MAI THỊ LINH KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TẠO VI NANG đa NHÂN CHỨA saccharomyces boulardii THEO PHƯƠNG PHÁP TÁCH PHA ĐÔNG TỤ KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược SĨ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

MAI THỊ LINH

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TẠO VI NANG
ĐA NHÂN CHỨA Saccharomyces boulardii
THEO PHƯƠNG PHÁP TÁCH PHA
ĐÔNG TỤ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2021


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

MAI THỊ LINH
MÃ SINH VIÊN: 1601445

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TẠO VI NANG
ĐA NHÂN CHỨA Saccharomyces boulardii
THEO PHƯƠNG PHÁP TÁCH PHA
ĐÔNG TỤ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn
ThS. Kiều Thị Hồng
Nơi thực hiện
Bộ mơn Cơng nghiệp dược

HÀ NỢI - 2021

LỜI CẢM ƠN
Khóa luận được thực hiện và hoàn thành tại tổ Vi sinh – Bộ môn Công
nghiệp Dược. Trong thời gian thực hiện khóa luận, tôi đã nhận được nhiều sự quan
tâm, giúp đỡ của thầy cô, bạn bè và gia đình.
Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn, tôi xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Kiều
Thị Hồng, người thầy luôn tận tình giúp đỡ, chỉ bảo tôi từ những ngày đầu tiên
cho đến khi tôi hoàn thành khóa luận này.
Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Đàm Thanh Xuân
cùng tất cả thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Công Nghiệp
Dược đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề
tài.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể thầy cô giáo
trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt 5
năm học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân và bạn
bè đã luôn đồng hành, ủng hộ tôi trong học tập và cuộc sống.

Hà Nội, ngày 03 tháng 06 năm 2020
Sinh viên
Mai Thị Linh


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN...................................................................................... 2
1.1. Đại cương về probiotic ........................................................................... 2
1.1.1. Định nghĩa về probiotic ......................................................................... 2
1.1.2. Các loài probiotic phổ biến ................................................................... 2

1.1.3. Các xu hướng chế phẩm chứa probiotic ................................................ 3
1.2. Loài Saccharomyces boulardii ................................................................ 4
1.2.1. Đặc điểm hình thái và điều kiện ni cấy ............................................. 4
1.2.2. Vai trị của Saccharomyces boulardii trong đời sống ........................... 5
1.2.3. Các dạng chế phẩm chứa Saccharomyces boulardii hiện nay .............. 6
1.3. Đại cương về vi nang hóa ....................................................................... 7
1.3.1. Khái niệm và đặc điểm của vi nang ...................................................... 7
1.3.2. Đặc điểm của vi nang ............................................................................ 8
1.3.3. Ưu và nhược điểm của phương pháp vi nang hóa trong bao gói tế bào
...............................................................................................................8
1.3.4. Các phương pháp tạo vi nang ................................................................ 9
1.4. Nguyên liệu tạo vi nang đa nhân ......................................................... 11
1.5. Một số nghiên cứu vi nang hóa Saccharomyces boulardii ................. 13
PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................... 16
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ................................................................... 16
2.1.1. Chủng vi sinh vật ................................................................................. 16
2.1.2. Hóa chất ............................................................................................... 16
2.1.3. Thiết bị ................................................................................................. 16
2.1.4. Dụng cụ................................................................................................ 17
2.1.5. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu................................................. 17
2.1.6. Dung dịch sử dụng trong nghiên cứu .................................................. 17
2.2. Nội dung nghiên cứu............................................................................. 18
2.2.1. Tạo vi nang đa nhân chứa Saccharomyces boulardii theo phương pháp
tách pha đông tụ ............................................................................................ 18


2.2.2. Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV của vi nang đa nhân .. 18
2.3. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 18
2.3.1. Phương pháp tiệt khuẩn [4] ................................................................. 18
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào ......................................... 19

2.3.3. Phương pháp tạo vi nang theo nguyên tắc tách pha đông tụ ............... 19
2.3.4. Phương pháp đông khô ........................................................................ 20
2.3.5. Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng VSV [4] .............. 21
2.3.6. Phương pháp phá hạt xác định số lượng VSV có trong mẫu hạt sau
đông khô ........................................................................................................ 22
2.3.7. Phương pháp xác định hình ảnh vi nang [7] ....................................... 22
2.3.8. Phương pháp định tính tinh bột bằng thuốc thử lugol [7] ................... 22
2.3.9. Phương pháp đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV của vi
nang đa nhân [7]. ........................................................................................... 22
2.3.10.

Phương pháp tính hiệu suất tạo vi nang ........................................ 23

PHẦN 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN ................................... 24
3.1. Tạo vi nang đa nhân chứa Saccharomyces boulardii theo phương
pháp tách pha đông tụ ................................................................................... 24
3.1.1. Khảo sát nồng độ alginat của thành phần dịch bao ngoài ảnh hưởng
đến quá trình tạo vi nang đa nhân ................................................................. 24
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giữa vi nang nhân và hỗn dịch bao gói
tới quá trình tạo vi nang đa nhân .................................................................. 29
3.1.3. Tạo vi nang đa nhân chứa Saccharomyces boulardii .......................... 33
3.2. Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV của vi nang đa nhân 37
3.2.1. Đánh giá khả năng bảo vệ VSV và giữ cấu trúc vi nang trong dung
dịch pH 1.2 .................................................................................................... 37
3.2.2. Đánh giá khả năng giải phóng VSV của vi nang đa nhân ................... 39
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.............................................................. 42
4.1. Kết luận.................................................................................................. 42
4.2. Đề xuất ................................................................................................... 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
B. longum

: Bifidobacterium longum

CFU

: Số đơn vị khuẩn lạc (Colony – Forming Units)

FAO

: Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc
(Food and Agriculture Organization of the United
Nations)

