Khóa luận xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu bằng LC MSMS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƢỢC
----------------

HÀ ANH TUẤN

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
ĐỊNH LƢỢNG AFLATOXIN
TRONG DƢỢC LIỆU BẰNG LC-MS/MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

Hà Nội – 2019


----------------

an
dP

HÀ ANH TUẤN

ha
rm
ac
y

KHOA Y DƢỢC

,V
NU

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ed
ici
ne

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
ĐỊNH LƢỢNG AFLATOXIN

fM

TRONG DƢỢC LIỆU BẰNG LC-MS/MS

Sc
ho
ol
o

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

KHÓA: QH.2014.Y

Ngƣời hƣớng dẫn 2: TS. Nguyễn Hữu Tùng

Co
p

yri
g

ht

@

Ngƣời hƣớng dẫn 1: TS. Nguyễn Thị Phƣơng

Hà Nội – 2019

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


LỜI CẢM ƠN

,V
NU

Bản luận văn này đƣợc hoàn thành tại Khoa Hóa phân tích – Tiêu
chuẩn, Viện Dƣợc liệu dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Thị Phƣơng và
TS. Nguyễn Hữu Tùng.

ha
rm
ac
y

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Phƣơng
(Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu) và TS. Nguyễn Hữu
Tùng (Bộ môn Hóa dƣợc và kiểm nghiệm, Khoa Y Dƣợc - ĐHQGHN) là
q báu để em hồn thiện khóa luận.

an
dP

những ngƣời thầy đã hƣớng dẫn, chỉ bảo, góp ý và đƣa ra những ý kiến

Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Phƣơng Thiện Thƣơng (Trƣởng
khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu) cùng với các anh chị,bạn

ed
ici
ne

bè, cán bộ, nhân viên khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu đã
giúp đỡ em, đặc biệt là anh Nguyễn Đình Quân - ngƣời đã luôn theo sát,
hƣớng dẫn cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

fM

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong Khoa Y – Dƣợc đã
dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em trong suốt 5 năm theo học tại trƣờng.

Sc
ho
ol
o

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã ln ở
bên cạnh, ủng hộ, động viên em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và
hồn thành khóa luận.

Cuối cùng, em xin chúc các thầy cô mạnh khỏe, hạnh phúc và thành

Co
p

yri
g

ht

@

công trong công việc cũng nhƣ trong cuộc sống.

Hà Nội, ngày 16 tháng 04 năm 2019
Sinh viên

Hà Anh Tuấn

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


,V
NU

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG

ha
rm
ac
y

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................. 2

an
dP

1.1. Tổng quan về aflatoxin ......................................................................... 2
1.1.1. Giới thiệu về aflatoxin.................................................................... 2
1.1.2. Tính chất hóa lý .............................................................................. 2

ed
ici
ne

1.1.3. Điều kiện sinh aflatoxin ................................................................. 7
1.1.4. Cơ chế gây bệnh của aflatoxin ....................................................... 8
1.1.5. Độc tính của aflatoxin lên cơ thể ngƣời ......................................... 9

fM

1.1.6. Những nghiên cứu về phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin trong
dƣợc liệu.................................................................................................... 10

Sc
ho
ol
o

1.2. Tổng quan về sắc ký ái lực miễn dịch và sắc ký lỏng – khối phổ (LCMS/MS) ........................................................................................................ 15
1.2.1. Sắc ký ái lực miễn dịch ................................................................ 15
1.2.2. Sắc ký lỏng khối phổ .................................................................... 16

@

CHƢƠNG2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 21

yri
g

ht

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ......................................................................... 21
2.2. Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị ............................................................ 21

Co
p

2.2.1. Chất chuẩn ...................................................................................... 21

2.2.2. Hóa chất .......................................................................................... 21

1

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


2.2.3. Thiết bị, dụng cụ ............................................................................. 22

,V
NU

2.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 22
2.3.1. Thu thập mẫu nghiên cứu ............................................................... 22

ha
rm
ac
y

2.3.2. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin trong dƣợc liệu ....... 22
2.3.3. Áp dụng phƣơng pháp đánh giá hàm lƣợng aflatoxin trong các mẫu
dƣợc liệu giàu tinh bột trên thị trƣờng Hà Nội ......................................... 23
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................... 23

an
dP

2.4.1. Phƣơng pháp thu thập và xử lý sơ bộ mẫu thử ............................... 23
2.4.2. Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc kí ................................................ 23
2.4.3. Quy trình thẩm định phƣơng pháp .................................................. 23

ed
ici

ne

2.4.3.1. Tính đặc hiệu/ chọn lọc................................................................ 23
2.4.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD), Giới hạn định lƣợng (LOQ) ............. 24
2.4.3.3. Khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn ............................................. 24

fM

2.4.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi................................................................ 25

Sc
ho
ol
o

2.4.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu .............................................................. 26
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..................................................... 27
3.1. Khảo sát điều kiện khối phổ.................................................................. 27
3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký...................................................................... 29

