Định lượng Bacillus cereus

ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS CEREUS
NHÓM 7


Tình hình ơ nhiễm Bacillus cereus
2

Đặc điểm sinh học
Cơ sở phân tich

4

3

Quy trình phân tich
Dụng cụ, mơi trường và thiết bị

6

1

5

Giải thích quy trình
An tồn trong phân tich

7


1

Tình hình ơ nhiễm Bacillus cereus

Bacillus cereus có mặt khắp nơi trong tự
nhiên và có thể được tìm thấy trong nhiều loại
đất, trầm tích, bụi và thực vật. Bào tử có
thể lây lan một cách thụ động và do đó cũng
được tìm thấy bên ngồi mơi trường sống
tự nhiên. B.cereus có thể nảy mầm, phát
triển và tạo bào tử trong đất, do đó thể hiện
vịng đời hoại sinh. Ruột của cơn trùng có
thể làm mơi trường sống cho B. cereus khi
vi khuẩn tạo bào tử, được phân lập từ ruột
của các loài chân đốt sống trong đất, nơi vi
khuẩn dường như tồn tại cộng sinh với vật chủ
là động vật không xương sống của chúng


1

Tình hình ơ nhiễm Bacillus cereus

Ngồi vịng đời đầy đủ trong đất, B. cereus cũng thích nghi với lối sống trong
vật chủ, như một mầm bệnh hoặc có thể là một phần của hệ thực vật đường ruột,
cũng như để phát triển trong các loại thực phẩm. Khả năng thích nghi của B.
cereus với mơi trường ruột động vật có thể là cơ sở cho tác dụng lợi khuẩn
được đề xuất của chúng. Việc sử dụng như vậy không thể được coi là an tồn đối
với con người vì tất cả các chủng B. cereus đều có thể tạo ra ít nhất một
trong các độc tố liên quan đến bệnh tiêu chảy. Tuy nhiên, một số chủng tạo ra
một lượng độc tố không đáng kể ở 37 C đã được Cơ quan An toàn Thực phẩm
Châu Âu (EFSA) cho phép sử dụng chế phẩm sinh học.

1

Tình hình ơ nhiễm Bacillus cereus

• Bacillus cereus có thể được phân lập từ nhiều loại thực phẩm và thành
phần thực phẩm khác nhau, bao gồm gạo, các sản phẩm từ sữa,
gia vị, thực phẩm khơ và rau.
• Khi thu hoạch, tế bào hoặc bào tử B. cereus có thể đi cùng nguyên liệu
thực
vật vào các khu vực sản xuất thực phẩm và hình thành trên thiết bị chế
biến thực phẩm.
• Bacillus cereus là chất gây ơ nhiễm phổ biến trong sữa, và nó có thể
gây ra
một khuyết tật được gọi là sữa đông ngọt trong các sản phẩm sữa. Bào tử hoặc
tế bào của B. cereus có thể gây ơ nhiễm bầu vú của bị trong q trình
chăn thả, hoặc xâm nhập vào trang trại bò sữa qua vật liệu lót chuồng
hoặc thức ăn.


1

Tình hình ơ nhiễm Bacillus cereus

Xét đến sự hiện diện phổ biến của
B.cereus, khơng loại thực phẩm nào
có độ pH> 4,8 có thể bị loại trừ
như một phương tiện có thể xảy ra hoặc
là một nguy cơ hư hỏng thực phẩm hoặc

bệnh do thực phẩm. Người tiêu dùng
không tuân thủ các quy tắc chuẩn bị
thực phẩm cơ bản, tức là làm lạnh chậm
hoặc không đủ, bảo quản ở nhiệt độ môi
trường xung quanh hoặc giữ nhiệt kéo dài
ở <60 C, có thể cho phép B. cereus
phát triển


2

Đặc điểm sinh học

Là trực
khuẩn Gram
dương, nội
bào tử

Kích thước 0,51,5 x 2-4

Không tạo giáp
mô và không
di động


2

Đặc điểm sinh học

Đặc điểm ni cấy:

Hiếu khí và khị khí tùy ý. Nhiệt độ 5-50, tối ưu 35-40. pH 4,5-9,3 thích hợp 7-7,2

Trên mơi trường NA hay TSA sau 24 giờ tạo nhóm lớn, nhăn nheo, xù xì

Trên mơi trường MYP: khóm hồng xung quanh có vịng sáng.

