Nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin (HA) tái tổ hợp của virus cúm a h5n1 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá và đánh giá khả năng sinh miễn dịch

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (6.36 MB, 182 trang )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Phạm Thị Vân

NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN
HEMAGGLUTININ (HA) TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS CÚM
A/H5N1 BẰNG PHƯƠNG PHÁP BIỂU HIỆN TẠM THỜI
TRÊN CÂY THUỐC LÁ VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH
MIỄN DỊCH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Phạm Thị Vân

NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN
HEMAGGLUTININ (HA) TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS CÚM
A/H5N1 BẰNG PHƯƠNG PHÁP BIỂU HIỆN TẠM THỜI
TRÊN CÂY THUỐC LÁ VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH
MIỄN DỊCH
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 9 42 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. Vũ Huyền Trang
2. GS. TS. Lê Thanh Hoà

Hà Nội – 2021

i

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy cô giáo, TS. Vũ Huyền Trang và
GS.TS. Lê Thanh Hoà đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ tôi thực hiện
và hoàn thành luận án.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hoàng Hà, PGS. TS. Phạm
Bích Ngọc, Ths. Hồ Thị Thương, ThS. Nguyễn Thu Giang, KTV. Trần Thị Loan cùng
tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, phòng công nghệ ADN ứng dụng,
Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện làm việc, hỗ trợ kinh phí, nhiệt tình giúp
đỡ và truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực hiện và
hoàn thành luận án.
Đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Udo Conrad, TS. Phan

Trọng Hoàng, Viện nghiên cứu di truyền và cây trồng thực vật (IPK) CHLB Đức đã
truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
thực tập tại Viện IPK cũng như trong thời gian tôi học tập tại Việt Nam.
Tôi xin cảm ơn sâu sắc tới TS. Trần Xuân Hạnh Công ty CP thuốc thú y Ttrung
ương NAVETCO đã giúp đỡ tôi thực hiện thành công các thí nghiệm công cường độc
trên gà.
Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam với đề tài
Nghị định thư mã số NĐT.07.GER.15 và Bộ giáo dục và nghiên cứu CHLB Đức với
đề tài “Plantfluvac” mã số 031A283 đã hỗ trợ kinh phí cho tôi thực hiện các nghiên
cứu trong luận án này.
Tôi xin cũng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Bộ phận Đào tạo, các phòng chức
năng và Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Học viện Khoa học và Công nghệ,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi trong quá trình học tập và bảo vệ luận án.
Cuối cùng, tôi xin dành lòng biết ơn sâu sắc tới những người thân trong gia
đình, bạn bè đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình thực hiện
luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó!
Hà Nội, ngày

tháng

Nghiên cứu sinh

Phạm Thị Vân

năm 2021

ii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi, các số liệu và kết quả trình bày trong
luận án là trung thực, đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự
đồng ý và cho phép của các đồng tác giả.
Hà Nội, ngày

tháng

Nghiên cứu sinh

Phạm Thị Vân

năm 2021

iii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN........................................................................................................................ i
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................. ii
MỤC LỤC ........................................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT.................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................................. vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................................. viii
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1
1.

Tính cấp thiết của luận án ...................................................................................... 1

2.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án ........................................................................... 2

3.

Các nội dung nghiên cứu chính của luận án ......................................................... 3

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 4
1.1. Virus cúm A/H5N1 ................................................................................................... 4
1.1.1. Phân loại và đặc tính của virus cúm A/H5N1 ...................................................... 4
1.1.2. Cấu trúc, chức năng hệ gen của virus cúm A ...................................................... 6
1.1.3. Cấu trúc, chức năng của protein hemagglutinin .................................................. 8
1.1.4. Biến đổi thành phần hemagglutinin tạo nên các clade của virus A/H5N1 ........ 13
1.2. Bệnh cúm gia cầm .................................................................................................. 16
1.2.1. Lịch sử và tình hình dịch cúm A/H5N1 trên thế giới ........................................ 16
1.2.2. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 ở Việt Nam......................................................... 17
1.3. Vaccine phòng bệnh cúm cho gia cầm ................................................................. 22
1.3.1. Vaccine phòng bệnh cúm gia cầm trên thế giới ................................................. 23
1.3.2. Vaccine phòng bệnh cúm gia cầm tại Việt Nam................................................ 24
1.3.3. Nghiên cứu vaccine cúm phổ rộng .................................................................... 27
1.3.4. Nghiên cứu vaccine từ thực vật ......................................................................... 29
1.3.5. Nghiên cứu vaccine dựa vào HA ELP hoá ........................................................ 33
1.3.6. Nghiên cứu vaccine dựa vào HA oligomer hoá ................................................. 34
1.4. Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp tạm thời ở thực vật thông qua
Agrobacterium (agroinfiltration) .......................................................................... 36
1.4.1. Nguyên lý ........................................................................................................... 36
1.4.2. Ứng dụng agroinfiltration trong nghiên cứu và sản xuất protein có hoạt tính
sinh học trên thế giới ......................................................................................... 37

1.4.3. Tình hình nghiên cứu và sản xuất protein có hoạt tính sinh học thông qua
agroinfiltration ở Việt Nam ............................................................................... 40
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 44
2.1. Vật liệu .................................................................................................................... 44
2.1.1. Nguồn vật liệu thực vật ...................................................................................... 44

iv
2.1.2. Chủng vi sinh vật, plasmid, trình tự gen ............................................................ 44
2.1.3. Các cặp mồi sử dụng .......................................................................................... 45
2.1.4. Nguồn vật liệu động vật ..................................................................................... 45
2.1.5. Hóa chất ............................................................................................................. 45
2.1.6. Thiết bị ............................................................................................................... 45
2.1.7. Môi trường và đệm ............................................................................................ 46
2.2. Phương pháp........................................................................................................... 46
2.2.1. Phương pháp lựa chọn gen mã hoá kháng nguyên HA của các chủng virus
cúm A/H5N1 ..................................................................................................... 46
2.2.2. Phương pháp sử dụng trong thiết kế cấu trúc vector biểu hiện ở thực vật
mang gen mã hoá kháng nguyên HA và đánh giá sự biểu hiện tạm thời
kháng nguyên HA của virus cúm A/H5N1 trên cây thuốc lá ............................ 48
2.2.3. Phương pháp tinh sạch, đánh giá trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng
kết hồng cầu của các kháng nguyên HA tái tổ hợp ........................................... 55
2.2.4. Phương pháp đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên
HA tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm ............................................................. 57
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................................. 62
3.1. Lựa chọn gen mã hoá kháng nguyên HA của các chủng virus cúm
A/H5N1….. ............................................................................................................. 62
3.1.1. Thu thập và phân loại trình tự HA theo từng năm ............................................. 62
3.1.2. Phân tích đởi mã gen và tổng hợp nhân tạo chuỗi gen mã hóa kháng nguyên
HA của chủng virus cúm A/H5N1 trên cơ sở những trình tự đã biến đổi ......... 63

