Xây dựng phương pháp định lượng felodipin trong huyết tương bằng GC MS

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI


NGUYỄN VĂN MẠNH
XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH
LƢỢNG FELODIPIN TRONG HUYẾT
TƢƠNG BẰNG GC-MS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ




HÀ NỘI - 2014
1

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN MẠNH
XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH
LƢỢNG FELODIPIN TRONG HUYẾT
TƢƠNG BẰNG GC-MS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Ngƣời hƣớng dẫn :
1. PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
2. DS Ngô Thị Quỳnh Nga
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn hóa phân tích và độc chất - Đại
học Dƣợc Hà Nội

2. Trung tâm Giám Định Ma Túy – Viện
Khoa Học Hình sự - Bộ Công An

HÀ NỘI - 2014
2

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả lòng kính trọng và sự chân thành, tôi xin đƣợc bày tỏ niềm biết ơn sâu
sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh – Phó trƣởng phòng Quản lý khoa học,
Trƣờng Đại Học Dƣợc Hà Nội và DS. Ngô Thị Quỳnh Nga - những ngƣời đã trực tiếp
hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình, giúp đỡ và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi
hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Hóa Phân Tích và Độc
chất – Trƣờng Đại Học Dƣợc Hà Nội, các anh chị ở Trung tâm Giám Định Ma Túy –
Viện Khoa học Hình Sự đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, động viên khích lệ, ủng hộ
nhiệt thành và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện khóa
luận.
Tôi cũng xin gửi tới toàn thể giảng viên, cán bộ trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội lời
cảm ơn chân thành vì sự dìu dắt, dạy bảo tận tình trong suốt năm năm tôi học tập tại
đây.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ kính yêu, ngƣời thân, bạn
bè – những ngƣời đã luôn bên cạnh động viên, yêu quý và chăm lo cho tôi trong cuộc
sống.
Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tất cả sự giúp đỡ quý báu đó.


Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2014
Sinh viên

Nguyễn Văn Mạnh
1


MỤC LỤC

Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Đại cƣơng về Felodipin 3
1.1.1. Công thức và tính chất lý hóa [5] 3
1.1.2. Dƣợc động học [2] [10] 4
1.1.3. Tác dụng dƣợc lý 4
1.1.4. Chỉ định [2] 4
1.1.5. Chống chỉ định [2] 5
1.1.6. Một số chế phẩm trên thị trƣờng 5
1.2. Một số nghiên cứu định lƣợng Felodipin trong dịch sinh học 6
1.3. Tổng quan về phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ GC-MS 10
1.3.1. Khái niệm [3] 10
1.3.2. Nguyên tắc sắc ký khí-lỏng [3] 10
1.3.3. Sơ đồ hệ thống sắc ký khí [3] 11
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1. Nguyên vật liệu thiết bị 16
2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất, dung môi 16
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị 16
2.2. Nội dung nghiên cứu 16
2

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 17
2.3.1. Xây dựng phƣơng pháp phân tích 17
2.3.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích 18
2.3.3. Xử lý và biểu thị kết quả nghiên cứu 24
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25
3.1. Kết quả xây dựng phƣơng pháp phân tích 25
3.1.1. Khảo sát lựa chọn chất chuẩn nội. 25
3.1.2. Khảo sát chƣơng trình sắc ký 26
3.1.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu 28
3.2. Kết quả thẩm định phƣơng pháp phân tích 33
3.2.1. Độ đặc hiệu – chọn lọc. 33
3.2.2. Đƣờng chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính. 37
3.2.4. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày. 40
3.2.5. Tỷ lệ thu hồi 43
3.2.6. Độ ổn định 46
3.3. Bàn luận 50
3.3.1. Phƣơng pháp sử dụng 50
3.3.2. Kết quả thu đƣợc so với các phƣơng pháp khác 51
Chƣơng 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53
4.1. Kết luận 53
4.2. Đề xuất 54
TÀI LIÊU THAM KHẢO 55
PHỤ LỤC
3