@

3.2.1. Lựa chọn pha tĩnh ........................................................................... 29

ht

3.2.2. Khảo sát pha động........................................................................... 30

yri
g

3.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu ................................................................ 33

Co
p

3.3.1. Khảo sát dung môi chiết mẫu ......................................................... 33
3.3.2. Khảo sát dung môi làm sạch ........................................................... 34

3.4. Thẩm định phƣơng pháp ....................................................................... 35
2

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


3.4.1. Độ chọn lọc của phƣơng pháp ........................................................ 35

,V
NU

3.4.2. Tính phù hợp hệ thống .................................................................... 36
3.4.3. Đƣờng chuẩn và khoảng tuyến tính ................................................ 37

ha
rm
ac
y

3.4.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) ............. 39
3.4.5. Độ lặp lại và độ thu hôi................................................................... 40

3.5. Áp dụng phƣơng pháp đánh giá hàm lƣợng aflatoxin trong dƣợc liệu. 42
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN

Co
p

yri
g

ht

@

Sc
ho
ol
o

fM

ed
ici
ne

an
dP

TÀI LIỆU THAM KHẢO

3

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AF

Aflatoxin

AFB1

Aflatoxin B1

AFB2

Aflatoxin B2

AFG1

Aflatoxin G1

AFG2

Aflatoxin G2

AFM1

Aflatoxin M1

AFM2

Aflatoxin M2
Association of Official Analytical

Hiệp hội các nhà phân

Chemists

tích hóa học

Capillary Electrophoresis – Mass

Điện di mao quản –

Spectrometry

khối phổ

ed
ici
ne

CE/MS
CTCT
CTPT

@

HCC

yri
g

ht

HPLC

Co
p

HPLC-FLD

IARC

Công thức phân tử
Hệ số biến thiên

Enzyme – Linked Immuno Sorbent

Kỹ thuật miễn dịch liên

Sc
ho
ol
o

ESI

Công thức cấu tạo

Coefficient of Variation

fM

CV%
ELISA

an
dP

AOAC

Tiếng Việt

,V
NU

Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học

ha
rm
ac
y

Ký hiệu

Assay

kết với enzyme

Electrospray Ionization

Ion hóa bằng tia điện tử

Hepatocellular carcinoma

Ung thƣ biểu mô tế bào
gan

High Performance Liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng

Chromatography

cao

High performance liquid
chromatography- Fluorescence
Detection
International Agency for Research

Sắc ký lỏng hiệu năng
cao đầu dò huỳnh quang
Cơ quan nghiên cứ ung

1

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma

thƣ quốc tế

on Cancer

,V
NU

Liquid Chromatography Mass

LC-MS

Sắc ký lỏng khối phổ

Spectrometry
Liquid Chromatography tandem

Sắc ký lỏng khối phổ

Mass Spectrometry

hai lần

ha
rm
ac
y

LC-MS/MS

Giới hạn phát hiện

LOD

Limit of detetion

LOQ

Limit of quantitation

MeOH

Methanol

PBS

Phosphate-Buffered Saline

R%

Recovery

RSD

Relative Standard Deviation

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

SPE

Solid phase extract

Chiết pha rắn

SPE-IM

Solid phase extract-Immuno

TLPT

fM

ed
ici
ne

an
dP

Dung dịch đệm

Thin layer chromatography

phosphat
Độ thu hồi
Độ lệch chuẩn tƣơng

đối

Chiết pha rắn với cột ái
lực miễn dịch
Sắc ký lớp mỏng
Trọng lƣợng phân tử
Tài liệu tham khảo

Co
p

yri
g

ht

@

TLTK

Sc
ho
ol
o

TLC

Giới hạn định lƣợng

2

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


DANH MỤC CÁC BẢNG

,V
NU

Bảng 1. 1. Tính chất của một vài aflatoxin ....................................................... 4
Bảng 1. 2. Một số nghiên cứu định lượng aflatoxin trong và ngoài nước...... 11
Bảng 2.1. Danh sách các mẫu thu mua........................................................21

ha
rm
ac
y

Bảng 3.1. Thông số MS tối ưu......................................................................28

Bảng 3. 2. Một số chương trình gradient khảo sát ......................................... 30
Bảng 3. 3. Các thông số sắc ký ứng với chương trình gradient 2 .................. 32
Bảng 3. 4. Hiệu suất thu hồi của các aflatoxin với các dung môi khác nhau. 34

an
dP

Bảng 3. 5. Hiệu suất thu hồi của các aflatoxin với các dung môi làm sạch ... 35
Bảng 3. 6. Ion mẹ và ion con của các aflatoxin .............................................. 35
Bảng 3. 7. Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống của phương pháp .......... 37

ed
ici
ne

Bảng 3. 8. Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích píc của các chất ... 38
Bảng 3. 9. Kết quả xác định LOD và LOQ của phương pháp ........................ 40

