Nghiên cứu một số đột biến gen k13 và plasmepsine 23 trên quần thể plasmodium falciparum liên quan đến kháng thuốc dihyrdoartemisinin piperaquin tại huyện tuy đức, tỉnh đăk nông

4
Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về ký sinh trùng Plasmodium spp. gây bệnh ở người
Sốt rét là một bệnh truyền nhiễm do ký sinh trùng Plasmodium spp. gây ra,
thường gặp ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới. Với hàng trăm ca tử vong mỗi
năm, SR gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe con người và thiệt hại nghiêm trọng về
kinh tế-xã hội, khoảng 90% trong số này xảy ra ở châu Phi và châu Á Thái Bình
Dương. Bệnh lây lan chủ yếu từ người này sang người khác qua muỗi Anopheles
spp. Ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) sống ký sinh chủ yếu trong hồng cầu (HC) và
gây tổn thương nhiều cơ quan khác nhau. Biểu hiện cơn sốt rét điển hình, có kèm
gan, lách lớn hoặc thiếu máu. Ngồi ra, cịn có sốt rét ác tính (SRAT) có thể gây
tử vong do thể não, đái huyết cầu tố, suy thận, suy gan, trụy tim mạch. Đến nay,
Tổ chức Y tế thế giới ghi nhận 5 loài Plasmodium spp. gây bệnh cho người (P.
falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale và P. knowlesis [43].
Chu kỳ phát triển KSTSR qua giai đoạn sinh sản hữu tính ở muỗi và giai
đoạn sinh sản vơ tính thực hiện ở người. Đời sống KSTSR trong người thay đổi
tùy theo loài với thời gian tồn tại dài hay ngắn. P. falciparum là lồi có đặc điểm
bệnh sinh nghiêm trọng nhất so với các loài khác. Với các nghiên cứu dựa trên y
học chứng cứ cho thấy nhiễm trùng P. falciparum và P. knowlesi ở đối tượng chưa
có miễn dịch sẽ có mật độ KSTSR trong HC rất cao và dễ chuyển vào SRAT và tử
vong nếu khơng được chẩn đốn sớm và điều trị kịp thời. Chu kỳ vơ tính của P.
falciparum và P. knowlesi có giai đoạn tiền HC duy nhất ở gan và thời gian
24 giờ, mà khơng có thể ngủ như các loài P. vivax và P. ovale. Mặc dù chu kỳ vơ
tính HC là 48 giờ, nhưng sự phân chia thể phân liệt P. falciparum thường không
xảy ra cùng lúc, nên tính chu kỳ của cơn sốt ở bệnh nhân đơi khi bất thường.
1.2. Tổng hợp về tình hình ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc
1.2.1.Tình hình kháng thuốc trên thế giới
Theo TCYTTG (WHO, 1981), định nghĩa một chủng KSTSR kháng thuốc
là khả năng một chủng KSTSR có thể sống sót và phát triển mặc dù bệnh nhân đã

5
được điều trị và hấp thụ một liều lượng thuốc bằng hoặc cao hơn liều thơng
thường. Kháng thuốc có thể là tương đối nếu như tăng liều trong giới hạn chịu
đựng được của con người, có thể diệt được KSTSR [42]. Các yếu tố quan trọng
liên quan đến kháng thuốc gồm có thời gian bán hủy của thuốc kéo dài, bệnh nhân
không theo đúng hướng dẫn điều trị, mức độ miễn dịch của bệnh nhân, loại thuốc.
Chủng P. falciparum kháng chloroquine (CQ) lần đầu tiên xuất hiện năm
1957 tại biên giới Colombia-Venezuela (Moore và cs., 1961) và lan rộng nhanh
hơn sau đó như tại biên giới Colombia-Venezuela (Peters và cs., 1960), biên giới
Campuchia-Thái Lan (Harinasuta và cs., 1961), tại Cam Ranh, Khánh Hòa của
Việt Nam (Powell và Alving., 1963) và từ đó P. falciparum tiếp tục kháng cao CQ
trên diện rộng hầu hết quốc gia có SRLH. Trong vịng 20 năm, P. falciparum
kháng CQ đã lan ra nhiều vùng Thái Lan, Campuchia, Việt Nam, Lào. Đến năm
1978 xuất hiện kháng ở Kenya, Tanzania, Madagascar (1980), Angola, Rwanda
(1984), Cameroon (1985), Nigeria (1987). Do đó, thuốc này nhanh chóng bị loại
khỏi danh mục thuốc thiết yếu và chính sách thuốc quốc gia từ những năm 1990.
1.2.2. Kháng các thuốc quinin, proguanil, pyrimethamin và chloroquin
Loài P. falciparum kháng quinin (QNN) được phát hiện từ 1910 ở Brazil.
Những năm 1930, mepacrine bắt đầu được dùng cùng với QNN. Thời gian 19401950, một số thuốc mới đã được ra đời, bổ sung trong điều trị như amodiaquin,
proguanil. P. falciparum kháng proguanil và pyrimethamin được phát hiện từ đầu
những năm 1950 khi những thuốc này được dùng rộng rãi. Đặc biệt, tại Đông
Nam Á, P. falciparum kháng CQ gặp ở các nước với mức độ kháng tăng dần ở
châu Phi, đặc biệt vùng Tây Phi, nhưng có thay đổi ở các quốc gia châu Á. Kháng
mefloquin (MQ) tăng nhanh ở Thái Lan.
Sulfadoxin-Pyrimethamin (S/P) từ năm 1968 được dùng để điều trị P.
falciparum kháng CQ Tuy nhiên, phối hợp này khơng có hiệu lực chữa khỏi
100%, ngay cả những bệnh nhân nhiễm P. falciparum nhạy. Sự không đáp ứng tự
nhiên chiếm 10-20%. Kháng Fansidar được phát hiện năm 1980 ở Thái Lan, năm

1981 ở châu Mỹ, mức độ kháng tăng dần và lan rộng ở nhiều vùng trên thế giới,


6
đặc biệt các nước Đông Nam Á, châu Phi và Nam Mỹ. Mefloquin đưa vào dùng
năm 1972, đến năm 1986, tại Thái Lan cho thấy bắt đầu P. falciparum kháng trên
in vivo và in vitro, nhất là tại một số vùng biên giới Campuchia-Myanmar.
1.2.3. Tình hình P. falciparum kháng artermisinin và giảm hiệu lực với ACTs
Thuốc artemisinin và dẫn suất ra đời năm 1972 và đưa vào điều trị chủng
P. falciparum kháng CQ và đa kháng ở Trung Quốc, Việt Nam và vài nước Đơng
Nam Á. Thuốc có tác dụng diệt KSTSR nhanh và cải thiện lâm sàng trong vòng
24-48 giờ. Tuy nhiên, trong giai đoạn 2006-2007, TCYTTG đã cảnh báo về sự
xuất hiện P. falciparum kháng artermisinin ở biên giới Campuchia-Thái Lan, sau
đó là Việt Nam, Myanmar (2010) và Lào (2013) và đến nay đã đến mức báo động
ở Tiểu vùng sơng Mê Kơng [14],[41]. Artemisinin có tiềm năng diệt nhanh thể tư
dưỡng trẻ đến thể phân liệt già và có thể ức chế q trình hình thành giao bào qua
trung gian làm giảm các giai đoạn trước trong chu kỳ Plasmodium spp. Hoạt chất
dihydroartemisinin là một chất chuyển hóa chính của artemisinin, về hiệu lực có
thể sánh ngang với artemisinin.
Quá trình hình thành và phát triển kháng thuốc có thể chia thành hai yếu tố
góp phần: Một là các yếu tố liên quan đến di truyền phát sinh, hình thành các đột
biến kháng và thứ hai là quá trình chọn lọc kháng do lan truyền đột biến, nên
kháng sẽ lan rộng. Định nghĩa mới của kháng artemisinin theo TCYTTG qua thời
gian nghiên cứu có cập nhật (2010-2014) như là sự gia tăng thời gian làm sạch
KSTSR, tương ứng ≥ 10% số ca theo dõi có KSTSR được phát hiện vào ngày thứ
3 sau khi điều trị bằng thuốc phối hợp có artemisinins hay dẫn suất (ACTs) (gọi là
nghi ngờ kháng); hay thất bại điều trị sau khi điều trị đơn thuần với artemisinins
với nồng độ thích hợp trong máu, bằng chứng là sự tồn tại của KSTSR sau 7 ngày
điều trị, hoặc sự hiện diện của KSTSR vào ngày thứ 3 và tái phát trong vòng
28/42 ngày (gọi là xác định kháng) và đến năm 2018, TCYTTG có bổ sung các

tiêu chí về đột biến kháng gen K13.
Tình trạng P. falciparum kháng thuốc lan rộng nghiêm trọng trên thế giới là
một khó khăn cho việc lựa chọn thuốc điều trị. Tại Việt Nam, chủng P. falciparum
kháng cao với CQ, MQ và giảm đáp ứng với nhiều loại thuốc hiện


