Tài liệu Các phương pháp lập bản đồ di truyền người doc

Các phương pháp lập bản đồ
di truyền người


1. Phân tích liên kết (Linkage analysis)
Sự trao đổi chéo giữa các locus trên cùng
nhiễm sắc thể có thể tạo ra tái tổ hợp. Việc
đánh giá tần số tái tổ hợp có thể thực hiện
dựa vào quan sát sự di truyền các allele
trong các gia đình. Sự xác định các phase
liên kết (có nghĩa là nhiễm sắc thể mà trên
đó mỗi một allele được định vị) là một phần
quan trọng của phương pháp này.
Mặc dù có sự tương quan giữa centiMorgan
và khoảng cách vật lý thật sự giữa các locus,
mối quan hệ này bị phức tạp do các sai khác
về giới tính trong tái tổ hợp, các tần số tái tổ
hợp cao hơn ở gần các telomere và sự tồn tại
của các điểm nóng tái tổ hợp (recombination
hot spots).

Sự sai khác về thống kê của 2 locus có thể
được tính toán bằng cách tính tỉ số của hai
hợp lẽ (likelihood): hợp lẽ của liên kết ở tần
số tái tổ hợp đã cho chia cho hợp lẽ của
không liên kết. Logarithm của tỉ số sai khác
này được ký hiệu là LOD (logarithm of
odds). LOD>0,3: có liên kết; LOD<-0,2:
không liên kết.
Khoảng cách giữa các locus được tính bằng

đơn vị centiMorgan (cM). 1 cM tương ứng
với tần số tái tổ hợp xấp xỉ 1%.
Phân tích liên kết cho phép chúng ta xác
định được khoảng cách tương đối giữa các
locus nhưng không xác định được các vị trí
đặc trưng với marker hoặc các gene bệnh.
2. Các phương pháp lập bản đồ vật lý
(physical mapping)
2.1. Phương pháp lập bản đồ mất đoạn
(delection mapping)
Karyotype của các bệnh nhân mắc bệnh di
truyền thỉnh thoảng được phát hiện thấy hiện
tượng mất đoạn một vùng đặc trưng trên
nhiễm sắc thể. Điều này cho thấy rằng locus
gây bệnh có thể nằm trong vùng bị mất.
Chiều dài đoạn bị mất có thể biến đổi ở một
số bệnh nhân mắc cùng một bệnh. Các đoạn
mất của nhiều bệnh nhân được so sánh để
xác định vùng bị mất ở tất cả các bệnh nhân,
do đó thu hẹp lại vị trí của gene bệnh.
Phương pháp lập bản đồ mất đoạn đã được
sử dụng để xác định vị trí các gene chịu
trách nhiệm đối với ung thư võng mạc
(retinoplastoma), hội chứng Prader Willi và
Angelman và khối u Wilms. Khối u Wilms
là một khối u thận ở giai đoạn đầu do đột
biến nhiễm sắc thể số 11 gây ra. Chú ý rằng
các mất đoạn này chỉ xảy ra ở một nhiễm
sắc thể trong cặp tương đồng, tạo ra bệnh
nhân dị hợp tử đối với đoạn bị mất. Nếu

đoạn bị mất đủ lớn để có thể quan sát dễ
dàng dưới kính hiển vi và xảy ra trên cả hai
nhiễm sắc thể của cặp tương đồng thì
thường gây chết.
2. 2. Phương pháp lai tại chỗ (In situ
hybridization)
Đoạn DNA thu được từ marker đa hình hoặc
gene bệnh mà chúng ta muốn biết vị trí được
tạo dòng với mẫu dò (probe) bằng kỹ thuật
DNA tái tổ hợp. Mẫu dò được đánh dấu với
chất phóng xạ như tritium chẳng hạn. Sau đó
mẫu dò được đặt vào một màng lai chứa
nhiễm sắc thể kỳ giữa mà DNA của nó đã
biến tính. Mẫu dò phóng xạ sẽ bắt cặp bổ
sung với DNA đã biến tính của đoạn nhiễm
sắc thể đặc trưng. Bởi vì mẫu dò phát ra bức
xạ nên vị trí của nó có thể được xác định
một cách chính xác bằng cách đặt một phim
nhạy cảm tia X lên trên màng lai (phóng xạ
tự ghi (autoradiography)).
Phương pháp lai tại chỗ sử dụng các mẫu dò
phóng xạ thường diễn ra chậm và mức phân
tích khá thấp (2-5 Mb). Kỹ thuật FISH
(fluorescence in situ hybridization) sử dụng
mẫu dò huỳnh quang thay cho mẫu dò
phóng xạ là nhanh hơn và cho phép phân
tích vùng của mẫu dò tốt hơn, thường là ở
trong khoảng 1 Mb đối với nhiễm sắc thể kỳ
giữa. Bằng cách sử dụng nhiễm sắc thể kỳ
trung gian, các nhiễm sắc thể ở kỳ này kết

