Thu nhận chế phẩm enzyme protease ruột cá basa

NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME PROTEASE TỪ RUỘT
CÁ BASA (Pangasius bocourti)
Trần Quốc Hiền
(1)
, Lê Văn Việt Mẫn
(2)
(1)

Trung tâm Công nghệ Sau thu hoạch, Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II
(2) Trường Đại học Bách khoa, ĐHQG-HCM
1.MỞ ĐẦU
Ngành chế biến thủy sản trong nước và trên thế giới hàng năm thải ra một lượng lớn
các phụ phế phẩm cần được xử lý hoặc chế biến tiếp. Phụ phẩm thủy sản thường là nội
tạng, đầu, xương, da... Để giải quyết một lượng lớn phụ phẩm như hiện nay, tại Việt Nam
và trên thế giới đang có xu hướng tận thu phần phụ phẩm để chế biến thành các sản phẩm
có giá trị gia tăng[1]. Một số phụ phẩm có giá trị dinh dưỡng cao dùng để chế biến thành
bột cá, dầu cá… [4]. Ngoài ra các sản phẩm như: chế phẩm enzyme, peptide có hoạt tính
sinh học, màng sinh học được chế biến từ một số loại phụ phẩm thủy sản có thể mang lại
những hiệu quả kinh tế rất lớn cho con người [8].
Tại Việt nam hiện nay, phụ phẩm của cá tra, basa được sử dụng chủ yếu làm thức ăn
cho gia súc, thủy sản và làm phân bón. Việc thu nhận chế phẩm enzyme protease từ ruột
cá basa là một vấn đề được đặt ra nhằm khai thác và sử dụng hiệu quả hơn phụ phẩm của
ngành chế biến thủy sản.
2.NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.Nguyên liệu
Nội tạng của cá basa do nhà máy chế biến thủy sản Vĩnh Long cung cấp. Sau khi giết
mổ, nội tạng được bảo quản ở nhiệt độ -20
o
C. Thời gian bảo quản nội tạng càng ngắn
càng tốt để tránh hiện tượng enzyme bị biến tính.
Muối amonium sulfat, ethanol, aceton và isopropanol được sử dụng như là những tác

nhân để kết tủa enzyme. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này đều do Trung Quốc
sản xuất.
2.2.Phương pháp nghiên cứu
Ruột cá basa được cắt nhỏ đến kích thước 4 x 8 (mm x mm) và được phối trộn với
dung môi theo tỷ lệ thích hợp. Nhiệt độ dung môi trước khi phối trộn là 2-4
o
C. Tiếp theo,
hỗn hợp được nghiền trong thiết bị Ik T25 (Đức) với vận tốc 9000v/phút trong thời gian 3
phút trước khi quá trình trích enzyme bắt đầu. Trong quá trình nghiền, nhiệt độ hỗn hợp
không vượt quá 5
o
C.
Việc tối ưu hóa quá trình chiết enzyme từ ruột cá basa được thực hiện theo phương
pháp qui hoạch thực nghiệm. Ý nghĩa của các hệ số phương trình hồi qui được kiểm tra
theo tiêu chuẩn Student và sự tương thích của phương trình hồi qui với thực nghiệm được
kiểm tra theo tiêu chuẩn Fisher [3].
Các phương pháp phân tích
Hoạt tính protease được xác định theo phương pháp Anson cải tiến [1]. Hàm lượng
protein được xác định theo phương pháp Lowry [1]
Cụng thc tớnh toỏn
Hot tớnh riờng l s n v hot tớnh enzyme c tớnh trờn 1mg protein ca ch
phm. Hiu sut thu hi protease l t l gia tng hot tớnh enzyme thu c sau quỏ
trỡnh tinh sch v tng hot tớnh enzyme trong mu trc khi em tinh sch.
tinh sch l t l gia hot tớnh riờng ca enzyme thu c sau quỏ trỡnh tinh sch
v hot tớnh riờng ca mu enzyme trc khi em tinh sch
3.KT QU V BN LUN
3.1.Trớch ly enzym protease t rut cỏ Basa
3.1.1.Xỏc nh t l khi lng ni tng/ dung mụi (w/w) cho quỏ trỡnh trớch ly
enzyme protease
Rut cỏ basa c em trớch ly bng nc ct nhit 30