7
dùng, ngay cả artemisinin và dẫn chất được thử nghiệm lâm sàng và chính thức
đưa vào dùng ở Việt Nam từ 1997 có vai trị hạ thấp tỷ lệ mắc và tử vong [7],[9].
Các phối hợp ACTs nhằm mục đích đạt được hoạt tính diệt thể phân liệt
trong máu nhanh bằng cách lựa chọn phối hợp có artemisinine cùng với một
thuốc có hiệu lực kéo dài hơn liên quan đến cơ chế tác động khác nhau và thời
gian bán hủy cũng khác nhau khi lựa chọn các thuốc đi kèm. Phối hợp
dihydroartemisinin-piperaquin (DHA-PPQ) là một trong 5 thuốc phối hợp ACTs
được khuyến cáo bởi TCYTTG [42].
DHA có tác dụng rất quan trọng diệt thể phân liệt, DHA là một chất chuyển
hố chính có hoạt tính sinh học như artesunate và artemether được sử dụng thời
gian dài trên toàn cầu. Một vài nghiên cứu cho rằng thuốc tập trung có tính chọn
lọc vào tế bào nhiễm trên in vitro, phản ứng này sinh ra các gốc tự do độc hại có
thể phá huỷ các màng KSTSR. Thành phần đi cùng là thuốc PPQ, có cơ chế tác
dụng tương tự như các quinolein khác, thay cho CQ và đóng vai trị quan trọng
trong những năm 1980. PPQ có tác dụng tốt trên các thể trong HC của
P. vivax, P. malariae và các thể P. falciparum, ngoại trừ giao bào. Việc kết hợp
DHA có khả năng tiêu diệt KSTSR nhanh nhưng có thời gian bán hủy ngắn nên
PPQ có thời gian bán hủy dài, có thể ngăn chặn tái phát, nên cần thuốc đi cặp đôi.
Phác đồ phối hợp DHA-PPQ khắc phục nhược điểm của từng loại thuốc
trên khi dùng đơn trị liệu, cũng như có khả năng làm chậm kháng. Các nghiên
cứu đã khẳng định DHA-PPQ là một phối hợp ACTs hiệu quả cao và an toàn đối
với các KSTSR, kể cả P. falciparum đa kháng. Phối hợp ACTs đang được khuyến
cáo dùng ưu tiên các ca P. falciparum chưa biến chứng vì khi phối hợp với PPQ

có thời gian bán hủy kéo dài và trì hỗn kháng, thuốc tác động nhanh và dung nạp
thuốc tốt [10],[13]..
Trong một vài nghiên cứu về DHA-PPQ đều cho kết quả chữa khỏi trên
95% với tính dung nạp tốt trong điều trị bệnh nhân người lớn và trẻ em mắc sốt
rét do P. falciparum cùng với các tác dụng ngoại ý không đáng kể. Đồng thời,
DHA-PPQ có ưu thế hơn các thuốc phối hợp khác (artesunate-amodiaquine hay
artemether-lumefantrine) trong việc chống lại P. falciparum khỏi sự tái phát sớm.


8
Hầu hết các bệnh nhân (97%) sạch KSTSR trong vòng 48 giờ, phác đồ DHAPPQ chỉ ra tốc độ làm sạch KSTSR của DHA rất nhanh, và hiệu lực dự phòng sau
điều trị của phối hợp này là do PPQ đóng vai trị là một thuốc đi kèm [16],[17].
Trẻ em dưới 5 tuổi có nguy cơ cao hơn về vấn đề tái phát KSTSR, thuốc DHAPPQ chứng minh an toàn, dung nạp tốt, hiệu lực cao trong điều trị ca bệnh P.
falciparum tại các quốc gia châu Á và châu Phi.
1.2.3.1. Trên thế giới
Đã có nhiều báo cáo về phác đồ đơn trị liệu artesunate trong thời gian 10
năm trở lại đây với liệu trình 3 ngày, 4 ngày hoặc 5 ngày được thử nghiệm tại
Thái Lan, Tanzania cho tỷ lệ chữa khỏi từ 72-100%. Thực tế lâm sàng điều trị sốt
rét đến nay chưa báo cáo kháng thuốc artemisinin thật sự, nhưng mơ hình kháng
thực nghiệm trên lồi gặm nhấm đã khẳng định (P. yoelii hoặc P. berghei kháng
artemisinin và artemether hoặc P. chabaudi kháng với artesunate) khoảng 20% số
ca còn tồn tại KSTSR ngày D 3 (WHO, 2012). Ngoài ra từ những bằng chứng về
giảm hiệu lực thuốc ART từ các nghiên cứu đánh giá hiệu lực quy mô đa quốc gia
và từ những báo cáo ca bệnh lâm sàng đơn lẻ cho thấy gia tăng áp lực thuốc là chỉ
điểm quan trọng cho lan rộng KSTSR kháng thuốc và liệu trình dùng thuốc ART
khơng đủ liệu trình góp phần phát triển kháng [10],[13].
Phương pháp điều trị ACTs theo khuyến cáo của TCYTTG là liệu pháp
hàng đầu đối với các ca SR do P. falciparum. Loại thuốc này đem lại thành công
đáng kể trong việc giảm tỷ lệ tử vong do SR trên toàn cầu trong những năm qua.
Tuy nhiên, P. falciparum có một khả năng đề kháng với thuốc SR bằng sự tiến

hóa thích nghi, do đó hiệu quả ACTs đang bị đe dọa bởi việc xuất hiện KSTSR
kháng artemisinin. Sự đề kháng trên lâm sàng của P. falciparum với artemisinin
và dẫn xuất hiện nay đã xuất hiện tại phía Campuchia, Thái Lan, Việt Nam,
Myanmar và Lào [46],[47]. Điều này đe dọa việc kiểm soát SR và các hoạt động
loại trừ SR trên tồn cầu. Do đó, vấn đề cấp thiết đặt ra là cần phải tìm ra các yếu
tố di truyền của KSTSR liên quan đến kháng artemisinin và xác định chỉ điểm
phân tử để giám sát sự lan rộng kháng artermisinin.
Liệu pháp thuốc hiện tại đang dùng đồng thời sử dụng hai hay nhiều thuốc


9
diệt thể phân liệt trong máu theo các cơ chế tác động riêng biệt. Điều này cải thiện
hiệu lực điều trị và cũng làm trị hoãn phát triển kháng với từng thành phần của thuốc
phối hợp. Để chống lại sự phát triển kháng, TCYTTG khuyến cáo các liệu pháp đơn
trị liệu phải được loại bỏ và các trường hợp SR nên điều trị với thuốc phối hợp có
dẫn xuất artemisinine và một thuốc khác có cơ chế tác động khác, nên ACTs ra đời là
vậy. Các dẫn xuất artemisinin làm giảm nhanh dung khối KST, trong khi có sự hiện
diện của thuốc thứ hai với cơ chế tác động khác sẽ làm giảm đi khả năng xuất hiện
chủng kháng thuốc. TCYTTG khích lệ phát triển các phiên bản thuốc phối hợp
ACTs, hơn là chế phẩm cùng vỉ vì có thể dẫn đến sử dụng nhầm lẫn dùng để hỗ trợ
cho các đơn trị liệu của ART [10],[13]. Điều đáng chú ý là trong Hướng dẫn chẩn
đoán và điều trị sốt rét của TCYTTG đã đề cập DHA-PPQ vào như 1 liệu pháp ACTs
ưu tiên trong điều trị SR do P. falciparum trên tồn cầu.

Một trong những vấn đề khó khăn trong sốt rét trên cơ địa phụ nữ mang
thai là lựa chọn thuốc điều trị sốt rét [19],[22].

Hình 1.1.a. Tình trạng P. falciparum

Hình 1.1b. Tình trạng P. falciparum

kháng artemisinine (WHO, 2015)

kháng các thuốc ACTs (WHO, 2017)


10
Một số ít dữ liệu về DHA-PPQ trên PNMT thích hợp trong nghiên cứu đã
cho kết quả rất an toàn, dung nạp tốt và hiệu quả trên PNMT. Thử nghiệm lâm
sàng ngẫu nhiên đối chứng so sánh DHA-PPQ và artesunate + amodiaquine trong
điều trị các PNMT 3 tháng giữa và 3 tháng cuối mắc SR chưa biến chứng để đánh
giá tính an tồn, dung nạp và hiệu lực thuốc DHA-PPQ. Hiệu lực được đánh giá
vào thời điểm D28 và D42, nồng độ hemoglobin của mẹ vào thời điểm ngày D 28 và
D42, tỷ lệ bất thường bẩm sinh và sinh non với độ tin cậy 95%.
Tại Đơng Nam Á, tình trạng chậm làm sạch KSTSR và kháng artermisinine
đang phát triển phức tạp. Từ năm 2013, TCYTTG đưa ra các khuyến cáo khẩn cấp
về tình hình kháng artemisinin như “một bệnh mới nổi” tại tiểu vùng sông Mê
Kông và tỷ lệ tồn tại KSTSR ngày D 3 được ghi nhận trên 10%. Đặc biệt, tại
Campuchia, sau khi thực hiện ngăn chặn sốt rét năm 2009, số ca SR P. falciparum
đã giảm, nhưng tỷ lệ ca sau khi được điều trị với DHA-PPQ tồn tại KSTSR ngày
D3 tăng từ 26% đến 45%, từ năm 2008-2010; song song với sự gia tăng thất bại
trong điều trị với DHA-PPQ được báo cáo từ 2008-2013 [14].
Tại Lào, thử nghiệm tiến hành tại Champasack (2013) báo cáo rằng 22,2%
số ca sau khi được điều trị bằng artemether-lumefantrine vẫn còn tồn tại KSTSR
ngày D3 và xuất hiện kháng artemisinin ở Nam Lào với hiện diện đột biến protein
K13 trong quần thể KSTSR đang lưu hành. Tại Thái Lan, dùng phác đồ điều trị
trong 3 ngày AS-MQ nhưng thất bại điều trị tăng lên ≥ 10% và với artemetherlumefantrine có tỷ lệ thất bại cũng trên 10%.
1.2.3.2. Tại Việt Nam
Miền Trung-Tây Nguyên là khu vực trọng điểm SR với trên 70% số ca mắc
và 80% ca tử vong hàng năm so với cả nước, đặc biệt chủng P. falciparum đa