GRAS

: được công nhận là an toàn (Generally Recogized As
Safe)

kl/tt

: Khối lượng/thể tích

L. casei

: Lactobacillus casei

L. reuteri LRE02

: Lactobacillus reuteri LRE02

L. rhamnosus LR06

: Lactobacillus rhamnosus LR06

MT1

: Môi trường 1

MT2

: Môi trường 2

TCCS

: Tiêu chuẩn cơ sở

TCNSX

: Tiêu chuẩn nhà sản xuất

TKHH

: Tinh khiết hóa học

VSV

: Vi sinh vật

WHO

: Tổ chức y tế thế giới (World Heald Organization)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Ưu nhược điểm của các phương pháp tạo vi nang phổ biến .............. 10
Bảng 2.1: Các nguyên liệu và hóa chất sử dụng ................................................. 16
Bảng 2.2: Các thiết bị sử dụng ............................................................................ 16
Bảng 3.1: Kết quả quá trình tạo vi nang đa nhân và đánh giá khả năng bao gói
của các mẫu vi nang A-0.5; A-1; A-2 và A-3 ..................................................... 25
Bảng 3.2: Tỷ lệ vi nang nhân : hỗn dịch bao gói cần khảo sát ........................... 30
Bảng 3.3: Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ phối hợp vi nang nhân và dịch bao ngoài
tới quá trình tạo vi nang đa nhân ......................................................................... 30
Bảng 3.4: Hiệu suất tạo vi nang .......................................................................... 37
Bảng 3.5: Số lượng VSV giải phóng và sống sót tại các thời điểm khác nhau .. 39


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Hình ảnh Saccharomyces boulardii quan sát dưới kính hiển vi thường
và kính hiển vi điện tử [19] ................................................................................... 5
Hình 1.2: 3 loại vi nang chứa vi sinh vật thường gặp [11] ................................... 8
Hình 1.3: Phương pháp tách pha đông tụ tạo vi nang [11] ................................. 11
Hình 1.4: Cấu trúc của Alginat [30] .................................................................... 12
Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của Chitin [40] ........................................................ 12
Hình 1.6: Cấu trúc hóa học của Chitosan [40] .................................................... 13
Hình 3.1: Hình ảnh vi nang tươi a) Mẫu A-0.5; b) Mẫu A-1; Mẫu A-2; ............ 27
Hình 3.2: Hình ảnh vi nang sau đông khô a) Mẫu A-0.5; b) Mẫu A-1;.............. 27

Hình 3.3: Hình ảnh vi nang AT – 2.5 a) Trước đông khô; b) Sau đông khô ...... 31
Hình 3.4: Hình ảnh vi nang AT – 5 a) Trước đông khô; b) Sau đông khô ......... 32
Hình 3.5: Hình ảnh vi nang AT – 10 a) Trước đông khô; b) Sau đông khô ....... 32
Hình 3.6: Sơ đồ các bước tạo vi nang đa nhân chứa Saccharomyces boulardii . 35
Hình 3.7: Hình ảnh vi nang ATC – AT a) Trước đông khô b) Sau đông khô .... 35
Hình 3.8: Hình ảnh vi nang ATC-ATC a) Trước đông khô; b) Sau đông khô ... 36
Hình 3.9: a) Vi nang ATC – ATC; b) Vi nang ATC – AT dưới kính lúp soi nổi
có độ phóng đại 25X ........................................................................................... 36
Hình 3.10: Kết quả thử định tính tinh bột trong dung dịch pH 1.2 sau 30 phút
của các mẫu vi nang ATC – AT và ATC – ATC (theo thứ tự từ trái qua phải) . 38
Hình 3.11: Biểu đồ biểu diễn số lượng VSV giải phóng trong dịch tiêu hóa mô
phỏng tại các thời điểm khác nhau ...................................................................... 40


ĐẶT VẤN ĐỀ
Nấm men Saccharomyces boulardii là probiotic được ứng dụng nhiều trong
thực phẩm và dược phẩm với vai trò cải thiện sức khỏe con người. Các tác động
tích cực tới sức khỏe của Saccharomyces boulardii có thể kể đến như tăng cường
khả năng miễn dịch chống nhiễm trùng đường ruột, ngăn ngừa và điều trị tiêu
chảy,.. [34].
Tuy nhiên, tiềm năng điều trị đó chỉ có thể đạt được khi chúng sống sót qua
dạ dày, chống lại các tác động bất lợi trong đường tiêu hóa, bám dính vào niêm
mạc ruột với số lượng đủ lớn tạo ra tác dụng [23]. Ngoài ra, trong quá trình chế
biến và bảo quản các yếu tố như độ ẩm, áp suất, oxy hòa tan có thể làm giảm đáng
kể số lượng vi khuẩn sống sót làm giảm hiệu quả điều trị [41].
Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm nâng cao hiệu quả bảo vệ
Saccharomyces boulardii trong bảo quản cũng như đưa được VSV tới vị trí thích
hợp ở trong ruột. Phương pháp tạo vi nang đa nhân được tiến hành trên nhiều hoạt
chất cho kết quả khả quan trong việc bao bọc và giải phóng hoạt chất so với các
vi nang đơn nhân [21]. Đề tài “ Khảo sát quá trình tạo vi nang đa nhân

Saccharomyces boulardii theo phương pháp tách pha đông tụ” được tiến hành với
mục tiêu sau:
1. Tạo vi nang đa nhân chứa Saccharomyces boulardii theo phương pháp tách pha
đông tụ
2. Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV của vi nang đa nhân.

1


PHẦN 1: TỔNG QUAN

1.1.