Co
p

yri
g

ht

@

Sc
ho
ol
o

fM

Bảng 3. 10. Độ lặp lại và độ thu hồi của aflatoxin trên nền mẫu dược liệu .. 41

3

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ

,V
NU

Hình 1.1. Sơ đồ khối của máy khối phổ..........................................................18
Hình 1.2. Bộ phân tích tử cực chập ba ........................................................... 19
Hình 3.1. Phổ khối của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 quan sát dưới chế độ

ha
rm
ac
y

ESI-positive ...................................................................................................28
Hình 3. 2. Phổ khối của ion con các aflatoxin...............................................29
Hình 3. 3. Sắc ký đồ chương trình gradient 1 ................................................. 31
Hình 3. 4. Sắc ký đồ chương trình gradient 2 ................................................. 31

an
dP

Hình 3. 5. Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp ........................ 36

Co
p

yri

g

ht

@

Sc
ho
ol
o

fM

ed
ici
ne

Hình 3. 6. Đường chuẩn của các độc tố aflatoxin .......................................... 39

4

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


ĐẶT VẤN ĐỀ

,V
NU

Trong những năm gần đây, dƣợc liệu cũng nhƣ các sản phẩm từ dƣợc

liệu đƣợc nhân dân sử dụng ngày càng nhiều. Để đảm bảo ngƣời dân đƣợc sử
dụng những sản phẩm tốt nhất, cũng nhƣ an toàn cho sức khỏe, ngồi việc

ha
rm
ac
y

đảm bảo các tiêu chí trong Dƣợc điển các sản phầm này cũng nên đƣợc kiểm
tra đánh giá mức độ ô nhiễm các độc tố nấm, trong đó phổ biến nhất là
aflatoxin. Hiện nay trên thế giới nhiều tác giả đã tiến hành xây dựng phƣơng
pháp định lƣợng aflatoxin trong nhiều nền mẫu dƣợc liệu khác nhau. Tuy

an
dP

nhiên, trong nƣớc hiện tại các nghiên cứu công bố cho thấy quy trình xử lý
mẫu trải qua nhiều cơng đoạn, tốn nhiều thời gian nên hiệu suất cịn chƣa
đƣợc cao. Vì vậy, nhằm đƣa ra đƣợc phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin trong

ed
ici
ne

dƣợc liệu với hiệu suất thu hồi cao và phƣơng pháp đơn giản, cũng nhƣ tiết
kiệm thời gian hơn, chúng tôi đề xuất đề tài “Xây dựng phƣơng pháp định
lƣợng aflatoxin trong dƣợc liệu bằng LC-MS/MS”, áp dụng để xác định
hàm lƣợng aflatoxin trong một số dƣợc liệu với mục tiêu:

fM

- Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng đồng thời 4 độc tố
aflatoxin (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2) trong dƣợc liệu bằng phƣơng pháp

Sc
ho
ol
o

LC-MS/MS sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn với cột ái lực miễn dịch (SPE-IM).
- Áp dụng phƣơng pháp đã xây dựng đánh giá mức độc ô nhiễm một số

Co
p

yri
g

ht

@

aflatoxin trên các mẫu dƣợc liệu thu mua trên thị trƣờng Hà Nội.

1

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

Tổng quan về aflatoxin

,V
NU

1.1.

1.1.1. Giới thiệu về aflatoxin

Aflatoxin đƣợc phát hiện và phân lập lần đầu tiên vào năm 1960 sau sự

ha
rm
ac
y

kiện Bệnh Gà tây X ở Anh làm chết hơn 100.000 con gà tây. Những con gà
tây này bị hoại tử gan sau khi đƣợc cho ăn lạc mốc và aflatoxin đƣợc xác định
là nguyên nhân gây bệnh [15,25].

Aflatoxin là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp đƣợc sản xuất bởi một vài

an
dP

loại vi nấm, đặc biệt là nấm Aspergillus flavus và Aspergillus paraciticus.
Nấm mốc có thể phát triển và sinh aflatoxin trƣớc và sau khi thu hoạch, khi
bảo quản cũng nhƣ chế biến. Nhiều nông sản có thể bị nhiễm aflatoxin nhƣ

ed

ici
ne

ngũ cốc, lúa gạo; các loại hạt có dầu nhƣ hạt đậu, hạt hƣớng dƣơng, bông; các
loại gia vị nhƣ ớt , hạt tiêu, nghệ, gừng; hạnh nhân, quả óc chó và sữa cùng
các sản phẩm từ sữa (bơ, pho mát...) [10,20].

fM

Aflatoxin là một nhóm chất gồm các chất có cấu tạo tƣơng tự nhau và
đều là dẫn chất của difuranocoumarin, đƣợc tổng hợp nhờ con đƣờng

Sc
ho
ol
o

polyketide. Ngày nay, ngƣời ta đã xác định đƣợc khoảng 20 loại aflatoxin
trong đó 6 loại aflatoxin quan trọng nhất lần lƣợt là B1, B2, M1, M2, G1 và G2
[27]. Aflatoxin B1là loại aflatoxin độc nhất và phổ biến nhất, chiếm 60-80%
tổng số aflatoxin nhiễm độc trong lƣơng thực, thực phẩm. Thơng thƣờng, nếu
khơng có aflatoxin B1 thì cũng sẽ khơng có AFB2, AFG1 và AFG2 [10,14].

