Quy trình định lượng e.coli bằng phương pháp đếm đĩa

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÁO CÁO TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM(Sáng Thứ
4_Tiết 3-4)

Đề tài: QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG
PHÁP ĐẾM ĐĨA

Nhóm: 01
Sinh viên thực hiện:
Đỗ Thị Kim Anh (2005170003)
Trần Nguyễn Bảo Châu (2005170017)
Văn Thị Dung (2005170026)

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019


2
PHÂN CƠNG NHIỆM VỤ
TÊN

MSSV

NHIỆM VỤ

Đỗ Thị Kim Anh

2005170003

Tính tốn kết quả, soạn

Word và Power point

Trần Nguyễn Bảo Châu

2005170017

Tổng quan và quy trình,
soạn Power point

Văn Thị Dung

2005170026

Các phương pháp phân tích,
quy trình


3
MỤC LỤC


4
DANH MỤC HÌNH ẢNH

4


5
MỞ ĐẦU
Hiện nay, thế giới đang đối mặt với rất nhiều loại bệnh nguy hiểm, có khả năng lây lan

cao do các chủng virus, vi khuẩn khác nhau gây ra. Tùy theo nhiều mức độ mà hậu quả
của chúng để lại cũng khác nhau. Tuy nhiên, nếu khơng có những kiến thức cần thiết thì
việc phịng tránh, ngăn ngừa cũng như để kịp thời nhận biết và xử lí sẽ gặp khơng ít khó
khăn. Và trong số những vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm ấy, E.coli cũng là 1 chủng vi
khuẩn mang lại cho con người khơng ít rắc rối. Vì những lí do kể trên mà suốt những
năm qua con người luôn cố gắng sử dụng nhiều biện pháp khác nhau để định lượng được
E.coli, trong đó có 1 phương pháp được sử dụng khá phổ biến là phương pháp đếm đĩa.
Trước khi, tìm hiểu sâu về phương pháp trên, nhóm làm tiểu luận sẽ giới thiệu đơi nét về
vi khuẩn E.coli cũng như vài phương pháp định lượng E.coli khác nhau

5


6

I.

TỔNG QUAN VỀ E.COLI

Escherichia coli do Theodore Escherich (1857-1911), một nhà vi khuẩn học người Áo,
phát hiện lần đầu tiên năm 1885. Chi Escherichia thuộc họ vi khuẩn đường ruột. trong
các loài thuộc chi này, E.coli được chọn làm điển hình và có vai trị quan trọng nhất trong
y học.
E.coli là một trong những thành viên chính của hệ vi khuẩn bình thường ở ruột nhưng
cũng là căn nguyên của nhiều bệnh nhiễm trùng, trong đó có những bệnh nó là căn
nguyên đứng đầu.
E.coli đã được sử dụng làm mô hình nghiên cứu về sinh học phân tử trong lĩnh vực vi
sinh học nói riêng và sinh học nói chung.

Hình 1: Vi khuẩn E.coli

1. Cấu tạo của vi khuẩn E.coli
E.coli là trực khuẩn gram âm, có hai đầu trịn, kích thước từ 0,5 – 3 micromet. Di động
bằng tiêm mao, khơng bào tử, loại có độc lực thì có capsul.
2. Đặc điểm sinh học
2.1. Hình thái
Kích thước trung bình từ 2-3m x 0,5m; trong những điều kiện khơng thích hợp (ví dụ như
6
trong mơi trường có kháng sinh) vi khuẩn có thể rất dài như sợi chỉ. Rất ít chủng E.coli
có vỏ, nhưng hầu hết có lơng và có khả năng di động.