Đại cương về probiotic

1.1.1. Định nghĩa về probiotic
Lịch sử ghi nhận việc sử dụng các vi sinh vật có lợi trong sữa lên men đã
có niên đại từ hơn 2500 năm trước công nguyên. Nhưng mãi tới năm 1965 thì
thuật ngữ probiotic mới được Lilley và Stillwell sử dụng lần đầu tiên để mô tả về
“chất do một vi sinh vật tiết ra để kích thích sự phát triển của VSV khác” [25].
Thuật ngữ “probiotic” có nguồn gốc từ Hy Lạp có nghĩa là “ dành cho sự
sống” và nó mang nhiều ý nghĩa khác nhau theo thời gian. Tác dụng của các VSV
này được đặt trên cơ sở khoa học trong nghiên cứu của Elie Metchnikoff. Những
phát hiện mới và những nghiên cứu sâu về lợi ích sức khỏe của sữa lên men đã
được ông đưa vào cuốn sách “Essais Optimistes” (1907) [25].
Sau Lilley và Stillwell thì rất nhiều nhà khoa học đã nỗ lực để cải thiện định
nghĩa về probiotic. Parker (1974) đề xuất rằng “ Probiotic là những VSV góp phần
cân bằng hệ vi sinh đường ruột”. Năm 1989, Fuller đã định nghĩa lại probiotics là
“ Một chất cung cấp các VSV sống có những tác động có lợi tới cơ thể vật chủ
thông qua việc cải thiện sự cân bằng vi sinh đường ruột” [25].

Nhận ra việc định nghĩa không đồng thuận và chính xác về probiotic là một
vấn đề lớn, rất nhiều các sản phẩm khai thác thuật ngữ này chưa chính xác vì thế
chúng không đáp ứng được các tiêu chí cần thiết. Đồng thời các sản phẩm men vi
sinh đã nhận được sự quan tâm chính đáng của các cơ quan quản lý tới việc bảo
vệ sức khỏe người tiêu dùng. Năm 2002, qua nhiều cuộc tranh luận của các chuyên
gia để làm lại định nghĩa probiotic, tổ chức FAO và WHO đã đưa ra một định
nghĩa thống nhất về probiotic như sau: “Probiotic là những vi sinh vật sống mà
khi đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe
vật chủ” [29]. Kể từ đó định nghĩa này trở nên phổ biến và được sử dụng rộng rãi
nhất trên toàn thế giới trong hầu hết các ấn phẩm khoa học.
1.1.2. Các loài probiotic phổ biến
Không có một bộ tiêu chí thống nhất để lựa chọn và phân loại một chủng vi
2


khuẩn sống được làm lợi khuẩn. Các tiêu chí phổ biến thường được sử dụng để
phân lập và xác định vi khuẩn probiotic bao gồm: (i) Các giống có nguồn gốc từ
người; (ii) Tính ổn định chống lại acid mật, acid, enzym và oxy; (iii) Khả năng
bám dính vào niêm mạc ruột, probiotic phải phóng thích và sản sinh nhanh chóng
tại ruột; (iv) Khả năng sản xuất các chất kháng khuẩn; (v) Chứng minh được hiệu
quả tích cực trong chữa trị và an toàn khi sử dụng – thuộc nhóm GRAS [29].
Hiện nay có rất nhiều chế phẩm probiotic được sử dụng với mục đích cải
thiện sức khỏe cho vật chủ được thương mại hóa, trong đó thường sử dụng chủng
vi khuẩn lactic (Lactobacillus, Bifidobacterium …), nấm men (Saccharomyces
boulardii, …) và các vi khuẩn khác (Bacillus, Lactococcus,…) [41]. Lactobacillus
và Bifidobacteria là hai chi vi khuẩn được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi trong
các chế phẩm sinh học hiện nay [23]. Lactobacillus acidophilus, L. casei,
Bifidobacterium bifidum, B. longum và nấm men Saccharomyces boulardii là
những loài được sử dụng phổ biến nhất trong các chế phẩm sinh học ở người [29].
Trong đó, Saccharomyces boulardii là loại nấm men không gây bệnh duy nhất

được sử dụng như một chế phẩm sinh học [34] .
1.1.3. Các xu hướng chế phẩm chứa probiotic
Việc cải tiến các dạng bào chế của probiotic đang không ngừng được tiến
hành nhằm nâng cao hiệu quả và tính an toàn khi sử dụng. Trong các sản phẩm
probiotic hiện nay thì sữa là một nhóm lớn có khả năng mang và vận chuyển
probiotic vào trong cơ thể vật chủ. Một số các dạng chế phẩm từ sữa phổ biến như
sữa lên men dạng lỏng, sữa chua, phô mai [5].
Bên cạnh các sản phẩm từ sữa thì nước trái cây, rau quả lên men bổ sung
probiotic ngày càng được quan tâm nhờ ưu điểm vượt trội trong việc phù hợp với
các đối tượng không dung nạp lactose có trong sữa và có nhu cầu năng lượng thấp
[5].
Để phát triển các chế phẩm probiotic thì VSV phải tồn tại được trong điều
kiện gia công công nghiệp và ổn định trong suốt quá trình bảo quản. Các sản phẩm
probiotic đời đầu thường là các chế phẩm lỏng như sữa chua và nước trái cây. Tuy
nhiên, VSV trong các chế phẩm này khó sống sót khi đi qua dạ dày và khả năng
3


