi nấm; chúng đƣợc sử dụng phối hợp cùng
coenzyme A, cytocrom C, ATP, carboxylase để chế thuốc điều trị bệnh tim mạch,
bệnh thần kinh. Phối hợp với enzyme thủy phân để chữa bệnh thiếu enzyme đƣờng
tiêu hóa (Dharani Aiyer, 2004).
Trong cơ thể, amylase là hormone tuyến tụy ngoại tiết có tác dụng chống phù nề
sau chấn thƣơng hoặc sau mổ. Điều trị triệu chứng phản ứng viêm kèm nhiễm
khuẩn đƣờng hô hấp trên hoặc dƣới.
Sử dụng amylase trong chuẩn đoán bệnh viêm tụy cấp ở trẻ em: Khi lựa chọn
điểm cắt thích hợp và phối hợp cả 2 enzyme s- amylase + lipre hoặc p- amylase +
lopre trong chuẩn đốn thì độ chính xác cao nhất (Trƣơng Trọng Ngôn và cs,
2011).
1.1.3.2. Ứng dụng cellulase
Cellulase đƣợc sử dụng trong chế biến thực phẩm thƣơng mại trong cà phê.
Nó thực hiện thủy phân cellulose trong quá trình sấy hạt. Hơn nữa, cellulase đƣợc
sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp dệt và bột giặt. Chúng cũng đƣợc sử

dụng trong ngành giấy và bột giấy cho các mục đích khác nhau và thậm chí cịn
đƣợc sử dụng cho các ứng dụng dƣợc phẩm. Cellulase đƣợc sử dụng trong quá
trình lên men sinh khối thành nhiên liệu sinh học, mặc dù quá trình này chỉ mang
tính chất tƣơng đối trong thử nghiệm. Về mặt y học, Cellulase đƣợc dùng để điều
trị các bào tử, một dạng bezoel cellulose đƣợc tìm thấy trong dạ dày của con


ngƣời và nó đã thể hiện hiệu quả trong các màng sinh học vi khuẩn phân huỷ sinh
học bằng cách thủy phân


các liên kết glycosidic β (1-4) trong các exopolysaccharides chất ngoại bào ngoại
bào (EPS) (Fleming và cs, 2007).
1.1.3.3. Ứng dụng protease
- Chất tẩy rửa: Protease là một trong những thành phần không thể thiếu trong
tất cả các loại chất tẩy rửa, từ chất tẩy rửa dùng trong gia đình đến những
chất làm sạch kính hoặc răng giả và kem đánh răng. Việc ứng dụng enzyme
vào các chất tẩy rửa nhiều nhất là trong bột giặt. Các protease thích hợp để
bổ sung vào chất tẩy rửa thƣờng có tính đặc hiệu cơ chất rộng để dễ dàng
loại bỏ các vết bẩn do thức ăn, máu và các chất do cơ thể con người tiết ra.
- Cơng nghiệp thuộc da: Q trình chế biến da bao gồm một số công đoạn
nhƣ ngâm ƣớt, tẩy lông, làm mềm da và thuộc da. Thông thƣờng các
phƣơng pháp thuộc da thƣờng dùng các hóa chất độc hại nhƣ natri sulfide,
làm ảnh hƣởng rất nghiêm trọng đến môi trƣờng khi nƣớc thải của nhà
máy này thải ra sông. Việc sử dụng enzyme để thay thế các hóa chất đã rất
thành cơng trong việc nâng cao chất lƣợng da và làm giảm ô nhiễm môi
trƣờng. Protein là một thành phần cơ bản của da và lông nên protease đã
đƣợc sử dụng để thủy phân một số thành phần phi collagen của da và loại
bỏ các protein phi fibrin nhƣ: albumin, globulin trong q trình thuộc da rất
có hiệu quả.