3.1.3. Thiết kế trình tự HA COBRA đại diện các chủng virus cúm A/H5N1 quan
tâm ..................................................................................................................... 67
3.1.4. Chuyển đổi các trình tự amino acid của kháng nguyên HACOBRA1 và
HACOBRA2 thành các trình tự nucleotide ....................................................... 71
3.1.5. Phân tích và so sánh trình tự của các protein HA lựa chọn trong nghiên
cứu… ................................................................................................................. 72
3.2. Thiết kế các cấu trúc vector biểu hiện ở thực vật mang gen mã hoá kháng
nguyên HA và đánh giá sự biểu hiện tạm thời kháng nguyên HA của virus
cúm A/H5N1 trên cây thuốc lá ............................................................................. 74
3.2.1. Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên HA trimer .......................................... 76
3.2.2. Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên HA oligomer ELP .............................. 79
3.2.3. Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên HA oligomer TP ................................ 82
3.2.4. Lựa chọn điều kiện thích hợp cho sự biểu hiện kháng nguyên HA trên cây
thuốc lá .............................................................................................................. 84
3.2.5. Đánh giá sự biểu hiện các kháng nguyên HA tái tổ hợp trong dịch chiết thô
thuốc lá .............................................................................................................. 91
3.2.6. Đánh giá hoạt tính ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên HA trong dịch
chiết thô lá thuốc lá ........................................................................................... 92
3.3. Tinh sạch, đánh giá trạng thái oligomer hố và hoạt tính ngưng kết hồng
cầu của các kháng nguyên HA tái tổ hợp ............................................................ 94

v
3.3.1. Tinh sạch kháng nguyên HA oligomer ELP từ cây thuốc lá bằng mITC .......... 94
3.3.2. Tinh sạch kháng nguyên HA trimer và oligomer TP bằng IMAC ..................... 98
3.3.3. Trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng
nguyên HA sau tinh sạch ................................................................................. 100
3.4. Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên HA tái tổ
hợp trên động vật thí nghiệm ............................................................................. 103
3.4.1. Miễn dịch trên chuột thí nghiệm ...................................................................... 103

3.4.2. Miễn dịch trên gà thí nghiệm ........................................................................... 110
Chương 4. THẢO LUẬN ................................................................................................ 122
4.1. Lựa chọn gen HA là một yếu tố quan trọng trong nghiên cứu phát triển
vaccine phòng bệnh cúm gia cầm A/H5N1 tại Việt Nam ................................. 122
4.2. HA trimer dung hợp ELP làm tăng cường sự biểu hiện protein trong thực
vật, đơn giản hố trong tinh sạch nhưng khơng làm tăng cường hoạt tính
sinh học của HA trimer ....................................................................................... 125
4.3. HA COBRA đã kích thích tạo ra kháng thể trung hồ phổ rộng trên động
vật thí nghiệm ...................................................................................................... 127
4.4. HA oligomer có hoạt tính sinh miễn dịch cao trên động vật ............................ 128
4.5. Dịch chiết thô thuốc lá chứa kháng nguyên HA oligomer TP có thể sử dụng
làm ứng viên vaccine phòng bệnh cúm A trên động vật .................................. 129
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 131
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ............................................................... 132
DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ .............................................................. 133
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 134
PHỤ LỤC............................................................................................................................ P1

vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

bp

base pair

BS3

bis [sulfosuccinimidyl] suberate

DNA

deoxyribonucleic acid

dNTP

deoxyribonucleotide triphosphate

E. coli

Escherichia coli

EDTA

ethylene diamine tetra-acetate acid

ELISA

enzyme-linked immunosorbent assay

ELP

elastin-like polypeptides

EtBr

ethidium bromide

FAO

The Food and Agriculture Organization

HA

Hemagglutinin

HI

hemagglutinin inhibition

IMAC

Immobilized metal ion chromatography

kb

kilobase

kDa

kilodalton

LB

Luria and Bertani

mITC

membrane-based inverse transition cycling

OD

optical density

OIE

The World Organisation for Animal Health

PCR

polymerase chain reaction

SDS

sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE

sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

SEC

size exclusion chromatography

TAE

tris acetate EDTA

Taq DNA polymerase

Thermus aquaticus DNA polymerase

v/p

vòng/phút

WHO

World Health Organization

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Các gốc amino acid ở các vị trí điểm cắt protease, vị trí bám dính thụ
thể, vị trí liên kết thụ thể, vị trí epitope và một vị trí glycosyl hoá bị
biến đổi của các H5 từ một số chủng virus A/H5N1 khác nhau ............. 11
Bảng 1.2. Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 phát triển vaccine ................... 23
Bảng 1.3. Các protein có hoạt tính sinh học, kháng thể và vaccine được sản xuất
từ thực vật đang trong thử nghiệm lâm sàng hoặc có mặt trên thị
trường ...................................................................................................... 30
Bảng 2.1. Danh sách mồi sử dụng trong nghiên cứu................................................ 45
Bảng 3.1. Số lượng trình tự gen HA của các chủng virus cúm A/H5N1 gây bệnh
trên gia cầm ở Việt Nam ......................................................................... 63
Bảng 3.2. Các vị trí sai khác khi so sánh các trình tự protein HACOBRA clade
1.1; 1.1.1 và 1.1.2 .................................................................................... 68
Bảng 3.3. Các vị trí sai khác khi so sánh các trình tự protein HACOBRA clade
2.3.2.1, 2.3.2.1a, b và c ........................................................................... 69

Bảng 3.4. Danh sách các cấu trúc vector thiết kế chứa HA tự nhiên và nhân tạo .... 75
Bảng 3.5. Hiệu suất thu hồi các kháng nguyên HA oligomer ELP .......................... 98
Bảng 3.6. Bảng tổng hợp kết quả thiết kế, biểu hiện và đánh giá hoạt tính của
các kháng nguyên HA tái tổ hợp ........................................................... 120
Bảng 4.1. Trình tự amino acid tại các vị trí phân cắt protein, liên kết thụ thể
epitope kháng nguyên và vị trí glycosyl của các protein HA ............... 124

viii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc của virus cúm A [8]. ........................................................... 5
Hình 1.2. Mô hình cấu trúc hemagglutinin xuyên lớp màng bao lipid kép .............. 10
Hình 1.3. Dòng thời gian xuất hiện các clade của A/H5N1 dựa vào trình tự của
gen HA ở Việt Nam [1]........................................................................... 18
Hình 1.4. Bản đồ các ổ dịch cúm A/H5N1 xảy ra ở các năm 2006 đến 2014 dựa
vào số liệu được báo cáo trên OIE .......................................................... 19
Hình 1.5. Bản đồ các ổ dịch cúm A/H5N1 xảy ra ở các năm 2015 đến 2017 dựa
vào số liệu được báo cáo trên OIE .......................................................... 20
Hình 1.6. Bản đồ các ổ dịch cúm gia cầm xảy ra ở các năm 2018 đến 11/09/2020
dựa vào số liệu được báo cáo trên OIE ................................................... 21
Hình 1.7. Sơ đồ dạng lục thể IgM (A) và dạng đơn tiểu đơn vị (B) ........................ 35
Hình 1.8. Quy mô thương mại N. benthamiana tăng trưởng (A) và khử trùng
(B) ........................................................................................................... 39
Hình 1.9. Quy trình sản xuất virus cúm mùa tại công ty Medicago, Canada ........... 40
Hình 2.1. Sơ đồ mô tả các bước thí nghiệm cơ bản trong nghiên cứu ..................... 46
Hình 2.2. Hình ảnh cây thuốc lá thuỷ canh 5 tuần tuổi (A) được loại bỏ bớt lá
già, lá non và lá bánh tẻ trước khi biến nạp (B) ...................................... 52
Hình 2.3. Biến nạp dịch khuẩn vào lá thuốc lá bằng máy hút chân không .............. 52
Hình 3.1. Hình ảnh so sánh trình tự amino acid của protein H5TG chủng