xoắn ít hơn các nhiễm sắc thể kỳ giữa, phân
tích FISH có thể được tăng lên từ 25-250 kb.
2.3. Lai tế bào soma
Các tế bào soma của các loài khác nhau khi
sinh trưởng trong cùng môi trường nuôi cấy
với sự có mặt của một số tác nhân như
polyethylene glycol hoặc virus Sendai, thỉnh
thoảng sẽ dung hợp với nhau tạo thành các
tế bào lai. Khi lai các tế bào chuột và tế bào
người với nhau sẽ thu được các tế bào lai
chứa 86 nhiễm sắc thể : 46 nhiễm sắc thể
người và 40 nhiễm sắc thể chuột. Sau đó các
tế bào lai được phép sao chép. Các tế bào
này bắt đầu mất đi một số nhiễm sắc thể
người khi chúng trải qua quá trình nguyên
phân. Cuối cùng các tế bào còn lại bộ nhiễm
sắc thể đầy đủ của chuột và chỉ một hoặc
một số nhiễm sắc thể người. Các tế bào này
được lập karyotype để xác định nhiễm sắc
thể nào của người còn lại (nhiễm sắc thể của
người và chuột có thể được phân biệt với
nhau dựa vào kích thước và các phương
pháp hiện băng). Sau đó các tế bào này được
nghiên cứu để xác định tế bào nào mang
gene thích hợp đang nói đến. Ví dụ nếu gene
luôn luôn được tìm thấy trong các tế bào
chứa nhiễm sắc thể số 1 của người nhưng
chưa bao giờ được phát hiện trong các tế bào
không mang nhiễm sắc thể số 1, chúng ta có
thể kết luận rằng gene này phải được định vị

trên nhiễm sắc thể số 1.
Sự có mặt của gene trong tế bào lai có thể
được phát hiện bằng một số phương pháp.
Nếu gene mã hoá một enzyme được sản xuất
ra bởi tế bào thì một xét nghiệm enzyme có
thể được sử dụng. Điện di protein được sử
dụng để nhận ra một sản phẩm protein người
và để phân biệt nó với sản phẩm protein
tương đương của chuột. Tuy nhiên các
phương pháp này yêu cầu một sản phẩm
protein đã biết phải được phát hiện. Thông
thường hơn, hiện nay các nhà nghiên cứu
kiểm tra sự lai của các dòng tế bào dung hợp
với một mẫu dò đánh dấu phóng xạ mang
DNA quan tâm bằng cách sử dụng phương
pháp Southern blotting hoặc kỹ thuật PCR.
2.4. Lập bản đồ lai phóng xạ (Radiation
hybrid mapping)
Phương pháp này bắt đầu với một thể lai tế
bào soma chứa một nhiễm sắc thể đơn của
người. Sau đó các tế bào này được chiếu với
tia X hoặc tia -> để làm đứt gãy sợi kép
nhiễm sắc thể. Bức xạ này giết chết tế bào vì
vậy chúng phải được dung hợp với tế bào
động vật gặm nhấm để tồn tại. Một số tế bào
lai được tạo ra gọi là các thể lai phóng xạ
(radiation hybrid) mang các đoạn nhỏ nhiễm
sắc thể người đã lai với nhiễm sắc thể gặm
nhấm. Sự có mặt của nhiễm sắc thể người có
thể được phát hiện bằng sự sàng lọc đối với

các trình tự Alu. Các trình tự Alu này tìm
thấy ở mỗi một đoạn có kích thước vài kb
trong nhiễm sắc thể người nhưng không tìm
thấy ở trong nhiễm sắc thể của gặm nhấm.
Bởi vì bức xạ bẻ gãy nhiễm sắc thể người ở
những khoảng cách ngẫu nhiên, các locus
được định vị gần với một locus khác hơn sẽ
được tìm thấy thường hơn trên cùng đoạn
nhiễm sắc thể (có xu hướng cùng đi với
nhau). Kỹ thuật PCR có thể được sử dụng để
xác định thể lai phóng xạ mang các tổ hợp
đặc trưng của các locus người. Sau đó sử
dụng phương pháp thống kê để đánh giá mỗi
một cặp locus thường được tìm thấy trên
cùng đoạn nhiễm sắc thể như thế nào. Kết
quả này cung cấp sự đánh giá khoảng cách
tương đối giữa các locus.
Ngoài các phương pháp trên người ta còn
dùng các phương pháp tạo dòng định vị
(positional cloning), phân tích sự bảo tồn
của các loài lai (analysis of cross-species
conservation), phân tích trình tự DNA bằng
máy tính, sàng lọc các đột biến ở trong trình
tự (screen for mutations in the sequence),
kiểm tra sự biểu hiện của gene