@

1.1.2. Tính chất hóa lý

ht

Aflatoxin hịa tan trong dung mơi phân cực nhẹ nhƣ cloroform,

yri
g

methanol, dimethyl sulfoxid. Độ tan của aflatoxin trong nƣớc vào khoảng 10–
20 mg/l. Dung dịch aflatoxin trong dung môi cloroform hay benzen có thể

Co
p

đƣuọc trong nhiều năm nếu bảo quản ở điều kiện lạnh và tối [3].

2

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


Ở nhiệt độ đun nấu thông thƣờng không thể phân hủy đƣợc aflatoxin,

,V
NU

nhƣng dƣới ánh sáng tử ngoại các aflatoxin bị phân hủy. Trong cơng thức cấu
tạo có vịng lacton nội phân tử, nên các aflatoxin dễ bị phân hủy bởi base
mạnh và nếu tiếp tục acid hóa nhẹ thì aflatoxin ban đầu đƣợc tái tạo [3].

ha
rm
ac
y

Các aflatoxin phát huỳnh quang rất mạnh, dựa vào tính chất này ta có
thể phát hiện chúng ở nồng độ rất thấp (trên sắc ký đồ lớp mỏng có thể phát
hiện với lƣợng chất khoảng 0,5ng hay nhỏ hơn). Đây chính là cơ sở hóa lý

Co
p

yri
g

ht

@

Sc
ho
ol
o

fM

ed
ici
ne

an
dP

cho việc phát hiện và định lƣợng các hợp chất này [3].

3

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


Bảng 1. 1. Tính chất của một vài aflatoxin

STT

1

Loại
aflatoxin

CTPT

AFB1

C17H12O6

TLPT

Tính chất

(đvC)
-

Nhiệt độ nóng chảy 268-269 oC

-

Huỳnh quang màu xanh da trời.
-

312

d
n
a
e
n
i
c
i
ed

U
N

V
,
y
c
a
m
r
a
h
P

CTCT

[α]D: -480 (0,1M/dimethyl
o

formamid)

-

TLTK

[22]

Hấp thụ UV cực đại trong môi

trƣờng ethanol: 223; 265; 362 nm.

2

AFB2

C17H14O6

@
t
h

g
i
r

y
p
Co

o
h
Sc

ol

314

-

M
f
o

Nhiệt độ nóng chảy 286-289 oC

Huỳnh quang màu xanh da trời.

-

[α]D: -492o (0,1M/cloroform)

-

Hấp thụ UV cực đại trong môi
trƣờng ethanol: 265; 363 nm.

4

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

[22]


3

AFG1

C17H12O7

328

-

Nhiệt độ nóng chảy 244-246 C

-

Huỳnh quang màu xanh lá cây.

o

-

[α]D: -556o (0,1M/cloroform)

-

Hấp thụ UV cực đại trong môi
trƣờng ethanol: 243; 257; 264;
362nm.

4

AFG2

C17H14O7

330

d
n
a
e
n
i
c
i
ed

-

Nhiệt độ nóng chảy 237-240 C

-

Huỳnh quang màu xanh lá cây.

-

[α]D: -430o (0,084M/cloroform)

-

Hấp thụ UV cực đại trong mơi

V
,
y
c
a
m
r
a
h
P

U
N
[22]

o

[22]

M

f
o

trƣờng ethanol: 265; 363 nm.

ol

5

AFM1

C17H12O8

@
t
h

g
i
r
y

p
o
C

o
h
Sc

-

344

Nhiệt độ nóng chảy 299 oC

-

Huỳnh quang màu xanh tím.

-

[α]D: -280o (0,1M/dimethyl
formamid)

-

Hấp thụ UV cực đại trong môi
trƣờng ethanol: 266; 265; 357 nm.

5

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

[22]


U
N

Nhiệt độ nóng chảy 293 oC

6

AFM2

C17H14O8

-

346

-

Huỳnh quang màu tím.