A/duck/Vietnam/TG24-O1/05 đã được tối ưu trong biểu hiện thuốc
lá so với trình tự gốc ............................................................................... 66
Hình 3.2. Hình ảnh so sánh trình tự amino acid của protein H5HT chủng
A/duck/Vietnam/HT-O2/2014 đã được tối ưu trong biểu hiện thuốc
lá so với trình tự gốc ............................................................................... 67
Hình 3.3. Mô hình thiết kế các trình tự HA COBRA (A) và hình ảnh xây dựng
cây phân loại dựa vào các trình tự của kháng nguyên HA tự nhiên và
nhân tạo ................................................................................................... 71
Hình 3.4. Hình ảnh biểu diễn và so sánh trình tự amino acid của 4 kháng nguyên
HA tự nhiên và HA nhân tạo .................................................................. 73
Hình 3.5. Các loại cassette biểu hiện kháng nguyên HA trong thực vật .................. 75
Hình 3.6. Mô hình thiết kế vector biểu hiện protein H5TG trimer ở thực vật ......... 76
Hình 3.7. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuyếch đại đoạn gen H5TG (A) và
sản phẩm cắt vector tách dòng pRTRA_H5TG trimer bởi enzyme
BamHI và PspOMI (B) ........................................................................... 77
Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm của quá trình thiết kế cấu trúc vector biểu
hiện kháng nguyên HA trimer................................................................. 78
viii

ix

Hình 3.9. Bản đồ vector biểu hiện kháng nguyên HA trimer ................................... 78
Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm của quá trình thiết kế vector tách dịng
gen mã hóa kháng nguyên HA oligomer ELP ........................................ 79
Hình 3.11. Hình ảnh điện di sản phẩm của quá trình thiết kế cấu trúc vector biểu
hiện kháng nguyên HA oligomer ELP .................................................... 80
Hình 3.12. Bản đồ vector biểu hiện kháng nguyên HA oligomer ELP .................... 81
Hình 3.13. Hình ảnh điện di sản phẩm của quá trình thiết kế vector biểu hiện
kháng nguyên HACOBRA1 oligomer TP .............................................. 82

Hình 3.14. Bản đồ vector biểu hiện kháng nguyên HA oligomer ELP .................... 83
Hình 3.15. Kết quả gieo và nhân nhanh cây thuốc lá N. benthamiana in vitro từ
hạt............................................................................................................ 84
Hình 3.16. Hình ảnh cây thuốc lá trồng thuỷ canh ................................................... 85
Hình 3.17. Hình ảnh thuốc lá sau 5 ngày biến nạp tạm thời. A–D là cây thuốc lá
được sử dụng cho biến nạp ở 3, 4, 5 và 6 tuần tuổi ................................ 86
Hình 3.18. Phân tích sự biểu hiện của kháng nguyên HA trên lá thuốc lá bằng
SDS-PAGE và Western blot ................................................................... 86
Hình 3.19. Phân tích sự biểu hiện của HApII theo các mật độ OD600 biến nạp
khác nhau ................................................................................................ 87
Hình 3.20. Lựa chọn thời gian biến nạp ................................................................... 88
Hình 3.21. Mức độ biểu hiện của protein HApII sau các ngày biến nạp. ................ 89
Hình 3.22. Quy trình biểu hiện kháng nguyên HA của A/H5N1 tái tổ hợp trong
cây thuốc lá trồng thuỷ canh ................................................................... 90
Hình 3.23. Mức độ biểu hiện của các kháng nguyên HA trên thuốc lá.................... 91
Hình 3.24. Hàm lượng kháng nguyên HA tái tổ hợp biểu hiện trong lá thuốc lá .... 92
Hình 3.25. Phản ứng ngưng kết tế bào hồng cầu của các kháng nguyên HA trong
dịch chiết thô thuốc lá ............................................................................. 93
Hình 3.26. Quy trình tinh sạch kháng nguyên HA oligomer ELP tái tổ hợp trong
cây thuốc lá ............................................................................................. 94
Hình 3.27. Kết quả ly tâm loại bỏ tạp chất sử dụng PEG 8000 ở các nồng độ
khác nhau ................................................................................................ 95
Hình 3.28. Kết quả phân tích protein trong dịch nổi bằng lai miễn dịch (A) và
nhuộm Coomassie Brilliant Blue (B). ..................................................... 96
Hình 3.29. Cải tiến quá trình tinh sạch mITC bởi PEG. .......................................... 96
Hình 3.30. mITC dựa vào PEG để tinh sạch các protein HA oligomer ELP ........... 97
Hình 3.31. Tinh sạch H5TG trimer và oligomer TP bằng IMAC ............................ 99
Hình 3.32. Tinh sạch HACOBRA1 trimer bằng IMAC. .......................................... 99
Hình 3.33. Đặc điểm cấu trúc và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng
nguyên H5TG tinh sạch ........................................................................ 100

ix

x

Hình 3.34. Hoạt tính ngưng kết hồng cầu (A) và trạng thái oligomer hoá (B, C,
D) của các kháng nguyên HACOBRA1, H5TG và H5HT tinh sạch .... 101
Hình 3.35. Đặc điểm cấu trúc của các kháng nguyên H5TG trimer và
HACOBRA1 trimer tinh sạch bởi SEC ................................................ 102
Hình 3.36. Sơ đồ gây đáp ứng miễn dịch trên chuột thí nghiệm ............................ 103
Hình 3.37. ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể IgG đặc hiệu HA trong huyết
thanh chuột ở độ pha loãng huyết thanh 16 x 10-3 ................................ 104
Hình 3.38. Phân tích Western blot (A) và ELISA (B) phát hiện kháng thể đặc
hiệu IgG đặc hiệu kháng nguyên H5TG trimer và HACOBRA1
trimer trên chuột thí nghiệm ................................................................. 105
Hình 3.39. ELISA gián tiếp xác định điểm end-point của kháng thể chuột được
gây miễn dịch với H5TG trimer và HACOBRA1 trimer...................... 107
Hình 3.40. Hiệu giá HI chống lại kháng nguyên HACOBRA1 trimer và H5TG
trimer đồng gen và dị chủng ................................................................. 108
Hình 3.41. Sơ đồ gây đáp ứng miễn dịch trên gà thí nghiệm ................................. 110
Hình 3.42. Phân tích Western blot (A) và ELISA (B) của huyết thanh gà phát
hiện kháng thể IgY đặc hiệu H5TG sau tiêm kháng nguyên lần 1 và
lần 2 ....................................................................................................... 112
Hình 3.43. Phân tích HI của huyết thanh gà để phát hiện kháng thể trung hoà
virus clade 1.1 sau công cường độc ...................................................... 113
Hình 3.44. Tỷ lệ gà sống sót sau công cường độc với chủng A/duck/TG/NAVET
(3)/2013. ................................................................................................ 114
Hình 3.45. Phân tích Western blot (A) và ELISA (B) của huyết thanh gà phát
hiện kháng thể IgY đặc hiệu H5HT sau tiêm kháng nguyên lần 1 và
lần 2. ...................................................................................................... 116