kháng thuốc.
Tương tự như các quốc gia có SRLH khác trong khu vực tiểu vùng sông
Mê Kông, cho đến trước 2009, tại Việt Nam kháng thuốc cũng đã được ghi nhận
với tất cả thuốc SR, ngoại trừ artemisinine và các dẫn suất. Phối hợp DHA-PPQ
chứng minh có hiệu lực cao trong điều trị SR do P. falciparum và là cơng cụ hữu
ích tại các vùng SRLH ở Việt Nam. Tuy nhiên DHA-PPQ trong nghiên cứu thử


11
nghiệm lâm sàng tại Việt Nam tại những vùng SRLH nặng, đa kháng thuốc ở
Quảng Trị, Ninh Thuận, Bình Phước, Gia Lai, Quảng Nam, Đăk Nông, Đăk Lăk
trong thời gian từ năm 2011-2015 [36],[37] cho kết quả đáp ứng lâm sàng và KST
đầy đủ rất cao, song có một tỷ lệ nhỏ thất bại điều trị muộn. Bên cạnh đó, tại
nhiều tuyến bệnh viện điều trị khu vực miền Trung-Tây Nguyên trong thời gian từ
2007-2011 đã ghi nhận nhiều ca SR do P. falciparum và/ hoặc nhiễm phối hợp P.
falciparum với một loài khác điều trị bằng DHA-PPQ cho kết quả còn tồn tại KST
vào ngày D3 sau khi kết thúc liệu trình 3 ngày [38], bất luận có ghi nhận về dung
nạp hoặc không và một số yếu tố có thể ảnh hưởng lên hiệu quả điều trị cho các
BNSR tại hệ điều trị, cho thấy hiệu lực DHA-PPQ phần nào đã giảm, đặc biệt là
khâu làm sạch KST qua các cuộc giám sát đánh giá chất lượng chẩn đoán và điều
trị [4],[5],[6]. Việc đánh giá đáp ứng P. falciparum với các phác đồ phối hợp
ACTs trên BNSR do P. falciparum là hết sức cần thiết trước khi kháng thuốc xảy
ra thật sự. Dẫn liệu còn cho thấy nhiều thử nghiệm lâm sàng in vivo tại Bình
Phước vào năm 2008-2011 và tại Gia Lai vào 2010-2011 đánh giá phác đồ AS
đơn trị liệu và DHA-PPQ, theo dõi 28/ 42 ngày với nhiều cỡ mẫu khác nhau cho
thấy tỷ lệ D3(+) khoảng 20% [20],[21].
Tình trạng chậm làm sạch KST sau khi điều trị DHA-PPQ tại Việt Nam lần
đầu tiên được phát hiện tại Bình Phước (2009). Giám sát thường quy trong năm
2011 với DHA-PPQ cũng phát hiện hiện giảm nhạy với artemisinin ở Gia Lai (D 3
dương tính 18%), tại tỉnh Đắk Nơng và Quảng Nam (2012) [40] có tỷ lệ D 3 dương

tính lần lượt 23,4% và 21%. Tại miền Trung Việt Nam, hiệu quả DHA-PPQ có tỷ
lệ chữa khỏi cao nhưng thời gian và tỷ lệ làm sạch KST được cho là liên quan đến
kháng artemisinin (thời gian làm sạch KSTSR ≥ 72 giờ). Trong khi DHA-PPQ đã
cho thấy hiệu quả tuyệt vời trong các thử nghiệm lâm sàng gần đây ở châu Phi và
một số quốc gia châu Á thì tại Việt Nam, hiệu lực điều trị của phác đồ artesunat
đơn thuần tại Gia Lai là 97,4%, tỷ lệ KSTSR cịn dương tính ở ngày D 3 là 38,5%
và ngày D4 là 23,1% trong năm 2013.
Theo một nghiên cứu tổng hợp do Tạ Thị Tĩnh và cộng sự (2011) thực hiện,
theo dõi 28 ngày về hiệu lực DHA-PPQ liệu trình 3 ngày và artesunate đơn


12
trị liệu 7 ngày tại Bình Phước [39], Đăk Nơng [6], Ninh Thuận [37],[38], Gia Lai,
Quảng Trị và Quảng Bình từ 2005-2010 [6], tổng số 417 ca điều trị bằng DHAPPQ chỉ ra hiệu lực cao (ACPR = 97,8% ờ Bình Phước và 100% tại các vùng
khác), tỷ lệ sạch P.falciparum vào ngày D3 là 100% tại các nghiên cứu Quảng
Bình, Quảng Trị, Gia Lai, Ninh Thuận, Đăk Nơng, nhưng vẫn còn 15,3% số ca
còn tồn tại P. falciparum vào ngày D3 tại Bình Phước. Tỷ lệ chữa khỏi của liệu
pháp artesunate đơn trị liệu từ 96,8-100% ở các vùng nghiên cứu khác nhau,
nhưng ở Bình Phước chỉ có 84,8% (2009). Đặc biệt, KSTSR P.falciparum tồn tại
vào ngày D3 tại Bình Phước tăng theo thời gian (từ 13,2% năm 2009 đến 24%
năm 2010), nghiên cứu đã cho thấy có một mối liên quan giữa tồn tại KSTSR
ngày D3 với tái phát KST, nhưng khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa mật
độ KSTSR ngày D0 với sự tái phát [6],[20],[21].
Một nghiên cứu khác từ 2012-2013 tại Quảng Nam theo dõi 42 ngày trên
95 ca SR do P. falciparum, có 93.7% ca điều trị đầy đủ trong 3 ngày bằng DHAPPQ và có 92.6% ca được theo dõi đến ngày 42, tỷ lệ tồn tại KST dương tính
ngày D3 là khoảng 30% và thời gian làm sạch ½ số lượng KST là 6,2 giờ, tăng so
với nghiên cứu trước đây tại miền Trung Việt Nam chỉ 2,9 giờ [40].
Thêm vào đó, liên quan giữa đột biến gen K 13 propeller đối với kháng
artemisinin đang được các nhà khoa học quan tâm. Đột biến gen K 13 được xác
định tại nhiều vùng ở Campuchia và gần đây được báo cáo tại các quốc gia Tiểu

vùng sông Mê Kông (Myanmar, Thái Lan, Việt Nam). Sự liên quan giữa alen đột
biến với tỷ lệ sống sót của KSTSR trong thử nghiệm in vitro và hiện tượng chậm
làm sạch KSTSR trên in vivo, cho thấy chỉ điểm đột biến K13 propeller hiện là một
chỉ điểm quan trọng trong kháng artemisinin [41],[47].
Tuy nhiên, nhiều đột biến K 13 tồn tại, song không phải luôn luôn tỷ lệ thuận
với sự làm sạch chậm KSTSR sau điều trị bằng ACTs như một chỉ điểm kháng
thuốc artemisinin và lan rộng, dường như độc lập với nhau. Do đó, cần thiết phải
hiểu và làm rõ vai trị tính đa hình đột biến K 13 trong vấn đề kháng artemisinin để
giám sát kháng thích hợp và tin cậy (Elizabeth A.W. và cs., 2014).


13
Hiện tượng kéo dài thời gian sạch KSTSR so với số liệu trước đây tại châu
Phi và châu Á như một chỉ điểm lâm sàng gián tiếp của thất bại điều trị hoặc
kháng với DHA-PPQ. Việc phát hiện hiệu lực thuốc giảm không chỉ là bước đầu
tiên phổ cập các thơng tin hữu ích cho cơng tác kiểm sốt SR, mà còn đưa ra các
bằng chứng để xây dựng kế hoạch và chính sách thuốc với sự phối hợp tồn cầu
để ngăn chặn và loại trừ SR trên toàn thế giới [46].
Tại Việt Nam, ngay từ đầu những năm 1990 đã thử nghiệm lâm sàng các
thuốc artemisinin và dẫn xuất (artesunate, dihydroartemisinin) và đầu năm 2000,
các thử nghiệm đầu tiên với thuốc ACTs như CV-8 và 5 năm trở lại đây với các
thuốc DHA-PPQ và phối hợp artemisinin + piperaquine, hoặc artesunate +
amodiaquin, hay artesunate + mefloquin bước đầu cho hiệu lực rất cao, nhiều
phác đồ thử nghiệm nhiều vùng cho hiệu lực lên đến 100% [93]. Nhìn chung, với
các liệu trình ngắn ngày (2 hoặc 3 ngày), các phác đồ thuốc ACTs trên đều cho
hiệu lực cao từ 97-100%, một số ít có tỷ lệ thất bại điều trị vì nhiều lý do khoảng
1-3%, song nhìn chung các phác đồ được dùng phổ biến và rộng rãi tại các quốc
gia hiện nay và chỉ tập trung vào DHA-PPQ, A/L, artesunate + amodiaquine, thực
tế hiện trên phạm vi toàn cầu có đến ít nhất 90 quốc gia đang dùng các phác đồ
phối hợp thuốc này.

