Tài liệu NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ THU NHẬN CHẾ PHẨM PROTEASE NGOẠI BÀO CỦA Bacillus amyloliquefacien N1 potx

279

TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, tập 71, số 2, năm 2012


NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ THU NHẬN CHẾ PHẨM
PROTEASE NGOẠI BÀO CỦA Bacillus amyloliquefacien N1
Đỗ Thị Bích Thủy
Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế

Tóm tắt. Một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng thu nhận chế phẩm protease
ngoại bào của chủng B. amyloliquefaciens N1, phân lập từ nem chua Huế, như
thành phần môi trường, nhiệt độ nuôi cấy, pH ban đầu và thời gian lên men đã
được nghiên cứu. Kết quả cho thấy rằng tinh bột hòa tan là nguồn carbon bổ sung
vào môi trường cơ bản (MTCB), có chứa 1% petone, 0,3% cao thịt và 0,5% NaCl,
làm cho quá trình thu nhận chế phẩm protease ngoại bào của B. amyloliquefaciens
N1 tốt nhất; hoạt độ protease trong môi trường nuôi cấy đạt được 0,758 HP/ml, lớn
hơn so với mẫu đối chứng (0,613 HP/ml) 1,2 lần. Trong tất cả các nguồn nitơ bổ
sung vào MTCB, chỉ có casein làm cho hoạt độ protease (0,758 HP/ml) cao hơn
mẫu đối chứng (0,511 HP/ml). Các thí nghiệm có bổ sung kết hợp các nguồn nitơ
và carbon vào môi trường nuôi cấy, hoạt độ protease không tăng so với khi khảo sát
ảnh hưởng riêng rẽ nguồn tinh bột. Trên cơ sở khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng
tinh bột (0,25%-1,75%) đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng này, hoạt
độ quan sát đạt được giá trị cao nhất (0,760 HP/ml) ở hàm lượng tinh bột 0,75%.
Môi trường nuôi cấy có thành phần thích hợp cho quá trình thu nhận chế phẩm
protease ngoại bào B. Amyloliquefaciens N1 được gọi là môi trường thích hợp
(MTTH). Nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens N1 trong MTTH, hoạt độ protease
đạt cao nhất ở pH ban đầu bằng 8 và nhiệt độ 35
o

C. Thời gian thu nhận enzyme
thích hợp nhất khi nuôi cấy chủng này trong các điều kiện trên là 32 giờ với hoạt
độ đạt được là 0,777 HP/ml.
Từ khóa: Bacillus amyloliquefaciens N1, môi trường, nhiệt độ, protease, thu nhận.

1. Đặt vấn đề
Protease là enzyme xúc tác thủy phân các mối liên kết peptide trong phân tử
protein. Nó được ứng dụng một cách rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công
nghiệp chế biến thực phẩm, y học, nông nghiệp, công nghiệp thuộc da, công nghiệp sản
xuất xà phòng và chiếm khoảng 60% thị trường enzyme.
Chế phẩm enzyme này có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như thực vật,
động vật và vi sinh vật. Tuy nhiên, hiện nay trên thế giới, đa số các chế phẩm enzyme
này được thu nhận từ vi sinh vật do có nhiều ưu điểm vượt trội như chu kỳ phát triển


280

ngắn, môi trường nuôi cấy rẻ, dễ điều khiển…. Vì vậy, hai phần ba protease ứng dụng
trong công nghiệp được sản xuất ra từ vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn. Quá trình thu
nhận các chế phẩm protease phụ thuộc rất nhiều yếu tố như tính chất nguyên liệu, tác
nhân vi sinh vật, điều kiện thu nhận Vì vậy, tùy từng trường hợp cụ thể, cần nghiên
cứu lựa chọn điều kiện thích hợp để thu nhận các chế phẩm protease phù hợp với mục
đích sử dụng.
Hiện nay, trên thế giới, các chế phẩm protease đã được thương mại hóa và được
đưa vào ứng dụng một cách rộng rãi. Tuy vậy, trong thời gian gần đây, trên thế giới,
nhiều nhà khoa học vẫn tiếp tục tiến hành nghiên cứu thu nhận, tinh chế, xác định các
tính chất của chế phẩm thu được (Gessesse et al., 2002; Mehrotra et al., 1999; Gajju et
al., 1996, Kim et al., 2001; Rai, Mussarat et al., 2009; ).
Ở Việt Nam cũng đã có một số nghiên cứu về protease vi sinh vật, tuy nhiên chỉ
mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (Lê Gia Hy et al., 2000, Lê Đức Mạnh et al.,