Hình 3.46. Phân tích HI của huyết thanh gà để phát hiện kháng thể trung hoà
virus clade 2.3.2.1c trước và sau công cường độc. ............................... 117
Hình 3.47. Tỷ lệ gà sống sót sau công cường độc với chủng
A/Chicken/DL/NAVET_0292/2013(H5N1) clade 2.3.2.1c ................. 118
Hình 3.48. Hiệu giá HI và tỷ lệ sống sót của gà sau công cường độc dịch chiết
thô H5HT oligomer và trimer ............................................................... 119
Hình 4.1. Cấu trúc của các protein HA nhân tạo và tự nhiên được mô phỏng bởi
RaptorX ................................................................................................. 123
Hình 4.2. Sự hình thành dạng HA oligomer trong tế bào thực vật......................... 128

x

1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Cúm gia cầm thể độc lực cao (highly pathogenic avian influenza, HPAI) do
virus cúm A/H5N1 gây ra là bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc độ lây lan nhanh với
tỷ lệ gây chết cao trong đàn gia cầm bị bệnh. Dịch cúm gia cầm liên tục tái phát hàng
năm với tốc độ lây lan nhanh và diễn biến phức tạp. Hàng chục triệu gia cầm và thuỷ
cầm đã bị chết hoặc bị tiêu huỷ gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho ngành chăn nuôi trên
thế giới cũng như ở Việt Nam. Đặc biệt, chủng virus cúm A/H5N1 có thể xâm nhiễm
gây bệnh ở người với tỉ lệ tử vong rất cao và đang trở thành mối đe dọa nguy hiểm
cho sức khoẻ cộng đồng.
Vaccine là một biện pháp hiệu quả bảo vệ sức khoẻ người và vật nuôi chống
lại virus cúm gia cầm A/H5N1. Tuy nhiên, sự tiến hoá của virus cúm gia cầm
A/H5N1, trong đó đáng chú ý là sự biến đổi của gen mã khoá kháng nguyên bề mặt
hemagglutinin (HA) - một trong hai kháng nguyên đích của virus cúm A/H5N1 được
sử dụng cho phát triển vaccine, có thể làm thay đổi tính kháng nguyên dẫn đến ảnh

hưởng đáp ứng miễn dịch của gia cầm khi được tiêm phòng vaccine. Tại Việt Nam,
bệnh cúm gia cầm A/H5N1 khởi phát và gây dịch cho đàn gia cầm vào năm 2003,
chủ yếu thuộc clade 1 và 2. Các clade này tiếp tục tiến hoá và phân nhánh nhỏ hơn
như clade 1.1, 1.1.1, 1.1.2, 2.3.1, 2.3.2, 2.3.4… [1]. Clade 2.3.2 phân bố phổ biến tại
Việt Nam trong giai đoạn 2009–2014 và sau đó biến đổi tiếp để tạo thành các phân
nhánh nhỏ hơn, phổ biến như clade 2.3.2.1a/b/c. Từ 2014–2017, clade 2.3.2.1c và
2.3.4.4 chiếm ưu thế và thể hiện sự tiến hóa dựa vào địa lý một cách khác biệt. Các
virus clade 2.3.2.1c phát hiện ở các vùng phía Bắc, Trung và Nam, trong khi các virus
clade 2.3.4.4 chỉ được phát hiện ở các vùng Bắc và Trung tạo thành các nhóm nhỏ.
Những virus này đã trải qua sự tái tổ hợp đa dạng với sự tồn tại của ít nhất 12 kiểu
gen và giữ lại các motif đặc trưng điển hình [2]. Sự tiến hoá phức tạp này của virus
cúm gia cầm A/H5N1 đã làm cho vaccine hiện có trở nên kém hiệu lực, công tác
phòng chống dịch bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam ngày càng khó khăn, dịch bệnh tái
bùng phát dễ dàng. Tính từ 2003 đến nay, Việt Nam là nước được ghi nhận có số ổ
dịch cao nhất trên thế giới. Do đó, nếu chúng ta có thể chủ động được nguồn vaccine

2

cập nhật nhất cũng như có tính bảo hộ phổ rộng và lâu dài sẽ giúp giảm chi phí cho
sản xuất, kinh doanh và chủ động đáp ứng nhanh nhu cầu khi có các biến chủng virus
mới xuất hiện tại Việt Nam.
Trước vấn đề cấp thiết đó đòi hỏi quá trình nghiên cứu và sản xuất vaccine cần
được rút ngắn, tăng quy mô sản xuất, giảm công sức và chi phí để cung cấp kịp thời
một lượng lớn vaccine cúm trên diện rộng. Mô hình sản xuất kháng nguyên HA tái
tổ hợp bằng phương pháp biểu hiện tạm thời ở thực vật thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens (agroinfiltration) đang được xem là một giải pháp hữu
hiệu, đơn giản, an toàn và có thể cho phép sản xuất vaccine với số lượng lớn và nhanh
chóng (1–2 tháng) đáp ứng kịp thời khi dịch bệnh xảy ra. Mô hình này đã được nhóm
nghiên cứu của TS. Phan Trọng Hoàng và cộng sự tại Viện nghiên cứu di truyền và

cây trồng thực vật CHLB Đức nghiên cứu với nhiều thành công trong việc tạo ra các
kháng nguyên HA dạng monomer và trimer có và khơng có ELP hố hay các dạng
HA oligomer. Dạng trimer của HA đã được chứng minh là giúp tăng cường đáp ứng
miễn dịch hơn so với dạng HA monomer. HA trimer đã tạo ra các kháng thể trung
hịa có khả năng tương tác với cả các hạt có cấu trúc giống virus đồng dạng từ thực
vật và virus cúm A/H5N1 dị chủng đã bị bất hoạt. Đáng chú ý, việc dung hợp ELP
vào kháng nguyên HA trimer không ảnh hưởng tới q trình trimer hóa hay tính sinh
miễn dịch của HA, nó làm tăng cường mức độ biểu hiện mạnh mẽ của protein HA
trimer được ELP hóa. Đặc biệt, các HA trimer ELP hóa có thể được tinh sạch dễ dàng
bằng quy trình mITC với tiềm năng có thể mở rộng quy mơ sản x́t [3]. Nhóm nghiên
cứu cũng đã chứng minh HA dạng oligomer được tạo thành từ các HA dạng trimer
trong thực vật dựa vào tương tác đặc hiệu của S·Protein và S·Tag có hoạt tính sinh
miễn dịch tốt hơn so với dạng HA trimer [4].
Căn cứ vào tình hình thực tiễn và các luận cứ khoa học trên, đề tài “Nghiên
cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin (HA) tái tổ hợp của virus cúm A/H5N1
bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá và đánh giá khả năng
sinh miễn dịch” đã được lựa chọn cho luận án này.
2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
1) Tạo được kháng nguyên HA A/H5N1 tái tổ hợp bằng phương pháp biểu hiện
tạm thời trên cây thuốc lá.
2) Đánh giá được khả năng gây đáp ứng miễn dịch của các kháng nguyên HA
A/H5N1 tự nhiên và nhân tạo ở các dạng trimer, oligomer TP và oligomer ELP