7

Hình 2: Cấu tạo của vi khuẩn E.coli
2.2. Tính chất nuôi cấy
E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường ni cấy thơng thường. Một số có thể sống
trên mơi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng. Hiếu kỵ khí tuỳ ý. Có thể phát triển
ở nhiệt độ từ 5-400C. Nhiệt độ thích hợp xung quanh 370C.
Trong điều kiện thích hợp E.coli có thể phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ khoảng 2030 phút. Cấy vào môi trường lỏng (như canh thang) sau 3 – 4 giờ đã làm đục nhẹ môi
trường, sau 24 giờ làm đục đều; sau hai ngày trên mặt mơi trường có váng mỏng. Những
ngày sau, dưới đáy ống có thể thấy lắng cặn. E.coli không mọc trên canh thang Selenit.
Trên môi trường thạch thường, sau khoảng 8 - 10 giờ, dùng kính lúp đã có thể quan sát
được khuẩn lạc. Sau 24 giờ khuẩn lạc có kích thước khoảng 1,5mm. Hình thái khuẩn lạc
điển hình dạng S, nhưng có thể gặp dạng R hoặc M. Trên môi trường phân lập, tuỳ theo
chất chỉ thị màu, E.coli có khuẩn lạc màu vàng (như trên thạch lactose) hoặc màu đỏ (như
trên thạch MacConkey). Không mọc được trên mơi trường SS.
Một số loại E.coli có tính chất ni cấy riêng có giá trị sàng lọc nhanh như EAEC tạo
thành váng đặc trường khi nuôi cấy trên canh thang Muller-Hinton.
7
2.3. Tính chất hố sinh

8
E.coli có khả năng lên men nhiều loại đường và có sinh hơi. Hầu hết E.coli đều lên men
lactose và sinh hơi trừ E.coli trơ (inactive) (trong đó có EIEC) không hoặc lên men rất
chậm. Một số chi khác trong họ vi khuẩn đường ruột cũng có khả năng lên men lactose
(như Klebsiella, Enterobacter, Serratia và Citrobacter) được gộp vào một nhóm vi khuẩn
có tên chung là Colifom.
E.coli có khả năng sinh indole. Không sinh H 2S. Không sử dụng được nguồn cacbon của
citrate trong mơi trường Simmons. Có decarboxylase, vì vậy có khả năng khử carboxyl
của lysine, ornithin, arginin và acid glutamic. Betagalactosidase dương tính. Thử nghiệm
VP (Voges Proskauer) sau 24 giờ âm tính, sau 48 giờ có thể dương tính.
2.4. Kháng nguyên
Kháng nguyên O: người ta đã biết tới 160 yếu tố kháng nguyên O của E.coli
Kháng nguyên K: khoảng 100 yếu tố kháng nguyên K đã được xác định và được chia
thành ba loại: A, B và L; trong đó A dưới dạng vỏ quan sát được bằng kính hiển vi quang
học thơng thường, B và L dưới dạng màng rất mỏng chỉ có thể quan sát được nhờ kính
hiển vi điện tử.
Kháng nguyên H: hơn 50 yếu tố kháng nguyên H đã được xác định.
3. Phân loại
Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, E.coli được chia thành các loại huyết thanh. Với sự tổ
hợp của các yếu tố kháng nguyên O, K và H sẽ có rất nhiều loại huyết thanh khác nhau.
Mỗi loại huyết thanh được ký hiệu bằng các kháng nguyên O và K ví dụ O86B7 (yếu tố
kháng nguyên O số 86, yếu tố kháng nguyên K số 7 loại B).
Dựa vào vị trí gây bệnh các E.coli có khả năng gây bệnh ở người được chia thành hai
nhóm: thứ nhất là nhóm gây bệnh đường ruột (IPEC – intestinal pathogenic E.coli) hay
E.coli gây bệnh tiêu chảy (DEC - dierrheagenic E.coli), thứ hai là nhóm gây bệnh ngồi
đường ruột (ExPEC – extraintestinal pathogenic E.coli).
Các loại E.coli gây bệnh đường ruột (IPEC) đã được biết gồm:
 EPEC (Enteropathogenic E.coli):

E.coli gây bệnh đường ruột
8
 ETEC (Enterotoxigenic E.coli): E.coli sinh độc tố ruột
 EIEC (Enteroinvasive E.coli): E.coli xâm nhập ruột


9
 EAEC (Enteroaggregative E.coli): E.coli ngưng tập ruột
 DAEC (Diffusely adherent E.coli): E.coli bám dính phân tán
 EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli): E.coli gây xuất huyết ruột