Một nghiên cứu đánh giá và giám sát P. falciparum kháng thuốc ART và
AS tại tỉnh Bình Phước, Việt Nam từ 1998 - 2009. Đây là một cơng trình phối hợp
giữa khoa y, đại học Melbourne, bệnh viện Royal Melbourne, Victoria, Úc và
Viện Sốt rét-KST-CT TƯ, Việt Nam tiến hành. Các dẫn chất của ART đã được
dùng tại Việt Nam từ 1989, đã làm giảm số ca SR và từ vong SR đáng kể từ năm
1991-2006. Hướng dẫn cũng như chính sách hiện tại của quốc gia đang khuyến
cáo dùng các liệu pháp thuốc sốt rét phối hợp ACTs, dù AS vẫn đang cịn có sẵn
tại hệ thống y tế tư nhân. Các báo cáo gần đây cho thấy hiệu quả của ACTs và liệu
pháp AS đơn trị liệu có giảm tại phía tây Campuchia. Nghiên cứu này nhằm đánh
giá mơ hình kháng do P. falciparum qua 10 năm tại một tỉnh phía nam Việt Nam
với BNSR được điều trị bằng các thuốc phối hợp có artemisinine [39].


14
Nghiên cứu được tiến hành tại hai xã của huyện Phước Long, tỉnh Bình
Phước, cách biên giới Campuchia về phía tây khoảng 100km, nên khả năng xảy ra
sốt rét kháng thuốc trên nhóm dân di biến động Thái Lan và Myanmar như đã
từng xảy ra với các vùng khác trên thế giới. Lựa chọn này như một vùng có khả
năng xuất hiện kháng artemisinine vì tỷ lệ SR do P. falciparum cao ở đây, thời
gian dùng thuốc ART và dẫn xuất tại đây cũng rất lâu. Các giám sát dựa vào kỹ
thuật in vivo và in vitro đối với tính nhạy của P. falciparum với các TSR qua thời
gian năm 1998-2009. Các ca xác định nhiễm P. falciparum được đưa vào điều trị
ART 5 ngày hoặc 7 ngày AS. Tổng số 270 ca đưa vào nghiên cứu, kết quả thấy
thời gian làm sạch KST khác nhau giữa các năm 1998, 2001 và 2004/2005 (1,8;
2,3 và 2,1 ngày nhưng giữa 1998 và 2008/2009. Thời gian làm sạch KSTSR trung
bình có có liên quan đến mật độ KSTSR ngày D 0 (r = 0,4; p < 0,001). Tỷ lệ thất
bại điều trị sau khi hiệu chỉnh PCR lần lượt là 13,8%, 2,9%, 1,2%, và 0%. Độ
nhạy của P. falciparum với ART trên in vitro ổn định trong thời gian theo dõi,
ngoại trừ có tăng EC 90 và EC99 vào năm 2001. Nghiên cứu này chỉ ra mức độ
nhạy của P. falciparum ổn định đối với hợp chất ART tại 2 vùng nghiên cứu qua

thời gian theo dõi là 10 năm [20],[21],[32].
Việc áp dụng các ACTs trong vùng năm 2003 có thể bảo vệ chống lại hình
thành và phát sinh kháng ART. Sự phối kết hợp giữa hướng dẫn của Việt Nam và
phiên bản mới nhất của TCYTTG khuyến cáo ACTs như liệu pháp đầu tay tại tất
cả các vùng SRLH và giám sát liên tục dọc theo biên giới Việt Nam-Campuchia là
cần thiết để ngăn ngừa lan tràn kháng thuốc ART tại Việt Nam. Nhìn chung, thuốc
phối hợp DHA-PPQ là thuốc hiệu lực cao đa chống kháng. Tuy nhiên, DHA
không thể là một dẫn xuất phù hợp nhất của dẫn xuất artemisinin trong các phối
hợp ACTs vì tính ổn định với nhiệt kém khi cơng thức phối hợp. Phối hợp
artesunate-piperaquin có thể là một thay thế tốt hơn do lợi điểm tăng ổn định với
nhiệt độ hơn DHA. Phối hợp nên có hiệu lực tương đương vì AS là chuyển hóa
nhanh thành DHA sau uống. Điểm tồn tại trong nghiên cứu về cung cấp thơng tin
mới đặc tính dược động học PPQ, bao gồm cả các nghiên cứu in vivo lâm sàng và
phi lâm sàng và cung cấp thêm cho vấn đề sử dụng PPQ như một thuốc đi


15
cùng trong ACTs tại các vùng SRLH. Có thể nói rằng liệu pháp phối hợp DHAPPQ như 1 công cụ sống còn trong nổ lực loại trừ SR. Các ACTs làm tăng tỷ lệ
chữa khỏi lâm sàng và sạch KSTSR cũng như giúp giảm quá trình lựa chọn áp lực
thuốc để xuất hiện kháng với các thuốc.
Tỷ lệ D3 thay đổi ở tỉnh Gia Lai này cũng phù hợp với một số nghiên cứu
đa trung tâm ở Việt Nam trong thời gian 5 năm gần đây, chẳng hạn ở Bình Phước
đánh giá hiệu lực thuốc DHA-PPQ tại nhiều điểm đã cho thấy thuốc giảm hiệu lực
và dần dần xác định kháng thuốc thật sự biểu hiện qua tỷ lệ thất bại đơn phần
dihydroartemisinin hay cả thuốc đi kèm piperaquin tại huyện Bù Gia Mập, Bù
Đăng năm 2007, số ca theo dõi là 25 ca, hiệu lực đáp ứng lâm sàng và ký sinh
trùng đầy đủ (ACPR) là 100% và tỷ lệ ký sinh trùng ngày D 3 là 4% (n = 25; 100%
và D3 = 4%), sau đó hai năm thì hiệu lực thuốc bắt đầu thay đổi ở năm 2009 (n =
46; 97,8 và D3 = 15,3%), tiếp đó năm 2010 (n = 55; 100% và D 3 = 22%), năm
2012 (n = 53; 100% và D3 = 30,6%), năm 2013 (n = 50; 100% và D3 = 36%) và

đến năm 2015 thì hiệu lực giảm rõ ràng với tỷ lệ đáp ứng lâm sàng và ký sinh
trùng đầy đủ chỉ là 68,2%, kèm theo tỷ lệ thất bại điều trị cao gần 50%, kèm theo
90% số ca có đột biến gen K 13 propeller xác định C580Y và có cả đột biến
Plasmepsin 2/3 có liên quan đến kháng thuốc đi kèm PPQ (n = 44; 68,2% và D 3
(+) 50%). Tuy nhiên, đến năm 2016, sau khi phác đồ điều trị bằng DHA-PPQ mới
ra có điều chỉnh liều dùng cao hơn so với phác đồ năm 2013 thì nghiên cứu cũng
cho thấy kết cục không khả quan khi hiệu lực chỉ cịn 37% nhưng tỷ lệ KST thể
vơ tính ngày D3 giảm từ 36% cịn 19,4% (n = 48; 37,0% và D3 = 19,4%), hay như
nghiên cứu ở xã Ma Nới, huyện Ninh Sơn, tỉnh Ninh Thuận từ năm 2015 có tỷ lệ
KST thể vơ tính ngày D 3 là 10,9% thì năm 2017 chỉ cịn D 3 (+) là 3%, hay nghiên
cứu ở huyện Tuy Đức, Đăk Nơng năm 2014 có 60 ca, đáp ứng lâm sàng và
KSTSR đầy đủ là 100% và tỷ lệ KSTSR ngày D 3 là 26,7% nhưng đến năm 2016
với số cs nghiên cứu là 13, đáp ứng ACPR là 84,6% và tỷ lệ D 3 dương tính cũng
chỉ cịn 23,1% [3],[4],[5],[6],[7].
Với hiệu lực phác đồ DHA-PPQ trong nghiên cứu này trình bày ở trên cho
thấy với phác đồ mới DHA-PPQ theo hướng dẫn mới của Bộ Y tế (2016) với tổng