- Do protease kiềm từ Bacillus đƣợc tạo thành với lƣợng lớn, có đặc tính bền
vững, hoạt động tốt với nhiệt độ và pH cao nên chúng đƣợc ứng dụng ở
nhiều ngành công nghiệp khác nhau, xử lý phim X-quang đã qua sử dụng
để nhằm thu hồi bạc, làm nƣớc mắm cá (Rebeca và cs, 1991), làm thức ăn
gia súc (Cheng và cs, 1995), xử lý chất thải từ động vật giáp xác (Yang và
cs., 2000), xử lý rác thải trong các lò mổ gia cầm trên cơ sở dùng B. subtilis
(Dalev và cs, 1994), v.v…
1.1.4. Nguồn thu nhận enzyme
Vì enzyme là những chất khơng thể chế biến bằng phƣơng pháp tổng hợp
hóa học, nên ngƣời ta thƣờng thu nhận chúng từ các nguồn sinh học. Enzyme có


trong tất cả các cơ quan, mô của sinh vật; nhƣng để thuận lợi về kinh tế, ngƣời ta
chỉ dùng


những vật liệu cho phép thu một lƣợng lớn enzyme với hiệu suất cao. Tuy nhiên,
để sử dụng rộng rãi trong cơng nghiệp, enzyme động vật ít thuận lợi do sản xuất
chúng bị hạn chế và nguồn nguyên liệu thu nhận enzyme không lớn lắm. Lƣợng
enzyme thu đƣợc từ các nguyên liệu thực vật không lớn lắm so với lƣợng nhiên
liệu tiêu hao. Hai nguồn nguyên liệu trên không thể dùng nguyên liệu trong sản
xuất công nghiệp qui mô lớn do những hạn chế về nguyên liệu và công nghệ. Vì
vậy, dùng enzyme từ vi sinh vật sẽ khắc phục đƣợc các hạn chế trên do:
+ Nguồn nguyên liệu vô hạn
+ Hệ enzyme phong phú
+ Hoạt tính mạnh
+ Có khả năng tăng cƣờng sinh tổng hợp enzyme nhờ chọn giống
+ Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực nhanh
+ Thức ăn nuôi dễ kiếm, rẻ riền (Nguyễn Đức Lƣơng, 2008).
1.1.4.1. Nguồn thu nhận amylase

Enzyme amylase đƣợc thu nhận từ các nguồn khác nhau:
- Từ động vật: Amylase có trong tuyến tụy và tuyến nƣớc bọt của động vật.
- Từ thực vật: Trong ngũ cốc nảy mầm với hàm lƣợng cao nhƣ đại mạch,
lúa, ngô.
- Từ vi sinh vật: Các giống nấm sợi, nấm men và vi
khuẩn Thông thƣờng thu nhận từ những nguồn sau:
+ Nấm sợi: Aspergillus, Rhizopus.
+ Nấm men: Candida, S.endomycopsy, Endomyces
+ Vi khuẩn: B.polymyxa, Phytomonas, destructans, B.cassavanum,
Clostridium acetobytylium, P.saccharohila... (Vũ Ngọc Bội và cs, 2010)
1.1.4.2. Nguồn thu nhận cellulase
Enzyme cellulase đƣợc thu nhận từ các nguồn khác nhau:
- Từ động vật: Dịch chiết dạ dày bò hay các nhóm thân mềm
- Từ thực vật: Trong hạt ngũ cốc nảy mầm nhƣ đại mạch, yến mạch, lúa mì
mạch đen.


- Từ vi sinh vật: Các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men.
Trong thực tế, ngƣời ta thƣờng thu nhận enzyme cellulase từ vi sinh vật. Các chủng
thƣờng sử dụng đó là:
+ Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergilus oryzae, Aspergilus candidus
+ Xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli
+ Vi khuẩn: Acetobacter xylinim, Bacillus subtilis, Bacillus pumilis (Nguyễn
Đức Lƣơng, 2008).
1.1.4.3. Nguồn thu nhận protease
Hiện chúng ta sử dụng 3 nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản để thu nhận
protease: Các mô và cơ động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật.
- Từ động vật: Thông thƣờng protease động vật có ở tuyến tiêu hóa (niêm
mạc dạ dày, niêm mạc ruột non, tuyến tụy…) nhƣ: Pepsin từ niêm mạc dạ
dày và dịch vị của động vật bậc cao, Chymosin “rennin” có trong ngăn thứ