3

tái tở hợp có nguồn gốc từ thuốc lá.
3) Đề xuất được ứng viên tiềm năng cho định hướng phát triển vaccine phòng
bệnh cúm gia cầm A/H5N1 ở Việt Nam.
3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án

Nội dung 1: Lựa chọn gen mã hoá kháng nguyên HA của các chủng virus cúm
A/H5N1
Nội dung 2: Thiết kế các cấu trúc vector biểu hiện ở thực vật mang gen mã hoá
kháng nguyên HA và đánh giá sự biểu hiện tạm thời kháng nguyên HA của virus cúm
A/H5N1 trên cây thuốc lá.
Nội dung 3: Tinh sạch, đánh giá trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng
kết hồng cầu của các kháng nguyên HA tái tổ hợp.
Nội dung 4: Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên HA
tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm.

4

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Virus cúm A/H5N1
1.1.1. Phân loại và đặc tính của virus cúm A/H5N1
Virus cúm A/H5N1 (Influenza A virus subtype H5N1) thuộc họ
Orthomyxoviridae, chi Alphainfluenzavirus, loài virus cúm A (Influenza A virus).
Virus cúm A được phân loại thành các phân nhóm theo sự kết hợp của hai
protein bề mặt virus hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Cho đến nay có 18
phân nhóm HA khác nhau và 11 phân nhóm NA khác nhau và trong tự nhiên các phân
nhóm HA và NA có thể tái tổ hợp luân chuyển (reassortment) tạo nên các phân type
HxNy mới. Tùy thuộc vào vật chủ gốc, virus cúm A có thể được phân loại là cúm gia
cầm (ví dụ: cúm gia cầm A/H5N1, A/H9N2, A/H5N6… ), cúm lợn (ví dụ: cúm lợn
A/H1N1, A/H3N2…) hoặc các loại virus cúm động vật khác.
Virus cúm A có phở thích ứng rộng có thể gây bệnh trên nhiều đối tượng vật
chủ khác nhau như: chim, gia cầm, thuỷ cầm, lợn, ngựa, hải cẩu, cá voi và người. Đặc
điểm thích ứng đa vật chủ là điều kiện thuận lợi cho virus cúm A trao đổi hoặc tái tổ
hợp các phân đoạn gen (đặc biệt là gen kháng nguyên HA và NA) giữa các chủng lưu
hành để tạo ra chủng virus cúm mới có khả năng thích ứng xâm nhiễm ở loài vật chủ

mới. Đặc biệt hơn, các phân type hay chủng mới gây bệnh khi chúng vượt qua được
“rào cản loài” (species-barrier) dễ dàng thích ứng lây nhiễm gây bệnh từ gia cầm
sang người và giữa người với người [5]. Sự xuất hiện của một loại virus cúm A mới
và rất khác biệt có khả năng lây nhiễm sang người và lây truyền từ người sang người
là rất có thể và có khả năng gây ra đại dịch cúm toàn cầu.
Virus cúm A/H5N1 gây bệnh nặng ở gia cầm và dẫn đến tỷ lệ tử vong cao nên
còn được gọi là virus cúm gia cầm thể độc lực cao (highly pathogenic avian influenza
virus, HPAIV) type A và phân type (subtype) H5N1, HPAI A(H5N1))
[ />Dưới kính hiển vi điện tử, hầu hết các hạt của virus (virion) có dạng hình cầu
đường kính từ 50–100 nm. Một số ít có dạng hình sợi đường kính 20 nm và dài từ
200–300 nm. Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài (envelope)
và lõi chứa RNA. Vỏ virus với bản chất là protein có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm

5

đã được đặc hiệu hóa để gắn protein màng của virus vào, bao gồm một số protein
được glycosyl hoá (glycoprotein) và một số protein dạng trần không được glycosyl
hoá (non-glycosylated protein). Protein bề mặt có cấu trúc từ glycoprotein, bao gồm
protein gây ngưng kết hồng cầu HA, protein enzyme cắt thụ thể NA và protein đệm
M (matrix). Lipid tập trung ở màng virus, chủ yếu là lipid có gốc photpho, số còn lại
là cholesterol, glucolipid và một ít carbohydrate gồm các loại đường galactose,
mannose, ribose, fructose, glucosamin. Bên trong virus có cấu trúc phức tạp gồm
protein capsid và các sợi RNA nối với nhau thành các nucleocapsid có cấu trúc đối
xứng xoắn. Vỏ của virus được cấu tạo bởi 2 lớp lipid, trên bề mặt có khoảng 500 các
gai khác nhau nhô lên từ bề mặt của virus, mỗi gai có độ dài từ 10–14 nm. Các gai
này được cấu tạo bởi hai loại glycoprotein HA và NA. Các gai HA thường nhiều hơn
và xen kẽ với các gai NA với tỷ lệ là (4–5):1.

Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc của virus cúm A [8].

Hệ gen virus cúm A/H5N1 là RNA sợi đơn âm, gồm 8 phân đoạn RNA riêng
biệt (Hình 1.1), mã hoá cho 11 protein khác nhau của virus, các phân đoạn được sắp
xếp theo trật tự: PB2, PB1 (PB1 và PB1-F2), PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2), NS
(NS1 và NS2) [6]. Mỗi phân đoạn RNA của virus cúm A có cấu trúc xoắn bậc 2 α
đối xứng dài 50–100 nm, đường kính 9–10 nm, được bao bọc bởi nucleoprotein (NP)

6

với bản chất là lipoprotein, tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein của virus (vRNP)
(Hình 1.1). Các phân đoạn của hệ gen virus cúm A nối với nhau bằng các cầu nối
peptide tạo nên vòm (loop) tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và tạo thành một sợi
RNA duy nhất có độ dài từ 10.000–15.000 nucleotide (tuỳ theo từng chủng virus cúm
A) và có cấu trúc xoắn α (α-helix) bên trong vỏ virus. Phân tích thành phần hoá học
các hạt virus cúm A có chứa khoảng 0,8–1,1% RNA, 70–75% là protein, 20–24%
lipid và 5–8% là carbohydrate [7].
Về mặt dịch tễ học, virus cúm A có nhiều biến chủng khác nhau, thích ứng hầu
như với mọi loài vật chủ và hệ gen luôn luôn biến đổi, định kỳ gây nên những vụ dịch
cúm trong lịch sử ở động vật và người [6, 9]. Do đặc tính biến đổi nội gen nhanh
chóng và trao đổi gen để tái tổ hợp tạo biến thể mới lây truyền trong quần thể sinh
vật, cho nên virus cúm A thuộc nhóm virus nguy hiểm gây bệnh động vật sang người
(zoonotic infections). Virus cúm A/H5N1 được coi là loại biến chủng có mức độ độc
lực cao nhất cho các loài động vật và người, có nhiều minh chứng khoa học là chủng
này bắt nguồn từ H6N2 hoặc trao đổi gen thông qua H9N2 (trên lợn) [5, 10]. Virus
cúm A/H5N1 thể độc lực cao gây chết phôi gà gần như ngay lập tức nên không thể
sử dụng nguồn phôi gà để sản xuất vaccine vô hoạt cho gia cầm. Để khắc phục điều
này, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và các mạng lưới phòng thí nghiệm của WHO đã
kiến tạo thành công hướng sản xuất vaccine H5N1 bằng phương pháp di truyền ngược
(reverse genetics - based technology). Đây là phương pháp tạo virus nhân tạo tái tổ
hợp gen của virus cúm A/H5N1 đương nhiễm có khả năng gây miễn dịch nhưng