Trên mơi trường Mossel: khóm to hồng chung quanh có vịng sáng.

Trên môi trường canh NB, TSB: đục tạo váng, sau cặn lợn cợn


2

Đặc
Đặcđiểm
điểmsinh
sinh học
học

Tính chất sinh hóa

Trên mơi trường đường: lên men glucose trong điều kiện hiếu khí và khị khí, khơng lên m

Phản ứng khử VP (+) Phân giải Tyroxin Khử nitrat bằng nitrit

Catalase (+), Citrate (+)

Mọc trên NB + 0,001% lyzozym

2

Đặc
Đặcđiểm
điểmsinh
sinh học
học

Đặc điểm gây bệnh - độc tố - triệu chứng:
- Độc tố:

Diarhoed
Toxin

Emetic Toxin

• Độc tố gây tiêu chảy
• Vi khuẩn sản sinh độc tố trên thịt, rau quả, gia vị.
Bản chất là một loại protein gây phân hủy hoại biểu
bì và niêm mạc ruột gây tiêu chảy có thể nguy hiểm
đến tinh mạng.

• Độc tố gây nơn mữa
• Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm nguội, đậu các
loại. Bản chất độc tố là phospholipit có tinh ổn
định cao khơng bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch
dạ dày.


2

Đặc điểm sinh học

Đặc điểm gây bệnh - độc tố - triệu chứng:
• Ngồi ra vi khuẩn cịn có enzyme
hemolyzin là một loại protein gây độc mạnh
có thể gây chết người. Độc tố này có thể bị
trung hịa bởi cholesterol trong huyết thanh
nhưng nó có thể góp phần cho sự phát triển
của vi khuẩn.
• Bacillus Cereus có thể gây nhiễm trùng và
nhiễm độc khác nhau như: nhiễm trùng máu,
viêm màng não và nhiễm trùng mắt.


2

Đặc điểm sinh học

Đặc điểm gây bệnh - độc tố - triệu chứng:
- triệu chứng gây độc
Thực ăn chứa mật độ vi khuẩn: 105 vi khuẩn/g thực phẩm đủ gây độc

Biểu hiện: đau bụng, buồn nôn, nôn sau 1-5 giờ ăn phải thực phẩm nhiễm vi khuẩn. B

Biện pháp phòng ngừa: không ăn thức ăn để nguội qua đêm, thức ăn ln hâm nóng trên


3

Cơ sở phân tich

• TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 4992 : 2005 (ISO 7932 :
2004): VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN
NUÔI – PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS CEREUS GIẢ
ĐỊNH TRÊN ĐĨA THẠCH – KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC Ở 30OC.
• TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 6404:2016 (ISO
7218:2007 WITH AMENDMENT 1:2013): VI SINH VẬT TRONG
THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - YÊU CẦU CHUNG VÀ
HƯỚNG DẪN KIỂM TRA VI SINH VẬT.


3

Cơ sở phân tich

Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này qui định phương pháp định lượng Bacillus cereus giả định
có khả năng mọc được trên đĩa thạch bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở
30oC. Tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho:
• Các sản phẩm dùng cho con người và thức ăn chăn ni.

• Các mẫu mơi trường trong khu vực sản xuất và xử lý thực phẩm.


3

Cơ sở phân tich

Thuật ngữ - định nghĩa

Bacillus cereus giả định (presumptive Bacillus cereus)
Để cho phương pháp thử mang tinh thực tiễn thì giai đoạn khẳng định đã giới
hạn về thử điển hình trên thạch MYP và thử hồng cầu. Do đó, thuật ngữ "giả
định" đã được đưa vào để công nhận thực tế là giai đoạn khẳng định không thể
phân biệt được B.cereus với các lồi Bacillus khác có liên quan mật thiết.