tƣ dạ cỏ bê non dƣới 5 tháng tuổi.
- Từ thực vật: Papain thu từ mủ đu đủ xanh, Bromelin từ thân cây dứa, Ficin
tách từ dịch ép thân cây sung.
- Từ vi sinh vật: thu nhận từ vi khuẩn và nấm sợi :
 Protease kiềm (EC.3.4.21.14): Cịn có tên thƣơng mại là SUBTILISIN. Có
khoảng pH hoạt động là 7 – 11. Trong trung tâm hoạt động có serine. Chế
phẩm dạng bột và dạng hạt có hoạt tính 1 – 6 đơn vị Anson/gram. Dạng kết
tinh có hoạt tính khoảng 25-30 đơn vị Anson/ Gram. Ứng dụng nhiều trong
sản xuất chất tẩy rửa.
 Protease trung tính (EC.3.4.24.4): Protease trung tính là metalloenzym có pH
hoạt động từ 6-9 đƣợc sản xuất từ Bacillus subtilic, B. thermoproteolycus
và Streptomycesgriceus. Chế phẩm thƣơng mại là dạng bột có hoạt tính 0,5-2
đơn vị anson/1gam. Ứng dụng trong cơng nghiệp sản xuất bia, da và protein
thuỷ phân.


 Protease từ nấm sợi: Protease từ nấm sợi thuộc protease acid, kiềm và cả trung
tính. Ứng dụng để sản xuất bia và công nghiệp bánh kẹo và thuộc da
(Nguyễn Đức Lƣơng, 2008).
1.1.5. Một số mơi trường ni cấy kích thích vi sinh vật sinh enzyme (amylase,
cellulase, protease)
v Lên men chìm (SMF)
Là phƣơng pháp vi sinh vật đƣợc ni cấy trong mơi trƣờng dinh dƣỡng dạng
lỏng, tuy nhiên sẽ có sự tổn thất đáng kể trong q trình cơ đặc và tách enzyme từ
môi trƣờng chủ yếu là nƣớc. Thay thế cho phƣơng pháp truyền thống là phƣơng
pháp nuôi cấy trên môi trƣờng rắn (SSF). Khi so sánh với SMF trên lý thuyết,
SSF đơn giản và ít tốn kém hơn nhƣng không đƣợc sử dụng rộng rãi. Trong khi ở
các nƣớc châu Á, thực phẩm lên men từ các chất rắn nhƣ nƣớc tƣơng, miso
đƣợc sản xuất cách đây hàng nghìn năm bằng phƣơng pháp SSF, cịn ở phƣơng
tây phƣơng pháp này không đƣợc chú ý tới (Pandey, 2003).

Kể từ năm 1990, SSF đƣợc quan tâm phát triển nhiều hơn, một phần do sự thừa
nhận rằng nhiều vi sinh vật có thể sản xuất enzyme hiệu quả hơn SSF.
v Phƣơng pháp lên men bán lỏng SMF:
Lên men trong môi trƣờng lỏng là sự nuôi cấy vi sinh vật trong dung dịch có
chứa các chất dinh dƣỡng dạng bán lỏng. Khi vi sinh vật sử dụng các chất dinh
dƣỡng, chúng ta sẽ thu đƣợc các enzyme mong muốn. Nguồn chất nền sử dụng
dựa trên các nguyên vật liệu tái tạo nhƣ ngơ, đƣờng và đậu nành. Trong suốt q
trình ni cấy, chất dinh dƣỡng đã tiệt trùng đƣợc thêm vào để làm tăng q trình
lên men. Các thơng số nhƣ nhiệt độ, pH, oxi, CO 2 đƣợc kiểm soát để tối ƣu hóa q
trình lên men. Để thu hoạch các enzyme từ môi trƣờng lên men, ngƣời ta phải loại
bỏ các sản phẩm khơng hịa tan, ví dụ nhƣ tế bào vi sinh vật, đƣợc thực hiện bằng
cách ly tâm (Công nghệ sinh học đại cƣơng, 2008).
Ƣu điểm:
+ Đo các thông số trong quá trình dễ dàng hơn so với quá trình lên men rắn.
+ Tế bào vi khuẩn và nấm men đƣợc phân bố đều khắp môi trƣờng.