không gây bệnh. Tuy nhiên do virus cúm gia cầm A/H5N1 có nhiều biến đổi nội gen
và xảy ra nhanh nên việc sản xuất vaccine cũng gặp không ít khó khăn và đòi hỏi sự
cập nhật liên tục.
1.1.2. Cấu trúc, chức năng hệ gen của virus cúm A
Nhóm virus cúm A đều có hệ gen là RNA chứa 8 phân đoạn mã hoá cho 11
protein, có độ dài tùy từng phân type, được nối với nhau thành một sợi RNA liên tục,
nhưng hệ gen lại phân thành nhiều đoạn, mỗi phân đoạn chịu trách nhiệm mã hóa cho
một loại protein của virus. Hai đầu 5' và 3' của RNA hệ gen có hai chuỗi nucleotide
bảo tồn trong tất cả virus cúm A, đó là 5'-AGUAGAACAAGG... và 3'UCG(U/C)UUUCGUCC... [8]. Sáu phân đoạn từ 1–6, mỗi phân đoạn chịu trách
nhiệm mã hoá cho các protein riêng biệt, phân đoạn 7 và 8 mã hoá cho từng phần của

7

gen, mỗi gen mã hoá cho một phân tử RNA thông tin và mỗi phân tử RNA thông tin
này sau khi được xử lý nhờ cơ chế nối ghép (splicing) sẽ được dịch mã tổng hợp
protein [8]. Mỗi đoạn RNA được bao xung quanh bởi nucleoprotein (NP) tạo thành
cấu trúc ribonucleoprotein (RNP). RNP kết hợp với 3 loại polymerase PB2, PB1, PA
chịu trách nhiệm cho sự phiên mã và sao chép RNA của virus.
Phân đoạn 1 mã hoá cho enzyme polymerase PB2 (polymerase basic protein
2) là tiểu đơn vị của polymerase (RNA transcriptase) chịu trách nhiệm khởi đầu phiên
mã, có độ dài 2341 nucleotide, có trọng lượng phân tử theo tính toán là 84 kDa (thực
tế là: 87 kDa) [8].
Phân đoạn 2 mã hoá cho enzyme polymerase PB1 (polymerase basic protein
1) là tiểu đơn vị xúc tác của polymerase (RNAtranscriptase), có độ dài 2341
nucleotide, với trọng lượng phân tử tính toán là 87 kDa (thực tế: 96 kDa) [11].
Phân đoạn 3 mã hoá cho enzyme kéo dài phiên mã PA (polymerase acidic
protein 2) là tiểu đơn vị của polymerase (RNAtranscriptase) tham gia tổng hợp RNA,
có độ dài 2233 nucleotide, trọng lượng phân tử theo tính toán là 83 kDa (thực tế: 85
kDa) [11].

Phân đoạn 4 mã hóa cho hemagglutinin (HA) điều khiển quá trình tổng hợp
hemagglutinin (protein gây ngưng kết hồng cầu). Có 18 loại HA, trong đó chỉ có H1,
H2, H3 tìm thấy ở các virus gây bệnh cho người. Virus mang gen H5, H7 và H9 có
thể lây nhiễm từ chim sang người. HA được phân bố rải rác trên bề mặt của virus, là
protein kháng nguyên bề mặt type I liên quan đến sự bám dính của virus và gắn virus
vào thụ thể acid sialic của tế bào, có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu gà và
tham gia vào quá trình khởi đầu xâm nhiễm của virus, hợp nhất vỏ virus với màng tế
bào nhiễm và tham gia vào phản ứng trung hoà virus. HA có phân tử lượng là 63 kDa
(nếu không được glycosyl hoá), 77 kDa (nếu được glycosyl hoá, trong đó HA1 là 48
kDa và HA2 là 29 kDa) [12], chuỗi nucleotide có độ dài thay đổi tùy từng phân type
virus, đối với H5N1 là 1704–1707 bp, H7N1 là 1683–1695 bp, H9N1 là 1683 bp,
H1N1 là 1701 bp.
Phân đoạn 5 mã hoá cho protein nucleoprotein (NP) có trọng lượng phân tử
tính toán là 56 kDa, gen NP của H5N1 có độ dài là 1497 bp [8]. Nucleocapsid protein
(NP) là một loại protein được photphoryl hoá, có biểu hiện đặc tính kháng nguyên

8

đặc hiệu theo nhóm và tồn tại trong hạt virus theo dạng liên kết với mỗi phân đoạn
RNA, cho nên NP còn được gọi là ribonucleoprotein.
Phân đoạn 6 mã hóa cho protein neuraminidase (NA). NA có trọng lượng phân
tử theo tính toán 50 kDa (thực tế: 48–63kDa), độ dài cũng rất thay đổi, đối với H5N1
là 1350–1410 bp [12]. NA là protein màng type II tồn tại như các gai hình nấm trên
bề mặt của virus. NA vừa có vai trò kháng nguyên vừa có hoạt tính enzyme phân cắt
liên kết giữa thụ thể acid sialic và HA, để virus thực hiện quá trình giải phóng ra khỏi
tế bào, nhờ vậy mà đẩy nhanh quá trình lan truyền virus trong tế bào chủ. Chỉ có các
phân đoạn HA, NA (glycoprotein màng) của virus có chức năng bám dính vào màng
tế bào chủ bị tấn công rồi sau đó tiếp tục thực hiện quá trình xâm nhập, nhân lên và
giải phóng virus.