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AMLO
Amlodipin

DC
Dƣợc chất
FEL
Felodipin
GC
Sắc kí khí
HQC
Mẫu kiểm chứng nồng độ cao (High Quality Control Sample)
HT
Huyết tƣơng
HTT
Huyết tƣơng trắng
IS
Nội chuẩn (Internal Standard)
LLOQ
Giới hạn định lƣợng dƣới (Lower Limit of Quantitation)
LOD
Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)
LQC
Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp (Low Quality Control Sample)
MeOH
Methanol
MQC
Mẫu kiểm chứng nồng độ trung bình (Medium Quality Control
Sample)
MS
Phƣơng pháp phổ khối lƣợng
NIF
Nifedipin
RSD

Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative standard deviation)
SD
Độ lệch chuẩn (Standard deviation)
SKD
Sinh khả dụng của thuốc
TDSH
Tƣơng đƣơng sinh học

4

DANH MỤC CÁC BẢNG

Số bảng
Tên bảng
Trang
Bảng 1.1
Một số chế phẩm chứa Felodipin trên thị trường
5
Bảng 1.2
Một số nghiên cứu định lượng Felodipin bằng GC
6
Bảng 1.3
Một số nghiên cứu định lượng Felodipin bằng sắc kí lỏng hiệu
năng cao.
8
Bảng 1.4
Cách tiêm mẫu trong sắc kí khí
12
Bảng 2.1
Cách pha dung dịch chuẩn làm việc WS1 và WS2

19
Bảng 2.2
Cách chuẩn bị các mẫu đường chuẩn trong huyết tương
20
Bảng 2.3
Cách chuẩn bị mẫu QC
20
Bảng 3.1
Thể tích dung môi chiết toluen khảo sát
30
Bảng 3.2
Kết quả khảo sát dung môi chiết
31
Bảng 3.3
Kết quả độ chọn lọc – đặc hiệu của phương pháp.
37
Bảng 3.4
Kết quả xác định khoảng nồng độ tuyến tính.
38
Bảng 3.5
Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới
40
Bảng 3.6
Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày
41
Bảng 3.7
Độ đúng, độ chính xác khác ngày
42
Bảng 3.8
Tỷ lệ thu hồi của IS

44
Bảng 3.9
Tỷ lệ thu hồi của FEL
45
Bảng 3.10
Kết quả nghiên cứu độ ổn định của mẫu huyết tương sau ba
chu kì đông rã.
46
Bảng 3.11
Độ ổn định trong thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng.
47
Bảng 3.12
Độ ổn định của mẫu sau xử lý
48
Bảng 3.13
Kết quả độ ổn định dài ngày của mẫu huyết tương
49

5

DANH MỤC CÁC HÌNH

Số hình
Tên hình
Trang
Hình 1.1
Công thức cấu tạo của Felodipin

3
Hình 1.2

Sơ đồ thiết bị sắc ký khí

11
Hình 1.3
Sơ đồ hệ thống máy khối phổ

14
Hình 3.1
Sắc kí đồ hỗn hợp ba chất Fel, NIF, AMLO trong
methanol
25
Hình 3.2
Phổ khối của FEL
27
Hình 3.3
Phổ khối của NIF
28
Hình 3.4
Sơ đồ tóm tắt quy trình xử lý mẫu FEL và IS trong
huyết tương băng phương pháp chiết lỏng-lỏng
29
Hình 3.5
Biểu đồ hiệu suất chiết của FEL theo thể tích chiết
32
Hình 3.6
Sắc kí đồ mẫu huyết tương trắng