Hình 3: EPEC (Enteropathogenic E.coli): E.coli gây bệnh đường ruột
Hai loại E.coli gây bệnh ngoài đường ruột quan trọng nhất là:
 MAEC (Meningitidis-associated E.coli): E.coli gây viêm màng não
 UPEC (Uropathogenic E.coli): E.coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu
II. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
1. Phương pháp truyền thống
1.1. Phương pháp đếm đĩa (đếm khuẩn lạc)
Tế bào sống được xác định như một tế bào có khả năng phân chia, sinh sản. Cách thường
để tính tế bào sống là xác định số tế bào sống trong mẫu có khả năng tạo thành khuẩn lạc
trên mơi trường thạch thích hợp. Vì lẽ này nên phương pháp xác định số tế bào sống như
trên được gọi là phương pháp đếm đĩa hay phương pháp đếm khuẩn lạc.
Trong phương pháp này cần thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha lỗng bậc 10
liên tiếp sao cho có độ pha lỗng với mật độ tế bào thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc
riêng lẻ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính tốn. Mật
độ tế bào q lớn sẽ làm các khuẩn lạc chồng chéo lên nhau tạo thành màng sinh khối.
Ngược lại số khuẩn lạc trên một9 đĩa q nhỏ sẽ khơng có giá trị thống kê. Số lượng khuẩn
lạc tối ưu được đề nghị bởi các cơ quan uy tín như FDA, AOAC là 25-250 khuẩn lạc/ đĩa.

10
Số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa phụ thuộc vào lượng mẫu sử dụng, môi trường và
điều kiện ủ. Các tế bào trên đĩa khơng tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc với tốc độ như
nhau, do vậy nhiều tế bào chưa kịp hình thành khuẩn lạc nếu thời gian ủ không đủ dài.
Thông thường điều kiện nuôi cấy ( môi trường, nhiệt độ, thời gian) cần được đảm bảo sao
cho số khuẩn lạc xuất hiện tối đa. Phương pháp đếm khuẩn lạc dễ cho sai số lớn nên cần
thực hiện ít nhất trên 1 nồng độ và nhiều nhất 2 nồng độ.
Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm vi sinh vật trong nước, thực
phẩm và bệnh phẩm
Có 2 phương pháp đếm đĩa là:
-

Phương pháp cấy trang;
Phương pháp đỗ đĩa

Ưu điểm
 Cho phép xác định số tế bào sống.
 Định lượng chọn lọc vi sinh vật.
 Có thể xác định vi sinh vật ở mật độ thấp.
Nhược điểm
û Mất nhiều thời gian, hóa chất và công sức.
1.2. Phương pháp MPN (Most Possible Number)
Phương pháp MPN dùng để đánh giá lượng vi sinh vật theo số có xác suất lớn nhất của
lượng vi sinh vật có thể có trong một đơn vị thể tích mẫu với độ chính xác tương đối cao
tuy dựa trên những thao tác và trang thiết bị khá đơn giản.
Phương pháp MPN ( phương pháp có số xác suất cao nhất) cịn được gọi là phương pháp
pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ.
Quy trình định lượng theo phương pháp MPN: cho vào các ống nghiệm có chứa mơi
trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng vi sinh vật cần định lượng một thể tích
chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp ( ví dụ: 1/10, 1/100,

1/1000). Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp . Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự
10
tăng trưởng của vi sinh vật trong từng ống nghiệm ( thường là các hiện tượng như sinh
hơi, đổi màu, đục…) ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha lỗng .
Sử dụng các số liệu này và dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật được trình


11
bày dưới dạng số MPN/100 ml hay MPN/1g mẫu. Độ chính xác của trị số MPN phụ
thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng, số lượng ống nghiệm lặp
lại càng cao thì thì độ chính xác của trị số MPN càng lớn. Phương pháp MPN có thể dùng
định lượng mọi nhóm vi sinh vật có thể được nuôi cấy trong môi trường lỏng chọn lọc và
cho kết quả biểu kiến thích hợp. Ví dụ, sử dụng mơi trường BGBL ở 37 0C có thể định
lượng nhóm coliform, cùng mơi trường này ở 440C cho phép định lượng coliform phân
hoặc mơi trường Mannitol Salt Broth có thể dùng để định lượng Staphylococcus…
Phương pháp MPN có thể thực hiện theo 2 cách:
-