Hấp thụ UV cực đại trong môi
trƣờng ethanol: 221; 264; 357 nm.

d
n
a
e
n
i
c
i
ed

l

o
o

@
t
h

g
i
r
y
p
Co

V
,
y
c
a
m
r
a
h
P

M
f
o

h

c
S

6

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

[22]


1.1.3. Điều kiện sinh aflatoxin

,V
NU

 Chủng giống:

Các loài nấm mốc có thể sinh aflatoxin gồm các lồi thuộc chi
Aspergillus, thuộc họ nấm cúc: A. flavus, A. arachidicola, A. bombycis, A.

ha
rm
ac
y

minisclerotigenes, A. nomius, A. ochraceoroseus, A. parasiticus, A.
pseudotamarii, A. rambellii, trong đó A. flavus và A. parasiticus là hai chủng
nấm chủ yếu thƣờng gặp sinh aflatoxin B1 [12]. Hầu hết các chủng nấm
Aspergillus sinh trƣởng tốt trong điều kiện nhiệt độ 30-35oC và độ ẩm khơng

an
dP

khí trên 55% trong khoảng pH rộng từ 3-10 trên những cơ chất giàu năng
lƣợng dạng tinh bột [6]. Tuy nhiên, sự có mặt của chủng nấm mốc sinh
aflatoxin không đồng nghĩa với nhiễm aflatoxin do sự tổng hợp aflatoxin còn

ed
ici
ne

phụ thuộc vào nhiều yếu tố vật lý, hóa học và sinh học.
 Điều kiện mơi trƣờng và cơ chất:

Các chất dinh dƣỡng cần thiết cho sự sinh trƣởng và phát triển của nấm

fM

mốc và sự hình thành aflatoxin bao gồm: năng lƣợng (thƣờng dƣới dạng tinh
bột), vitamin, acid béo, amino acid và chất khoáng, đặc biệt cần có mặt Kẽm

Sc
ho
ol
o

(Zn). Vì thế, nhiễm độc aflatoxin thƣờng có trong những sản phẩm nhiều tinh
bột, các hạt có dầu nhƣ hạt bơng, đậu nành tỷ lệ nhiễm ít hơn [14].
Nhiệt độ và độ ẩm cũng ảnh hƣởng đến sự tạo thành aflatoxin. Nhiệt độ
tối thiểu và tối đa cho tổng hợp aflatoxin theo nghiên cứu lần lƣợt là 12oC và

@

42oC. Nhiệt độ tối ƣu để hình thành aflatoxin là 25-35oC, nhiệt độ tối ƣu để
tổng hợp aflatoxin B1 là 24-28oC. Độ ẩm cần thiết cho tổng hợp aflatoxin của

ht

nấm mốc là trên 62%, hàm ẩm nông sản cho tổng hợp aflatoxin tối đa ở nông

yri
g

sản nhiều tinh bột là 18% và trong quả, hạt có dầu là 9-10% [10,14,21].

Co
p

Nhƣ vậy, khí hậu và điều kiện bảo quản ảnh hƣởng rất lớn đến sự

nhiễm độc aflatoxin trong sản phẩm. Các nƣớc nhiệt đới và cận nhiệt đới

trong đó có Việt nam có khí hậu nóng ẩm, nhiệt độ cao, mƣa nhiều phần lớn

7

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


thời gian trong năm, thƣờng có sản phẩm bị nhiễm aflatoxin nhiều hơn so với

,V
NU

các nƣớc ôn đới. Các nƣớc đang phát triển nhƣ ở khu vực Đông Nam Á, Châu
Phi...chƣa có nền nơng nghiệp hiện đại hóa với những điều kiện trồng trọt và
bảo quản chƣa đạt tiêu chuẩn làm tăng nguy cơ xuất hiện aflatoxin trong các

ha
rm
ac
y

sản phẩm nơng nghiệp nói chung và dƣợc liệu nói riêng.
1.1.4. Cơ chế gây bệnh của aflatoxin

Trong số các loại aflatoxin thì AFB1 là loại độc nhất và phổ biến nhất,
chiếm 60-80% tổng số aflatoxin nhiễm độc trong lƣơng thực, thực phẩm.

an
dP

AFB1 đƣợc chuyển hóa chủ yếu tại gan thành dạng có hoạt tính aflatoxin exo8,9-epoxide hoặc hydroxyl hóa thành AFM1 ít độc tính hơn bởi cytochrome
P450, một họ enzyme trong tế bào gan. Sự epoxide hóa AFB1 là một bƣớc

ed
ici
ne

nguy hiểm gây nguy cơ đột biến gen và ung thƣ. Aflatoxin exo-8,9-epoxide là

một chất rất ái điện tử, không bền vững, nó liên kết ái lực cao với guanine
base trong DNA tạo thành aflatoxin-N7-guanine. Aflatoxin-N7-guanine
đến ung thƣ [13,19].

fM

methyl hóa biến G thành T, gây đột biến gen và có thể là nguyên nhân dẫn

Sc
ho
ol
o

Aflatoxin exo-8,9-epoxide và sản phẩm hydrat hóa của nó là
dihydrodiol, gắn kết cộng hóa trị với DNA, RNA làm thay đổi cấu trúc và ảnh
hƣởng chức năng của acid nucleic và protein. Aflatoxin exo-8,9-epoxide còn
ức chế enzyme RNA polymerase và ribosomal translocase, ảnh hƣởng đến
quá trình phiên mã và dịch mã [12].