34
Hình 3.7
Sắc kí đồ mẫu huyết tương trắng có pha IS

35
Hình 3.8
Sắc kí đồ mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn FEL

36
Hình 3.9
Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ FEL trong
huyết tương (ng/ml) với tỉ lệ diện tích FEL /IS
38
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay cùng với sự phát triển của xã hội ngày càng nhanh, mô hình bệnh tật ở
nƣớc ta đang có nhiều biến động to lớn. Các bệnh không lây nhiễm, trong đó có các
bệnh tim mạch đang có khuynh hƣớng tăng lên rõ rệt. Những nguyên nhân gây tử vong
hàng đầu là: bệnh lý tim mạch đặc biệt là tăng huyết áp, bệnh động mạch vành, tai biến
mạch máu não và ung thƣ. Trong đó, các bệnh lý tim mạch chiếm vị trí đứng đầu. Theo
điều tra gần đây nhất (2008) của Viện Tim mạch Việt Nam, thì tỷ lệ tăng huyết áp của
những ngƣời từ 25 tuổi trở lên ở nƣớc ta đã là 25,1%.
Felodipin là một trong những thuốc đang đƣợc sử dụng rộng rãi trong điều trị, nó là
chất ức chế kênh calci chọn lọc trên mạch máu. Hiện nay, nhóm nghiên cứu ở Trƣờng
Đại học Dƣợc Hà Nội đang triển khai nghiên cứu bào chế dạng thuốc giải phóng kéo
dài của Felodipin. Để so sánh chất lƣợng của chế phẩm nghiên cứu với chế phẩm lƣu
hành trên thị trƣờng thì việc đánh giá sinh khả dụng (SKD) của thuốc là rất cần thiết.
Để thực hiện đƣợc các nghiên cứu đánh giá SKD các thuốc, một trong những nội
dung quan trọng là xây dựng quy trình chiết tách, xử lý mẫu và phân tích, định lƣợng
thuốc trong dịch sinh học (máu, huyết tƣơng, nƣớc tiểu ). Quá trình phân tích thuốc
trong dịch sinh học thƣờng gặp nhiều khó khăn do nồng độ thuốc trong mẫu thƣờng rất
thấp, mẫu có nhiều thành phần tạp chất gây ảnh hƣởng tới quá trình phân tích thuốc.

Hơn nữa, sau khi vào cơ thể dƣợc chất bị chuyển hoá tạo thành nhiều dẫn chất khác
nhau, có cấu trúc và tính chất hoá lý tƣơng tự với dƣợc chất nên việc phân tách để định
lƣợng gặp rất nhiều khó khăn. Chính vì vậy, phƣơng pháp phân tích phải đƣợc xây
dựng và thẩm định chặt chẽ theo những quy định riêng, để đảm bảo kết quả thử nghiệm
chính xác và tin cậy.
2

Nhằm đóng góp một quy trình phân tích thuốc trong dịch sinh học đơn giản, hiệu
quả và kinh tế, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp định
lượng Felodipin trong huyết tương bằng sắc kí khí” với các mục tiêu sau:
Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng Felodipin trong huyết tƣơng bằng
GC-MS

3

Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Đại cƣơng về Felodipin
1.1.1. Công thức và tính chất lý hóa [5]
- Công thức hóa học:





Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Felodipin
- Công thức phân tử: C
18
H
19
Cl

2
NO
4
.
- Khối lƣợng phân tử: 384,3.
- pKa : 5,07.
- Tên khoa học: Ethyl methyl (4RS)-4-(2,3-dichlorophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-
dihydropyridine-3,5-dicarboxylate.
- Tính chất lý hóa:
+ Bột tinh thể màu trắng hoặc vàng nhạt.
+ Thực tế không tan trong nƣớc, tan tự do trong aceton, ethanol khan,
methanol và methylen chlorid.
4