1995) , nghiên cứu ứng dụng enzyme vẫn còn hạn chế. Hiện nay, trong nước chưa có
cơ sở nào sản xuất chế phẩm enzyme, các chế phẩm sử dụng trong nước đều phải nhập
ngoại.
Từ chủng Bacillus amyloliquefacien N1 phân lập từ nem chua Huế có khả năng
sinh tổng hợp protease ngoại bào cao, trong công trình này, chúng tôi tiếp tục nghiên
cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease ngoại bào của nó như
thành phần môi trường, nhiệt độ, pH ban đầu và thời gian nuôi cấy. Kết quả này sẽ làm
tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm thiết lập được quy trình sản xuất chế
phẩm protease ngoại bào từ B. amyloliquefaciens N1 có hiệu quả kinh tế cao.
2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Nguyên liệu
Chủng Bacillus amyloliquefacien N1 phân lập từ nem chua có khả năng
sinh tổng hợp protease ngoại bào cao được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công
nghệ vi sinh, Viện Tài nguyên môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy để thu nhận enzyme
Phân phối 0,5 ml dịch canh trường vào bình tam giác dung tích 100 ml có chứa
20 ml môi trường. Nuôi cấy lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ ở 35
o
C. Dịch môi trường
nuôi cấy có chứa enzyme được thu nhận bằng cách ly tâm tách tế bào ở 14.000
vòng/phút, nhiệt độ 4
o
C trong 10 phút.
2.2.2. Xác định hoạt độ protease bằng phương pháp Anson cải tiến
Nguyên tắc của phương pháp là định lượng sản phẩm tạo thành do quá trình
thủy phân cơ chất casein của protease bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Hỗn hợp


281

phản ứng thủy phân gồm dung dịch enzyme và dung dịch casein 2,0%, tỷ lệ 1:2 (v/v)
được ủ ở 30
o
C trong 10 phút; ngưng phản ứng bằng dung dịch tricloacetic acid (TCA)
5,0% theo tỷ lệ 5 thể tích dung dịch acid cho 1 thể tích enzyme; ly tâm thu dịch nổi để
thực hiện phản ứng tạo màu với thuốc thử Folin 0,2N có mặt Na
2
CO
3
6% (tỷ lệ dịch nổi:
dung dịch Na
2
CO
3
: Folin 0,2N = 1:4:1). Thực hiện đồng thời mẫu kiểm tra bằng cách
cho dung dịch TCA vào enzyme trước khi ủ với cơ chất. Độ hấp thụ ánh sáng (OD) của
dung dịch màu thu được sau phản ứng được đo trên máy quang phổ kế ở bước sóng
750nm. Dựa vào đồ thị chuẩn tyrosine để tính sản phẩm tạo thành tương ứng dưới tác
dụng của enzyme. Một đơn vị hoạt độ protease (HP) được định nghĩa là lượng enzyme
mà trong một phút ở 30
o
C có khả năng phân giải protein tạo thành các sản phẩm hòa tan
trong tricloacetic acid, cho phản ứng màu tương đương với 1,0 µmol tyrosine.
2.2.3. Nghiên cứu thành phần môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp
protease ngoại bào bởi B. amyloliquefaciens N1
Chủng B. amyloliquefaciens N1 được nuôi cấy để thu nhận enzyme trong
môi trường cơ bản (MTCB) bao gồm 1% peptone, 0,3% cao thịt và 0,5% NaCl làm
mẫu đối chứng (ĐC) và các môi trường có bổ sung các nguồn carbon (tinh bột hòa
tan, lactose, glucose, saccharose) và nguồn nitơ (NH