@

AFB1 ức chế enzyme glycogen synthetase và transglycosylase làm

ht

giảm glycogen ở gan và tăng glucose trong máu. AFB1 ức chế

yri
g

phosphoglucomutase – một enzyme xúc tác thuận nghịch phản ứng chuyển
G6P Glucose-6-phosphate thành Glucose-1-phosphate, dẫn đến tích lũy G6P

Co
p

Glucose-6-phosphate và giảm tổng hợp glycogen [12].

8

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


Aflatoxin còn ảnh hƣởng đến DNA và cấu trúc ty thể. Aflatoxin-8,9-

,V
NU

epoxide ƣu tiên gắn vào DNA của ty thể hơn là DNA nhân tế bào cản trở sản
xuất ATP làm mất chức năng tổng hợp năng lƣợng dƣới dạng ATP của ty thể
và gây tăng chết tế bào theo chƣơng trình (apoptosis) [12,13].

ha
rm
ac
y

1.1.5. Độc tính của aflatoxin lên cơ thể ngƣời

Aflatoxicosis là tình trạng bệnh lý do nhiễm độc aflatoxin, ở ngƣời

phơi nhiễm với aflatoxin có thể xảy ra aflatoxicosis cấp hoặc mạn tính [9,13].
Độc tính cấp bao gồm: sốt cao, xuất huyết, tổn thƣơng gan cấp với biểu

an
dP

hiện nhiễm độc gan nặng (tỷ lệ tử vong 25%), phù, rối loạn tiêu hóa, rối loạn
hấp thu và/hoặc chuyển hóa chất dinh dƣỡng, thậm chí có thể gây tử vong.
Aflatoxicosis nguyên phát cấp tính xuất hiện khi phơi nhiễm với lƣợng trung

ed
ici
ne

bình đến lƣợng lớn aflatoxin [12,14].

Độc tính mạn của aflatoxin B1 do tiêu thụ lƣợng thấp đến trung bình
aflatoxin, thƣờng khơng có biểu hiện lâm sàng và khó nhận ra. Sau thời gian
phơi nhiễm kéo dài, AFB1 có thể gây quái thai và tật nguyền bẩm sinh; đột

fM

biến gen làm thay đổi mã gen và DNA, phá vỡ nhiễm sắc thể, tái sắp xếp các
mảnh nhiễm sắc thể, tăng thêm hoặc mất hoàn toàn nhiễm sắc thể; gây ung

Sc
ho
ol
o

thƣ trong đó HCC (ung thƣ biểu mơ tế bào gan) là loại ung thƣ thƣờng gặp do
AFB1 [12,14].

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng những thức ăn nhiễm độc AFB1 là
yeus tố nguy cơ chính dẫn đến ung thƣ gan. IARC phân loại AFB1 là tác nhân

@

gây HCC nhóm I [23]. Cơ chế HCC do AFB1 đƣợc chứng minh là do đột biến
gen p53 – gen ức chế khối u. Một số nghiên cứu tại Trung Quốc và Nam Phi

ht

cho thấy có đột biến ở codon 249 (guanine (G) thành thymine (T), kết quả là

yri
g

argenine (R) chuyển thành serine (S)), exon 7 trên gen p53 ở những bệnh

nhân HCC [14]. Nguy cơ mắc HCC tăng lên khi đồng phơi nhiễm với AFB1

Co
p

và virus HBV hoặc HCV [27]. Ở những cá thể có HbsAg dƣơng tính,
aflatoxin có tiềm năng gây độc gấp 30 lần ở những ngƣời không nhiễm virus.

9

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


Nhiễm HBV tăng nguy cơ ung thƣ gan lên 5 lần trong khi đồng phơi nhiễm

,V
NU

virus HBV và aflatoxin tăng nguy cơ ung thƣ gan lên 60 lần [17]. Ngoài ra
ung thƣ phổi do AFB1 cũng đƣợc báo cáo ở những ngƣời phơi nhiễm kéo dài
với sản phẩm đã nhiễm độc aflatoxin qua đƣờng hơ hấp [19].

ha
rm
ac
y

AFB1 cịn đƣợc báo cáo có liên quan đến hội chứng giống nhƣ hội
chứng Reye ở trẻ em với những triệu chứng nhƣ ho, sốt, thay đổi trƣơng lực
cơ, nôn. Giải phẫu cho thấy hình ảnh gan to nhiễm mỡ, phù não, thối hóa mỡ
nội tạng, thối hóa thần kinh. Khi gan bị tổn thƣơng do AFB1 dẫn đến

an
dP

amoniac – sản phẩm chuyển hóa protein và acid amin – không đƣợc giải độc
khỏi cơ thể, đạt nồng độ cao trong cơ thể, đi qua hàng rào máu não và gây hội
chứng não gan [12].