1.1.2. Dƣợc động học [2] [10]
Hấp thu: Felodipin hấp thu gần nhƣ hoàn toàn qua đƣờng tiêu hoá sau khi uống
nhƣng chuyển hoá lần đầu ở gan và có sinh khả dụng tuyệt đối (SKD) khoảng 15% (
thay đổi từ 10-25 %).
Phân bố: Liên kết với protein huyết tƣơng xấp xỉ 99%, chủ yếu là albumin.
Chuyển hóa và thải trừ : Felodipin chuyển hoá mạnh qua ruột và gan và đƣợc bài
tiết gần nhƣ hoàn toàn các chất chuyển hóa, khoảng 70% của liều đƣợc bài tiết qua
nƣớc tiểu và phần còn lại đƣợc thải trừ qua phân.
1.1.3. Tác dụng dƣợc lý
Tác dụng hạ áp động mạch: Felodipin là thuốc chẹn kênh calci chậm có tính chất
chọn lọc thuộc nhóm dihydropyridin. Felodipin làm giảm trƣơng lực động mạch (nhất
là trên tiểu động mạch), dẫn đến tác dụng giãn mạch gây hạ huyết áp [2].
Tác dụng chống đau thắt ngực: Felodipin cải thiện sự cân bằng trong cung và cầu
oxy của cơ tim. Lƣu lƣợng động mạch vành cũng nhƣ lƣợng cung cấp oxy cho cơ tim
tăng lên nhờ giãn mạch vành. Felodipin giảm huyết áp toàn thân nên làm giảm hậu
gánh thất trái, do đó giảm nhu cầu oxy của cơ tim. Felodipin làm tăng khả năng gắng

sức và giảm số cơn đau thắt ngực ở ngƣời bệnh đau thắt ngực ổn định [2].
Giãn mạch não nên tăng máu vào não, đƣợc dùng cho những ngƣời tai biến mạch
máu não [1].
1.1.4. Chỉ định [2]
- Bệnh tăng huyết áp.
- Điều trị dự phòng cơn đau thắt ngực ổn định.
5

1.1.5. Chống chỉ định [2]
- Quá mẫn với dihydropyridin.
- Nhồi máu cơ tim cấp.
- Suy tim mất bù hoặc chƣa kiểm soát đƣợc.
- Đau thắt ngực không ổn định.
- Phụ nữ có thai.
- Không dùng felodipin cho trẻ em vì hiệu quả và khả năng dung nạp thuốc ở trẻ
em chƣa đƣợc xác định.
1.1.6. Một số chế phẩm trên thị trƣờng
Bảng 1.1: Một số chế phẩm chứa Felodipin trên thị trƣờng Việt Nam
STT
Tên biệt dƣợc
Thành phần
Dạng thuốc
Nhà sản xuất
1
Enfelo-5
Felodipin
Viên nén phóng
thích chậm-5mg

Aegis., Ltd - Kibris

2
Felodil ER
Felodipin
Viên nén bao
phim giải phóng
chậm-5mg
Korea United Pharm Inc - HÀN
QUỐC
3
Felodipin
Stada 10mg
retard
Felodipin
Viên nén giải
phóng chậm
Stadapharm GmbH - ĐỨC
4
Felodipin
Stada 5 mg
retard
Felodipin
Viên nén tác
dụng chậm
Stadapharm GmbH - ĐỨC
5

Felutam

Felodipin
Viên nén giải

phóng có kiểm
soát
Công ty TNHH Dƣợc phẩm
Vellpharm Việt Nam - VIỆT
NAM
6

1.2. Một số nghiên cứu định lƣợng Felodipin trong dịch sinh học
Trên thế giới, nhiều phƣơng pháp đã đƣợc xây dựng để định lƣợng FEL trong dịch sinh học đƣợc tổng hợp
ở bảng 1.2 và bảng 1.3 sau:
Bảng 1.2 Một số nghiên cứu định lƣợng Felodipin bằng GC
Tài liệu
Mẫu
thử
Detector
Cột sắc ký
Chuẩn
nội
Điều kiện sắc ký
Dung môi
chiết

Martin
Ahnoff
và Cs(
1984)
[9]

HT
ngƣời

ECD
Cột mao quản
(25 m x 0,32
m)
H
165/04

- Nhiệt độ Detector: 300
0
C - 380
0
C
Toluen:H
2
O
(1:1)
J.D- Y.
Dru và
Cs (1995)
[7]


HT
ngƣời
MS
Cột mao quản
(30 m x 0,2
mm, 5 µm)
với pha tĩnh
Methylsilicon

( HP-1,
Hewlett-





- Nhiệt độ buồng tiêm: 300
0
C
- Chƣơng trình nhiệt độ:
220
0
C/ 0,6 ph. Tăng 15
0
C/ph đến 300
0
C.
Duy trì 10 ph
- Khí mang: He. Tốc độ: 0,365 ml/ph.
- Chế độ ion hóa (Áp suất nguồn ion hóa:
Toluen