4
Cl, casein, cao nấm, urê) vào
MTCB. Mỗi nguồn bổ sung 0,5%. Sau đó, tiến hành phối hợp nguồn cacbon có tác dụng
kích thích vi khuẩn sinh tổng hợp protease ngoại bào cao nhất với các nguồn nitơ khác;
đồng thời khảo sát kết hợp nguồn nitơ kích thích vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme ngoại
bào cao nhất với các nguồn carbon khác. Xác định hoạt độ protease trong dịch môi
trường thu được sau khi nuôi cấy bằng phương pháp Anson cải tiến. Môi trường có
thành phần thích hợp cho vi khuẩn sinh tổng hợp protease ngoại bào cao nhất được gọi
là môi trường thích hợp (MTTH).
2.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp
protease ngoại bào B. amyloliquefaciens N1
B. amyloliquefaciens N1 được nuôi cấy để thu nhận enzyme trong MTTH có
pH ban đầu thay đổi trong khoảng 5-11. Hoạt độ proease trong dịch môi trường thu
được sau khi nuôi cấy được xác định bằng phương pháp Anson cải tiến.
2.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
protease ngoại bào B. amyloliquefaciens N1
Quá trình nuôi cấy thu nhận enzyme ngoại bào của chủng B. amyloliquefaciens
N1 được thực hiện trong MTTH và pH ban đầu thích hợp. Nhiệt độ nuôi cấy được
thay đổi trong các mẫu thí nghiệm từ 30
o
C đến 60
o
C. Hoạt độ protease trong môi
trường sau khi nuôi cấy được xác định bằng phương pháp Anson cải tiến.
2.2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
protease ngoại bào B. amyloliquefaciens N1


282

B. amyloliquefaciens N1 được nuôi cấy để thu nhận enzyme trong MTTH,
pH ban đầu và nhiệt độ nuôi cấy thích hợp và thay đổi thời gian nuôi cấy từ 8 giờ đến
72 giờ. Sau mỗi khoảng thời gian nuôi cấy 8 giờ, các mẫu thí nghiệm được lấy để xác
định hoạt độ protease trong môi trường bằng phương pháp Anson cải tiến.
2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu
Các kết quả thí nghiệm thu được trong quá trình nghiên cứu đều được phân tích
sai số (Analysis Of Variance, ANOVA) và xử lý Ducan để xác định sự sai khác giữa các
trung bình, có ý nghĩa với độ tin cậy P < 0,05.
3. Kết quả và thảo luận
3.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon lên khả năng sinh protease ngoại bào của
B. amyloliquefaciens N1

Hình 1. Ảnh hưởng của nguồn C đến hoạt độ protease trong dịch môi trường nuôi cấy B.
amyloliquefaciens N1
(ĐC: Đối chứng; TB: Tinh bột; Glu: Glucose; Lac: Lactose; Sac: Saccharose).
(Các chữ cái trên các số khác nhau biểu thị sự sai khác có ý nghĩa, Duncan’s test
(P<0,05)).
Kết quả hình 1 cho thấy, khi thêm tinh bột hòa tan vào MTCB, hoạt độ protease
đạt được cao nhất (0,758 HP/ml), lớn hơn so với mẫu đối chứng (0,613 HP/ml) 1,2 lần. Kết
quả này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của Đỗ Thị Bích Thủy (2005) trên đối tượng
Bacillus subtilis, hoạt độ protease của dịch môi trường nuôi cấy khi có mặt tinh bột hòa tan
là cao nhất (gấp 1,6 lần so với mẫu đối chứng). Các công bố của Wellingta và đồng tác giả
(2004), Joo và đồng tác giả (2002), Sangeetha và đồng tác giả (1999) cũng cho rằng
tinh bột không có vai trò kích thích. Khi có mặt glucose và saccharose trong môi
d
e
b
a
Ho


t đ

(HP/ml)