Với một nồng độ pha loãng
Với vài nồng độ pha loãng

Ưu điểm
 Khắc phục được nhược điểm của phương pháp đếm trực tiếp
 Cho biết được số lượng vi sinh vật có trong mẫu
Nhược điểm
û Dễ nhầm lẫn
û Khơng thích hợp cho huyền phù vi sinh vật có mật độ thấp.
Chú ý:
-

Đa số các bảng MPN cung cấp số liệu ở dạng số MPN trong 100ml dung dịch
được sử dụng để phân tích ở các liều lượng là 10ml, 1ml, 0.1ml. Trên thực tế phân
tích, người ta thường dùng 1ml cho mẫu đã pha loãng 10 -1,
10-2, 10-3. Lượng mẫu với các độ pha loãng này tương đương với 1/100 lượng mẫu
sử dụng theo bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu 10ml, 1ml, 0.1ml nêu trên.
Vậy số liệu của bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu là 10ml, 1ml, 0.1ml tương
đương với MPN/ml mẫu chưa pha loãng khi 1ml của các dung dịch có độ pha
lỗng 10-1, 10-2, 10-3 được dùng để phân tích

-

Trường hợp mật độ vi sinh vật quá cao, cần phải sử dụng loạt nồng độ pha loãng
tiếp theo cần phải phân trị số tra bảng MPN nêu trên với hệ số pha lỗng. Ví dụ: sử
11loãng 10-2, 10-3, 10-4 tức là chỉ sử dụng 1/10 lượng mẫu
dụng 1ml cho mỗi độ pha
ở mỗi nồng đọ so với trường hợp dùng 1ml mẫu ở các độ pha loãng 10 -1, 10-2, 10-3.
Do vậy, trị số tra bảng MPN cần nhân thêm hệ số pha loãng là 10.


12
1.3. Phương pháp màng lọc (Membrane Filter Method)
Phương pháp màng lọc dùng để định lượng vi sinh vật chỉ thị trong mẫu nước khi tiến
hành các thử nghiệm môi trường nơi có mật độ vi sinh vật tương đối thấp. Bản chất của
phương pháp này là tập trung số vi sinh vật ít ỏi trong một mẫu nước có khối lượng khá
lớn trên màng lọc khuẩn và định lượng chúng theo số khuẩn lạc đếm được sau khi đặt
màng lọc lên một mơi trường thạch có thành phần dinh dưỡng thích hợp cho loại vi sinh
vật cần kiểm. Dựa trên mẫu nước ban đầu và quy ước coi mỗi lạc khuẩn được hình thành
từ một vi khuẩn mà người ta quy ra số lượng vi sinh vật có trong một đơn vị thể tích
nước.
Về thực chất đây là sự kết hợp của phương pháp lọc vô khuẩn (thường dùng để lọc thanh

trùng một số dung dịch kém chịu nhiệt, dễ bị biến chất hoặc phân hủy khi khử trùng ở
nhiệt độ cao) và phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa. Màng lọc có kích thước lỗ vào
khoảng 0,2-1μm. Những vật liệu thường được dùng để chế tạo màng lọc khuẩn là sợi
thủy tinh siêu mảnh, sợi amiante, sợi polypropylen… là những vật liệu có khả năng chịu
được nhiệt độ và áp suất cao của nồi hấp tiệt trùng. Màng lọc loại này thường được cung
cấp trong trạng thái vơ trùng.
Ngồi màng lọc bình thường thì người ta cịn sử dụng màng lọc lưới kỵ nước trên đó có
in các ơ vuông bằng vật liệu kỵ nước. Các vạch chia ô bằng vật liệu này ngăn cản sự mọc
lan của các khuẩn lạc và như vậy chia bề mặt màng lọc thành những ơ đều nhau có kích
thước xác định. Số ô vuông có khuẩn lạc mọc được đếm và quy về số có xác suất lớn
nhất ( MPN) của lượng vi sinh vật có trong một thể tích mẫu theo cơng thức:
MPN = N.ln (N/N – x)
Trong đó :
-