7

Packard)


2,0.10
-3

Pa).
- Chế độ chọn lọc ion ( SIM) với mảnh ion mẹ
có m/z=238.
Takashi
Sakamoto
và Cs
(1993)
[13]



HT
ngƣời
và
HT
chó
MS
Cột mao quản
(12,5 m x 0,2
mm, Ultra 1,
Hewlett-
Packard)

D6-
Felodip
in
- Tiêm chia dòng. Nhiệt độ buồng tiêm: 260
0
C
- Chƣơng trình nhiệt độ:

220
0
C/ 0,6 ph. Tăng 24
0
C/ph đến 290
0
C.
- Khí mang: He. Áp suất 0,25 kg/cm
2

- Kỹ thuật ion hóa phun sƣơng điện tử ion
dƣơng ( PIEI) với mức năng lƣợng electron
:70 eV
-Nhiệt độ nguồn ion hóa : 300
0
C
- Chế độ chọn lọc ion (SIM) với mảnh ion mẹ
có m/z=238
n-hexan:
toluene
(4:1)


Ryota
Nishioka
và
Cs(1991)
[11]

HT

ngƣời
ECD và
MS
GC-ECD Cột
mao quản( 25
m x 0,32 mm)
GC-MS Cột
mao quản
H165/0
4
- Tiêm chia dòng. . Nhiệt độ buồng tiêm: 330
0
C
- Chƣơng trình nhiệt độ: 110
0
C/ 1ph. Tăng 10
0
C/ph đến 300
0
C.

Toluen
8

(12 m x 0,2
mm, HP-1,
Hewlett-
Packard)
- Khí mang: He. Khí bổ trợ: N
2

.
- Tốc độ: 40 ml/ph.
- Mảnh ion mẹ có m/z=238

Bảng 1.3: Một số nghiên cứu định lƣợng Felodipin bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao.
Tài liệu
Mẫu thử
Detector
Cột sắc ký
Chuẩn
nội
Điều kiện sắc ký
Dung môi
chiết
Luis H.
Migliorança
và cộng sự
(2005)
[8]

HT
ngƣời

MS/MS

Cột C18
(100 x 4,6
mm, 3 µm)

Nimodipin

- Pha động acetonitril : nƣớc (80:20
v/v) chứa 10 mM acid formic
- Tốc độ dòng 0,8 mL/phút
- Thể tích tiêm mẫu 40 µl
- Thời gian phân tích 5 phút

Diethyl
ether/hexan
(80:20 v/v)
Soo-Hwan
Kim• Hye
Jung Lee
(2012)
[12]

HT
ngƣời


MS-MS
Eclipse
XDB-C18
(3,0 mm,
i.d.975 mm,
l, 3,5 µm;
Agilent,


Amlodipin
- Pha động: hỗn hợp acetonitril và

acid formic 0,1% (75/25, v/v).
- Tốc độ dòng 0,25 mL/phút.
- Cột và khay lấy mẫu tự động đƣợc
duy trì ở nhiệt độ 25
0
C và 10
0
C.
- Thời gian phân tích là 2 phút và


MTBE
9

Littelfall,
CA, USA)
thể tích tiêm là 2 µL.
Hohyun kim
và Cs
(2003)
[6]

HT
ngƣời và
HT chó


MS-MS
C8
Capcell Pak

column (2,0
mm ×150
mm, 5,0 µm
particle)


Nifedipin
- Pha động: hỗn hợp ammonium :
acetate–acetonitrile (20:80), PH 6,0
đã đƣợc khử khí trƣớc khi sử dụng.
- Tốc độ dòng: 200 µL/phút.
- Tổng thời gian chạy 5,0 phút.