Nguồn carbon (0,5%)
c
0,581
0,542
0,656
0,758
0,613
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
Glu Sac Lac TB ĐC


283

trường, hoạt độ protease trong môi trường thấp hơn so với mẫu đối chứng. Sangeetha
và cộng sự (1999) cũng công bố saccharose, glucose có tác dụng kìm hãm hoạt độ
protease của Bacillus sp Trái lại, Ravichandra và đồng tác giả (2007) và Sangeetha và
đồng tác giả (2008) cho rằng glucose có khả năng kích thích sự sinh enzyme mạnh nhất.
Nguồn lactose cũng có kích thích chủng này sinh tổng hợp protease ngoại bào nhưng

không nhiều. Nhiều công trình đã có những kết luận khác nhau về nguồn này. Có trường
hợp công bố lactose làm giảm hoạt độ protease trong dịch môi trường nuôi Bacillus sp.
(Sangeetha et al., 1999); trong khi một số trường hợp khác lại cho thấy rằng nguồn này
làm tăng hoạt độ protease trong môi trường nuôi cấy (Gerritse et al., 2007; Sangeetha et
al., 1999; Robert et al., 2008). Như vậy, các nguồn carbon khác nhau có tác dụng khác
nhau lên khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào của vi sinh vật. Đối với B.
amyloliquefaciens N1, tinh bột là chất cảm ứng mạnh nhất cho chủng này sinh tổng
hợp protease ngoại bào cao.
3.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh protease ngoại bào của B.
amyloliquefaciens N1

Hình 2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt độ protease trong dịch môi trường nuôi cấy B.
amyloliquefaciens N1
(ĐC: Đối chứng; Cas: Casein; CN: Caonấm).
(Các chữ cái trên các số khác nhau biểu thị sự sai khác có ý nghĩa, Duncan’s test
(P<0,05)).
Trong tất cả các nguồn nitơ, chỉ có casein làm cho hoạt độ protease trong môi
trường (0,758 HP/ml) cao hơn mẫu đối chứng (0,511 HP/ml) (Hình 2). Kết quả
nghiên cứu của Mussarat (2008) trên chủng Bacillus subtilis BS1 cũng kết luận rằng
casein làm tăng hoạt độ protease mạnh nhất. Cao nấm không thể hiện khả năng tăng
hoạt độ protease, mà làm giảm hoạt độ protease 2,3 lần so với đối chứng, nhưng
Ho
ạ
t đ
ộ
(HP/ml)

a
d
c

b
e
Nguồn N (0,5%)
NH
4
Cl
0,502
0,222
0,012
0,567
0,511
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
Ure CN Cas ĐC


284

giảm ít hơn so với các nguồn nitơ vô cơ. Điều này trái ngược với nghiên cứu của
Robert và đồng tác giả (2008) trên chủng Bacillus pumilus SG2 xác định cao nấm
men là nguồn nitơ tốt nhất. Điều này có lẽ là do enzyme ngoại bào được tiết ra môi
trường từ mỗi loài vi sinh vật có tính đặc hiệu cơ chất khác nhau nên đòi hỏi các chất
cảm ứng khác nhau.
3.3. Ảnh hưởng kết hợp của nguồn carbon và nitơ lên khả năng sinh protease
ngoại bào của B. amyloliquefaciens N1

Kết quả khảo sát ảnh hưởng riêng rẽ của một số nguồn carbon và nitơ đến hoạt
độ protease của dịch môi trường nuôi cấy cho thấy nguồn carbon tốt nhất là tinh bột và
nguồn nitơ tốt nhất là casein. Chúng tôi tiến hành thử khảo sát hoạt độ protease trong
môi trường thu được sau khi nuôi cấy B. amyloliquefaciens N1 có sự bổ sung phối hợp
các nguồn carbon và nitơ với nhau. Trong đó, tinh bột được chọn làm nguồn carbon
chính phối hợp với các nguồn nitơ khác và casein là nguồn nitơ chính phối hợp với các
nguồn carbon khác nhau (Hình 3).