16
liều 9 viên hoặc 12 viên tùy theo cân nặng của bệnh nhân như hiện nay, có thể
hiệu lực cao hơn so với nhóm bệnh nhân thử nghiệm in vivo với thuốc DHA-PPQ
liệu trình tổng liều 8 viên của Hướng dẫn phác đồ chẩn đoán và điều trị của Bộ Y
tế (2013) vì nghiên cứu năm 2014 đó có tỷ lệ đáp ứng lâm sàng và ký sinh trùng
đầy đủ (ACPR) là 100% và tỷ lệ tồn tại KSTSR thể vơ tính ngày D 3 hay sau 72
giờ là 11,5% nhưng nghiên cứu năm nay lại không thấy tồn tại D 3. Số liệu này
tương tự như nghiên cứu in vivo đánh giá hiệu lực thuốc artesunate hay DHAPPQ tại huyện Thuận Bắc, Ninh Sơn tỉnh Ninh Thuận từ năm 2008, 2009, 2010,
2011 cho tỷ lệ đáp ứng lâm sàng và KSTSR đầy đủ là 100%, chưa có ca nào D 3
dương tính, song đến năm 2013 cho tỷ lệ chữa khỏi dưới 100% và D 3 (+) là 8% (n
=
51; ACPR = 100% và D3 là 8%) và đến năm 2015 cho tỷ lệ chữa khỏi

cũng là
100% nhưng tỷ lệ làm sạch ký sinh trùng có tăng lên thơng qua tỷ lệ D 3 (n = 40;
ACPR = 100% và D3 là 11%). Tuy nhiên, ở điểm Ninh Thuận cũng cho thấy có tỷ
lệ đột biến gen đa hình K 13 propeller với tỷ lệ dao động 20%, trên nhóm bệnh
nhân người Răglay, đặc biệt có đột biến C580Y khá phổ biến ở khu vực tiểu vùng
sông Mê Kông [27],[28].
So sánh với một số nghiên cứu khác gần đây thực hiện tại khu vực miền
Trung-Tây Nguyên, chẳng hạn nghiên cứu đánh giá hiệu lực thuốc DHA-PPQ đối
với P. falciparum tại huyện Cư Jut, tỉnh Đăk Nông cho thấy dù tỷ lệ đáp ứng lâm
sàng và ký sinh trùng đầy đủ là 100%, hiệu lực rất cao trong điều trị, song đáng
chú ý sự tồn tại ký sinh trùng P. falciparum thể vơ tính được đánh giá sau mỗi 12
giờ sau khi dùng thuốc DHA-PPQ, cho thấy tỷ lệ tồn tại ngày D 3 là 15,5% và sau
D3 còn là 7,04% - như một chỉ điểm lâm sàng nghi ngờ kháng thuốc tại vùng này,
trước khi khẳng định có kháng thuốc thì cần có phân tích thêm về mặt gen học,
phát hiện đột biến đơn điểm K13 propeller theo quy định và định nghĩa kháng
thuốc của TCYTTG (WHO, 2015).
Đối chiếu với các nghiên cứu in vivo gần đây, như ở Phú Yên cho hiệu lực
phác đồ DHA-PPQ trong điều trị sốt rét do P. falciparum chưa biến chứng cho
thấp đáp ứng lâm sàng và ký sinh trùng đầy đủ (ACPR) là 100%, khơng có trường
hợp thất bại điều trị, tổng số ca mất theo dõi do nhiều lý do là 3 (8,11%) và đặc


17
biệt chưa có ca nào cịn tồn tại KSTSR ngày D3 sau điều trị. Một số nghiên cứu
khác thực hiện tại khu vực miền Trung-Tây Nguyên, chẳng hạn nghiên cứu đánh
giá hiệu lực thuốc DHA-PPQ đối với P. falciparum tại huyện Cư Jut, tỉnh Đăk
Nông cho thấy dù tỷ lệ đáp ứng lâm sàng và ký sinh trùng đầy đủ là 100%, hiệu
lực rất cao trong điều trị, song đáng chú ý sự tồn tại ký sinh trùng P. falciparum
thể vơ tính được đánh giá sau mỗi 12 giờ sau khi dùng thuốc DHA-PPQ, cho thấy
tỷ lệ tồn tại ngày D3 là 15,5% và sau D3 còn là 7,04% - như một chỉ điểm lâm

sàng nghi ngờ kháng thuốc tại vùng này, trước khi khẳng định có kháng thuốc thì
cần có phân tích thêm về mặt gen học, phát hiện đột biến đơn điểm K 13 propeller
theo quy định và định nghĩa kháng thuốc của TCYTTG năm 2014. Theo dõi đầy
đủ trong 7 ngày đầu với 71 ca sốt rét do P. falciaprum cho thấy có 11 ca (15,5%)
cịn tồn tại thể vơ tính trong máu với tốc độ giảm ký sinh trùng khác nhau trên
từng ca bệnh [8],[37],[38]. Song, tính trung bình mật độ KST của tồn bộ 11 ca
này từ ngày D0, D1, đến D5 cho thấy mật độ đã giảm đi đáng kể từ D 0 sang D1
(bằng chứng góc alpha-slope) và từ D1 sang D2, D3 giảm chậm hơn và từ D3 sang
D5 giảm dần tương ứng với thời gian bán hủy thuốc DHA-PPQ. Phân tích tổng số
71 ca sốt rét do P. falciparum, với mật độ ký sinh trùng ban đầu 35.295/l vào
ngày D0, sau khi dùng DHA-PPQ cho thấy thời gian làm sạch ký sinh trùng trung
bình khoảng 60 giờ và thời gian cắt sốt là 18 giờ. Số liệu này cho thấy tương tự
như một số nghiên cứu trước đây tại Bình Phước, Gia Lai, Đăk Nông, Quảng
Nam.
Số liệu trên cũng tương tự như nghiên cứu của Huỳnh Hồng Quang và cộng
sự tiến hành tại các điểm xã Hàm Cần, huyện Thuận Nam, tỉnh Bình Thuận hay
huyện Bn Đơn, tỉnh Đăk Lăk từ năm 2014-2016 đều cho tỷ lệ đáp ứng lâm sàng
và KST đầy đủ là 100% và chưa có tình trạng chậm làm sạch KST hay D 3 dương
tính [2],[3]. Tuy nhiên, trên thực hành lâm sàng tại bệnh viện đa khoa Bn Đơn
cho thấy nhiều ca bệnh biểu hiện cịn tồn tại KSTSR ngày D 3 dương tính và các
lam máu được kiểm định lại bởi Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn thẩm định lại là
đúng, số liệu này như một cảnh báo là một cảnh báo sớm như một chỉ điểm lâm
sàng nghi ngờ kháng thuốc xảy ra tại vùng huyện Buôn Đôn này.


18
Nhiều nghiên cứu của tác giả Tạ Thị Tĩnh và cộng sự (2011) hay của Bùi
Quang Phúc và cộng sự (2014) và Trần Tịnh Hiền và cộng sự (2014) tại Bù Đăng
(Bình Phước) và Huỳnh Hồng Quang và cộng sự (2014) Tuy Đức (Đăk Nông),
Phú Thiện (Gia Lai), Nam Trà My (Quảng Nam) với hiệu lực đáp ứng lâm sàng

và ký sinh trùng đầy đủ từ 91,2-100%, song tỷ lệ tồn tại KST thể vơ tính ngày D 3
dao động 14,7-44% qua các nghiên cứu hiệu lực trên in vivo và in vivo cải tiến
[24], rút ngắn ngày theo dõi, đánh giá giám sát chỉ điểm K 13 có liên quan đến
kháng thuốc [4],[7],[40]. Song song, các nghiên cứu tại các điểm ở Gia Lai cũng
cho diễn tiến tương tự như hai tỉnh Bình Phước và Đăk Nơng nhưng tại các vùng
khơng có đường biên giới và nhóm bệnh nhân khơng có giao lưu biên giới
Campuchia, có xu hướng đáp ứng lâm sàng và KSTSR đầy đủ giảm và tỷ lệ
KSTSR ngày D3 dương tính tăng dần như năm 2007-2008 cho thấy tỷ lệ đáp ứng
ACPR là 100%, khơng có D3 dương tính, sang năm 2010 tại các điểm Phú Thiện
cho tỷ lệ đáp ứng lâm sàng và KST giảm còn 94,8% và D 3 (+) là 11,7%, năm
2010 với 34 ca tại điểm Konch’ro cho đáp ứng lâm sàng và KST đầy đủ là 100%
và D3 (+) là 3%. Đặc biệt, trong thời gian từ 2012-2016 tại huyện Phú Thiện, đặc
biệt tại Krông Pa cho tỷ lệ đáp ứng ACPR giảm và tỷ lệ D 3 tăng lần lượt 23%;
26,4%, 44,2% và 29,4% [4],[5],[6].
Một số nghiên cứu trong các tỉnh khác dọc theo các tỉnh ven biển miền
Trung như tại huyện Nam Trà My, Quảng Nam với 89 ca nhiễm đơn thuần P.
falciparum chưa biến chứng theo dõi liên tục cũng cho thấy đáp ứng ACPR là
97,7% và tỷ lệ D3 (+) là 29,2% [40] hay tại huyện Khánh Vĩnh, tỉnh Khánh Hòa từ
năm 2011 trên 30 ca cho thấy đáp ứng ACPR là 100% và khơng có D 3, đến năm
2014 nghiên cứu trên 46 ca cho tỷ lệ ACPR là 100% nhưng có tỷ lệ D 3 là 17,4%.
1.3. Các phương pháp nghiên cứu và đánh giá mức độ kháng [23],[29]
Các kỹ thuật nghiên cứu KSTSR kháng thuốc được nhiều tác giả trên thế
giới xây dựng và áp dụng rộng rãi, trong đó quan trọng phải kể đến kỹ thuật in
vivo, in vitro và sinh học phân tử như (PCR, Nested PCR và giải trình tự gen). Về
nguyên tắc, giám sát đáp ứng KSTSR với thuốc chống SR theo phương pháp in