Diethyl ether
10

1.3. Tổng quan về phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ GC-MS
1.3.1. Khái niệm [3]
Sắc ký khí là phƣơng pháp tách các chất ở thể khí bay hơi trong hỗn hợp, trong đó pha
động là một chất khí thƣờng là khí trơ. Mẫu phân tích đƣợc đƣa vào đầu cột và quá
trình rửa giải đƣợc thực hiện chủ yếu nhờ chƣơng trình nhiệt độ cột sắc ký. Khác với
các dạng sắc ký khác, trong GC pha động không tƣơng tác với chất phân tích mà chỉ
làm chức năng vận chuyển chất phân tích qua cột.
Trong sắc ký khí-lỏng (GLC), pha tĩnh là chất lỏng. Pha này đƣợc bao hay gắn lên một
chất mang là pha rắn, ta có sắc ký khí phân bố. Trong sắc ký khí-rắn (GCS), pha tĩnh là
chất rắn: pha tĩnh rắn là chất hấp phụ, đó là sắc ký khí khí hấp phụ.
1.3.2. Nguyên tắc sắc ký khí-lỏng [3]
Trong GLC, chất tan chỉ có thể di chuyển theo pha động qua cột khi nó ở thể khí. Vì
vậy kỹ thuật này đƣợc dùng để tách các chất tan bền với nhiệt. Quá trình tách phụ

thuộc vào tính bay hơi của chất tan- tức là điểm sôi.
Hệ số phân bố x/p phụ thuộc vào áp suất hơi của chất tan và hệ số hoạt độ của chất tan.
Vì vậy, có thể tách đƣợc hai chất tan có áp suất hơi nhƣ nhau nhƣng có hệ số hoạt độ
trong pha tĩnh lỏng khác nhau.
Quá trình rửa giải theo thứ tự điểm sôi tăng dần, ngoại trừ có tƣơng tác đặc biệt giữa
chất tan và pha tĩnh. Pha động đƣa chất tan ra khỏi cột đến detector. Nhiệt độ cột dao
động trong khoảng 50÷350  đảm bảo chất tan bay hơi và đẩy nhanh quá trình rửa
giải.

11

1.3.3. Sơ đồ hệ thống sắc ký khí [3]


Hình 1.2: Sơ đồ thiết bị sắc ký khí
 Khí mang
Pha động trong sắc ký khí hay còn gọi là khí mang giữ vai trò vận chuyển chất phân
tích dọc theo cột sắc ký và tiếp nhận các phân tử chất phân tích đã bị giữ lại trƣớc đó
và tiếp tục tƣơng tác với các phần khác của bề mặt pha tĩnh.
Điều kiện của khí mang:
-Trơ về mặt hóa học.
-Thuận lợi cho detector sử dụng.
-Có khả năng giảm thiểu sự khuếch tán khí.
-Tinh khiết .

12

 Buồng tiêm mẫu
Buồng tiêm mẫu là nơi khi mẫu đƣợc bơm vào sẽ hóa hơi và bị lôi cuốn theo dòng
khí mang.

Có ba kỹ thuật tiêm mẫu : Chia dòng, không chia dòng, tiêm thẳng vào cột. Trong
đó kỹ thuật tiêm chia dòng thƣờng đƣợc sử dụng nhất. Các cách tiêm mẫu trong GC
đƣơc trình bày ở bảng 1.4:
Bảng 1.4: Cách tiêm mẫu trong sắc kí khí
Loại cột
Kỹ thuật tiêm
Cách thực hiện
Đánh giá
Mao quản
Chia dòng (split)
Chia dòng khí mang 1:10
đến 1:100 để giảm lƣợng
mẫu vào cột (giảm 90%
hoặc hơn).
Thích hợp cho cột mao quản. Độ
nhạy giảm vì chỉ một phần rất
nhỏ của mẫu vào cột.
Không chia
dòng (splitless)
Toàn bộ mẫu ngƣng tụ ở
đàu cột đã làm lạnh, sau
đó tăng nhiệt độ làm bay
hơi mẫu.
Độ nhạy tăng. Nhƣng có nguy cơ
giãn rộng pic.
Thẳng vào cột
(on – column)
Mẫu đƣợc ngƣng tụ ở đầu
cột, sau đó làm bay hơi
theo chƣơng trình nhiệt độ.