Hình 3. Ảnh hưởng của sự kết hợp một số nguồn dinh dưỡng hoạt độ protease trong dịch môi
trường nuôi cấy B. amylolyquefaciens N1
(ĐC: Đối chứng,; TB: Tinh bột; Glu: Glucose; Lac: Lactose; Sac: Saccharose; Cas:
Casein; CN: Caonấm).
(Các chữ cái trên các số khác nhau biểu thị sự sai khác có ý nghĩa, Duncan’s test
(P<0,05)).
Hầu hết tất các mẫu thí nghiệm bổ sung kết hợp các nguồn dinh dưỡng, hoạt độ
protease trong môi trường thu được sau khi nuôi cấy đều thấp hơn môi trường chỉ bổ
sung tinh bột. Riêng mẫu kết hợp tinh bột và cao nấm cho kết quả tương đối cao và
không sai khác so với mẫu có bổ sung tinh bột khi xử ký Duncan (p<0,05). Xét về hiệu
Hoạt độ (HP/ml)
0,736
0,525
0,157
0,710
0,738
0,522
0,564
0,509
0,567
0,00
0,10

0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
TB+CN
TB+Urê
TB+
TB+Cas
TB
Cas+Glu
Cas+Lac
Cas+Sac
Cas
e
f
d
d
c
c
b
a a
B
ổ
sung các ngu
ồ
n dinh dư
ỡ

ng (0,5%)



285

quả kinh tế thì chọn mẫu chỉ có bổ sung thích bột là hợp lý nhất. Các thí nghiệm tiếp
theo chỉ khảo sát trong môi trường chỉ có bổ sung tinh bột vào MTCB.
3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột bổ sung vào lên hoạt độ protease của
môi trường nuôi cấy B. amyloliquefaciens N1
Khi bổ sung tinh bột với hàm lượng 0,75% hoạt độ protease trong môi trường
nuôi cấy đạt giá trị cao nhất (0,760 HP/ml) so với các hàm lượng tinh bột còn lại (Hình
4).

Hình 4. Ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột đến hoạt độ protease trong dịch môi trường nuôi
cấy B. amyloliquefaciens N1
(Các chữ cái trên các số khác nhau biểu thị sự sai khác có ý nghĩa, Duncan’s test (P<0,05)).
3.5 Ảnh hưởng của pH ban đầu lên hoạt độ protease của môi trường nuôi cấy
B. amyloliquefaciens N1
Hoạt độ protease trong dịch môi trường sau khi nuôi cấy ở pH ban đầu từ 6 đến
8 cho kết quả khá cao (Hình 5). Một số công bố cũng cho kết quả tương tự (Ghafoor &
Shahida, 2008; Yong et al., 2004; Deepak et al., 2008; Sung et al., 2009; Wang et al.,
2006; Wang et al., 2008). Ở các giá trị pH ban đầu 10 và 11 cho hoạt độ protease trong
môi trường giảm hẳn. Trong khi đó, khi nghiên cứu sự ảnh hưởng đến quá trình sinh
tổng hợp protease ngoại bào của B. subtilis, Sivasubramanian và đồng tác giả (2008)
công bố rằng pH ban đầu thích hợp là 9 và Mussarat và đồng tác giả (2008) công bố là
11.
a
Hoạt độ (HP/ml)
Hà

m l
ượ
ng tinh b
ộ
t (%)

d
c
b
c
e
f
0,631
0,737
0,760
0,655
0,654
0,627
0,618
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,25% 0,50% 0,75% 1% 1,25% 1,50% 1,75%

286


Hình 5. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt độ của protease trong môi trường nuôi cấy B.
amyloliquefaciens N1
(Các chữ cái trên các số khác nhau biểu thị sự sai khác có ý nghĩa, Duncan’s test (P<0,05)).
3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ protease trong môi trường nuôi cấy
của B. amyloliquefaciens N1