Phân đoạn 7 mã hoá cho phần đệm matrix protein MA, gồm 2 tiểu phần M1
và M2. Tiểu phần M1 là protein nền, là thành phần chính của virus, có chức năng bao
gói và tham gia vào quá trình nảy chồi của virus. Tiểu phần M2 là protein nội màng,
có chức năng là kênh ion vận chuyển sản phẩm của virus, trọng lượng phân tử tính
toán của M1 là 28 kDa (thực tế: 25 kDa), và M2 là 11 kDa (thực tế: 15 kDa), phân
đoạn M có độ dài khoảng 1027 bp [14]. M là protein màng không được glycosyl hóa,
mang tính chất protein đệm, có vai trò bao gói RNA của hệ gen virus và là kênh vận
chuyển các thành phần của virus qua màng.
Phân đoạn 8 mã hoá cho protein không cấu trúc NS (non-structural protein) có
độ dài ổn định trong tất cả các chủng cúm A và gồm hai tiểu phần protein không cấu
trúc NS1 và NS2. Tiểu phần NS1 có chức năng vận chuyển mRNA ra tế bào chất,
dịch mã, là protein kháng interferon và tiểu phần NS2 có vai trò vận chuyển RNP ra
khỏi nhân, trọng lượng phân tử tính toán NS1 là 27 kDa (thực tế: 25 kDa), của NS2
là 14 kDa (thực tế: 12 kDa), NS có độ dài 890 bp [15]. Nếu thiếu protein NS, virus
sinh ra sẽ khơng hồn chỉnh, trở thành virus thiểu năng.
1.1.3. Cấu trúc, chức năng của protein hemagglutinin
Protein HA là một trong hai kháng nguyên bề mặt đặc trưng cho bản chất của
từng chủng virus cúm A [16], có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình gây nhiễm
và góp phần rất lớn quyết định tính gây bệnh của virus. Protein HA có khả năng gây

9

ngưng kết tế bào hồng cầu gà trong ống nghiệm (in vitro), kháng thể đặc hiệu với HA
có thể ngăn cản sự ngưng kết đó, được gọi là kháng thể trung hoà và được sử dụng
trong xét nghiệm ức chế ngưng kết tế bào hồng cầu (hemagglutinin inhibition test,
HI). HA có các vị trí epitope quyết định tính kháng nguyên đặc hiệu của từng phân
type virus khác nhau và cũng là vị trí để kháng thể đặc hiệu liên kết trung hoà virus.
HA và NA cũng là đích cho các loại thuốc kháng virus trong điều trị bệnh sẽ gắn kết
và phát huy tác dụng diệt virus. Đồng thời HA còn có vai trò quan trọng trong việc

quyết định tính kháng nguyên trong sản xuất vaccine. Thay đổi cấu trúc amino acid
ở một số vị trí trên HA có thể làm “lệch” kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu sẽ
không hoặc kém tác dụng trung hòa đối với các biến chủng.
Có 18 phân type HA đã được phát hiện, trong đó có 3 phân type (H1, H2 và
H3) thích ứng lây nhiễm gây bệnh ở người liên quan đến các đại dịch cúm đã xảy ra
trong lịch sử [17]. Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstrom (Å), cấu
tạo gồm 3 đơn phân (trimer) (Hình 1.5), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ
hai tiểu đơn vị HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa). Các đơn phân HA sau khi tổng hợp
đã được glycosyl hóa (glycosylation) và phần tiểu đơn vị HA2 sẽ gắn vào mặt ngoài
capsid, còn phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi dưới đơn vị HA 1 chứa vị trí
gắn thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào đích. Sự biến đởi liên tục trong
gen mã hố kháng nguyên HA mà đặc biệt tại một số vị trí amino acid quan trọng của
protein HA như điểm cắt protease, vị trí bám dính thụ thể, vị trí epitope, vị trí glycosyl
hóa… đã hình thành nên các nhóm (clade) và phân nhóm (subclade) của virus cúm
A/H5N1 và là nguyên nhân gây ra các vụ dịch hằng năm.
Điểm cắt protease (cleavage site)
Protein HA gồm 2 đoạn là HA1 và HA2 nối với nhau bằng chuỗi oligopeptide.
Chuỗi oligopeptide nối giữa HA1 và HA2 thuộc loại hình riêng biệt, đặc trưng cho các
biến thể trong quá trình tái tổ hợp tạo nên biến chủng [18, 19]. Chuỗi này chứa một
số amino acid mang tính kiềm làm khung, thay đổi đặc hiệu theo từng loại hình phân
type. Sự biến đổi thành phần của chuỗi nối quyết định tính độc lực của virus thuộc
biến chủng mới [20]. Nếu ở điểm cắt của protease càng có nhiều amino acid kiềm
(arginine và lysine) thì khả năng HA được phân cắt càng lớn và quá trình xâm nhập
nội bào nhanh dẫn đến tăng độc lực của virus cúm A [18]. Đối với phân type H5N2

10

chuỗi nối này có cấu trúc VPQRKRKTR. Đối với các phân type H vô độc (hoặc
nhược độc) của H5N1, H5N2, H5N3, H4N6 và H11N1, loại hình của chuỗi nối này

có cấu trúc là VPQRETR [5, 21]. Đối với các chủng H5 cường độc, cấu trúc của chuỗi
nối là TPQRERRRKKR, trong đó RRRKK quyết định tính gây bệnh của H5N1. Sự
đột biến ‘‘giãn nở” chuỗi nối giữa HA1 và HA2 mã hóa cho các amino acid kiềm có
liên quan đến tiến trình tăng cường độc lực của virus. Ở các chủng thuộc phân dòng
Quảng Đông (Guangdong-like sublineage), các amino acid thông thường là RRRKK- [22], còn ở các chủng thuộc phân dòng Phúc Kiến (Fujian-like sublineage)
các amino acid của vùng chuỗi nối là -RRRK- [23]. Mức độ gây bệnh của virus cúm
A còn phụ thuộc rất lớn đến chức năng hoạt động của vùng tiếp nhận enzyme protease
để cắt rời HA khỏi thụ thể sialic acid của tế bào nhiễm [11]. Virus cúm A khơng có
gen tởng hợp enzyme protease, mà phải nhờ vào hỗ trợ của tế bào cơ thể bị nhiễm
virus. Càng có điểm cắt protease hoàn chỉnh và cắt đặc hiệu, càng có nhiều enzyme
tham gia cắt thụ thể, thì virus mới nhanh chóng xâm nhập vào tế bào thực hiện quá
trình nhân lên tạo nhiều virus mới và mức độ gây bệnh cũng vì thế mà nặng nề hơn.
Khi cơ thể gia cầm bị đa nhiễm nhiều vi khuẩn, đặc biệt là tụ cầu khuẩn
Staphylococcus và liên cầu khuẩn Streptococcus, thì hoạt động tương tác gây bệnh
của virus cúm A càng mạnh mẽ hơn, do các loại cầu khuẩn này có nhiều protease trợ
giúp cho virus cúm trong quá trình thực hiện cắt hemagglutinin khỏi thụ thể để gây
bệnh [24].

Hình 1.2. Mô hình cấu trúc hemagglutinin xuyên lớp màng bao lipid kép
Có 4 vùng biến đởi kháng nguyên chính, và 1 vị trí gắn với thụ thể trên mỗi
HA [26]

11

Vùng kỵ nước (hydrophobic site)
Trên phân tử HA có hai vùng kỵ nước ở tận cùng đầu N và đầu C. Vùng kỵ
nước ở đầu tận cùng N định hướng cho protein ra khỏi màng tế bào và bị cắt bỏ khỏi
HA trưởng thành, còn vùng tận cùng đầu C (gốc amino acid từ 186–211 của HA2) có
nhiệm vụ neo giữ phân tử protein trên vỏ virus [25].