Tăng độ nhạy, giảm phân hủy
mẫu do nhiệt.
Cột nhồi
Bay hơi nhanh
(flash
vaporixation)
Mẫu tiêm vào vùng có
nhiệt độ cao hơn 20 – 50
0
C so với nhiệt độ cột.
Mẫu bay hơi nhanh, có thể xảy
ra phân hủy mẫu do nhiệt độ cao.
Thẳng vào cột
(on – column)
Mẫu đƣợc tiêm thẳng vào
đầu cột nhồi.
Tăng độ nhạy, giảm phân hủy
mẫu do nhiệt.


13


 Cột tách sắc ký:
Trong thực tế có nhiều cột tách dùng cho các mục đích phân tích khác nhau. Phổ
biến là cột nhồi và cột mao quản. Nhìn chung cột sắc ký cần đạt các yêu cầu sau:
o Đảm bảo trao đổi chất tốt giữa pha tĩnh và pha động nhờ việc tối ƣu hóa
các thông số của phƣơng trình Van Deemter.
o Độ giảm áp suất nhỏ với một tốc độ khí mang nhất định.
o Vật liệu dùng chế tạo cột phải có tính bền ở nhiệt độ cao.

 Detector
Detector là bộ phận ghi nhận sự xuất hiện và nồng độ các chất trong khí mang. Các
loại Detector thƣờng dùng trong sắc ký khí:
-Detector ion hóa ngọn lửa (FID): Khi chất hữu cơ đi qua ngọn lửa trong detector
(ngọn lửa H
2
ở nhiệt độ 2500
0
C) sẽ bị đốt cháy, bị nguyên tử hóa và ion hóa thành ion.
FID là detector vạn năng, rất nhạy và đáp ứng với tất cả các chất hữu cơ trừ
formaldehyd, acid formic và các chất đã halogen hóa hết. Đây là detector có khoảng
tuyến tính rộng nhất trong các detector sắc ký khí.
-Detector nitơ- phốt pho (NPD) : Là một dạng FID đặc biệt. Detector này có ƣu thế
về độ nhạy và độ chọn lọc cho phân tích định lƣợng các hợp chất có chứa nitơ hoặc
phospho.
- Detector cộng kết điện tử (ECD):
ECD củng là một detector ion hóa sử dụng tia β từ một nguồn phóng xạ, thƣờng là
Niken – 63

28
Ni
63
→
29
Cu
63
+ e
14

Electron trong phản ứng phân hủy này sẽ kết hợp với các chất phân tích ái electron

có mặt trong khí mang tạo ra ion âm, cho nên tạo ra sự thay đổi cƣờng độ dòng ở mạch
điện ngoài. Sự thay đổi này tạo ra tín hiệu, nó đƣợc đƣợc khuếch đại và ghi lại. Ngƣời
ta thƣờng dùng argon chứa 10% methan làm khí mang thay cho nitơ để tăng độ nhạy
của ECD.

- Detector khối phổ (MS): Phát hiện và định lƣợng các chất phân tích dựa vào ion phân
tử và các ion mảnh của chúng. Detector MS đáp ứng với hầu hết các hợp chất hữu cơ.
+ Nguyên tắc:
Khối phổ là kỷ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lƣợng và điện tích của ion (m/z)
đƣợc tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử mẫu. Tỷ số này biểu thị
bằng đơn vị khối lƣợng nguyên tử (1 đơn vị khối lƣợng nguyên tử bằng 1/12
khối lƣợng của carbon
12
C) hoặc bằng dalton (1 dalton Da bằng khối lƣợng của
nguyên tử hydro).
+ Sơ đồ khối của máy khối phổ:







Hình 1.3:Sơ đồ hệ thống máy khối phổ
Hệ chân không (áp suất 10
-3
÷10
-6
Pa)
Nạp mẫu