19
vivo và in vitro cần làm thường xuyên. Trong đó, giám sát in vivo là phương pháp
quan trọng nhất trong quyết định phác đồ điều trị, phát triển chính sách thuốc sốt

rét thiết yếu quốc gia theo từng giai đoạn. Việc giám sát trên in vitro đánh giá độ
nhạy cảm của KSTSR với thuốc sẽ cung cấp những dấu hiệu dự báo sớm kháng
thuốc và bổ sung dữ liệu cho thay đổi chiến lược thuốc trên địa bàn.
1.3.1. Kỹ thuật nghiên cứu in vivo
Với mục đích đánh giá hiệu lực thuốc, xác định hiệu quả thực tế từng phác
đồ thuốc, giám sát đáp ứng với thuốc và xây dựng chính sách quốc gia, TCYTTG
đã đưa ra một số thử nghiệm phù hợp trong nghiên cứu kháng:


Thử nghiệm in vivo 7, 14 hay 28 ngày để đánh giá hiệu lực thuốc điều trị:

+

Nhạy (Sensitivity_S): sạch KSTSR thể vơ tính máu ngoại vi trong 7

ngày đầu (kể từ ngày uống thuốc) và không tái phát trong 28 ngày tiếp theo;
+

Kháng độ 1 (Resistance I_RI): KSTSR tái phát trong phạm vi 3 tuần sau;

+

Kháng độ 2 (RII): mật độ KSTSR ngày thứ 7 (D7) giảm so với ngày D0;

+

Kháng độ 3 (RIII): mật độ KSTSR không giảm mà tăng so với ngày D 0.



Đánh giá đáp ứng điều trị theo 3 loại: thất bại điều trị sớm, thất bại điều

trị muộn và đáp ứng lâm sàng đầy đủ (WHO, 2005).

-

Thất bại điều trị sớm (Early Treatment Failure_ETF)

+

Phát triển các dấu chứng nguy hiểm hoặc SR nặng vào ngày D 1, D2 hoặc

D3 kèm theo có KSTSR trong máu;

+

Mật độ KSTSR trong máu vào ngày D2 cao hơn ngày D0 khơng tính đến

hay bất luận nhiệt độ cơ thể như thế nào;

+

Có KSTSR trong máu vào ngày D3 và nhiệt độ nách ≥ 37,5°C;

+

Mật độ KSTSR trong máu vào ngày D3 ≥ 25% mật độ ngày D0

-

Thất bại điều trị muộn (Late Treatment Failure_LTF), gồm có:

+

Thất bại lâm sàng muộn (Late Clinical Failure_LCF) gồm có (i) Phát

triển các dấu hiệu nguy hiễm hoặc sốt rét ác tính vào bất kỳ ngày nào từ D 4
đến D28 kèm theo có KSTSR trong máu mà trước đó khơng có bất kỳ tiêu
chuẩn thất bại điều trị sớm nào; (ii) Có KSTSR trong máu và nhiệt độ nách ≥
37,5°C vào


20
bất kỳ ngày nào từ D4 đến D28 mà trước đó khơng có bất kỳ tiêu chuẩn thất bại
điều trị sớm nào;

+

Thất bại KSTSR muộn (Late Parasitological Failure_LPF): Có KSTSR

trong máu vào bất kỳ ngày nào từ D 7 đến D28 và nhiệt độ nách < 37,5°C mà
trước đó khơng có tiêu chuẩn thất bại điều trị sớm hoặc thất bại điều trị muộn.

-

Đáp ứng lâm sàng và KSTSR đầy đủ (Adequate Clinical &

Parasitological Respone_ACPR): Khơng có KSTSR trong máu vào D28
khơng tính đến nhiệt độ nách, trước đó khơng có bất kì tiêu chuẩn nào về thất
bại điều trị sớm hoặc

thất bại lâm sàng muộn hoặc thất bại KSTSR muộn.
1.3.2. Kỹ thuật in vitro: đây là thử nghiệm đánh giá ngưỡng nồng độ thuốc ức
chế sự trưởng thành của thể nhẫn thành schizonte trong môi trường nuôi cấy 2430 giờ có các nồng độ thuốc khác nhau:
- Macrotest (hay kỹ thuật Rieckman macro test, 1968)
Kỹ thuật này dựa trên đánh giá sự ức chế tư dưỡng P. falciparum phát triển
thành thể schizonte trong mơi trường ni cấy có glucose của ống chứng (khơng
có thuốc) so với các ống chloroquin có nồng độ thấp tăng lên cao dần (0,253nmol/ml). Bộ thử Macrotest do TCYTTG cung cấp. Kết quả của kỹ thuật này
phụ thuộc nhiều yếu tố (hấp thu thuốc, miễn dịch bệnh nhân.
- Micro test (hay kỹ thuật Rieckmamm micro test, 1978)
Dựa trên kết quả nuôi cấy liên tục P. falciparum bằng môi trường RPMI
1640 của W.Trager và B .Jensen (1976), thay vì việc lấy l0 ml máu tĩnh mạch ở
kỹ thuật Microtest, kỹ thuật Microtest chỉ lấy máu ở đầu ngón tay, có thể thử
được nhiều loại thuốc cùng lúc. Đánh giá kết quả dựa vào sự ức chế hoàn toàn thể
tư dưỡng thành schizonte so với giếng chứng.
Hiện nay, TCYTTG đã lưu hành rộng rãi bộ microtest với hầu hết thuốc sốt
rét đang sử dụng như chloroquin, amodiaquin, mefloquin, artemisinin. Ưu điểm
của macrotest và microtest là đánh giá chủng P. falciparum nhạy/ kháng thuốc ở
điều kiện thực địa, giám sát sự nhạy cảm P. falciparum nhằm phát hiện sự xuất
hiện của kháng thuốc. Nhược điểm Macrotest và microtest là thử nghiệm khi áp
dụng rộng rãi tại vùng SRLH, trang thiết bị phức tạp, cán bộ thực hiện phải thành


21
thạo về kỹ năng.

- Test 48 giờ: Kỹ thuật này tương tự như kỹ thuật microtest, trong microtest sử
dụng 10% hồng cầu (HC) trong môi trường nuôỉ cấy P. falciparum RPMI 1640,
trong kỹ thuật 48 giờ chỉ dùng 4% HC. Vì vậy, khơng cần thay mơi trường, mà
ni KSTSR trong 48 giờ. Phương pháp này rất có ích để đánh giá nhạy, kháng
với CQ so sánh với các thuốc khác, kể cả thuốc mới (artemisinin và các dẫn chất).

Tuy nhiên, có nhược điểm trong 48 giờ thể schizonte vỡ ra, xâm nhập HC mới,
nên phải đếm lượng KSTSR trên 10.000 HC;

- Test 72 giờ: P. falciparum nuôi cấy 3-4 ngày và được thích nghi ở điều kiện
labo. Dịch treo HC 5% hồng cầu nhiễm KSTSR 3-15% pha loãng với HC lành để
có mật độ KSTSR 0,3-0,5 HC nhiễm. Các đĩa ni cấy bao gồm các đĩa có nồng
độ thuốc khác nhau. Hàng ngày thay môi trường không thuốc (chứng), đĩa có
thuốc, sau 72 giờ lấy mẫu máu ni cấy làm tiêu bản giọt mỏng, nhuộm giemsa
đếm mật độ KSTSR/ 10.000 HC.
Phương pháp này đánh giá tính nhạy cảm của KSTSR với thuốc, xác định
nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ ức chế có hiệu quả (EIC) của thuốc
với KSTSR. Tuy nhiên kỹ thuật này có nhược điểm là đòi hỏi phải trong điều
kiện trang thiết bị hiện đại, kỹ thuật phức tạp, thao tác thuần thục chuẩn xác.
Thay môi trường hàng ngày, giá thành thử nghiệm cao.