N là tổng số các ơ vng
x là số ơ có khuẩn lạc mọc

Ưu điểm: Xác định được mật độ vi sinh vật cụ thể trong một thể tích mẫu lớn: 10ml,
100ml..
Nhược điểm: Khơng thích hợp 12
cho việc phân tích các mẫu thực phẩm rắn
2. Phương pháp hiện đại
2.1. Phương pháp PCR ( Plymerase Chain Reaction)


13
Phương pháp PCR là một phương pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên khn là một
trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng
triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn

DNA này. Kỹ thuật này được Karl Mullis phát minh năm 1985.
Phương pháp này cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng biệt.
Đây thực sự là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của một
gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao.
Phương pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao DNA
polymerase được tìm thấy trong các sinh vật ưa nhiệt ( vi khuẩn sống trong các suối nước
nóng). Phần lớn các DNA polymerase chỉ làm việc ở nhiệt độ thấp. Nhưng ở nhiệt độ
thấp các DNA xoắn chặt vì vậy DNA polymerase khơng có nhiều khả năng làm biến tính
phần lớn các phần của phân tử. Nhưng các polymerase chịu nhiệt này hoạt động ở nhiệt
độ rất cao, có thể lên đến 1000 C. Ở nhiệt độ này DNA ( dạng thẳng) sẽ bị biến tính.
Ưu điểm:
 Thời gian cho kết quả nhanh
 Có thể nhận diện những vi sinh vật khó ni cấy. Việc ni cấy tăng sinh là đơn giản
hơn và có khi khơng cần thiết.
 Hóa chất cần cho phản ứng PCR sẵn có hơn và dễ tồn trữ hơn so với trường hợp
huyết thanh lọc. Khơng cần dụng cụ và mơi trường chuẩn đốn phức tạp.
 Ít tốn kém về mặt nhân sự, có thể tự động hóa làm giảm chi phí phát hiện các vi sinh
vật gây bệnh trong thực phẩm.
Nhược điểm:
û Thực phẩm chứa chất ức chế enzyme polymerase
û Mật độ vi sinh vật trong mẫu thường thấp, đôi khi cần tăng sinh
û Không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết, có thể dẫn đến dương tính giả do
DNA từ tế bào chết (tuy vậy có thể phát hiện bào tử , tế bào đã chết của vi sinh vật gây
độc)
2.2. Phương pháp ELISA ( Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)
13
Phương pháp ELISA là phương pháp hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme. Nguyên tắc kỹ
thuật ELISA là sử dụng kháng thể đơn dịng (kháng thể sơ cấy) phủ bên ngồi những
giếng (well) nhỏ nhằm mục đích thu giữ những kháng nguyên mục tiêu. Những kháng

14
nguyên mục tiêu thu giữ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ hai có gắn với
enzyme có phát tín hiệu ( thường là horseradish peroxidase hay alkaline phosphatase).
Khi cho vào hỗn hợp phản ứng một cơ chất đặc hiệu của enzyme, phản ứng xảy ra và tạo
ra các sản phẩm làm đổi màu phản ứng. Như vậy chúng ta có thể phát hiện được sự hiện
diện của kháng nguyên.
Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi và phân tích Salmonella, E. coli gây
bệnh( EHEC, STEC, IEHEC,…), Listeria, độc tố Staphylococus, thuốc trừ sâu, dư lượng
kháng sinh… đối với vi sinh vật, phương pháp ELISA có thể sử dụng phát hiện và định
lượng vi sinh trong thực phẩm sau vài giờ tăng sinh nhằm tăng độ nhạy của phương pháp.
Ưu điểm:
 Độ nhạy cao
 Cho kết quả nhanh
Nhược điểm:
û Không phân biệt được tế bào sống và chết.
III. TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 7924-2 : 2008
Phạm vi áp dụng: Tham chiếu theo TCVN 7924-2-2008.
Tiêu chuẩn này qui định phương pháp định lượng Escherichia coli dương tính βglucuronidaza trong thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi. Phương pháp này sử dụng kỹ
thuật đếm khuẩn lạc ở 440C trên môi trường đặc có chứa thành phần để phát hiện enzyme
β-glucuronidaza.
Cảnh báo
Một số chủng Escherichia coli không phát triển được ở 440C và cụ thể là các
Escherichia coli âm tính β-glucuronidaza như Escherichia coli O157 sẽ không phát hiện
được.
Cấy một lượng mẫu thử xác định hoặc với một lượng xác định huyền phù ban đầu lên các
đĩa kép chứa môi trường trypton-mật-glucuronid
(TBX).
14
Sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu cấy