Nguồn ion
Phân tích khối
Detector
Bơm chân
không
Xử lý dữ
liệu
15



Máy khối phổ gồm 5 bộ phận sau:
 Bộ nạp mẫu: Đƣa mẫu vào máy.
 Bộ nguồn ion: Ion hoặc các phân tử, nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc
hơi
 Bộ phân tích khối: Tách các ion theo tỷ số m/z. Các ion đƣợc gia tốc và tách
riêng nhờ tác dụng của từ trƣờng, điện trƣờng để đi đến detector.
 Detector: Detector có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến thành tín hiệu điện đo
bằng hệ điện tử của máy khối phổ.
 Bộ xử lý dữ liệu: tín hiệu điện từ detector đƣợc khuếch đại trƣớc khi chuyển
thành tín hiệu số phục vụ xử lý dữ liệu theo yêu cầu khác nhau nhƣ: ghi phổ
khối, so sánh với thƣ viện phổ, định lƣợng,

16

Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất, dung môi
- Chất chuẩn :
Felodipin (FEL): Chuẩn làm việc, hàm lƣợng 99,76%, độ ẩm 0,01%.
- Chất chuẩn nội:
+ Nifedipin (NIF): Chuẩn làm việc, hàm lƣợng 99,51%, độ ẩm 0,02%.
+ Amlodipin (AMLO): Chuẩn làm việc, hàm lƣợng 99,71%, độ ẩm 0,00%.
- Dung môi hóa chất:
MeOH, toluen, n-hexan, đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho GC-MS.
- Huyết tƣơng trắng không có Felodipin: của viện Huyết học- Truyền máu Trung
ƣơng.
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị
- Máy sắc ký khí khối phổ Brucker, Mỹ.
- Cân phân tích Sartorius (d= 0,1 mg), Đức.
- Máy ly tâm EBA 20 – Hettich, Đức.
- Thiết bị bay hơi dung môi bằng khí nitơ có gia nhiệt Reacti-Therm III (Thermo
scientific), Mỹ.
- Máy lắc xoáy Vortex ZX
3
VELP Scientifica (3000 vòng/phút), Đức.
- Tủ lạnh sâu ( -40
o
C), Sanyo MDF -236.
- Micropipet 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1000 µl, Nhật.
- Bình định mức, dụng cụ thủy tinh (class A) dùng trong phân tích.
2.2. Nội dung nghiên cứu

17

- Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng FEL trong HT bằng phƣơng pháp GC-MS: lựa
chọn chất chuẩn nội, điều kiện sắc ký và quy trình xử lý mẫu để chiết tách FEL từ
HT.
- Thẩm định phƣơng pháp phân tích: thẩm định về các chỉ tiêu: độ đặc hiệu - chọn
lọc, đƣờng chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn định lƣợng, độ đúng - độ
chính xác, độ ổn định.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Xây dựng phƣơng pháp phân tích
2.3.1.1. Lựa chọn chất chuẩn nội
Dựa vào công thức hóa học, tính chất lý hóa của các chất để lựa chọn chất chuẩn
nội (IS), đảm bảo IS bền vững, có thể tách chiết cùng chuẩn, đồng thời phù hợp khi
phân tích cùng FEL. Dự kiến nội chuẩn lựa chọn gồm NIF và AMLO. Hai chất này
đƣợc pha trong MeOH (800 µg/ml) sau đó đƣợc pha loãng bằng MeOH thành nồng độ
( 4 µg/ml) và đƣợc bơm trực tiếp vào máy GC-MS để xác định mảnh phổ và thời gian
lƣu cùng với FEL.
Pha hỗn hợp ba chất FEL (1µg/ml), NIF (4µg/ml) và AMLO (4µg/ml) trong MeOH
và đƣợc bơm trực tiếp vào máy GC để xác định diện tich pic và hình ảnh pic của ba
chất, từ đó lựa chọn IS cho phù hợp.
2.3.1.2. Khảo sát chương trình sắc ký
Qua nghiên cứu các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát phƣơng pháp phân tích
trên hệ thống GC-MS với các điều kiện sắc ký nhƣ:
+ Cột mao quản, nhiệt độ cột, chƣơng trình nhiệt độ.
+ Tiêm mẫu chia dòng, không chia dòng, nhiệt độ buồng tiêm.