- In-vitro RSA test (RSA0-3h Witkowski B., 2013): Phương pháp này dùng để
đánh giá độ nhạy của P. falciparum với thuốc mới artemisinin. Kỹ thuật thử
nghiệm RSA0-3h được thực hiện trong môi trường nuôi cấy KST đồng bộ cao.
KSTSR dạng thể nhẫn sau khi xâm nhiễm 0-3 giờ được cho tiếp xúc với 700nM
dihydroartenisinin hoặc dung dịch DMSO (dimethyl sulfoxide) trong 6 giờ, sau
đó rửa và ni cấy KSTSR trong 6 giờ tiếp theo trong mơi trường khơng có
thuốc. Tỷ lệ KSTSR sống sót sẽ được tính tốn bằng cách đếm dưới giọt mỏng
nhuộm giêm sa.
1.3.3. Chỉ điểm phân tử xác định P. falciparum kháng artemisinin [15],[18]
Ký sinh trùng P. falciaprum kháng với artemisinin và các dẫn suất tại
nhiều vùng trong khu vực Đông Nam Á đe dọa các thành quả của chương trình


22
phòng chống và loại trừ SR. Để giám sát hiệu lực thuốc và thực trạng kháng

thuốc diễn ra quy mô nào thì việc phát hiện các chỉ điểm phân tử rất cần thiết.
Liên quan giữa đột biến gen K13 đối với kháng artemisinin đang được các nhà
khoa học quan tâm nghiên cứu. Tính đa hình các đột biến gen K 13 được xác định
có mặt tại nhiều tỉnh của Campuchia và gần đây được báo cáo tại nhiều nơi trên
thế giới, đặc biệt khu vực tiểu vùng sông Mê Kông (Myanmar, Thái Lan, Việt
Nam, Bangladesh, Lào) [22].
Nghiên cứu của Frederic Ariey và cộng sự (2014) nhằm phát hiện một chỉ
điểm (marker) phân tử kháng artemisinin, dòng P. falciparum F32-ART5 kháng
artemisinin đã được chọn lọc bằng phương pháp nuôi cấy liên tục từ dòng
KSTSR nhạy cảm với artermisinin F32-Tanzania dưới áp lực thuốc artemisinin
trong 125 chu kỳ trong 5 năm với liều tăng dần thuốc artemisinin. Giải trình trình
tự tồn bộ gen F32-TEM, F32-Tanzania hoặc 3D7 (dòng KST nhạy cảm với
artermisinin), nhóm nghiên cứu đã phát hiện dịng KSTSR kháng ART F32-ART5
có 07 gen [24], mà mỗi gen chứa đựng một mã codon đột biến so với các dòng
KSTSR còn lại, trong khi dịng KSTSR nhạy khơng tìm thấy các đột biến này
[26].
Trong số những gen này, chỉ có PF3D7-1343700 cho thấy mối liên quan
quan trọng với tỷ lệ sống sót của KSTSR trong thử nghiệm RSA 0-3h. Gen PF3D71343700 nằm ở vị trí 5,9 kb ở phần đầu locus có trọng lượng phân tử 35kb và
nằm trong vùng dấu hiệu ưu tiên để chọn lọc [25]. Ngoài ra trong nghiên cứu này
đã có sự kết hợp các đột biến trên domain PF3D7 Kelch propeller (K 13) với kháng
thuốc artemisinin trên nghiên cứu thử nghiệm in vivo và in vitro. Do vậy đa hình
đột biến gen K13 được dùng để tạo ra chỉ thị phân tử xác định kháng artemisinin
vì một số lý do:

-

Có sự mất liên tiếp những chủng KSTSR kiểu hoang dại ở phía tây

Campuchia suốt giai đoạn bắt đầu có sự kháng artemisinin;

-

Kiểu KSTSR đột biến tăng lên về tần số tại các vùng kháng thuốc của

Campuchia và xuất hiện rất ít ở những nơi kháng ART là không phổ biến;

-

Gen PF3D7_1343700 nằm trong vùng dấu hiệu ưu tiên để chọn lọc;


23
-

Những đột biến đa dạng trên K13-propeller phản ánh chọn lọc dương;

-

Những đột biến xảy ra trên vùng gen có tính bảo tồn cao của P.

falciparum, chỉ có một đột biến đa hình đơn nucleotide dạng SNPs (single
nucleotide polymorphism) được ghi nhận từ một phân lập ở châu Phi;

-

Tất cả các kiểu đa hình được quan sát là khác thường (trừ kiểu V568G);

-

3 đột biến có tần số cao nhất trong gen K 13 có mối liên quan chặt chẽ với

tỷ lệ RSA0-3h trong nghiên cứu in vitro trên các mẫu phân lập và thời gian làm
sạch 50% số lượng KSTSR trên bệnh nhân;

-

Tần xuất xuất hiện của những allen đột biến tương quan mạnh với tỷ lệ

KSTSR dương tính ngày D3 sau khi điều trị bằng thuốc ACTs[15],[18].
1.4. Nghiên cứu về đa hình đột biến gen K13 và plasmepsine trên thế giới

1.4.1. Gen K13 propeller và cơ chế kháng artemisinin trên góc độ sinh học
phân tử
Gen Kelch 13 propeller gồm có 3 domain với 225 acid amin:


Một domain có đầu N có tính chất bảo tồn đặc trưng cho Plasmodium

spp.


Một domain BTB/POZ và Phía đầu C với 6 domain hình cánh quạt điển

hình cho motif Kelch. Motif Kelch chứa protein được bảo tồn qua tiến hóa
giữa các lồi khác nhau và nhóm lại thành loại protein KLHL. Vật chủ là
người chứa 42 protein trong protein KLHL. Đa hình các điểm đột biến gen
K13, còn được gọi là “vùng cánh quạt” của protein K 13 đã được chứng minh có
liên quan đến tỷ lệ sống còn của KSTSR trong thử nghiệm RSA 0–3h, đồng thời
có liên quan đến hiện tượng chậm làm sạch KSTSR hay giảm sự nhạy cảm của
KSTSR với thuốc ở giai đoạn tư dưỡng và tỷ lệ KSTSR dương tính vào ngày

thứ 3 (giờ thứ 72) ở bệnh nhân điều trị SR do P. falciparum với ACTs.


24

Hình 1.2. Một số loại đột biến gen K13 liên quan kháng trên P. falciparum
Theo Frederic Ariey (2014), đa hình đột biến trên protein vùng cánh quạt K 13
tập trung tại các tỉnh Campuchia, nơi hiện tình trạng kháng artermisinin diễn ra
phổ biến và các tần số alen đột biến ngày càng tăng có liên quan đến sự lan của
kháng artemisinin ở Campuchia[15],[18].
Nghiên cứu cũng cho thấy mối tương quan chặt chẽ giữa sự hiện diện của
alen đột biến, tỷ lệ KSTSR sống sót trong thử nghiệm in vitro, giống nghiên cứu
thử nghiệm ex vivo (Witkowski. B và cs., 2013) và tỷ lệ làm sạch KSTSR trong
thử nghiệm in vivo. Mối tương quan này đã chỉ ra rằng đột biến K 13-cánh quạt là
yếu tố quyết định quan trọng của cơ chế kháng artermisinin và nghiên cứu của
Frederic Ariey và cộng sự (2014) cũng đã xác định đa hình các đột biến trên
protein K13 như một marker phân tử kháng arermisinin của P. falciparum và xác
định được 17 alen đột biến trên protein K 13 ở Campuchia [29].
Mặc dù đã xác định được lượng lớn đột biến, chỉ có một số alen đột biến có
tần số cao (> 5%), có chứa đột biến SNPs, cụ thể là Y493H, R539T và C580Y
nằm tương ứng ở vị trí cánh quạt 2, 3 và 4. Nghiên cứu này đã lập bản đồ các


25
điểm đột biến xác định tỷ lệ KSTSR có chứa các đột biến có nghĩa và sự phân bố
địa lý của chúng [30]. Quan trọng hơn, phân bố tần số của alen đột biến tại các
tỉnh khác nhau cũng phù hợp với tỷ lệ tồn tại KSTSR ở ngày D 3 ở bệnh nhân sau
khi được điều trị bệnh SR do P. falciparum với thuốc phối hợp ACTs. Hiện tượng
này được xem là chỉ điểm gợi ý cho kháng artemisinin trong điều trị lâm sàng.
Ngoài ra, nghiên cứu của Ashley và cộng sự (2014) tại các nước Đông Nam

Á và một số nước châu Phi như Nigeria, Congo, Kenya đã chỉ ra tình trạng chậm
làm sạch KSTSR (thời gian làm sạch ½ KST > 5 giờ), cũng liên quan chặt chẽ với
các đột biến điểm trên K13-propeller. Trong nghiên cứu này, các đột biến cánh
quạt K13 có 91,8% độ nhạy và độ đặc hiệu 88,4% với thời gian làm sạch 50%
dung khối KSTSR > 5 giờ. Tuy nhiên, việc kháng thuốc artemisinin lây lan chủ
yếu là tại các nước Đông Nam Á.
Nghiên cứu từ 2007 đến 2012 tại biên giới Trung Quốc và Myanmar cũng
đã xác định được 17 đột biến gen K13 với 7 loại đột biến mới. Đột biến F446I
chiếm ưu thế với 27,2%, C580Y xuất hiện với tần số thấp 1,6% và có sự gia tăng
về tần số KSTSR mang gen đột biến theo từng năm. Tuy nhiên, lại khơng tìm thấy
các đột biến I543T, R539T và Y493H liên quan đến tình trạng chậm làm sạch
KSTSR như ở Campuchia, kể cà M476I. Đi kèm là tỷ lệ tồn tại KSTSR ngày D 3
tại khu vực này là > 10%, cần có những nghiên cứu tiếp theo về khả năng kháng
artemisinin lan rộng sang các nước thuộc tiểu vùng Mê Kông [11],[12].
Tại Việt Nam, nghiên cứu của Kamala Thriemer và cộng sự (2015) tại
Quảng Nam, từ 2012-2013, trong 83 mẫu phân lập được phân tích về mặt phân tử
có 67 mẫu có mang đột biến gen K 13 tại vị trí 543 và 493, khơng tìm thấy đột biến
tại vị trí 539 và 580 [40]. Mẫu phân lập mang đột biến tại vị trí 543 có thời gian
làm sạch KSTSR cao hơn đáng kể so với mẫu mang đột biến hoang dại. Độ nhạy,
độ đặc hiệu của đột biến SNPs 543 với tình trạng chậm làm sạch KSTSR lần lượt
là 91,4% và 27,1%. Với tỷ lệ tồn tại KSTSR ngày D 3 gần 30%, điểm theo dõi của
Nam Trà My (Quảng Nam) cùng với điểm Phú Thiện (Gia Lai) được TCYTTG
đánh giá là khu vực đầu tiên của Việt Nam khơng có giao lưu biên giới nghi ngờ
xuất hiện kháng thuốc ART [8],[27],[28],[44].