0
C trong thi gian l 10
phỳt. T l rut/ nc ct (w/w) c thay i ln lt l: 1/1; 1/2; 1/3; 1/4 v 1/5. Kt
qu thc nghim c trỡnh by hỡnh 1.
12.421
8.579
4.808
4.161
5.748
0
5
10
15
1/11/21/31/41/5
Tyỷ leọ (w/w)
Toồng hoaùt tớnh protease
(UI/gCKNT)

12.79
12.95
15.67
13.88
12.31
9.88
12.39
0
5
10
15
20

789101112H2O
pH
Toồng hoaùt tớnh protease
(UI/g CKNT)

Hỡnh 1. nh hng ca t l rut/dung mụi
n quỏ trỡnh trớch ly protease t rut cỏ
Hỡnh 2. nh hng ca pH dung mụi n quỏ
trỡnh trớch ly protease t rut cỏ
Chỳng tụi nhn thy rng dch trớch ly enzyme thu c cú tng hot tớnh protease
cao nht l 12,42UI/g CKNT (cht khụ ni tng) tng ng vi t l rut/ dung mụi l
1/1(w/w).
Theo lý thuyt, khi tng lng dung mụi thỡ quỏ trỡnh trớch ly enzyme t nguyờn liu
vo dung mụi s tr nờn d dng hn. Tuy nhiờn, khi ta thay i t l rut v nc ct s
dng trong quỏ trỡnh trớch ly thỡ giỏ tr pH dch trớch cng thay i theo v nú nh hng
n hũa tan v kh nng khuch tỏn ca cỏc protein t rut vo dch trớch. Khi chỳng
tụi tng lng nc ct lờn nhiu hn so vi t l rut/dung mụi =1/1(w/w) thỡ tng hot
tớnh protease ca dch trớch ly s gim.
3.1.2.Xỏc nh pH trớch ly
Thụng thng, h enzyme protease trong rut nhúm cỏ da trn hot ng ti u trong
vựng pH kim [5]. Chỳng tụi tin hnh trớch ly protease t rut cỏ basa, s dng cỏc dung
dch m cú giỏ tr pH khỏc nhau nh sau: dung dch m 0,2 N phosphate (pH 7,0), m
0,2 N Tris-HCl (pH 8,0) v m 0,2 N Glycine-NaOH (pH 9,0-12,0). Nc ct c
chn lm dung mụi i chng.
Chọn tỷ lệ nội tạng/ dung mơi là 1/1 (w/w), nhiệt độ và thời gian trích ly lần lượt là
30
o
C và 10 phút. Kết quả được trình bày ở hình 2.
Chúng tơi nhận thấy rằng tổng hoạt tính protease của dịch chiết thu được sẽ thay đổi
khi ta sử dụng các dung dịch đệm có giá trị pH khác nhau để trích ly enzyme. Dịch trích