Hình 6. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt độ của protease trong môi trường nuôi cấy
B. amyloliquefaciens N1.
(Các chữ cái trên các số khác nhau biểu thị sự sai khác có ý nghĩa, Duncan’s test
(P<0,05)).
Hoạt độ (HP/ml)
Nhi
ệ
t đ
ộ
nuôi c
ấ
y (
0
C)

b
a
b
c
d

e
f

0,639
0,771
0,637
0,517
0,081
0,061
0,004
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
30 35 40 45 50 55 60
Hoạt độ (HP/ml)
pH ban đ
ầ
u c
ủ
a môi trư
ờ
ng

c
b
a
d
f
g
e
0,518
0,702
0,716
0,762
0,621
0,231
0,197
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
5 6 7 8 9 10 11


287

Hoạt độ protease đạt được cao nhất (0,771 HP/ml) ở nhiệt độ nuôi cấy 35
o

C khi
nuôi cấy B. amyloliquefaciens N1 ở khoảng 30 – 60
o
C (Hình 6). Trong điều kiện nuôi cấy
ở nhiệt độ 30
o
C, 40
o
C hoạt độ protease chỉ bằng 0,84 và 0,82 lần so với hoạt độ protease
ở 35
o
C. Khi nuôi cấy ở nhiệt độ 45
o
C, hoạt độ protease giảm chỉ còn 0,517 HP/ml; nhiệt
độ từ 50
o
C trở lên giảm hẳn đặc biệt ở nhiệt độ 60
o
C hoạt độ gần như không có. Điều
này có lẽ là khi nhiệt độ càng lên cao enzyme ngoại bào protease bị bất hoạt, đồng thời
các enzyme nội bào xúc tác các quá trình trao đổi chất của tế bào cũng bị ảnh hưởng nên
vi khuẩn không thực hiện quá trình sinh tổng hợp protein được. Đã có nhiều công trình
được công bố khác nhau về ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp
protease của vi khuẩn. Rai và Ashis (2010) cho kết quả nhiệt độ thích hợp là 37 - 45
o
C;
Kết quả nghiên cứu của Yong và đồng tác giả (2004) và Mussarat và đồng tác giả
(2008) là 50
o
C; trong khi đó Wang và đồng tác giả (2006) công bố là 55

o
C.
3.7. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ protease trong môi trường
của B. amyloliquefaciens N1

Hình 7. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ protease của chủng B.
amyloliquefaciens N1
(Các chữ cái trên các số khác nhau biểu thị sự sai khác có ý nghĩa, Duncan’s test
(P<0,05)).
Hoạt độ protease trong dịch môi trường đạt cao nhất sau thời gian nuôi cấy
B. amyloliquefaciens N1 32 giờ (0,777 HP/ml). Từ 40 giờ đến 72 giờ hoạt độ lại có xu
hướng giảm xuống, (0,561 HP/ml ở 40 giờ và 0,203 HP/ml sau 72 giờ nuôi cấy). Sự giảm
hoạt độ protease trong môi trường nuôi cấy có thể được giải thích bởi nhiều lý do
khác nhau. Khi kéo dài thời gian nuôi cấy, thành phần môi trường thay đổi do sự
hình thành các hợp chất mới của quá trình trao đổi chất của vi khuẩn, hàm lượng
Hoạt độ (HP/ml)
Thời gian nuôi cấy (giờ)
l
g
d
d


b
a
e
c
f
h
0.001

0.289
0.430
0.580
0.777
0.561
0.428
0.356
0.293
0.203
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
0.90
0 8 16 24 32 40 48 56 64 72