di động trong đường tiêu hóa thấp. Các dạng bào chế rắn cho phép VSV ổn định
hơn trong quá trình sản xuất, bảo quản và sử dụng [20]. Trên thị trường Việt Nam
hiện nay có các dạng bào chế dạng rắn sau đây:
Thế hệ 1: VSV probiotic không bao, dạng bột hoặc cốm, đơn loài. Nhược
điểm của các dạng chế phẩm này là VSV hầu như không thể sống sót qua tác động
của dạ dày, muối mật. Để cải thiện nhược điểm này thì nhiều nhà sản xuất sử dụng
các chủng VSV ở dạng bào tử, điển hình là chi Bacillus.
Thế hệ 2: VSV probiotic không bao, dạng bào chế nang cứng, đơn hoặc đa
loài. VSV sẽ được đưa vào trong nang dưới dạng bột. Ở dạng bào chế này, VSV
vẫn chịu tác động của các yếu tố môi trường bên ngoài làm suy giảm số lượng
VSV.
Thế hệ 3: VSV probiotic được bao tan ở ruột. VSV sẽ được bao gói trong

nang có lớp bảo vệ cho phép chỉ giải phóng probiotic tại ruột. Hầu hết các
probiotic ở thế hệ này đều được xử lý với một polyme acrylic acid.
Thế hệ 4: Vi nang hóa, tan trong ruột. Phương pháp này sử dụng các polyme
có nguồn gốc tự nhiên để bao gói VSV trong nang giúp bảo vệ VSV khỏi ảnh
hưởng tác động của các yếu tố bên ngoài như pH thấp, muối mật, sốc nhiệt,..
Thế hệ 5: Bao kép, giải phóng VSV tại ruột. Phương pháp này sử dụng hai
lớp bao để nâng cao hiệu quả bảo vệ VSV trong quá trình sản xuất, bảo quản và
sử dụng. Lớp bao trong cùng là hệ thống peptid/protein cho phép giải phóng VSV
tùy vào độ pH của môi trường. Lớp bao ngoài là hệ thống polysaccharid và
hydrocolloid. Lớp bao này giúp bảo vệ VSV trước các yếu tố như độ ẩm, nhiệt độ
và áp suất.
1.2.

Loài Saccharomyces boulardii

1.2.1. Đặc điểm hình thái và điều kiện nuôi cấy
Saccharomyces boulardii thuộc giới Fungi (nấm), ngành Ascomycota, phân
ngành Saccharomycotina, lớp Saccharomycetes, bộ Saccharomycetales, họ
Saccharomycetaceae, chi Saccharomyces [6].

4


Hình 1.1: Hình ảnh Saccharomyces boulardii quan sát dưới kính hiển
vi thường và kính hiển vi điện tử [19]
Saccharomyces boulardii có hình cầu hoặc hình trứng. Saccharomyces
boulardii là VSV hiếu khí không bắt buộc. Trong điều kiện hiếu khí, nấm men sử
dụng đường là nguồn năng lượng chính để tích lũy sinh khối [8]. Nhiệt độ tối ưu
cho sự phát triển của hầu hết chi Saccharomyces là 22℃ – 30℃, tuy nhiên
Saccharomyces boulardii có thể phát triển tốt ở nhiệt độ cơ thể là 37℃, kết hợp

với khả năng ức chế được một số mầm bệnh VSV đã mang lại lợi thế riêng biệt
của chủng nấm men này [31], [17]. Nấm men Saccharomyces boulardii phát triển
tối ưu trong khoảng pH 4.5 – 6.5. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh chủng
nấm men này có sức đề kháng với dịch dạ dày mô phỏng cao hơn chủng
Saccharomyces cerevisiae W303 [39]. Saccharomyces boulardii sẽ phát triển
mạnh mẽ và tích lũy nhanh sinh khối trong môi trường có đầy đủ nguồn
hydrocarbon, nito, phospho và các nguồn vi lượng thích hợp [8].
1.2.2. Vai trò của Saccharomyces boulardii trong đời sống
Nấm men Saccharomyces boulardii được biết đến là loài nấm men không
gây bệnh được sử dụng như một tác nhân phòng và điều trị bệnh tiêu chảy như
tiêu chảy do sử dụng kháng sinh, tiêu chảy do sử dụng ống thông mũi – dạ dày,
tiêu chảy do Clostridium difficile và bệnh tiêu chảy liên quan đến bệnh AIDS [32].
Bên cạnh tác dụng cân bằng hệ vi sinh đường ruột tương tự như các chủng VSV
khác khi được dùng ổn định, Saccharomyces boulardii còn có một ưu điểm vượt
trội là khả năng đề kháng với kháng sinh và sulfamid (trừ kháng nấm).
Tác dụng của Saccharomyces boulardii trong bệnh lý tiêu chảy cấp cần
được đánh giá thêm do thời gian mắc bệnh ngắn và có khả năng cao tự phục hồi
5


[32]. Ngoài ra Saccharomyces boulardii còn có hiệu quả tích cực trong điều trị
bệnh lý viêm dạ dày cấp tính và hỗ trợ loại bỏ các vi khuẩn Helicobacter pylori
gây nhiễm trùng [32].
Saccharomyces boulardii có 3 cơ chế chính để chống lại các tác nhân gây
bệnh: luminal action, tác động đến dinh dưỡng và tác động truyền tín hiệu chống
viêm trong cơ thể. Trong lòng ruột, Saccharomyces boulardii có thể tác động đến
các tác nhân gây bệnh, bảo tồn tế bào, can thiệp vào sự gắn kết của các VSV gây
bệnh vào niêm mạc, tăng quần thể đường ruột của một số các vi khuẩn có lợi như
Bifidobacterium và Lactobacilli [31].
Xét về mặt dược động học, nếu sử dụng chế phẩm uống chứa nấm men