26
Mặt khác, theo nghiên cứu tiến hành tại Bangladesh, Abu Naser Mohon
(2014) đã phát hiện đột biến A578S nằm gần vị trí với đột biến C580Y ở Đơng
Nam Á. Theo tác giả, đột biến này gây ra sự thay đổi cấu trúc không gian của

protein bằng cách thay đổi bề mặt tương tác với protein khác dẫn đến biến đổi
chức năng sinh học của protein, làm ảnh hưởng đến hoạt động của ART, kết quả là
thời gian làm sạch KSTSR bị kéo dài. Tuy nhiên, đột biến này không liên quan
đến việc tăng thời gian làm sạch ½ KSTSR hay nói cách khác là khơng liên quan
đến kháng ART. Dẫn liệu đã chứng minh rằng đột biến liên quan chặt chẽ với
kháng ART là khơng có mặt ở Bangladesh. Việc xác định liệu kháng ART gây ra
sự lây lan hay là độc lập với sự nổi lên do sốt rét tại khu vực biên giới
Campuchia-Thái Lan là cần thiết. Nếu kháng thuốc tồn tại ở một khu vực nhỏ, nó
có thể được kiểm soát và loại trừ, ngược lại kháng thuốc có thể lây lan sang các
nước lân cận khi đó sẽ là thảm họa phức tạp [44].
Theo Rie Isozumi và cộng sự (2015) tại Kenya, đã xác định được 4 đột
biến có ý nghĩa và 5 đột biến “im lặng” ở vùng bảo tồn cao của gen K 13 trên P.
falciparum và các đột biến này có tính chất xuất hiện theo mùa (?). Tuy nhiên,
những đột biến này không giống với công bố của Ariey và cộng sự năm 2014.
Tác giả đã tìm ra đột biến A78S tại quần đảo Mfangano. Cũng tương tự như
nghiên cứu của Abu Naser Mohon tại Bangladesh, tác giả cũng cho rằng đột biến
này làm biến đổi acid amin, nằm gần vị trí với đột biến C580Y (được xác định tại
Campuchia), ảnh hưởng đến tương tác protein-protein, điều này làm ảnh hưởng
đến tính nhạy của KSTSR với artemisinin [29].
Tại Myanmar, P. falciparum kháng artemisinin được được báo cáo tại khu
vực biên giới Myanmar- Thái Lan từ nhiều năm trước và gây chậm làm sạch
KSTSR sau điều trị ACTs cũng được xác định ở Myanmar [44].
Trong 2011-2012, dẫn liệu cho thấy tỷ lệ chậm làm sạch KSTSR là 15%,
với thời gian làm sạch ½ số lượng KST là > 5 giờ và khoảng 25% số ca có mang
các đột biến gen K13(Ashley EA và cs., 2014). Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện
tính đa hình các đột biến trên protein K13 hiện nay tiếp tục được thực hiện với các
mẫu giấy thấm thu thập tại Myanmar trong suốt nghiên cứu về hiệu quả phương


27

pháp điều trị trong thời gian 2012-2013 nhằm mục đích lập bản đồ mức độ kháng
artemisinin và đáp ứng khẩn cấp các hoạt động ngăn chặn phù hợp. Nghiên cứu
trong năm 2013-2014, đã xác định được 29 đột biến khác nhau tại vị trí sau acid
amin 210, với 26 đột biến trong số đó nằm sau vị trí acid amin 440 (cho thấy hầu
hết các đột biến này nằm tập trung tại cánh quạt đầu tiên, từ acid amin 441-475)
với 3 đột biến có tần số cao nhất lần lượt là C580Y , F446I và P574L và nhiều đột
biến khác, phần lớn các đột biến này đã được xác định trong các nghiên cứu tại
Campuchia. Đặc biệt là sự có mặt của đột biến M476I do quá trình chọn lọc trong
thời gian dài với áp lực thuốc artemisinin [25],[26]. Đột biến C580Y được cho là
liên quan đến tình trạng chậm làm sạch KSTSR có mặt ở khu vực biên giới của
Myanmar-Thái Lan [30] với tần số cao nhất, tiếp theo đó là F446I ở khu vực gần
biên giới Ấn Độ. Trong khi sự phân bố khác nhau của các đột biến tại các vùng
địa lý khác nhau chưa được làm rõ nhưng có thể giải thích rằng Myanmar đang ở
giai đoạn đầu của q trình tiến hóa (so với các điểm ở Campuchia). Những đột
biến ở Myanmar cho thấy sự giảm mức độ kháng artemisinin, có thể là do có sự
chọn lọc đặc biệt từ việc sử dụng thuốc SR, tính di truyền của vật chủ hoặc muỗi
sinh học có thể dẫn đến sự phân bố khác nhau về các đột biến ở 2 vùng phía Nam
và bắc Myanmar.
Nghiên cứu tại Uganda đánh giá sự liên quan giữa đột biến gen K 13 và
Falcipain-2 với tình trạng kháng artemisinin. Loại Falcipain-2 hay cysteine
protease falcipain-2 (FP2; PF3D7_1115700) là một enzym protease thủy phân
hemoglobine của hồng cầu vật chủ. Đột biến tại codon 69 dẫn đến gián đoạn gen
Falcipain-2 có thể “khóa lại” quá trình thủy phân hemoglobin, dẫn đến KSTSR
tăng nhạy cảm với các chất ức chế protease và kết quả là làm giảm hoạt động của
artemisinin (Rosenthal PJ và cs., 2011). Phân tích về mặt phân tử, ngồi sự có mặt
một số đột biến không liên quan đến kháng artemisinin, khơng thấy có mặt các
đột biến C580Y, R539T hay Y493H, là những đột biến liên quan chặt chẽ với tình
trạng chậm làm sạch KSTSR tại các nước Đông Nam Á, kể cả đột biến M476I.
Như vậy, sự hạn chế về đa hình các đột biến gen K 13 và đa dạng trong cấu trúc
gen Falcipain-2 không thay đổi trước và sau khi sử dụng ACTs một cách rộng rãi

28
để điều trị SR do P. falciparum cho thấy đột biến gen K13 không ảnh hưởng đến
việc điều trị bằng ACTs và ACTs vẫn là thuốc điều trị sốt rét P. falciparum hiệu
quả tại quốc gia này [44].
Tất cả kết quả trên cho thấy mối quan tâm đến kháng thuốc artemisinin trở
thành vấn đề cấp bách tại Việt Nam, một quốc gia chia sẻ với dải biên giới dài với
Campuchia, Lào, Trung Quốc, đặc biệt là các tỉnh miền Trung-Tây Nguyên - nơi
có tỷ lệ mắc và tử vong cao do sốt rét hàng năm và các nguy cơ giảm hiệu lực
DHA-PPQ, thậm chí thất bại điều trị hoặc kháng là có thể rất cao. Vấn đề cần
thiết hiện nay vẫn đang thiếu một marker phân tử có ý nghĩa trong việc kiểm soát
sự lây lan của P. falciparum kháng với artermisinin trong điều trị lâm sàng, điều
này đã cản trở việc tập trung ngăn chặn KSTSR kháng artemisinin tại các khu vực
đã được ghi nhận là có tình trạng kháng artemisinin và gây ảnh hưởng đến việc
phát hiện nhanh KSTSR ở những nơi khác, nơi ACTs vẫn là thuốc chống sốt rét
hiệu quả và giá hợp lý [28],[44].
Nhìn chung, đột biến K13 cung cấp một công cụ phân tử mới tiềm năng đối
với kháng artemisinin, có liên quan đến q trình làm sạch KSTSR thể vơ tính tại
các điểm kháng thuốc. Nhiều đột biến K13 tồn tại, song không phải luôn luôn tỷ lệ
thuận với sự làm sạch chậm KSTSR sau điều trị artesunate hoặc dẫn suất. Xuất
hiện kháng artemisinin và lan rộng dường như độc lập, do đó cần phải hiểu và
làm rõ vai trò chỉ điểm phân tử K13 để giám sát kháng artemisinin.
1.4.2. Gen plasmepsin 2-3 và cơ chế kháng piperaquine trên góc độ
sinh học phân tử
Gen plasmepsin là một họ gen gồm 4 gen plasmepsin I, II, III, IW (Amato
và cs, 2017). Đây là gen nằm trên nhiễm sắc thể số 14. Trong nhóm 4 gen ở trên,
chỉ có gen plasmepsin 2,3 liên quan đến sự gia tăng tỷ lệ IC50 trong thử nghiệm
với piperaquine. Dạng hoang dại của KST chỉ mang 1 bản sao của gen plasmepsin
2,3; dạng đột biến mang 2 bản sao của gen plasmepsin 2,3 được mơ tả rõ trong

hình dưới đây.