+ Có hàm lƣợng nƣớc cao, là điều kiện lý tƣởng cho vi khuẩn.
Nhƣợc điểm:
+ Chi phí cao do mơi trƣờng dinh dƣỡng đắt tiền.
+ Lò phản ứng làm chiếm diện tích, khó kiểm sốt sự hoạt động của các vi sinh
vật.
+ Nguy cơ ô nhiễm cao do lƣợng nƣơc thải ra mơi trƣờng sau q trình ni.
v Lên men rắn (SSF):
Lên men rắn là quá trình lên men xảy ra trong mơi trƣờng khơng hoặc gần
nhƣ khơng có nƣớc tự do. Quá trình lên men rắn sử dụng nguyên liệu tự nhiên
nhƣ nguồn cung cấp cacbon và năng lƣợng. SSF cũng có thể sử dụng nguồn
nhiên liêu như chất nền rắn, sử dụng nguồn nguyên liệu này thì cần bổ sung dung
dịch dinh dƣỡng cần thiết nhƣ một nguồn cung cấp cacbon. Chất nền rắn thì phải
có đủ độ ẩm. Tùy thuộc vào bản chất của chất nền, lƣợng nƣớc hấp thụ có thể gấp

một hoặc nhiều lần so với trọng lƣợng khơ của nó. Duy trì độ ẩm cùng với hoạt
độ nƣớc thích hợp là những yếu tố cần thiết cho q trình SSF. Nói chung, chất
nền rắn cung cấp môi trƣờng tốt để vi khuẩn, nấm mốc và nấm men phát triển.
Nấm mốc đƣợc nghiên cứu nhiều nhất cho phƣơng pháp SSF do khả năng tăng
trƣởng, phát triển không chỉ trên bề mặt của chất nền mà cịn đâm sâu vào chất
nền. Một số cây trồng nơng nghiệp nhƣ sắn, lúa mạch, phế liệu nông nghiệp nhƣ
cám, bã, bánh dầu, vỏ cà phê là các chất nền thƣờng đƣợc sử dụng trong phƣơng
pháp SSF. Một số yếu tố quan trọng khác ảnh hƣởng đến sự phát triển dựa trên
phƣơng pháp SSF: pH môi trƣờng, nhiệt độ, thời gian ni cấy; kích thƣớc, độ
tuổi của vi khuẩn cấy; bản chất chất nền, loại vi sinh vật sử dụng,... (Công nghệ
sinh học đại cƣơng, 2008).
Ƣu điểm:
+ Hiệu quả không gian lớn: cùng một thể tích lên men rắn, sử dụng đƣợc một
khối lƣợng cơ chất 4-5 lần lên men lỏng.
+ Mơi trƣờng dễ bảo quản.
+ Lƣợng nƣớc ít nên tiêu hao cho việc khử trùng và xử lý sản phẩm ít.


+ Hoạt tính nƣơc thấp, ít bị nhiễm.


+ Đòi hỏi thiết bị và ký thuật đơn giản.
+ Tùy mức độ sử dụng cơ chất thành sản phẩm thấp nhƣng tính theo mật độ
cơ chất thì năng suất vẫn cao.
Nhƣợc điểm:
+ Sự truyền nhiệt bị hạn chế làm ảnh hƣởng đến sự khuếch tán qua bề mặt.
Nếu không đƣợc kiểm sốt, sự tích tụ nhiệt và giảm năng lƣợng oxy có sẵn
có thể dẫn đến chấm dứt hoạt động của vi sinh vật hiếu khí mesophilic và
hậu quả là ngừng sản xuất enzyme.
+ Tính đồng nhất khi cấy, vi sinh vật phát triển không đồng đều, cách khắc