Saccharomyces boulardii đều đặn hàng ngày sẽ nhanh chóng đạt được nồng độ
ổn định và duy trì nồng độ đó cao trong ruột. Nếu ngừng sử dụng, chúng sẽ nhanh
chóng được thải trừ ra khỏi cơ thể mà không trở thành hệ vi sinh vật đường ruột
như các VSV khác [36].
1.2.3. Các dạng chế phẩm chứa Saccharomyces boulardii hiện nay
Các chế phẩm chứa Saccharomyces boulardii trên thị trường hiện nay rất
đa dạng từ nhóm các sản phẩm thực phẩm như sữa chua uống tới thực phẩm bảo
vệ sức khỏe, dược phẩm có dạng bột cốm pha hỗn dịch, viên nang uống.
Saccharomyces boulardii vẫn mang đầy đủ các đặc tính sinh học để chống
lại các tác nhân gây bệnh trong đường tiêu hóa. Tuy nhiên, chúng lại không phát
triển trong đường ruột mà thải trừ một cách nhanh chóng khi ngừng sử dụng. Vì
thế trên thị trường hiện nay ngoài các chế phẩm probiotic chứa Saccharomyces
boulardii đơn lẻ đa phần là dạng phối hợp để hiệp đồng tác dụng đem lại nhiều
tác dụng có lợi cho vật chủ. Một số dạng chế phẩm trên thị trường hiện nay có thể
kể đến như:
Bột cốm pha hỗn dịch Sachaces của công ty Mediphar USA, Pháp với 10
tỷ Saccharomyces boulardii trong 1 g kết hợp với Kẽm Gluconate.
Men vi sinh Normagut được sản xuất bởi công ty Ardeypharm GmbH.
Thành phần có chứa ít nhất 2.5x109 Saccharomyces boulardii trong 1 viên nang
uống.
6


Men vi sinh Bioacimin Gold của công ty cổ phần Dược phẩm Việt Đức.
Trong thành phần sản phẩm có chứa hỗn hợp các vi sinh vật giúp phòng và hỗ trợ
điều trị rối loạn tiêu hóa. Trong mỗi gói 4 g có chứa: Lactobacillus (≥ 108 CFU),
Bacillus subtilis (≥ 108 CFU), Bacillus clausii (≥ 108 CFU), Saccharomyces
boulardii (≥ 108 CFU), các thành phần vitamin và khoáng chất khác.
Nhược điểm của các chế phẩm men vi sinh thế hệ đầu là dễ bị tác động của
môi trường bên ngoài, số lượng VSV khi tới được đích tác dụng không cao vì thế

các công nghệ bao kép, bao đa lớp vẫn đang được nghiên cứu sâu rộng hơn để có
thể nâng cao được hiệu quả sử dụng các chế phẩm probiotic.
1.3.

Đại cương về vi nang hóa

1.3.1. Khái niệm và đặc điểm của vi nang
Vi nang là những tiểu phân hình cầu hoặc khơng xác định, kích thước từ 0.1
µm tới 5 mm. Dược chất (hoặc dược chất và tá dược) được bao bởi hợp chất cao
phân tử có nguồn gốc thiên nhiên hoặc tổng hợp [3].
Vi nang hóa là kỹ thuật bao gói các thành phần có hoạt tính ở thể rắn, lỏng
hoặc khí trong một vật liệu thứ hai nhằm mục đích bảo vệ các thành phần hoạt
tính khỏi tác động từ môi trường xung quanh và giải phóng chúng tại vị trí thích
hợp. Các thành phần có hoạt tính được gọi là vật liệu cốt lõi và vật liệu dùng để
bẫy được gọi là vật liệu bao gói. Kỹ thuật này được ứng dụng rộng rãi trong nhiều
lĩnh vực khác nhau từ hóa chất, dược phẩm tới mỹ phẩm [18].
Probiotic thường được bao gói thông qua quy trình đóng gói cụ thể, ví dụ
như tách pha đông tụ, đông tụ hóa muối. Quy trình đóng gói khác nhau tạo ra
những vi nang có hình dạng khác nhau như hình cầu, hình trụ, hình bầu dục hoặc
hình dạng bất thường tùy thuộc vào cả vật liệu bao gói và kỹ thuật bao gói [11].
Vật liệu bao gói sẽ tạo thành màng bán thấm như một hàng rào bảo vệ tế bào
probiotic tránh khỏi các tác động của môi trường bên ngoài [11]. Đối với các vi
nang chứa VSV probiotic thì phần vỏ thường là các polyme có nguồn gốc tự nhiên
như gelatin, alginat, chitosan, cellulose,... hoặc vật liệu có nguồn gốc nhân tạo
như polyamid, polyacrylat, polyacrylamid, polyester,... tạo nên lớp màng mỏng
có bề dày từ 0.1 µm đến 200 µm bao gói các tế bào VSV sống ở bên trong [3].
7


1.3.2. Đặc điểm của vi nang

Hình thái của vi nang phụ thuộc nhiều vào chất liệu lõi và sự lắng đọng của
vật liệu phủ (vỏ vi nang). Ba dạng hình thái cơ bản được sử dụng để tạo ra các vi
nang gồm:
- Hệ chứa (Reservoir) hay đơn nhân (Mono-core type): Bao gồm 2 phần,
phần vỏ bao quanh lõi, phần lõi chứa VSV.
- Matrix hoặc Poly-core type: Dạng này các lõi nhân được bao bọc trong vỏ
bằng phương pháp bẫy.
- Bao matrix: Vi nang sau khi được bao matrix được bao thêm một lớp phủ
bên ngoài. Lớp bao này có vai trò bảo vệ nhân chứa VSV khỏi các tác động
từ môi trường xung quanh và tác động của pH dạ dày và muối mật.