vào hai đĩa cho mỗi dung dịch pha loãng, trong cùng một điều kiện.


15

1. Mơi trường ni cấy và dịch pha lỗng
1.1. Dịch pha loãng: được tham chiếu theo TCVN 6507-1-2005
 Thành phần:
Pepton từ casein

1,0g

Natriclorua

8,5g

Nước

1000ml

 Chuẩn bị:
Hoà tan các thành phần trong nước, đun nóng nếu cần.
Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7 0,2 ở 250C nếu cần.
 Mục đích : Dùng để pha lỗng mẫu
1.2. Mơi trường ni cấy: tham chiếu theo TCVN 7924-2-2008.
Thạch trypton-mật-glucuronid (TBX)
 Thành phần:
Sản phẩm thuỷ phân casein bằng enzyme

20,0g

Muối mật No.3

1,5g

Acid 5-bromo-4-clo-3-indolyl-β-glucuronid (BCIG)

144μmola

Dimetyl sulfoxit (DMSO)b

3ml

Thạch (agar)

9g đến 18g c

Nước

1000ml

a

Ví dụ: 0,075g muối xyclohexylamoni.

b

Dimetyl sulfoxit là rất độc khi hít hoặc tiếp xúc phải. Cần phải sử dụng trong tủ hút
khói. Vì độc tính đó nên nhà sản xuất khuyến cáo dùng dung dịch pha lỗng
c

Phụ thuộc vào sức đơng của thạch.
15


16
Các sản phẩm thuỷ phân casein bằng enzyme sẽ là nguồn cung cấp nitrogen, vitamin, và
amino acid trong môi trường TBX.
Muối mật và nhiệt độ ủ cao 44 0C sẽ ức chế phần lớn vi khuẩn gram dương, đặc biệt là
trực khuẩn (bacillus) và liên cầu khuẩn (fecal streptococcus)
Bởi vì có sự hiện diện của enzyme β-glucuronidaza giúp phân biệt được hầu hết E.coli từ
các Coliforms khác. E.coli hấp thụ chất nền BCIG, enzyme β-glucuronidaza tách liên kết
giữa 5-bromo-4-clo-3-indol và β-glucuronid, E.coli sẽ tạo ra màu xanh lam.
Agar là tác nhân làm cứng hố mơi trường.
Nước có tác dụng hịa tan các chất có trong mơi trường
 Chuẩn bị:
Hồ tan BCIG trong Dimetyl sulfoxit hoặc trong dung dịch loãng theo khuyến cáo của
nhà sản xuất. Hoà tan tất cả các thành phần trên trong nước và đun đến sôi.
Khử trùng môi trường ở nhiệt độ 121 0C trong 15 phút trong nồi hấp áp lực. Làm nguội
ngay môi trường trên nồi cách thuỷ đến khoảng từ 44 đến 470C.
Chỉnh pH để sau khi khử trùng, pH phải là 7,2 0,2 ở 250C nếu cần.
Môi trường nuôi cấy được chuẩn bị này là trong suốt và có màu vàng. Được bảo quản ở
2-80C khỏi ánh sáng và đặt ở trong chai trong vịng 4 tuần.
Chuẩn bị các các đĩa thạch
Rót các lượng từ 12 đến 15 ml môi trường này vào các đĩa Petri vô trùng và để đông đặc.
Làm khô các đĩa thạch. Các đĩa này có thể bảo quản được đến 5 ngày ở 2-3 0C.
Các đĩa thạch cần phải đủ khô để hơi nước không xuất hiện trong 15 phút khi dàn dịch
cấy (1ml).
 Mục đích: Dùng làm môi trường nuôi cấy chọn lọc