ly từ ruột có tổng hoạt tính protease cao nhất (15,67UI/g CKNT) khi sử dụng dung dịch
đệm có giá trị pH 9,0. Khi tăng pH từ 7,0 đến 9,0, tổng hoạt tính protease của dịch trích
ly enzyme thu được tăng từ 12,79 đến 15,67UI/g CKNT, tức tăng 22,5%. Tuy nhiên, nếu
ta tiếp tục tăng giá trị pH từ 9,0 đến 12,0 thì tổng hoạt tính protease của dịch trích ly
enzyme thu được sẽ giảm.
So với mẫu kiểm chứng sử dụng dung mơi là nước cất, khi sử dụng dung dịch đệm
pH 9,0 để trích ly enzyme từ ruột thì tổng hoạt tính protease thu được cao hơn gấp 1,59
lần.
3.1.3.Xác định nhiệt độ trích ly
Tiến hành trích ly protease kiềm từ ruột cá basa trong dung dịch đệm pH 9,0 với tỷ lệ
ruột/dung mơi là 1/1(w/w) trong thời gian 10 phút. Nhiệt độ trích ly được thay đổi lần
lượt là: 20, 30, 40, 50 và 60
o
C. Hoạt tính protease tổng của dịch trích ly thu được ở các
giá trị nhiệt độ khác nhau được trình bày ở hình 3.
Chúng ta thấy rằng: khả năng trích ly enzyme proease từ ruột cá basa phụ thuộc vào
nhiệt độ. Khi nhiệt độ tăng từ 20
o
C đến 40
o
C, sự khuếch tán và hòa tan enzyme từ ruột
vào dung mơi tăng theo, do đó tổng hoạt tính protease của dịch trích ly tăng từ 11,19 lên
15,81 UI/gCKNT, tức tăng 41,29%.
Khi chúng tơi tăng nhiệt độ trích ly cao hơn 40
o
C thì tổng hoạt tính enzyme thu được
bị giảm đi. Có lẽ khoảng nhiệt độ 50-60
o
C là thích hợp cho các phân tử protease xúc tác
thủy phân lẫn nhau. Hơn nữa, nhiệt độ cao có thể làm biến tính bất thuận nghịch enzyme.

3.1.4.Xác định thời gian trích ly
Tiến hành trích ly protease kiềm từ ruột cá basa trong dung dịch đệm 0,2 N Glycine-
NaOH pH 9,0 với tỷ lệ ruột/dung mơi là 1/1(w/w) ở nhiệt độ 40
o
C. Thời gian trích ly thay
đổi lần lượt là: 5, 10, 15, và 20 phút. Kết quả được trình bày ở hình 4.
11.19
15.7015.81
15.42
10.51
0
5
10
15
20
2030405060
Nhiệt độ(
o
C)
T o å n g h o a ï t t í n h p r o tea s e
(UI/g CKNT)

0.00
15.4115.43
15.79
14.81
0
5
10
15

20
05101520
Thời gian(phút)
Tổng hoạt tính protease
(UI/g CKNT)

Hình 3. Ảnh hưởng nhiệt độ đến q trình
trích ly protease từ ruột cá
Hình 4. Ảnh hưởng thời gian trích ly đến hoạt
tính protease thu nhận được từ ruột cá
Khi chúng ta tăng thời gian trích ly từ 5 phút lên 10 phút thì khả năng khuếch tán của
enzyme protease vào dung môi tăng. Với thời gian trích ly là 10 phút, dịch trích ly
enzyme từ ruột cho tổng hoạt tính protease cao nhất là15,79UI/g CKNT. Nếu ta kéo dài
thời gian trích ly vượt hơn 10 phút thì tổng hoạt tính protease thu được trong dịch chiết
không tăng nữa mà còn bị giảm nhẹ. Có lẽ do thời gian dài, các phân tử protease trong
dịch trích ly xúc tác phản ứng thủy phân lẫn nhau.
3.1.4.Tối ưu hóa điều kiện trích ly protease từ ruột cá Basa (pH, nhiệt độ) bằng
phương pháp qui hoạch thực nghiệm
Hai yếu tố pH và nhiệt độ trích ly được chọn để thực hiện qui hoạch thực nghiệm vì
chúng ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất chiết enzyme protease.
Hai yếu tố không thay đổi trong quá trình khảo sát là:
+ Tỷ lệ Ruột/ dung môi: 1/1(w/w)
+ Thời gian trích ly: 10 phút.
Chúng tôi sử dụng phương án trực giao cấp 2:
Số thí nghiệm tối ưu: N = 9, trong đó có một thí nghiệm ở tâm phương án. Ngoài ra,
chúng tôi thực hiện thêm ba thí nghiệm ở tâm nữa để kiểm tra ý nghĩa các hệ số của
phương trình hồi qui.
Hai yếu tố cần khảo sát là:
+ X
1