ed

ici
ne

Do có độc tính cao, nhiều quốc gia đã đƣa ra các quy định để kiểm soát
hàm lƣợng aflatoxin trong thực phẩm và các sản phẩm nơng nghiệp có nguy
cơ lây nhiễm cao. Trong Dƣợc điển Trung Quốc 2015 và Dƣợc điển Hồng
Kông, quy định giới hạn tổng hàm lƣợng aflatoxin (AFG1, AFG2, AFB1,

fM

AFB2) trong dƣợc liệu không đƣợc quá 10 µg/kg và hàm lƣợng AFB1 không
đƣợc quá 5 µg/kg. Liên minh châu Âu (EU) quy định tổng hàm lƣợng

Sc
ho
ol
o

aflatoxin không đƣợc q 4 µg/kg và hàm lƣợng AFB1 khơng q 2 µg/kg
[18].

Thep FDA, nhiễm độc aflatoxin trong sản phẩm nơng nghiệp và dƣợc
liệu là khó tránh khỏi, hàng năm có rất nhiều ngƣời có nguy cơ phơi nhiễm

@

với aflatoxin. Tuy nhiên, nguy cơ nhiễm độc và độc tính aflatoxin có thể đƣợc
giảm tới mức tối thiểu nhờ các phƣơng pháp kiểm soát và phát hiện aflatoxin

yri

g

ht

trong sản phẩm và dƣợc liệu.

Co
p

1.1.6. Những nghiên cứu về phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin trong
dƣợc liệu

10

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


U
N

Bảng 1. 2. Một số nghiên cứu định lượng aflatoxin trong và ngồi nước

TT

Phƣơng pháp

Phƣơng

phân tích

pháp chiết

Dung mơi chiết Điều kiện sắc ký
Các nghiên cứu trên Thế giới

I
Phƣơng

1

LC-MS/MS

chiết pha

methanol : nƣớc + Pha động: methanol – nƣớc
(30:70)

(80:20, v/v)

+ Tốc độ dịng: 1mL/phút

giàu

2

h
g
i

r

y
p
o
C

lạnh +

t@

LC-FLD

chiết pha

rắn để làm
giàu

fM

lo

methanol :

o
o
h
c
S

pháp chiết

d
n
a
e
n
i
c
i
ed

(30mm × 4 mm, 3ϻm)

rắn để làm

Phƣơng

Hoạt chất định
lƣợng

TLTK

+ Pha tĩnh: LiChrocart C18 short column

pháp chiết
lạnh +

V
,
y
c

a
m
r
a
h
P

nƣớc (70:30,

v/v), methanol:
nƣớc (80:20,
v/v) và
methanol :
nitric acid1%

aflatoxin B1, B2,
G1, G2 trên nến mẫu

[26]

Rhammus purshiana

+ Detector phát hiện: ESI (+) - SIM
+ Pha tĩnh: Scharlau Chemie C18

aflatoxin B1, B2,

column (250 × 4.6 mm i.d.)

G1, G2 trên các nền

+ Pha động: methanol:nƣớc (52:48, v/v)

mẫu nhƣ Valeriana

với 119 mg/L Kali bromide và 100µL/L

officinalis,

acid nitric 65%.

Hypericum

+ Tốc độ dịng: 1,2 mL/phút
+ Detector phát hiện: máy dị huỳnh
quang FP-1520, bƣớc sóng kích thích và
11

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

perforatum, Cassia
angustifolia, Mentha
pulegium và

[16]


(70:30, v/v)

phát xạ tƣơng ứng là 365 và 435nm.

U
N

V
,
y
c
a
m
r
a
h
P

Chrysanthemum
parthenium

+ Pha tĩnh: Shim-Pack CLC – ODS
Column (5µm, 4.6 x 250 mm)

+ Pha động: dung dịch khử ion hon hợp

Phƣơng
pháp chiết
3

LC-FLD

lạnh +

chiết pha
rắn để làm

methanol :
nƣớc (85:15,

120 mg KBr.

AFB1 trong thuốc
từ thảo dƣợc và

[24]

dƣợc liệu

+ Detector phát hiện: máy dò huỳnh

M
f
o

quang Shimadzu LC-10 AD Model,

ol

o
h
Sc

bƣớc sóng kích thích và phát xạ tƣơng

ứng là 360 và 435nm.