phục khó do khối lƣợng lên men lớn.
1.1.6. Một số nghiên cứu về enzyme (amylase, cellulase, protease) trên thế giới và
trong nước
1.1.6.1. Nghiên cứu enzyme amylase
Năm 1814: Kirchoft`, Sairlt Petercburg chứng minh hạt lúa mạch nảy mầm
có tác dụng chuyển hóa tinh bột thành đƣờng ở nhiệt độ từ 400°C - 600°C.
Năm 1833, Payen và Perso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này, thu đƣợc
kểt tủa có khả năng phân giải tinh bột thành đƣờng, và đặt tên là Diastase (xuất
phát từ tiếng Hy Lạp, diastatics, có nghĩa là phân giải, đó là Amylase). Sau này
theo đề nghị của Duclo, Enzyme phân giải tinh bột đƣợc gọi là Amylase.
Năm 1851: Leuchs đã phát hiện nƣớc bọt cũng có khả năng phân giải tinh
bột thành đƣờng. Sau đó, các Enzyme Amylase trong nƣớc bọt, trong dịch tiệu
hóa của ngƣời và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn
bắt đầu đƣợc quan tâm nghiên cứu.
Năm l862, Danilevxki đã tách đƣợc Amylase của tuyển tuy bằng phƣơng
pháp hấp thu chọn lọc.
Năm 1949, Schwilnmer đã xác định đƣợc số chu chuyển của α-Amylase là
19000.
Năm 1950, Englard và Singer cho biết số chu chuyển của β-Amylase là
250000.
Đến năm 1952, ngƣời ta đã thu đƣợc 72 Enzyme ỏ trạng thái kết tinh trong
đó có 4 Enzyme α-Amylase.
Năm l97l , Uxtinilov và cộng sự bẳng phƣơng pháp điện di trên gel
poliacrylamid đã xác định đƣợc sự có mặt của một lƣợng lớn α-Amylase và
glucoamylase trong canh trƣờng nấm mốc và một lƣợng nhỏ các phân đoạn
có hoạt lực dextrinase và transglucosilase.


1.1.6.2. Nghiên cứu enzyme cellulase
Năm 1983, PTN của Quân đội Mỹ ở Natik và trƣờng đại học Rutgers, sử

dụng chủng Trichoderma viride QM6 hoang dại để sản xuất cellulase đầu tiên.
Năm 1998, YU đã nuôi cấy T. reesei Rut 30 trong MT chứa 5% tinh bột
cellulose + 1% cám mì, thu đƣợc hoạt lực CMCase 232,4 IU/g.
Năm 2000, Sonia Couri khảo sát khả năng sinh tổng hợn enzyme nhƣ
polygalacturonase, cellulase, xylanase và protease từ A. niger 3T5B8 trên nguồn
phụ phế liệu nông nghiệp khác nhau bằng phƣơng pháp lên men bán rắn và ứng
dụng enzyme trong việc tách chiết dịch thực vật.
Năm 2002, theo báo cáo gần đây của CORAL, dịch nuôi cấy A. niger trong
MT Czapek -Dox chứa CMC 1%, cho chạy điện di trên gel SDS - PAGE (chứa
0,2
% CMC) phát hiện có hai vạch có hoạt tính CMCase và trọng lƣợng phân tử lần
lƣợt là 83.000 và 50.000 Dalton.
Năm 1989, ở Việt Nam, Lê Hồng Mai nghiên cứu về sinh tổng hợp và một
số đặc tính của cellulase (typ CMCase) ở A.niger VS-1 trên MT lên men bán rắn.
Năm 2001, Huỳnh Anh nghiên cứu về nấm sợi T. reesei sinh tổng hợp
enzyme cellulase trên MT lỏng với nguồn cacbon là CMC.
Năm 2002, Kiều Hoa đã tổng hợp enzyme cellulase với nguồn cacbon là
cellulose tinh khiết, cám trấu, bã mía, vỏ cà phê.
Năm 2003, Hồng Quốc Khánh nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp và đặc
điểm cellulase của A.niger Rnnl 363. Châu Hoàng Vũ cũng nghiên cứu thu nhận
và tinh sạch enzyme cellulase từ nấm mốc T. reesei bằng phƣơng pháp lên men bán
rắn.
Năm 2004, Trần Thạnh Phong khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme
cellulase từ T. reesei và A.niger trên MT lên men bán rắn.
Năm 2005, Lê Thị Hồng Nga nghiên cứu sự sinh tổng hợp cảm ứng pectinase
và cellulase của một số chủng nấm mốc.
1.1.6.3. Nghiên cứu enzyme protease
Năm 1991, Rebeca và cs đã nghiên cứu ứng dụng protease làm nƣớc mắm cá.
Năm 1994, Dalev đã xử lý rác thải trong các lò mổ gia cầm trên cơ sở dùng
Bacillus subtilis.

Năm 1995, Cheng và cs đã nghiên cứu ứng dụng protease làm thức ăn gia súc.


Năm 2000, Yang và cs nghiên cứu sử dụng protease xử lý chất thải từ động
vật giáp xác.