Hình 1.2: 3 loại vi nang chứa vi sinh vật thường gặp [11]
Kích thước hạt của vi nang phụ thuộc vào vật liệu lõi, vật liệu bao gói, quy
trình đóng gói và kỹ thuật đóng gói vi nang. Vi nang có thể có hình cầu, hình bầu
dục hoặc một hình dạng bất kỳ tùy thuộc vào sự thay đổi thông số trong quá trình
bao gói [28].
Lớp vỏ vi nang có bản chất là lớp màng bán thấm giúp bảo vệ VSV khỏi
các tác động của môi trường bên ngoài. Khi đưa vào cơ thể VSV sẽ giải phóng
theo các cơ chế như gãy vỡ màng, hòa tan màng hoặc khuếch tán qua màng [11].
1.3.3. Ưu và nhược điểm của phương pháp vi nang hóa trong bao gói tế bào
 Ưu điểm của vi nang hóa
Vi nang hóa là phương pháp phổ biến nhất hiện nay trong nghiên cứu các
chế phẩm sinh học chứa probiotic. So với các phương pháp khác thì công nghệ vi
bao này đem lại những ưu điểm vượt trội như: (i) Kiểm soát việc giải phóng các
thành phần theo đích tác dụng thông qua vật liệu bao gói; (ii) Ổn định các chế
phẩm trước tác động của môi trường bên ngoài như độ ẩm, ánh sáng và oxy; (iii)
8


Tránh được sự tranh chấp, tương kỵ giữa các thành phần; (iv) Bảo vệ VSV trước

acid dịch vị dạ dày, muối mật,..; (v) Thời hạn sử dụng của các thuốc, thành phần
có hoạt tính sinh học được cải thiện bằng cách ngăn chặn các phản ứng phân hủy
[28].
Vật liệu bao gói VSV cho phép giải phóng VSV ở vị trí đích mong muốn.
Dựa trên sự khác biệt về pH giữa dạ dày, ruột non và đại tràng mà các nhà nghiên
cứu đã sử dụng các polyme giải phóng tùy thuộc độ pH, đưa VSV tới đại tràng
[11].
 Nhược điểm của phương pháp vi nang hóa
Phần lớn các nguyên liệu được sử dụng để bao gói vi nang như alginat,
thạch,.. đều là những nguồn dinh dưỡng mà VSV có thể tiêu hóa được. Vì thế tồn
tại khả năng VSV từ bên trong hoặc các VSV tạp nhiễm từ bên ngoài có thể tiêu
hóa làm vi nang bị rách, thủng và hư hỏng. [38].
Alginat (vật liệu hay được sử dụng nhất trong bao gói VSV) không phải lúc
nào cũng hiệu quả trong việc bảo vệ VSV khỏi các tác động bất lợi từ môi trường
ngoài. Do cấu trúc xốp, dễ bị phân hủy khi có mặt dư thừa các ion đơn hóa trị,
phức chelat Ca2+ hoặc môi trường hóa học bất lợi. Sự khác biệt trong hoạt động
của các vi hạt này không chỉ phụ thuộc vào chủng, phương pháp đóng gói mà còn
phụ thuộc vào bản chất của alginat. Vì thế cần phải tiến hành khảo sát thật kỹ
lưỡng tính chất của chúng trước khi đưa vào sản xuất [24]. Màng vi bao có thể
không đồng nhất, điều này có thể ảnh hưởng đến mô hình giải phóng thuốc trong
cơ thể.
1.3.4. Các phương pháp tạo vi nang
Hiện nay có rất nhiều kỹ thuật bao vi nang khác nhau để bao gói các VSV
probiotic. Lựa chọn phương pháp bao gói phù hợp dựa vào kích thước vi hạt trung
bình cần thiết, các đặc tính vật lý, hóa học của chất mang, ứng dụng của vật liệu
bao gói, cơ chế giải phóng và chi phí của quy trình. Đặc biệt các kỹ thuật này
không được gây ra các tác động bất lợi với VSV probiotic. Một số các kỹ thuật
phổ biến để bao gói các VSV bao gồm: (i) Phương pháp phun sấy; (ii) Phương
pháp tách pha đông tụ; (iii) Phương pháp nhũ tương hóa [28].
9

Bảng 1.1: Ưu nhược điểm của các phương pháp tạo vi nang phổ biến
Đặc điểm

Đặc điểm phương

Ưu điểm

pháp

Phương pháp

Nhược điểm

Pha không liên tục Dễ nâng cấp quy Kích thước và hình
là hệ phân tán sinh mô. Kích thước vi dạng vi nang tạo
Phương pháp nhũ khối
tương hóa

tế

bào nang tạo thành thành không đồng

probiotic, pha liên nhỏ hơn phương đều.
tục là dầu thực vật. pháp

tách

pha

đông tụ.
Hỗn

dịch

chứa Quy trình khép Tác động của nhiệt

VSV được phán kín dễ nâng cấp độ và sự mất nước
tán thành dạng tia quy mô.

nhanh chóng có

Phương pháp

vào luồng khí áp Vi nang tạo thành thể làm giảm khả

phun sấy

suất cao, đi qua có kích thước rất năng sớng sót của
b̀ng sấy bớc hơi nhỏ (5-600µm)

VSV.

dung mơi tạo vi
nang.
Các pha được tách Dụng cụ, thiết bị Sự hình thành hạt
nhờ sự thay đổi đơn giản, rẻ tiền.

chậm, khó nâng

Phương pháp tách nhiệt độ, sự hóa Ít gây tổn thương cấp quy mô.
pha đông tụ

muối

hoặc

khi tế bào.

thêm dung môi thứ
hai vào hệ vi nang.
 Phương pháp tách pha đông tụ
Tách pha động tụ là quy trình sử dụng kỹ thuật cố định gel để bao bọc tế
bào probiotic bằng hydrocollloid. Trong kỹ thuật này, hydrocolloid trộn với sinh
khối VSV, hỗn hợp thu được sẽ được đùn qua vòi phun (máy đùn hoặc kim tiêm)
rồi rơi tự do vào dung dịch hóa rắn [26]. Bản chất của phương pháp này là dựa
10


vào sự kết dính của một polysaccharid anion khi tiếp xúc với ion đa hóa trị nào
khác sẽ cố định VSV. Gel này ổn định trong môi trường acid nhưng lại phân hủy
trong môi trường base. Nhiều loại polyme khác nhau được sử dụng làm vật liệu
tạo vi nang bằng phương pháp này nhưng các chất được sử dụng nhiều nhất là
alginate, k-carrageenan và whey protein [23].