Bảng 1.1. Các gốc amino acid ở các vị trí điểm cắt protease, vị trí bám dính thụ thể,
vị trí liên kết thụ thể, vị trí epitope và một vị trí glycosyl hoá bị biến đổi của các H5
từ một số chủng virus A/H5N1 khác nhau

Ghi chú: Các chữ in đậm của amino acid thể hiện một sự thay đổi khi so sánh
với các chủng khác trong cùng clade. Dk, duck; Ck, chicken; BHG, black
headed gull; HK, Hong Kong; Mdk, muscovy duck; VN, Vietnam; sw, swallow;
MalDk, mallard Gs, goose [1].

Vị trí bám dính thụ thể (receptor bingding site)
Sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid) trên bề
mặt màng tế bào, khởi đầu quá trình xâm nhiễm của virus trên vật chủ giúp cho virus

12

xâm nhập, hòa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện quá trình nhân lên ở trong
tế bào cảm nhiễm. Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không gian
của thụ thể chứa sialic acid của tế bào đích với vị trí gắn của thụ thể này trên phân tử
HA của virus cúm, và quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các loài vật chủ
khác nhau [26]. Tính đặc hiệu trong việc bám dính thụ thể của kháng nguyên HA là
một yếu tố quan trọng quyết định phổ vật chủ của virus cúm. Virus cúm gia cầm ưu
tiên gắn với thụ thể sialic acid liên kết với phân tử đường galactose góc quay α-2,3,
trong khi đó ở lợn và người virus cúm có thụ thể thích hợp với góc quay α-2,6. Vị trí
amino acid 226 (aa 226) của tiểu đơn vị HA1 được xác định là vị trí quyết định phù
hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu. Ở hầu hết các chủng virus cúm A lưu hành trong tự
nhiên vị trí này là glycine, thích ứng với thụ thể Gal α-2,3 sialic acid (chứa sialic acid
liên kết với nhóm hydroxyl (4-OH) của galactose ở góc quay α-2,3) của tế bào biểu
mô đường hô hấp của chim và gia cầm (vật chủ tự nhiên của virus cúm A). Ở các
chủng virus cúm A/H1N1, A/H2N2 và A/H3N2 gây bệnh ở người, vị trí này trên

protein HA là leucine, thích ứng với thụ thể Gal α-2,6 sialic acid có mặt ở tế bào biểu
mô đường hô hấp dưới của người. Các tế bào cảm thụ với virus cúm A của lợn có cả
hai loại thụ thể này, do đó lợn được coi là vật chủ trung gian để virus cúm A tiến hóa
thích ứng lây nhiễm sang người [11]. Ngoài ra, một số vị trí amino acid khác là
glutamine 222, glycine 224, hay cấu trúc SGVSS và NGQSGR cũng có sự liên quan
chặt chẽ đến khả năng thích ứng với thụ thể chứa sialic acid bề mặt màng tế bào chủ
[16, 27].
Các vị trí glycosyl hóa
Ở virus cúm A/H5N1, glycosyl hoá là sự gắn kết của một chuỗi carbonhydrate
(oligosaccharide) vào amino acid asparagine (N) ở một số vị trí nhất định trong chuỗi
polypeptide HA hay NA hay một số polypeptide khác. Thông thường chuỗi
oligosaccharide được gắn tại vị trí NXS hoặc NXT (trong đó, N: asparagine, X: amino
acid bất kỳ, trừ proline, S: serine hoặc T: threonine). Glycosyl hóa trong HA rất quan
trọng đối với sự gấp khúc và ổn định của protein [28], và trong một số trường hợp
ảnh hưởng đáng kể đến sự gắn kết và phân cắt thụ thể của protein HA, ảnh hưởng đến
độc lực và tính kháng nguyên của virus [29]. Hiện tượng “lệch kháng nguyên” sinh
ra do đột biến điểm ở một vị trí nào đó hình thành nên bộ mã của asparagine, tạo tiền
đề cho hiện tượng glycosyl hoá xảy ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA hay NA,

13

làm thay đổi biểu hiện đặc tính kháng nguyên của HA và NA, giúp cho virus thoát
khỏi tác động miễn dịch bảo hộ của cơ thể chủ và điều hoà sự nhân lên của virus [30].
Protein HA có 7 vị trí glycosyl hoá trong đó vị trí amino acid 170–172 thường có sự
thay đổi giữa các chủng thuộc các clade khác nhau, ví dụ các chủng thuộc clade 2.3.2,
2.3.2.1, 2.3.2.1a, b, c là DNA, trong khi các chủng thuộc clade 2.3.4, 7.1 và 7.2 là
NNT, các chủng thuộc clade 1, 1.1, 1.1.1 và 1.1.2 là NST, và chủng thuộc clade 0 là
NSA [1].
Vị trí epitope

Epitope là vị trí quan trọng trong gen HA, quyết định tính kháng nguyên, sản
sinh kháng thể trung hoà chống lại virus cúm tương ứng. Do đó, epitope sẽ mang tính
quyết định trong việc sử dụng gen HA cho sản xuất vaccine phòng virus cúm. Có 4
vị trí epitope trong protein HA của A/H5N1 gồm: 1) Vị trí amino acid 69: đối với các
nhóm clade 0, 1.1, 1.1.1 hay 1.1.2 là R, trong khi các clade còn lại là K; 2) Vị trí
amino acid 99–102: có sự đa dạng giữa các clade khác nhau chẳng hạn clade 0, clade
7.1 và 7.2 ASPA; clade 1, 1.1, 1.1.1, 1.1.2, nhóm clade 2.3.2, 2.3.2.1, 2.3.2.1 a, b, c
là ANPA, ngoài ra clade 2.3.2.1 có nguồn gốc Hàn Quốc là AKPA); 3) Vị trí 140–
145 và 152–157 cũng có sự đa dạng, thậm chí ngay trong một clade cũng có sự thay
đổi, ví dụ cùng thuộc clade 2.3.2.1c nhưng chủng A/Dk/VN/HT5 (2014) clade
2.3.2.1c có epitope là NHEVSL, còn chủng A/Ck/VN/KH23(2013) có epitope là
DHEASL [1].
Trình tự mã hóa chuỗi nối và thành phần chuỗi nối trên protein HA cũng như
các vị trí amino acid liên quan đến khả năng gắn với thụ thể thích ứng, được coi là
các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phân tích gen kháng nguyên HA [16]. Protein
HA kích thích cơ thể tạo ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng type HA và
tham gia vào phản ứng trung hòa virus. Vì thế HA được coi là protein vừa quyết định
tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus vừa là đích của bảo vệ miễn dịch
nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm và là cơ sở trong điều chế
các vaccine phòng cúm hiện nay [16, 31].
1.1.4. Biến đổi thành phần hemagglutinin tạo nên các clade của virus A/H5N1
Sự tiến hoá của virus cúm gia cầm A/H5N1 có thể làm thay đổi tính kháng
nguyên dẫn đến ảnh hưởng đáp ứng miễn dịch của gia cầm khi được tiêm phòng

Nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin (HA) tái tổ hợp của virus cúm a h5n1 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá và đánh giá khả năng sinh miễn dịch

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về