3

Cơ sở phân tich

Nguyên tắc
• Cấy một lượng mȁu thử qui định nếu sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặc
một lượng huyền phù ban đầu qui định nếu các sản phẩm ở dạng khác, lên bề mặt
môi trường cấy đặc chọn lọc đựng trong các đĩa Petri.
• Chuẩn bị các đĩa khác trong cùng một điều kiện, sử dụng các dung
dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu.
• Ủ trong các điều kiện hiếu khí các đĩa ở 30oC từ 18 h đến 48 h.
• Tính số lượng B.cereus trong một mililit hoặc trong một gam mȁu từ số lượng
khuẩn lạc khẳng định thu được trên các đĩa ở các độ pha loãng đã chọn sao cho kết
quả có ý nghĩa và được khẳng định theo phép thử qui định.


3

Cơ sở phân tich

Phép thử

Kết quả khẳng định Bacillus cereus giả định

Thạch MYP

Hình thành khuẩn lạc màu hồng được bao quanh
bởi một vùng kết tủa.

Thử hồng cầu trên thạch huyết cừu

Phản ứng dương tinh, độ rộng của vùng hồng cầu
có thể thay đổi


3

Cơ sở phân tich

Quyết định 46/2007/QĐ-BYT
GIỚI HẠN B. cereus
Sản phẩm
Sữa dạng bột
Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ, đậu đỗ: bột, miến,
mỳ sợi (có xử lý nhiệt trước khi sử dụng)
Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ, đậu, đỗ: bánh,
bột (dùng trực tiếp, không qua xử lý nhiệt trước khi sử dụng)
Rau quả muối, rau quả khô
Thức ăn khô và thức ăn dinh dưỡng cho trẻ em, thức ăn thay
thế đặc biệt (phải xử lý nhiệt trước khi sử dụng)

(Trong 1g hoặc 1ml sản phẩm)
102

102
10
102
102

Thức ăn khô và thức ăn dinh dưỡng cho trẻ em, thức ăn thay
thế đặc biệt (dùng trực tiếp, không qua xử lý nhiệt trước khi
sử dụng)

10


3

Cơ sở phân tich
QCVN 8-3: 2012/BYT
Giới hạn cho phép B. cereus giả định (CFU/ml hoặc
CFU/g)

Sản phẩm
m

M

5x101

5x10

Sản phẩm dinh dưỡng công
thức dạng bột cho trẻ đến12

2

tháng tuổi
Sản phẩm dinh dưỡng công
thức với các mục đích y tế
đặc biệt cho trẻ đến 12
tháng tuổi

5x101

5x10
2


4

Quy trình phân tich


4

Quy trình phân tich


4

Quy trình phân tich
Bảng dụng cụ

STT

Dụng cụ

Mục đích

1

Bình tam giác

Chứa dung dịch hóa chất, chứa mȁu

2

Pipet

Vận chuyển một lượng thể tich (huyền phù hoặc dung
dịch pha lỗng) xác định

3

Đĩa petri

Ni cấy vi sinh vật

4

Que cấy trải

Trải đều dịch mȁu lên khắp bề mặt đĩa

5

Quy trải

Trải mȁu vật, làm mịn bề mặt thạch


4

Quy trình phân tich
Bảng mơi trường và hóa chất
Mơi trường và hóa chất

Mục đích

SPW (Saline Peptone Water) Pha lỗng mȁu
MYP agar base (Mannitol Egg Yolk - Polymixin)
Polymixin B

Nuôi cấy B.cereus

Egg Yolk
Blood agar base

Khẳng định B.cereus giả định

Sheep blood

Được bổ sung vào môi trường nhằm tăng khả năng

phát triển cho các lồi vi sinh vật khó mọc

HCl và NaOH 10%

Điều chỉnh pH


4

Quy trình phân tich
Bảng thiết bị

STT

Thiết bị

Mục đích

1

Cân

Cân lượng mȁu rắn

2

Máy lắc vortex

Trộn mȁu

3

Máy dập Stomacher

Đồng nhất mȁu và dịch pha lỗng

4

Máy đếm khuẩn lạc

Nhìn thấy độ khuếch đại của khuẩn lạc để dễ dàng đếm

5

Nồi hấp tiệt trùng

Tiệt trùng vi khuẩn cho các thiết bị, dụng cụ và hóa chất

Cân

Máy lắc vortex

Máy dập
Stomacher


Máy đếm khuẩn lạc

Nồi hấp
tiệt

trùng