288

các chất dinh dưỡng giảm làm cho tế bào vi khuẩn suy thoái, enzyme bị bất hoạt.
Hơn nữa, đối với protease còn xảy ra hiện tượng autolysis (hiện tượng enzyme tự
thủy phân chúng) hoặc do vi sinh vật tổng hợp nên các chất kìm hãm trong môi
trường làm cho hoạt độ protease giảm.
4. Kết luận
- Thành phần môi trường thích hợp để thu nhận chế phẩm protease ngoại bào

của chủng B. Amyloliquefaciens N1 tốt nhất bao gồm 1% peptone, 0,3% cao thịt, 0,5%
NaCl và 0,75% tinh bột hòa tan.
- Nuôi cấy trong môi trường trên ở pH ban đầu bằng 8 và nhiệt độ nuôi cấy 35
o
C,
hoạt độ protease trong môi trường đạt được cao nhất.
- Với các điều kiện trên, thời gian lên men thu nhận enzyme thích hợp nhất là
sau 32 giờ nuôi cấy.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Lê Gia Hy, Lỗ Tiến Sỹ, Phạm Kim Dung, Trương Nam Hải, Nghiên cứu sản xuất
protease kiềm từ chủng xạ khuẩn ưa kiềm CD 2-1 phân lập ở Việt Nam, Tạp chí Khoa
học và Công nghệ, 3, (2000), 88-89.
2. Lê Đức Mạnh, Ngô Tiến Hiển, Lê Đức Ngọc, Nghiên cứu thu nhận và bảo quản
protease từ chế phẩm lên men bề mặt của vi khuẩn Bacillus subtilis, Các công trình
nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm (Giai đoạn 1986-
1995), Nxb. Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, 1995.
3. Đỗ Thị Bích Thủy, Trần Thị Xô, Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng
sinh protease của Bacillus subtilis, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 49,
(2004), 1667-1668.
4. Deepak V, Kalishwaralal K, Ramkumarpandian S, Babu SV, Senthilkumar SR,
Sangiliyandi G., Optimization of media composition for Nattokinase production by
Bacillus subtilis using response surface methodology, Bioresour Technol 99 (17):
(2008), 8170-8174.
5. Gajju H, Bhalla, Agarwal T C, Thermostable alkaline proteinase from thermophilic
Bacillus coagulants PB-77. Ind. J. Microbiol., 36, (1996), 153-155.
6. Ghafoor A, Shahida H., Production dynamics Bacillus subtilis strains AG-1 and EAG-2,
producing an extracellular alkaline protease. Afr J of Microbiol Res, 3 (5), (2009),
258-263.
7. Gerritse SB, Shiva RR, Lokeswari N and Raja J., Optimization of Protease Production
from Aspergillus oryzae Sp. using Box-Behnken Experimental Design, E-Journal of

Chemistry, 4(2), (2007), 145-153.


289

8. Gessesse A, Hatti-Kaul R, Gashe B A, Mattiasson B., Novel alkaline proteinases from
alkaliphilic bacteria grown on chicken feather, Enzyme and Microbial Technology, 32,
(2002), 519-524.
9. Joo HS, Kumar CG, Park GC, Kim KT, Paik SR, Chang Cs., Optimization of the
production of an extracellular alkaline proteinase from Bacillus horikoshi, Process
Biochem, 38, (2002), 155-159.
10. Kim J M, Lim W J, Suh H J., Feather-degrading Bacillus species from poutry waste,
Process Biochemistry, 37, (2001), 287-291.
11. Mehrotra S, Pandey P K, Gaur R, Darmwa N S., The production of alkaline proteinase
by Bacillus species isolate, Bioresource Technology, 67, (1999), 201-203.
12. Mussarat S, Aamer AS, Abdul H, Fariha H., Influence of culture condition on
production and activity of protease from Bacillus subtilis BS1, Parkistan J of Microbiol,
40 (5), (2008), 2161-2169.
13. Rai SK, Ashis KM., Statistical optimization of production, purification and industrial
application of a laundry detergent and organic solvent-stable subtilisin-like serine
protease (Alzwiprase) from Bacillus subtilis DM-04. Biochem Eng J, 48 (2), (2010),
173-180.
14. Robert S, Geetha A & Arulpandi I., Optimization of protease and lipase production by
Bacillus pumilus SG2 isolated from an industrial effluent, The Internet Journal of
Microbiology, 5(2), (2008), 2161-2169.
15. Sangeetha M, Pandey PK, Gaur R, Darmwal NS., The production of alkaline
proteinase by Bacillus species isolated, Bioresoure Technology, 67, (1999), 201-203.
16. Sangeetha M, Pandey PK, Gaur R, Darmwal NS., The production of alkaline
proteinase by Bacillus species isolated, Bioresoure Technology, 67, (1999), 201-203.
17. Sivasubramanian S, Manohar BS, Puvanakrishnan R., Mechanism of enzymatic