Hình 1.3: Phương pháp tách pha đông tụ tạo vi nang [11]
Kích thước hạt phụ thuộc vào khoảng cách giữa kim và dung dịch tạo gel,
bản chất polyme, độ nhớt dung dịch bao gói và chủ yếu dựa vào đường kính lỗ
đùn [26].

Tách pha đông tụ được đánh giá là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, chi
phí thấp, không cần sử dụng nhiệt độ cao vì thế cho phép tế bào probiotic duy trì
khả năng sống cao. [26], [28].
1.4.

Nguyên liệu tạo vi nang đa nhân

 Alginat
Alginat là tên gọi chung cho các muối của acid alginic tồn tại dưới một
polysaccharide anion không phân nhánh có nguồn gốc từ tảo nâu. Nó được cấu
tạo từ hai gốc acid uronic là β-D-mannuronate (M) và β-L-guluronate (G) liên kết
với nhau bằng liên kết 1,4-glycosid sắp xếp ở dạng homopolyme (Khối GGG và
khối MMM) hoặc khối dị trùng hợp (Khối MGM). Phụ thuộc vào việc thu hoạch
và quy trình chiết xuất thì sẽ thu được tỷ lệ hai gốc khác nhau tạo nên các đặc tính
11


khác nhau của các loại alginat [41]. Nhiệt độ trong khoảng 60℃ – 80℃ là nhiệt
độ cần thiết để hòa tan alginat trong nước. Gel alginat không hòa tan trong môi
trường acid [28].

Hình 1.4: Cấu trúc của Alginat [30]
Sự gel hóa các hạt alginate xảy ra do liên kết chéo. Dung dịch alginat có
khả năng tạo gel với các ion kim loại hóa trị II như Ca2+, Ba2+,... Trong dung dịch
alginat khối M có cấu trúc dải hẹp còn khối G là các dải gấp khúc. Các khối G
liên kết chọn lọc với các cation hóa trị II tạo ra các liên kết chuỗi và tạo thành các
vùng tiếp giáp gọi là “mô hình hộp trứng” [41].
Ưu điểm của alginat là không độc hại, tương thích sinh học cao, giá thành
rẻ và dễ dàng hình thành ma trận gel bao bọc xung quanh tế bào vi khuẩn.
 Chitosan

Chitosan là polyaminosaccharide có được thông qua phản ứng deacetyl hóa
chitin ở mức độ 66% – 95%. Chitosan có thể thu được trong tự nhiên ở một số
loài nấm nhưng ít phổ biến hơn nhiều so với chitin [40].

Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của Chitin [40]

12


Hình 1.6: Cấu trúc hóa học của Chitosan [40]
Chitosan tích điện dương, có tính base yếu, thấm nước và dễ tan trong các
dung dịch acid hữu cơ như acid acetic, acid lactic và acid fomic có pH dưới 6.0.
Dung dịch chitosan có xu hướng tạo phức hợp đa ion với hydrocolloid anion và
hình thành màng gel [40]. Độ nhớt của dung dịch chitosan tăng lên khi tăng nồng
độ chitosan, giảm nhiệt độ và phụ thuộc vào mức độ deacetyl hóa chitin [37].
Ưu điểm của chitosan là khả năng phân hủy sinh học, thân thiện với môi
trường, tương thích sinh học tốt, không độc hại và giá thành rẻ. Chitosan tích điện
dương ở pH sinh lý vì thế có tính kết dính sinh học làm tăng khả năng lưu giữ tại
vị trí tác dụng. Trong các chế phẩm probiotic, chitosan có khả năng tạo lớp màng
sinh học đưa các tế bào vi khuẩn sống sót đến đại tràng dưới điều kiện khắc nghiệt
của đường tiêu hóa [12].
 Tinh bột
Tinh bột là polysaccharid được cấu tạo từ amylose và amylopectin, đều
được cấu tạo từ D – glucose. Tỷ lệ amylose và amylopectin trong tinh bột thường
là 1/4 [35],[14].
Khi tạo vi nang calci alginat, tinh bột phối hợp như tá dược độn rắn, góp
phần cải thiện thể chất vi nang sau đông khô, giúp tế bào ổn định hơn, cải thiện
khả năng sống sót trong quá trình đông khô và bảo quản [9]. Việc sử dụng riêng
tinh bột hoặc kết hợp với chitosan đã cải thiện khả năng bao bọc VSV sống so với
việc không sử dụng tinh bột [28].

1.5.