là pH dung môi trích ly với mức dưới: 8,5; tâm: 9,0 và mức trên: 9,5
+ X
2
là nhiệt độ trích ly với mức dưới 35
o
C, tâm 40
o
C và mức trên: 45
o
C
Hàm mục tiêu Y: Tổng hoạt tính protease thu được trong dịch trích ly (UI/g CKNT).
Ma trận qui hoạch thực nghiệm quá trình trích ly protease từ ruột cá Basa được trình
bày ở bảng 1
Bảng 1. Ma trận và kết quả qui hoạch thực nghiệm quá trình trích ly protease từ ruột cá
Basa

Mẫu thí
nghiệm
X
1
X
2

Y
(UI/g CKNT)
M
1
-

- 13.6161

M
2
- +

13.5490
M
3
0

- 14.4855
M
4
0 + 14.0125
M
5
+ - 15.7796
M
6
+ + 13.6581
M
7
- 0 12.6888
M
8
+ 0 13.7048
M
9
0 0 14.1111
M
10

0 0 14.2650
M
11
0 0 14.0330
M
12
0 0 14.0985
Phng trỡnh hi qui: Y=13.9562+0.481x
1
-0.4436x
2
-0.5136x
1
x
2
-0.3703x
1
2
+0.6819x
1
2
(1)
Ghi chỳ: (-): mc di ; (0): tõm; (+): mc trờn
Sau khi gii bi toỏn qui hoch thc nghim v tớnh cỏc h s phng trỡnh hi qui, ý
ngha ca cỏc h s c kim tra theo tiờu chun Student vi p = 0,05, s bc t do f =
3-1= 2, chỳng tụi thu c phng trỡnh hi qui (1)
Kim tra s tng thớch phng trỡnh hi qui vi thc nghim theo tiờu chun Fisher
vi F = 4,645; F
0,95
(9-2,3-1) = 19,3. Do F< F

0,95
(9-2,3-1) nờn phng trỡnh hi qui (1)
tng thớch vi thc nghim.
Phng trỡnh (1) vi h trc ta X
1
v X
2
nm trong khong [-1,1] c biu din
trờn hỡnh 5.
12
13
14
15
16
T oồn g h oaùt tớn h pro tease
(U I/g CKNT )
Nhieọt ủoọ (
o
C)
pH

Hỡnh 5. Tng hot tớnh protease ca dch trớch ly thu c t rut cỏ Basa trong thớ
nghim ti u húa qui hoch thc nghim
Chỳng tụi nhn thy rng c hai yu t pH v nhiờt u nh hng n quỏ trỡnh
trớch ly protease t rut cỏ basa theo mt qui lut phc tp. Giỏ tr cao nht ca hm mc
tiờu Y khi X
1
cú giỏ tr trong khong t 0,5 n 1,0 v X
2
cú giỏ tr trong khong t -1,0

n -0,75.
Chỳng ta cú th xỏc nh c pH v nhit ti u cho quỏ trỡnh trớch ly enzyme t
rut cỏ Basa khi gii phng trỡnh hi qui (1). Da theo kt qu thu c trờn hỡnh 5,
chỳng tụi chn iu kin thớch hp chit enzyme t rut cỏ basa cho nhng thớ nghim
tip theo nh sau: X
1
=1 v X
2
=-1 tng ng vi pH 9,5 v nhit chit 35
o
C.
3.2.Tinh sch enzyme protease trong dch chit t rut cỏ Basa bng tỏc nhõn
(NH
4
)
2
SO
4

Chỳng tụi ch kho sỏt s kt ta enzyme trong dch chit t rut cỏ basa ti nng
mui (NH
4
)
2
SO
4
bóo hũa l 70%. Chỳng tụi b sung mui (dng ht) vo dch chit