Tài liệu Bài giảng:"Chỉ thị phân tử" docx

CHỈ THỊ PHÂN TỬ
Lê Quang Hòa
Viện Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm
Đại học Bách Khoa Hà Nội

Định nghĩa
•
Trình tự DNA đặc trưng cho một cá thể

Phân loại chỉ thị
•
Chỉ thị hình thái: Kiểu hình
•
Chỉ thị sinh hóa: Protein
•
Chỉ thị phân tử: Trình tự DNA

Chỉ thị hình thái
•
Ví dụ: màu sắc, kích thước, hàm lượng….
•
Rẻ, dễ thực hiện nhưng chịu sự ảnh hưởng của
môi trường

Chỉ thị sinh hóa = Isozyme
•
Định nghĩa: Các dạng khác nhau của một enzym
•
Allozyme: một enzym và một locus (một điểm định
vị trên nhiễm sắc thể)

•
Isozyme: một enzym và nhiều locus (lặp gen, gia
đình gen)
•
Điều kiện: có thể được phân tách bằng điện di và
phát hiện được trên gel.

Chỉ thị sinh hóa = Phương pháp
•
Nghiền và chiết protein từ mô thích hợp bằng đệm
•
Phân tách các protein trong dịch chiết bằng gel tinh
bột hay gel polyacrylamit (không biến tính)
•
Hiển thị enzym bằng cách ngâm gel trong dung dịch
cơ chất để enzym xúc tác tạo ra sản phẩm có màu

Dụng cụ cần thiết

Protein dự trữ trong hạt – Tại sao?
•
Protein dự trữ trong hạt có hàm
lượng lớn và bền
•
Giai đoạn phát triển xác định
•
Dễ bảo quản và vận chuyển
•
Mỗi một vạch protein được coi
như là sản phẩm của một gen.

Định danh giống bằng chỉ thị sinh hóa

Chỉ thị sinh hóa - Hạn chế
•
Hạn chế về số lượng: các enzym có thể phát hiện
được trên gel
•
Các enzym đa cấu tử ⇒ kết quả phức tạp
•
Kết quả phụ thuộc vào môi trường và mô nghiên
cứu.

Chỉ thị phân tử
•
Số lượng: không hạn chế
•
Không phụ thuộc vào môi trường
•
Không phụ thuộc vào mô

Phân loại chỉ thị phân tử

•
Bản chất : so sánh kích thước của các sản phẩm
cắt DNA thể gen bằng enzym hạn chế trên gel
•
Các bước tiến hành:
-
Tách và tinh sạch DNA

-
Phân cắt bằng một hay nhiều enzym hạn chế
-
Điện di trên gel agarose để phân tách các sản phẩm của
quá trình cắt
-
Chuyển lên màng nylon
-
Lai với các đoạn dò DNA được đánh dấu phóng xạ và phát
hiện bằng phim.

Các bước RFLP

RFPL

RFPL
+
-
A: dạng cơ bản
B: dạng trèn
C:
D:
E:
F:

RFLP- Các điểm cần chú ý
•
DNA chất lượng tốt: tinh sạch, không bị đứt gãy
•
Tìm đoạn dò đa hình ⇒ giá thành đắt

•
Quy trình phân tích dài so với các chỉ thị PCR
•
Sử dụng phóng xạ ⇒ hạn chế phạm vi sử dụng
•
Cần lượng lớn DNA

Các loại chỉ thị PCR
•
Không cần thiết DNA chất lượng tốt
•
Rất nhạy ⇒ dễ nhiễm
•
Phản ứng PCR cần phải được tối ưu hóa
•
Nhanh
•
Giá thành rẻ

Dùng một mồi (8-15 base)
để nhân các sản phẩm
PCR trong thể gen

RAPD
•
Ưu điểm: đơn giản, nhanh, rẻ
•
Nhược điểm:
-
Tính lặp lại kết quả thấp

-
Một vạch trên gel = một trình tự?

RAPD: ứng dụng


•
Mồi PCR: 18-25 base
•
Dựa trên số đơn vị lặp ⇒ có tính đa hình cao (gồm nhiều alen)
•
Tính lặp lại cao
•
Dễ tiến hành

SSR: ví dụ

•
Cắt DNA thể gen bằng 2 enzym hạn chế (MseI và EcoR I)
•
Nối hai đầu các đoạn cắt với các adaptor
•
PCR sơ cấp sử dụng mồi bắt cặp với adaptor + 1-2 base ở đầu 3’
•
PCR thứ cấp sử dụng mồi bắt cặp với adaptor + 3-4 base ở đầu 3’
•
Điện di trên gel acrylamit