Các nghiên cứu trong nƣớc
Phƣơng

4

v/v/v) bổ sung 350 µL HNO3 4M and
+ Tốc độ dịng: 1 mL/phút

v/v)

giàu

II

d
n
a
e
n
i
c
i
ed

nƣớc-acetonitrile-methanol (60:20:20,

g
i

r
y

@
t
h

LC-MS

p
o
C

pháp chiết

methanol :

lạnh +

nƣớc (85:15,

chiết pha

v/v)

rắn để làm

+ Pha tĩnh: Betabasic 18 (2,0mm x
50mm, 5ϻm)
+ Pha động: kênh A: nƣớc; kênh B:

methanol; chạy chế độ Gradient.
+ Tốc độ dòng: 0,2ml/phút.
12

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Các loại aflatoxin
trong dƣợc liệu

[2]


giàu

+ Detector phát hiện: ESI (+) - SIM

(2,1x100 mm, 1,7ϻm)

pháp chiết

LC-MS

lạnh +

methanol :

chiết pha

nƣớc (6:4, v/v)

rắn để làm

d
n
a
e
n
i
c
i
ed

10mM; kênh B: methanol; chạy chế độ
Gradient.

+ Detector phát hiện: ESI (+) - SIM

l
o
o

g
i
r
y
p
Co

+ Pha động: kênh A: amoni acetat

+ Tốc độ dòng: 0,4 mL/phút

giàu

@
t
h

V
,
y
c
a
m
r
a
h
P

+ Pha tĩnh: cột C18 Acquity UPLC BEH

Phƣơng

5

U
N

M
f

o

h
c
S

13

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

aflatoxin B1 trong
dƣợc liệu

[7]


 Nhận xét:

,V
NU

Từ những nghiên cứu trên, ta có thể thấy hiện nay trong nƣớc và trên
thế giới nhiều tác giả đã tiến hành xây dựng phƣơng pháp định lƣợng
aflatoxin trong nhiều nền mẫu dƣợc liệu khác nhau. Tuy nhiên, trong nƣớc

ha
rm
ac
y

hiện tại các nghiên cứu công bố cho thấy quy trình xử lý mẫu trải qua nhiều
cơng đoạn, tốn nhiều thời gian nên hiệu suất còn chƣa đƣợc cao. Vì vậy,
nhằm đƣa ra đƣợc phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin trong dƣợc liệu với hiệu
suất thu hồi cao và phƣơng pháp đơn giản, cũng nhƣ tiết kiệm thời gian hơn,

an
dP

chúng tôi đề xuất đề tài “Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin
trong dƣợc liệu bằng LC-MS/MS”, áp dụng để xác định hàm lƣợng

Co
p

yri
g

ht

@

Sc
ho
ol
o

fM

ed
ici

ne

aflatoxin trong một số dƣợc liệu.

14

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


Tổng quan về sắc ký ái lực miễn dịch và sắc ký lỏng – khối phổ

1.2.

,V
NU

(LC-MS/MS)
1.2.1. Sắc ký ái lực miễn dịch
a) Sắc ký ái lực

ha
rm
ac
y

Sắc ký ái lực là một kỹ thuật sắc ký lỏng sử dụng một thuốc thử liên kết
đặc biệt để làm sạch hoặc phân tích các thành phần trong hỗn hợp. Lƣu giữ
chất phân tích là do tƣơng tác thuận nghịch và chọn lọc của các cặp có trong
cơ thể sống nhƣ: kháng nguyên – kháng thể, enzyme – cơ chất, hormone –

an
dP

receptor...[1].

Để thực hiện sắc ký ái lực ngƣời ta cố định một thành phần của cặp
(phối tử - ái lực) trên một chất mang rắn làm pha tĩnh đƣa vào cột. Mẫu phân

ed
ici
ne

tích có thành phần thứ hai đƣợc đƣa vào cột nhờ một pha động có pH xác
định, lực ion và thành phần dung môi phù hợp gọi là dung dịch đệm rửa giải.
Khi mẫu phân tích qua cột, các thành phần khác khuếch tán dễ dàng, chỉ có
hai thành phần của cặp tƣơng tác đặc hiệu và liên kết với nhau. Nhờ một dung

fM

dịch đệm rửa giải, liên kết trên bị phá vỡ và thành phần chọn lọc với phối tử

Sc
ho
ol
o

ái lực đi ra khỏi cột. Phát hiện và định lƣợng bằng một detector thích hợp [1].
- Phối tử ái lực: là những chất có tính đặc hiệu cao với chất phân tích,
quyết định thành cơng của kỹ thuật tách ái lực. Phối tử ái lực có thể có nguồn
gốc sinh học (kháng thể, protein...) hoặc nguồn gốc hóa học (boronat, phức

càng cua kim loại...).

@

- Chất mang: là những chất rắn đƣợc dùng để cố định phối lực ái tử

ht

trong cột sắc ký. Một số chất mang thƣờng dùng trong sắc ký ái lực là agarose

yri
g

và agarose liên kết, cellulose, silica...

Co
p

b) Sắc ký ái lực miễn dịch
Sắc ký ái lực miễn dịch là một loại hình sắc ký ái lực sử dụng phối tử ái

lực là kháng thể hoặc kháng nguyên. Do tính đặc hiệu cao của tƣơng tác

kháng thể - kháng nguyên và khả năng tạo kháng thể của nhiều loại chất, kỹ
15

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma