Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa của một số cây thuốc an giang, nghệ an và thành phần các hoạt chất

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CƠNG TRÌNH NCKH CẤP TRƯỜNG TRỌNG ĐIỂM

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HĨA
CỦA MỘT SỐ CÂY THUỐC AN GIANG, NGHỆ AN
VÀ THÀNH PHẦN CÁC HOẠT CHẤT
S

K

C

0

0

3

9

5

9

MÃ SỐ: T2013 - 39TĐ

S KC 0 0 4 2 8 5

Tp. Hồ Chí Minh, 2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KỸ THUẬT
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KH&CN CẤP TRƢỜNG TRỌNG ĐIỂM

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA
MỘT SỐ CÂY THUỐC AN GIANG, NGHỆ AN VÀ
THÀNH PHẦN CÁC HOẠT CHẤT

Mã số: T2013-39TĐ
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Phan Thị Anh Đào

TP. HCM, 11/2013


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC & THỰC PHẨM

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KH&CN CẤP TRƢỜNG TRỌNG ĐIỂM

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA

MỘT SỐ CÂY THUỐC AN GIANG, NGHỆ AN VÀ
THÀNH PHẦN CÁC HOẠT CHẤT
Mã số: T2013-39TĐ

Chủ nhiệm đề tài: Ths. Phan Thị Anh Đào
Thành viên đề tài: TS. Võ Thị Ngà

TP. HCM, 11/2012


DANH SÁCH NHỮNG NGƢỜI THAM GIA ĐỀ TÀI
ST
T
1

Đơn vị công tác và

Họ và tên

lĩnh vực chuyên môn

Phan Thị Anh Đào

Bộ mơn CN Hóa học- Khoa CN Hóa

Nội dung
nghiên cứu
đƣợc giao
Chủ trì

học& Thực phẩm, ĐH Sư phạm Kỹ
thuật TP. HCM
2

Võ Thị Ngà

Bộ mơn Hóa Phân Tich, Khoa Hóa,

Tham gia

ĐH Khoa học Tự Nhiên TP. HCM

ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH
Tên đơn vị

Nội dung phối hợp

Họ và tên

trong và ngoài nƣớc

nghiên cứu

ngƣời đại diện
đơn vị

Phịng thí nghiệm Hóa Dược– ĐH

Thử hoạt tính kháng oxy

Nguyễn Xn

Khoa học Tự nhiên Tp. HCM

hóa

Hải

Phân tích phổ nghiệm

Nguyễn Huỳnh

Phịng phân tích trung tâm-– ĐH
Khoa học Tự nhiên Tp. HCM

Hoa


LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành gửi tới TS. Nguyễn Thị Thanh Mai (Khoa Hóa, ĐH Khoa học
Tự nhiên TP HCM), đã dìu dắt, định hướng cho tơi trong nghiên cứu này.
Đề tài hồn thành cịn có sự đóng góp, hỗ trợ của các thầy cơ trong khoa CN
Hóa Học & Thực Phẩm- ĐH Sư phạm kỹ thuật HCM và khoa Hóa, ĐH Khoa học
Tự nhiên tp HCM.
Xin chân thành cảm ơn!

Chủ nhiệm đề tài: Phan Thị Anh Đào

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH V Ẽ
DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ SƠ ĐỒ
DANH MỤC PHỤ LỤC
THÔNG TIN KẾT QỦA NGHIÊN CỨU
INFORMATION R ES URCH R ES ULTS

MỞ ĐẦU....................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................... 1
1.1. TỔN G QUAN VỀ GỐC TỰ DO VÀ CHẤT KHÁN G OX Y HÓA .......................... 1
1.1.1. Gốc tự do ...............................................................................................................1
1.1.2. Chất kháng oxy hóa .............................................................................................5
1.1.3. Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa.......................................7
1.2. TÌM HIỂU VỀ CÂ Y THUỐC NAUCLEA ORIENTALIS (L.) ................................... 9
1.2.1. Mô tả thực vật [8, 9] ...............................................................................................9
1.2.2. Phân bố và sinh thái [8, 9]......................................................................................9
1.2.3. Những nghiên cứu về dược học .......................................................................11
1.2.4. Nghiên cứu về thành phần hóa học..................................................................12
1.3. ĐỊNH HƯỚN G N GHIÊN CỨU ................................................................................... 21
1.3.1. Những vấn đề còn tồn tại ..................................................................................21
1.3.2. Định hướng nghiên cứu.....................................................................................22

CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM .................................................................. 23
2.1. TRÍCH LY VÀ CƠ LẬ P HỢP CHẤT......................................................................... 23
2.1.1. Hóa chất và thiết bị ............................................................................................23
2.1.2. Nguyên liệu.........................................................................................................23
2.1.3. Điều chế các loại cao .........................................................................................24
2.1.4. Cô lập các hợp chất hữu cơ từ thân cây N.orientalis.....................................28
2.3. THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁN G OX Y HÓA ................................................. 29

2.3.1. Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bằng thử nghiệm ức chế gốc tự do DPPH
..........................................................................................................................................29
2.3.2. Khảo sát hoạt tính ức chế q trình peroxide hóa lipid .................................31

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 33
3.1. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG OX Y HĨA ............................................... 33
3.1.1. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của các mẫu cao meOH ............33
3.1.2. Kết quả thử hoạt tính trên các mẫu cao của cây N. orientalis ......................35
3.2. KHẢO SÁT CẤU TRÚC CÁ C HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂ Y NAUCLEA
ORIENTALIS L................................................................................................................... 36
3.2.1. Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất polyphenol đơn vòng ....................36
3.3. XÁ C ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁN G OX Y HĨA ....................................................... 43
3.3.1. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH .................................43
3.3.2. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid .............44

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................... 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 48
PHỤ LỤC ................................................................................................... 51
CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CƠNG BỐ ................................................... 65
THUYẾT MINH ĐỀ TÀI
HỢP ĐỒNG NCKH


DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
CHCl3

Cloroform

d

Doublet (NMR), mũi đôi

dd

Doublet of doublet (NMR), mũi đô i đôi

DPPH

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

EtOAc

Etyl acetat

1H-NMR

Proton Nuclear Magnetic Resonance

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Coherence

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Correlation

IC50

50% Inhibitory Capacity Value

J

Coupling constant, hằng số ghép

MeOH

Methanol

NMR

Nuclear Magnetic Resonance, cộng hưởng từ hạt nhân

Rf

Retention factor

s

Singlet (NMR), mũi đơn

SKC

Sắc kí cột

TLC

Thin Layer Chromatography, sắc kí bản mỏng.

δ

Chemical shift, độ dịch chuyển (ppm)

YH CT

Y học cổ truyền


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1. Q trình peroxide hóa lipid .................................................................................. 4
Hình 1.2. Một số chất kháng oxy hóa tổng hợp ............. Error! Bookmark not defined.
Hình 1.3. Cơng thức cấu tạo của L-ascorbic acid và dehydro ascorbic acid Error! Bookmark not defined.
Hình 1.4. Cơng thức cấu tạo của vitamin E .................... Error! Bookmark not defined.
Hình 1.5: Cơng thức cấu tạo của β-carotene ................... Error! Bookmark not defined.
Hình 1.6. Cơng thức cấu tạo của taurine và hypotaurineError! Bookmark not defined.
Hình 1.7: Công thức cấu tạo của acid α-lipoic ................ Error! Bookmark not defined.
Hình 1.8. Phản ứng trung hịa gốc DPPH.............................................................................. 7
Hình 1.9. Phản ứng tạo phức giữa malonyldialdehyde và thiobarbituric acid ................. 8
Hình 1.10. Ảnh minh họa cây, hoa và lá của ..................................................................... 10
N. orientalis............................................................................................................................. 10
Hình 1.11. Cấu trúc một số hợp chất steroid và chất béo được phân lập từ cây N.
orietalis .................................................................................................................................... 13
Hình 1.12. Cấu trúc một số hợp chất terpenoid được phân lập từ cây N. orietalis
13
Hình 1.13. Cấu trúc một số hợp chất chứa nitrogen được phân lập từ cây N. orietalis14
Hình 1.14. Cấu trúc một số hợp chất polyphenol được phân lập từ cây N. orietalis..... 15
Hình 1. 15. Cấu trúc một số hợp chất steroid, terpenoid có trong chi Nauclea ............. 16
Hình 1. 16. Cấu trúc một số hợp chất alkaloid được cô lập từ chi Nauclea ................... 19
Hình 1.17. Cấu trúc một số hợp chất polyphenol đã được cô lập từ chi Nauclea.......... 20

Hình 3.1. Cấu trúc của DR-1 ................................................................................................ 37
Hình 3.3. Cấu trúc hợp chất GV-2 ....................................................................................... 38
Hình 3.3. Cấu trúc hợp chất GV-3 ....................................................................................... 39
Hình 3.4. Cấu trúc của hợp chất GV-4 ................................................................................ 40
Hình 3.5. Cấu trúc của hợp chất GV-5 ................................................................................ 41
Hình 3.6. Cấu trúc của hợp chất GV-6 ................................................................................ 43


DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ SƠ ĐỒ
Bảng 1.1. Các dạng hoạt động của oxygen và nitrogen trong sinh học

[1]

........................ 1

Sơ đồ 1.2. Phân loại các chất kháng oxy hóa tự nhiên trong hệ thống sinh học [5]Error! Bookmark not defined.
Bảng 1.3. Các chất được phân lập từ các cây N. orientalis .............................................. 12
Bảng 1.4. Các hợp chất phân lập từ chi Nauclea [14-20] ..................................................... 15
Sơ đồ 2.1. Quá trình ly trích.................................................................................................. 24
Bảng 2.1. Danh mục 36 cây thuốc của An Giang và Nghệ An [1-2] .............................. 25
Bảng 2.2. Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate của thân cây N. orientalis ..................... 28
Sơ đồ 2.2. Qui trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH............................................... 30
Sơ đô 2.3. Qui trình khảo sát hoạt tính ức chế q trình peroxide hóa lipid .................. 32
Bảng 3.1. Phần trăm ức chế và giá trị IC50 của các 90 mẫu cao sàng lọc ....................... 33
Bảng 3.2. Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các cây thuốc An Giang và Nghệ An ..
có hoạt tính mạnh ................................................................................................................... 34
Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của cao thô từ thân cây N.
orientalis.................................................................................................................................. 35
Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của cao phân đoạn từ thân cây
N. orientalis............................................................................................................................. 35

Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-1 so sánh với 4 – hydroxybenzoic acid36
Bảng 3.6. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GV-2 so với acid protocatechuic ................ 38
Bảng 3.7. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GV-3 so với acid gallic ................................ 39
Bảng 3.8 . Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GV-4 với umbelliferone.............................. 40
Bảng 3.9. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GV-8 so với esculetin................................... 41
Bảng 3.10. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GV-9 so với scpoletin ................................ 42
Bảng 3.11. Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của tất cả hợp chất được phân lập trên
hai cây ...................................................................................................................................... 43


DANH MỤC PHỤ LỤC
Phụ lục 1a. Phổ 1H-NMR của chất GV-1 ............................................................................ 51
Phụ lục 1b. Phổ 13 C-NMR của chất GV-1 .......................................................................... 51
Phụ lục 2a: Phổ 1H-NMR của hợp chất GV-2 .................................................................... 52
Phụ lục 2b: Phổ 13 C-NMR của hợp chất GV-2................................................................... 52
Phụ lục 3a: Phổ 1H-NMR của hợp GV-3 ............................................................................ 53
Phụ lục 3b: Phổ 13 C-NMR của hợp chất GV-3................................................................... 53
Phụ lục 4a: Phổ 1H-NMR và phổ giãn rộng của hợp chất GV-4...................................... 54
Phụ lục 4b: Phổ 13 C-NMR của hợp chất GV-4................................................................... 54
Phụ lục 4c: Phổ COSY-NMR của hợp chất GV-4 ............................................................. 55
Phụ lục 4d: Phổ HSQC-NMR của hợp chất GV-4............................................................. 55
Phụ lục 4e: Phổ HMBC-NMR của hợp chất GV-4 ............................................................ 66
Phụ lục 5a: Phổ 1H-NMR và phổ giãn rộng của hợp chất GV-5...................................... 56
Phụ lục 5b: Phổ 13 C-NMR của hợp chất GV-5................................................................... 57
Phụ lục 5c: Phổ HSQC-NMR của hợp chất GV-5 ............................................................. 57
Phụ lục 5d: Phổ HMBC-NMR của hợp chất GV-5............................................................ 58
Phụ lục 6a: Phổ 1H-NMR và phổ giãn rộng của hợp chất GV-6...................................... 58
Phụ lục 6b: Phổ 13 C-NMR của hợp chất GV-6................................................................... 59
Phụ lục 6c: Phổ HSQC-NMR của hợp chất GV-6 ............................................................. 59
Phụ lục 6d: Phổ HMBC-NMR của hợp chất GV-6............................................................ 60

Phụ lục 7. Kết quả thử hoạt tính ức chế q trình peroxide hóa lipid (thử nghiệm
MDA) ....................................................................................................................................... 64


ĐH SPKT TP HCM
Đơn vị: KHOA CNH & TP

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Thông tin chung:
- Tên đề tài: Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa của một số cây thuốc An Giang,
Nghệ An và thành phần các hoạt chất
- Mã số: T2013-39TĐ
- Chủ nhiệm: Phan Thị Anh Đào
- Cơ quan chủ trì: ĐH Sư phạm Kỹ thuật Tp. HCM
- Thời gian thực hiện: 3/2013-11/2013
2. Mục tiêu:
 Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của các cây thuốc An Giang bằng phương pháp
thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH.
 Lựa chọn cây thuốc có hoạt tính mạnh để cô lập và định danh thành phần các hoạt
chất.
 Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa của các chất cô lập được bằng phương pháp
ức chế gốc tự do DPPH và ức chế q trình pero xide hóa lipid.
3. Tính mới và sáng tạo:
 Đây là nghiên cứu có tính định hướng về hoạt tính kháng oxy hóa và phân lập hoạt
chất kháng oxy hóa- Một xu hướng nghiên cứu mới trong Hóa dược.
 Đề tài cơng bố 06 hợp chất lần đầu tiên cô lập được từ thân cây này và chi
Nauclea.
 Đây là kết quả đầu tiên cơng bố hoạt tính ức chế q trình peroxide hóa lipid của
hợp chất esculetin (GV-5).
4. Kết quả nghiên cứu:

 Từ 36 mẫu cao MeOH được trích ly từ 36 mẫu cây thuốc An Giang, Nghệ An, đã
phát hiện ra 05 mẫu có hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH rất mạnh. Đây sẽ là tiềm
năng cho các nghiên cứu thành phần và hoạt tính sinh học tiếp theo.


 Từ thân cây Nauclea orientalis L., chúng tôi đã phân lập được 06 hợp chất bao
gồm: 4-hydroxylbenzoic acid (GV-1), protocatechuic acid (GV-2), gallic acid (GV3), umbelliferone (GV-4), esculetin (GV-5), scopoletin (GV-6). Đây cũng là 06
hợp chất lần đầu tiên cô lập được từ thân cây này và chi Nauclea (chi Gáo).
 Sáu hợp chất được phân lập từ hai cây nghiên cứu đều được thử hoạt tính ức chế
gốc tự do DPPH. Ba hợp chất có hoạt tính ức chế gốc tự do mạnh là 4-,
protocatechuic acid (GV-2), gallic acid (GV-3), esculetin (GV-5).
 03 hoạt chất này được lựa chọn để đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa trên mơ hình
ức chế q trình peroxide hóa lipid. Theo kết quả IC50 nhận thấy, 03 hợp chất này
đều có hoạt tính mạnh hơn chất đối chứng dương Trolo x (IC50, 2265.5 µM). Hai
hợp chất gallic acid (GV-3), esculetin (GV-5) có hoạt tính ức chế q trình
peroxide hóa lipid mạnh.
5. Sản phẩm:
 01 bài báo đang trên Giáo dục Kỹ thuật- ĐH Sư phạm kỹ thuật TP. HCM
 01 Bài báo đăng trên tạp chí Khoa học Cơng nghệ
6. Hiệu quả, phƣơng thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng:
Đề tài ghóp phần cung cấp thơng tin khoa học về hoạt tính kháng oxy hóa của một
số cây thuốc An Giang và Nghệ An và thành phần hóa học và hoạt tính của thân cây
Gáo vàng, do vậy, đây là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên ngành Hóa, Sinh và
Dược học. Bên cạnh đấy, kết quả nghiên cứu của đề tài giúp đẩy mạnh ứng dụng của
cây thuốc Gáo vàng trong y học cổ truyền Việt nam.

Ngày

tháng

năm

Trƣởng Đơn vị

Chủ nhiệm đề tài

(ký, họ và tên, đóng dấu)

(ký, họ và tên)


INFORMATION ON RESEARCH RESULTS

1. General information:
- Project title: Study of antioxidant activity of An giang and Nghe an medicinal
plants, and their compositions
- Code number: 2012- 29TĐ
- Coordinator: Phan Thi Anh Dao
- Implementing institution: HCM City University of Technical Education
- Duration: from

3/2013 to 12/2013

2. Objecti ve(s):
 Screening of antioxidant activity of 36 An Giang and Nghe An medicinal plants
using DPPH free radical scavenging test.
 Evaluation of the results to choose plants which for further investigation on these
medicinal plant species to isolate active constituents.
 Isolating and indentification the isolated compounds from the selected plant.
 Study on DPPH free radical scavenging and lipid pero xidation inhibitory activities

of isolated compounds.
3. Creativeness and innovati veness:
Until now, this is the first scientific report on chemical constituents and biological
activities of this plant.
4. Research results:
 36 extracts prepared from 36 medicinal plants from An Giang province and Nghe
An province were studied on antioxidant activity by the DPPH radical scavenging
test. The results indicate a five extracts that may be useful for the treatment of
diseases relating free radical damages, and provide the basis for further
investigation on these medicinal plants.
 Six compounds were isolated from the stem of Nauclea orientalis L. including 4hydroxybenzoic acid (GV-1), protocatechuic acid (GV-2), gallic acid (GV-3), 7hydroxycoumarin (GV-4, esculetin (GV-5), and scopoletin (GV-6). These
compounds were isolated for the first time from this plant.
 All isolated compounds from the stem of N. orientalis were assayed and compared
for their DPPH inhibitory activity to the positive control, trolo x. The results
indicated that

compounds (GV-2), (GV-3), and (GV-5) showed significant free


radical scavenging capacities with IC50 values of 10.3, 5.1 and 3.6 µM,
respectively. Among of them, compounds (3) and (5) were much more active than
trolox (IC50, 7.0 µM).


Based on the results obtained from the DPPH assay, three compounds which
exhibited strong DPPH inhibitory were tested for lipid pero xidation inhibition by
the thiobarbituric acid assay (TBA assay). All the studied compounds showed
antioxidant activity much more active than trolox (IC50, 2265.5 µM).

5. Products:

 one paper public on Journal of Technical Education Science
 one paper public on Journal of Science and Technology
6. Effects, transfer alternatives of reserach results and applicability:
This project which has supplied results about antioxidant activity of An Giang and
Nghe An, and medicinal plants chemical constituents and biological activities of stem
of N. orientalis helpful for student in chemistry, biology and pharmacy. In addition,
this investigation of antioxidant phenolic compounds suggested that the potency of
these compounds could provide a chemical basis for some of the health benefits
claimed for N. orientalis in foods and folk medicine.


Mở đầu

T2013-39TĐ

MỞ ĐẦU
 Tính cấp thiết:
Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đặc biệt quan tâm đến các vấn đề gốc
tự do-chất kháng oxy hóa và hoạt tính kháng oxy hóa. Trong cơ thể con người, khi
lượng gốc tự do quá lớn, vượt qua mức kiểm soát của hệ thống miễn dịch, gốc tự do sẽ
tấn công vào các đại phân tử như DNA, protein, lipid và gây rối loạn các q trình sinh
hóa trong cơ thể. Gốc tự do là thủ phạm có liên quan tới hơn 60 căn bệnh mà trong đó
phải kể tới các bệnh nguy hiểm hiện nay như ưng thư, viêm khớp, huyết áp, tim
mạch…
Ngày này, xu hướng nghiên cứu mới là tìm kiếm các hoạt chất có nguồn gốc tự
nhiên nhằm thay thế cho các chất kháng oxy hóa tổng hợp hiện vẫn còn sử dụng nhiều
trong thực phẩm, y học và cuộc sống hằng ngày.
Vùng Bảy Núi (Tịnh Biên, An Giang) và vùng Phủ Quỳ (Nghĩa Đàn, Nghệ An) là
hai địa danh có hệ thực vật phong phú và đa dạng ở Việt Nam. Với mong muốn tìm
kiếm những cây thuốc có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh, chúng tơi đã lựa chọn ra 36

cây thuốc cho nghiên cứu hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH.
Từ kết quả sàng lọc, chúng tơi đã tìm ra một số cây thuốc q có hoạt tính kháng
oxy hóa mạnh và lựa chọn thân cây Nauclea Orientalis L. cho nghiên cứu phân lập
hoạt chất tiếp theo. Đây là cây thuốc quí được sử dụng chữa trị các căn bệnh liên quan
tới gan, đặc biệt là xơ gan cổ trưởng và hiện chưa được nghiên cứu ở Việt Nam. Trên
thế giới, các nghiên cứu tập trung theo hướng phân lập nhóm hợp chất alkaloid từ cao
ammoniac và cao chloroform được trích ly từ các bộ phận của cây. Do đó, hướng
nghiên cứu phân lập hoạt chất kháng oxy hóa từ thân của cây N. orientalis sẽ góp phần
tìm ra các hoạt chất đa dạng khác có trong cây nói riêng và chi Nauclea nói chung.
 Mục tiêu:
 Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của các cây thuốc An Giang và Nghệ An
bằng phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH.
 Lựa chọn cây thuốc có hoạt tính mạnh để cơ lập và định danh thành phần
các hoạt chất.

1


Mở đầu

T2013-39TĐ

 Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa của các chất cô lập được bằng
phương pháp ức chế gốc tự do DPPH và ức chế q trình peroxide hóa
lipid.
 Phƣơng pháp nghiên cứu:
 Các mẫu cây sử dụng trong nghiên cứu sàng lọc được điều chế bằng kỹ
thuật trích nóng trong dung mơi methanol, 600 C.
 Cơ lập các hợp chất tinh khiết từ thân cây Gáo vànng, N. orientalis bằng
các phương pháp trích ly, sắc ký cột, sắc ký bản mỏng, sắc ký bản mỏng

điều chế.
 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cơ lập được bằng các phương
pháp phổ nghiệm hiện đại như cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai
chiều, khối phổ,...
 Thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp ức chế gốc tự do
DPPH và hoạt tính ức chế q trình peroxide hóa lipid.

2


Chương 1. Tổng quan

T2013-39TĐ

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG Q UAN VỀ GỐC TỰ DO VÀ CHẤT KHÁNG OX Y HÓA
1.1.1. Gốc tự do
Trong hóa học, gốc tự do là những nguyên tử, nhóm nguyên tử hoặc phân tử có
những electron khơng ghép cặp ở lớp ngồi cùng. Các electron này có năng lượng cao,
rất kém bền nên dễ dàng tham gia vào nhiều phản ứng hóa học như phản ứng oxy hóa
– khử, phản ứng polymer hóa…. Gốc tự do có hoạt tính cao nên thời gian tồn tại của
chúng thường rất ngắn, phụ thuộc nhiều yếu tố: cấu hình khơng gian, đặc tính cộng
hưởng, hiệu ứng liên hợp. [1]
Bảng 1.1. Các dạng hoạt động của oxygen và nitrogen trong sinh học [1]
Các dạng hoạt
động

Ký hiệu

Thời gian

tồn tại

Hoạt động

Các dạng hoạt động của oxygen
O2 ●

─

10 -6 s

Tạo ra trong ty thể (mitochondria), hệ thống tim
mạch và các bộ phận khác

HO ●

10 -9 s

Hoạt tính cao, được tạo ra trong tình trạng cơ thể dư
chất sắt (Phản ứng Fenton)

Hydrogen peroxide

H2O 2

Bền

Là tác nhân oxy hóa mạnh, dễ dàng nhận 1 electron
để chuyển hóa thành gốc tự do HO●

Gốc p eroxyl

ROO ●

Hydroperoxide hữu
cơ

ROOH

Ổn định

Phản ứng với các ion kim loại chuyển tiếp để tạo ra
các dạng hoạt động.

Singlet oxygen

1

10 -6s

Hoạt tính cao, hình thành trong quá trình quang học
(photosensitization) và phản ứng hóa học

Ozon

O3

Superoxide
Gốc hydroxyl

Hoạt tính cao, được hình thành khi các đại phân tử
bị gốc tự do tần công

O2

Là 1 chất gây ơ nhiễm trong khí quyển, có thể phản
ứng với các phân tử khác nhau để tạo ra 1O2.
Các dạng hoạt động của nitrogen
Vai trò rất quan trọng trong hệ thống thần kinh trung
ương và ngoại biên.

Nitric oxide

NO ●

Peroxynitrite

ONOO

Acid peroxynitrous

ONOOH

Nitrogen dioxide

NO2

─

─

10 -3 s

Hoạt tính cao, hình thành từ NO ● và O2 ●

Khá ổn
định

Được hình thành khi ONOO nhận thêm 1 proton.

─

Hình thành trong q trình ơ nhiễm khơng khí

1


Chương 1. Tổng quan

T2013-39TĐ

Các gốc tự do đóng vai trị quan trọng trong các quá trình sinh lý của con người và
cũng là nguyên nhân liên quan tới nhiều bệnh lý nguy hiểm. Có hai nhóm gốc tự do
bao gồm: các dạng hoạt động của nitrogen (nitrogen oxygen species, NOS) và các
dạng hoạt động của oxygen (reactive oxygen species, ROS) (bảng 1.1). Hệ thống gốc
tự do trong sinh học chủ yếu là các gốc có trung tâm là oxygen.
Hai gốc tự do quan trọng chứa nitrogen là NO• và ONOO─, trong đó NO• là gốc
tự do được quan tâm nhiều nhất do nó có vai trị rất quan trọng trong hệ thống thần
kinh trung ương, ngoại biên và là tác nhân điều hòa huyết áp. Nếu như các dạng hoạt
động của nitrogen có ý nghĩa trên lâm sàng thì các dạng hoạt động của oxygen lại là

tác nhân nguy hiểm gây hơn 60 bệnh lý. Các dạng oxygen hoạt động này có năng
lượng cao, rất kém bền và dễ dàng phản ứng với những đại phân tử sinh học như
protein, lipid, DNA… gây rối loạn các q trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng thời khi
một phân tử sống bị các gốc tự do tấn cơng, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự
do mới, tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng
thường gọi là phản ứng dây chuyền trong cơ thể, gây ra các biến đổi có tác hại đối với
cơ thể.[2]
1.1.2. Vai trò của gốc tự do trong cơ thể
Ở nồng độ trung bình, gốc tự do rất có lợi và cần thiết cho các hoạt động của cơ
thể sống. Trong quá trình trao đổi chất, gốc tự do đóng vai trị trung gian di chuyển các
điện tử từ phân tử này sang phân tử khác nhằm tạo ra năng lượng cung cấp cho hoạt
động sống của con người. Gốc tự do, phần lớn là các gốc tự do góp phần cùng với
bạch cầu tiêu diệt các vi sinh vật có hại, tăng cường khả năng bảo vệ cho hệ thống
miễn dịch của cơ thể. Bên cạnh tác dụng giúp tiêu diệt các vi sinh vật lạ, gốc tự do cịn
góp phần qt dọn những tế bào già, chết trong cơ thể tạo điều kiện cho những tế bào
mới sinh sôi và phát triển. Đồng thời, gốc tự do cịn góp phần tiêu diệt những tế bào
bất thường như tế bào ung thư. Ngồi hai vai trị trên, gốc tự do cịn tham gia vào
nhiều q trình có lợi khác cho cơ thể như đóng vai trị là chất dẫn truyền thần kinh
(NO•) và tác nhân điều hịa huyết áp.
Trong cơ thể sống luôn tồn tại sự cân bằng các dạng hoạt động và dạng kháng oxy
hóa, đó là một trạng thái cân bằng nội môi (homeostasis). Tuy nhiên, do ảnh hưởng
2


Chương 1. Tổng quan

T2013-39TĐ

của nhiều yếu tố tác động ngoại sinh làm gia tăng nồng độ của các dạng hoạt động,
vượt quá mức kiểm soát của các hệ thống kháng oxy hóa trong cơ thể. Hiện tượng

stress oxy hóa (oxydative stress) xảy ra, mang lại nhiều nguy hại cho con người khi
các gốc tự do bùng phát và tấn công các phân tử sống như lipid, protein, DNA và có
thể gây chết tế bào.
Theo các nhà khoa học, gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh, đáng
kể nhất gồm có: bệnh xơ vữa động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thuỷ tinh
thể, bệnh đái tháo đường, cao huyết áp vô căn, xơ gan.
Các bệnh lý này thường xảy ra do quá trình tổn thương trong cơ thể:
a) Sự tổn thƣơng do quá trình peroxide hóa lipid [4 ]
Trong cơ thể, ngồi nước ra thì các tổ chức màng chiếm phần lớn và giữ vai trò
quan trọng. Thành phần của màng chủ yếu là các acid béo chưa no, phospholipid, …Vì
vậy, xác suất các gốc tự do tấn công vào thành phần lipid gây ra q trình pero xide hóa
lipid là rất cao. Q trình peroxide hóa là sự tương tác của các dạng oxygen hoạt động
với các acid béo chưa no, tạo ra nhiều sản phẩm độc hại và các phản ứng gốc tự do lan
truyền trong cơ thể. Q trình peroxide hóa lipid là chuỗi phản ứng gốc tự do điển hình
với ba giai đoạn: khơi mào, phát triển và dập tắt mạch (hình 1.1).
Trong giai đoạn khơi mào, gốc HO• sẽ lấy một ngun tử hydrogen trong nhóm
methylen của lipid (LH) hình thành gốc tự do lipid (L•). Gốc tự do lipid sẽ tiếp tục
phản ứng với oxygen trong cơ thể tạo gốc tự do lipid peroxyl (LOO•). Gốc LOO• sẽ
hình thành hợp chất lipid hydroperoxid (LOOH) bằng cách lấy đi một nguyên tử
hydrogen từ một acid béo không no kế cận nó trong giai đoạn thứ hai gọi là giai đoạn
phát triển. Giai đoạn kết thúc xảy ra khi 2 gốc tự do kết hợp với nhau tạo thành phân tử
trung hịa hoặc khi sản phẩm của phản ứng khơng cịn ở trạng thái gốc.

3


Chương 1. Tổng quan

T2013-39TĐ

R

R
H2O
+ H2O

H

Khơi mào
Lipid chưa bão hòa

O2

Gốc tự do lipid
Phát triển mạch

R

R

R

OOH

H

+

OO

Gốc lipid peroxyl

Lipid peroxide

Hình 1.1. Quá trình peroxide hóa lipid

Các gốc tự do lipid có thể phản ứng với nhau, gây xáo trộn cấu trúc màng tế bào.
Q trình peroxide hóa lipid làm thay đổi độ nhớt, tính thấm của màng tế bào và chức
năng của các kênh ion trên màng, gây nguy hiểm cho các thành phần bên trong tế bào.
Khi màng tế bào mất chức năng sinh học, tế bào sẽ bị chết kéo theo sự thối hóa mơ.
Q trình peroxide hóa cũng có thể được xúc tiến bởi oxygen đơn bội. Lipid
hydroperoxide bị phân hủy thành rất nhiều sản phẩm aldehyde. Trong đó, hợp chất
malonyldialdehyde (MDA) là sản phẩm aldehyde phổ biến nhất và nó được xem là dấu
hiệu của q trình peroxide hóa lipid.
b) Sự tổn thƣơng các phân tử protein [2, 4]
Những nghiên cứu gần đây cho thấy protein là phần chính của tế bào bị gốc tự do
hydroxyl tấn công, tạo thành sản phẩm hydroperoxid trên protein (xem các phản ứng):
PrH + X• (HO•) → Pr• + XH (H2O)

(1.14)

Pr• + O2 → PrOO•

(1.15)

PrOO• + H+ → PrOOH

(1.16)

PrOO•+ PrH → PrOOH + Pr•

(1.17)

PrOO• + gốc tự do → PrOOH

(1.18)

Các protein bị hư hại bởi gốc tự do dẫn đến sự rối loạn chức năng của nhiều cơ
quan trong cơ thể. Ví dụ, sự hư hại các protein collagen ở da, gây tổn hại da; hay các
4


Chương 1. Tổng quan

T2013-39TĐ

enzym (bản chất là protein) khi bị tổn hại sẽ không hoạt động hiệu quả để xúc tác các
phản ứng sinh hóa trong cơ thể. Các enzym sẽ khơng được sửa chữa phục hồi vì nồng
độ các gốc tự do cao, tình trạng này dần dần làm cơ thể lão hóa nhanh hơn và có thể
tạo ung thư.
c) Sự phá huỷ DNA[2, 4]
Các gốc tự do dễ dàng tấn công DNA thông qua việc tấn công vào nhóm đường
deoxyribose và base nitơ của nhóm purin và pirimidin hình thành thể đột biến. Đột
biến gen do tác động của gốc tự do ở mức độ thấp trong các mơ khỏe mạnh vì trong cơ
thể khỏe mạnh có các enzym sửa sai thường xuyên loại bỏ những điểm hư hỏng trên
DNA. Sản phẩm của đột biến gen do gốc tự do gây ra được tìm thấy nhiều trong mơ
ung thư.
Như vậy, gốc tự do ảnh hưởng đến đoạn DNA ở vị trí đặc biệt nào đó hoặc đến
một đoạn gen làm cho gen đó thốt khỏi hệ thống sửa chữa trước khi sự sao chép xuất
hiện dẫn đến đột biến gen. Đồng thời, các tổn thương do gốc tự do gây ra cũng làm

cho DNA sao mã khơng chính xác làm cho tế bào ung thư được hình thành hoặc làm
kiệt quệ năng lượng của tế bào dẫn đến hoại tử mơ.
1.1.3. Chất kháng oxy hóa
1.1.3.1. Khái niệm
Chất kháng oxy hóa (AO hoặc AH) là những chất có khả năng ngăn ngừa, ức chế
và loại bỏ tác dụng độc hại của các gốc tự do một cách trực tiếp hoặc gián tiếp.
Một số hệ thống kháng oxy hóa thường gặp:
- Chất kháng oxy hóa ngăn ngừa (preventive antioxidant): cơ thể có một số protein
nhất định có khả năng ngăn chặn sự hình thành của gốc tự do như: transferin, albumin,
myoglobin, ceruloplasmin.
- Enzyme kháng oxy hóa (antioxidant enzyme): các enzyme kháng oxy hóa quan
trọng nhất bao gồm: superoxyde dismutase, catalase và glutathione peroxydase.
- Các hợp chất kháng oxy hóa: một số hợp chất có khả năng hoạt động như chất
kháng oxy hóa như các vitamin (vitamin C, vitamin E), β- carotene và nhóm hợp chất
flavonoid, stilbene, gutathione, polyphenol đơn vịng, lignan.

5


Chương 1. Tổng quan

T2013-39TĐ

- Các enzyme sửa chữa (repair enzyme): một số enzyme như DNA repair enzyme,
methionine sulfoxyde reductase có khả năng khắc phục những thiệt hại do gốc tự do
gây ra cho các các đại phân tử.
1.1.3.2. Cơ chế hoạt động của chất kháng oxy hóa [2, 3]
Chất kháng oxy hóa hoạt động theo một số cơ chế sau:
- Tạo rào cản vật lý để ngăn chặn các nguồn phát sinh gốc tự do như lưới lọc UV,
các màng tế bào