Một số nghiên cứu vi nang hóa Saccharomyces boulardii

13


Hiện nay, nhu cầu sử dụng men vi sinh ngày càng tăng cao vì thế rất nhiều
chủng probiotic được nghiên cứu và khai thác thương mại. Tuy nhiên việc duy trì
khả năng sống sót và hoạt động của probiotic vẫn là một thách thức lớn đối với
các nhà nghiên cứu. Công nghệ vi nang hóa là một trong những phương pháp hiện
đại nhất có tác dụng đáng kể trong việc nâng cao khả năng sống sót của VSV. Vì
thế rất nhiều nghiên cứu được tiến hành trong nước và trên thế giới.
Trên thế giới
Hassan Ghorbani-Choboghl và cộng sự (2019) đã tiến hành nghiên cứu để
khảo sát ảnh hưởng của vi nang đến khả năng sống sót của Saccharomyces
boulardii trong dịch dạ dày mô phỏng và dung dịch muối mật. Nghiên cứu được
tiến hành trên 30 chuột chủng Wistar chia làm 3 nhóm: nhóm chứng, nhóm sử
dụng Saccharomyces boulardii dạng tự do và nhóm sử dụng Saccharomyces
boulardii được bao gói trong vi nang. Vi nang được tạo thành từ phương pháp
đùn Natri alginat 2% vào dung dịch Calci clorid 0.1M. Kết quả cho thấy sau 2 giờ
ở trong dịch dạ dày (pH = 2) và dịch tiêu hóa mô phỏng (pH = 8) tại các thời điểm
khác nhau số lượng VSV ở dạng tự do giảm đi đáng kể so với nhóm sử dụng vi
nang chứa VSV (p< 0.05) [27].
Sultan Arslan và cộng sự (2015) đã tiến hành thử nghiệm đánh giá khả năng
sống sót của Saccharomyces boulardii được bao bọc trong vi nang được tạo bởi
phương pháp phun sấy với vật liệu bao khác nhau: malto dextrin, gôm Arabic,
tinh bột biến tính, đạm whey, gelatin và protein chiết xuất từ đậu. Nhiệt độ đầu
vào khảo sát ở 80℃ và 125℃. Kết quả cho thấy vật liệu bao gelatin cho hiệu quả
bảo vệ VSV trong quá trình phun sấy cũng như trong điều kiện thử nghiệm qua

dịch dạ dày mô phỏng ở pH 1, 1.5 và 2 tốt nhất. Ngoài ra, ở nhiệt độ 125℃ làm
giảm khả năng sống sót của vi sinh vật trong quá trình phun sấy nhưng lại làm
tăng khả năng bảo vệ VSV trong dịch tiêu hóa mô phỏng [10].
Tại Việt Nam
Tác giả Lê Thị Hoàng Anh và Ngô Nguyễn Quỳnh Anh (2020) đã tiến hành
khảo sát công thức tạo vi nang đa lớp chứa Lactobacillus acidophilus và
Saccharomyces boulardii. Kết quả cho ra công thức bao gói VSV tối ưu là vi nang
14


nhân chứa Lactobacillus acidophilus, alginat 3%, tinh bột 10% và dung dịch gel
hóa là CaCl2 2%/Chitosan 3%; lớp vỏ màng bao chứa Saccharomyces boulardii,
alginat 0.5%, tinh bột 10% và dung dịch gel hóa CaCl2 2%/Chitosan 3%. Vi nang
đa lớp đạt yêu cầu về hàm ẩm (dưới 5%) và số lượng VSV (trên 109 CFU/g) trong
suốt 90 ngày bảo quản [1],[2].

15


PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.

Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1. Chủng vi sinh vật
Saccharomyces boulardii bộ môn Công Nghiệp Dược cung cấp.
2.1.2. Hóa chất
Bảng 2.1: Các nguyên liệu và hóa chất sử dụng
Tên hóa chất

Nguồn gốc

Tiêu chuẩn

Glucose

Trung Quốc

TCNSX

Cao nấm men

Merck – Đức

TCNSX

Na2HPO4

Trung Quốc

TKHH

Natri clorid

Trung Quốc

TKHH

KH2PO4

Trung Quốc

TKHH

MgSO4.7H2O

Trung Quốc

TKHH

Natri citrat

Trung Quốc

TKHH

Natri alginat

Ấn Độ

TCNSX

Calci clorid

Trung Quốc

TKHH

Chitosan

Đức

TCNSX

Bột thạch (Agar)

Việt Nam

TCCS

Tinh bột

Việt Nam

TCCS

2.1.3. Thiết bị
Bảng 2.2: Các thiết bị sử dụng
Tên thiết bị

Nguồn gốc

Tên thiết bị

Nguồn gốc

Cân kỹ thuật

Đức (Satorious)

Máy ly tâm

Đức (Satorious)

Máy khuấy từ

Hàn Quốc (Wisd)

Máy đông khô

Tủ ấm CO2

Nhật (Sanyo)

Tủ lạnh sâu

16

Đức (Christ
Alpha)
Hàn Quốc (LG)


Tủ cấy vô trùng

Nhật (Sanyo)

Máy lắc ổn nhiệt

Tủ lạnh

Thái Lan (Sharp)
Hàn Quốc

Tủ sấy

khuẩn
Kính lúp soi nổi

(Daihan)

Kính hiển vi

Nồi hấp tiệt

Trung Quốc
(KWF)
Nhật (ALP)
Đức (Leica)

Nhật (Nikon)

2.1.4. Dụng cụ
Bình nón

Pipet Eppendort

Bơm kim tiêm Vinahankook 10 ml

Ống ly tâm

Xylanh 50 ml Tanaphar

Ống nghiệm có nắp

Pipet chia vạch

Ớng đong

Cớc có mỏ

Đĩa petri đường kính 9 cm

Pipet tips (đầu côn)
2.1.5. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu
a. Môi trường nhân giống nấm men (MT1)
Glucose

80 g

KH2PO4

2g

Cao nấm men

5g

MgSO4.7H2O

1g

Triamoni sulfat

3g

Nước máy vừa đủ

1000 ml

b. Môi trường nhân giống nấm men thạch (MT2)
MT2 = MT1 + thạch 2% (20 g thạch trong 1000 ml môi trường).
2.1.6. Dung dịch sử dụng trong nghiên cứu
- Dung dịch alginat a% (kl/tt): Cân a g Natri alginat, phân tán đều trong 100
ml nước cất. Đem hấp tiệt trùng ở 121℃ trong 15 phút cho alginat đồng
nhất.
- Dung dịch Calci clorid 2% (kl/tt): Cân 2,00 g CaCl2, hòa tan hoàn toàn
trong nước cất vừa đủ 100 ml.
- Dung dịch Calci clorid 2%/chitosan 3% (kl/tt): Cân 3,00 g chitosan và 2,00
17