dehairing of skins using a bacterial alkaline protease, Chemosphere, 70 (6), (2008),
1025-1034.
18. Sung JH, Sang JA, Na YK, Soo KJ, Joong KK, Joon KC, Hyung HL., Purification,
molecular cloning, and biochemical characterization of subtilisin JB1 from a newly
isolated Bacillus subtilis JB1, Appl Biochem Biotechnol, 162 (3), (2009), 900-911.
19. Wang CT, Baoping J, Bo L, Hong J, Long FC., Purification and characterization of a
fibrinolytic enzyme of Bacillus subtilis DC33, isolated from Chinese traditional douchi,
J Ind Microbiol Biotechnol, 33 (9), (2006), 750-758.
20. Wang SH, Cheng Z, Yan LY, Miao D, Ming FB., Screening of a high fibrinolytic
enzyme producing strain and characterization of the fibrinolytic enzyme produced from
Bacillus subtilis LD-8547, World J Microbiol Biotechnol, 24, (2008), 475-482.


290

21. Wellingta CAN, Meire LLM., Production and properties of an extracellular protease
from thermophilic Bacillus sp., Brazilian J of Microbiol, 35, (2004), 91-96.
22. Yong JK, Kim JH, Gal SW, Kim JE, Park SS, Chung KT, Kim YH, Kim BW, Joo WH.,
Molecular cloning and characterization of the gene encoding a fibrinolytic enzyme
from Bacillus subtilis strain A1, World J of Microbiol and Biotechnol, 20, (2003), 711-
717.

THE FACTORS EFFECT ON EXTRACELLULAR PROTEASE PRODUCTION
OF Bacillus amyloliquefaciens N1 ISOLATED FROM HUE ‘NEM CHUA’
Do Thi Bich Thuy
College of Agriculture and Forestry, Hue University

Abstract. This study was also carried out to examine the influence of optimal
factors on production of extracellular protease from Bacillus amyloliquefaciens N1
such as culture medium, culture temperature, initial pH and fermentation period.

Results showed that in the base culture medium (BCM), which containing 1% of
peptone, 0,3% of meat extract and 0,5% of NaCl, added soluble starch the
extracellular protease production of Bacillus amyloliquefaciens N1 with highest
activity (0,758 HP/ml) compared to the other carbon sources. This value was
significant higher (p<0,05) than control sample (0,613 HP/ml) by 1,2 times.
Besides, the addition of casein into BCM showed that protease activity (7.267
U/ml) was higher than control sample ((0,511 HP/ml). Moreover, the results
indicated that the combination of two nutrients (carbon and nitrogen) into BCM did
not increase the protease activity of Bacillus amyloliquefaciens N1 compared to the
separated addition of solution starch. Therefore, the effects of soluble starch
concentrations (from 0,25% to 1,75%) were studied. The highest protease activity
was 0,760 HP/ml at 0,75% soluble starch concentration. The new optimal medium
(NOM) therefore contains 1% of peptone, 0,3% meat extract, 0,5% NaCl and
0,75% solution starch. When growing the Bacillus amyloliquefaciens N1 in NOM,
the highest protease activity of with initial pH (8), temperature (35
0
C) and after 32
hours fermentation were 0,777 HP/ml.
Keywords: Bacillus amyloliquefaciens, culture temperature, medium, production,
protease.