- Tạo bẫy hóa học có khả năng “hấp thu” năng lượng và electron, gốc tự do chứa
oxygen như carotenoid, anthocyanidin
- Vai trò như các hệ thống xúc tác có khả năng trung hịa hay chuyển hóa các dạng
hoạt động như hệ thống các enzyme kháng oxy hóa superoxide dis mutase, catalase và
glutathione peroxidase
- Kết hợp/ khử hoạt tính của các ion kim loại để ngăn cản sự hình thành các dạng
hoạt động của oxygen như ferritin, ceruloplasmin, catechin
- Khả năng ức chế các dạng hoạt động chứa oxygen như vitamin C, vitamin E,
acid uric, glutathione.
1.1.3.3. Phân loại
Có nhiều cách phân loại chất kháng oxy hóa theo khả năng hịa tan, nguồn gốc bao
gồm:
- Chất kháng oxy hóa ưa nước (hydrophilic) và kỵ nước (hydrophobic).
- Chất kháng oxy hóa nội sinh và chất kháng oxy hóa ngoại sinh
- Các enzyme kháng oxy hóa và chất kháng oxi hóa khơng có bản chất enzyme
- Chất kháng oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên và chất kháng oxy hóa có nguồn gốc
tổng hợp.
Xu hướng ngày nay, chất kháng oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên được ưu tiên sử
dụng và đẩy mạnh nghiên cứu do có đặc tính an tồn, thân thiện, ít tác dụng phụ đối
với sức khỏe con người, động vật và môi trường sống.

6


Chương 1. Tổng quan

T2013-39TĐ

1.1.4. Các phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa
1.1.4.1. Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH [7]

Năm 1922 Goldschmidt và Renn đã phát hiện ra một gốc tự do bền có màu tím
đậm, hầu như khơng phân hủy, khơng bị trùng hợp và cũng khơng phản ứng với oxy
đó chính là gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl). DPPH là một gốc tự do
có màu tím giống như màu của dung dịch KMnO4, không tan trong nước, tan trong
dung môi hữu cơ. Dung dịch DPPH có cực đại hấp thu tại bước sóng 517 nm, và sản
phẩm khử của nó là 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH-H) có màu vàng vàng nhạt.
 Nguyên tắc
Các chất có khả năng kháng oxy hóa sẽ trung hịa gốc DPPH bằng cách cho
hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng
sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt.
Phản ứng trung hịa gốc DPPH của các chất kháng oxy hóa được minh họa trong
hình 1.8:

Hình 1.8. Phản ứng trung hịa gốc DPPH

 Ƣu điểm
Phương pháp DPPH sử dụng kỹ thuật đơn giản, nhanh với một máy đo phổ UVVis. Phương pháp được sử dụng rộng rãi, đặc biệt là ứng dụng với mục đích sàng lọc.
Phương pháp đã được phát triển để phân tích đồng loạt nhiều mẫu thử bằng cách sử
dụng các tấm microplate.
 Nhƣợc điểm
DPPH chỉ hòa tan trong dung môi hữu cơ (đặc biệt trong ethanol), không tan trong
dung mơi ưa nước, do đó các chất kháng oxy hóa ưa nước không xác định được bằng
phương pháp này.
7


Chương 1. Tổng quan

T2013-39TĐ

Nhiều chất kháng oxy hóa phản ứng nhanh với gốc tự do nhưng lại phản ứng
chậm, thậm chí trơ đối với gốc DPPH. Do đó. động học phản ứng giữa DPPH và chất
kháng oxy hóa khơng tuyến tính theo nồng độ DPPH. Hơn thế nữa, kết quả sẽ phức tạp
nếu như các chất kháng oxy hóa có phổ bao trùm phổ của DPPH tại 515 nm (ví dụ như
các carotenoid).
1.1.4.2. Phương pháp thử hoạt tính ức chế q trình peroxide hóa lipid [4]
Peroxide hố lipid là một cơ chế thường gặp của những tế bào động thực vật bị
tổn thương. Q trình đóng vai trị chỉ thị của q trình stress oxy hóa trong tế bào và
mơ. Việc đo malondialdehyd-là sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxide hoá lipid là
một phương pháp thuận tiện và đơn giản cho việc đánh giá nồng độ lipid peroxie trong
nhiều mẫu khác nhau bao gồm thuốc, thực phẩm và mô sinh học từ người và động vật.
 Nguyên tắc
MDA khi cho phản ứng với acid thiobarbituric (TBA ), một phân tử MDA phản
ứng với hai phân tử TBA tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm.
Phản ứng được thực hiện ở môi trường pH bằng 2-3, nhiệt độ là 90-100o C trong thời
gian từ 10 đến 15 phút, tạo ra phức có màu, hấp thu UV tại bước sóng cực đại là 532
nm, được phát hiện bởi máy đo quang phổ hấp thu phân tử. Các chất kháng oxy hóa sẽ
làm giảm sự hình thành MDA, nên dựa vào sự giảm cường độ hấp thu của phức ta tính
được khả năng kháng oxy hóa của chất cần nghiên cứu.
Phản ứng tạo phức giữa MDA và acid thiobarbituric được biểu diễn như sau:
O
HOC-CH2-CHO

+

2

HN
S

MDA

OH

OH

N
N
H

O

S

N
N

OH HO

N

SH

MDA-TBA2

TBA

Hình 1.9. Phản ứng tạo phức giữa malonyldialdehyde và thiobarbituric acid

 Ƣu điểm

Phương pháp đo MDA đơn giản, dễ thực hiện nên được sử dụng rộng rãi và được
xem là phương pháp sàng lọc áp dụng cho nhiều mẫu thử sinh học in vitro.
 Nhƣợc điểm

8