16


17

Hình 4: TBX Agar - BK146HA

Hình 5: Muối mật No.3

17

Hình 6: CTHH của Acid 5-bromo-4-clo-3-indolyl-β-glucuronid (BCIG)


18
2. Quy trình phân tích
2.1. Lấy mẫu
Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị
hư hỏng hoặc thay đổi thành phần trong quá trình vận chuyển và bảo quản.
Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo tiêu chuẩn cụ thể
liên quan đến sản phẩm. Nếu khơng có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các
bên tự thỏa thuận về vấn đề này.
2.2. Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm. Nếu khơng có tiêu
chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên tự thỏa thuận về vấn đề này.
 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng tiếp theo
Tham chiếu theo TCVN 6507-1-2015 hoặc tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần
xác định.
 Phần mẫu thử và huyền phù ban đầu
Cân một lượng 10g với sai số cho phép ± 5% hoặc đong một thể tích 10ml với sai số cho

phép ± 5%, của phần mẫu thử đại diện (xem điều 8) cho vào một chén đựng vô trùng
hoặc túi bằng chất dẻo vô trùng.
Cho một lượng dịch pha loãng 90 ml. Lượng thêm này có thể được cân hoặc đong với sai
số cho phép là ± 5%.
CHÚ THÍCH 1: Trong một số trường hợp cụ thể, đặc biệt là đối các sản phẩm có huyền
phù ban đầu 1 + 9 quá sánh hoặc q đặc thì có thể cần phải tăng thêm dịch pha lỗng.
Điều này phải được tính đến đối với các thao tác tiếp theo và/hoặc phải được tính đến
trong phần tính kết quả.
CHÚ THÍCH 2: Dung dịch pha lỗng ban đầu này quyết định một phần giá trị giới hạn
18
của phép định lượng, điều này cũng phụ thuộc vào kỹ thuật sử dụng (ví dụ, kỹ thuật rót
đĩa với 1 ml chất cấy của huyền phù 1/10, có giới hạn này là 10 vi sinh vật trong 1 gam).
Nếu cần, trong một số sản phẩm cụ thể để số đếm thấp hơn giới hạn này thì có thể sử


19
dụng một lượng dịch pha loãng nhỏ hơn 1). Cần chú ý rằng việc cấy huyền phù ban đầu
này có thể gặp khó khăn do khơng cân bằng về tỷ lệ chất cấy/môi trường cấy (ức chế sự
phát triển vi sinh vật do nồng độ các thành phần của thực phẩm tăng).
Để vi sinh vật không bị tổn thương do thay đổi nhiệt độ đột ngột, thì nhiệt độ của dịch
pha lỗng trong suốt q trình thao tác mơ tả dưới đây phải giữ xấp xỉ bằng nhiệt độ
phòng, trừ trường hợp đối với sản phẩm cụ thể (xem tiêu chuẩn riêng).
Đồng hóa hỗn hợp theo các khuyến cáo trong TCVN 6404 (ISO 7218).
Để các hạt to lắng xuống trong 15 phút, nếu cần. Có thể sử dụng các hệ thống lọc để có
kết quả tương đương.
Trong trường hợp định lượng các bào tử, việc xử lý nhiệt huyền phù ban đầu, ví dụ 10
phút ở 800C cần được thực hiện ngay sau khi chuẩn bị và làm nguội nhanh.
 Các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo
Dùng pipet vô trùng lấy 1 ml huyền phù ban đầu với sai số đo 2 ± 5% cho vào một ống
nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha lỗng vơ trùng ở nhiệt độ thích hợp.

CHÚ THÍCH: Nếu cần một thể tích lớn hơn, thì có thể thêm một thể tích xác định (lớn
hơn 1 ml) huyền phù ban đầu với sai số đo ± 5%, vào ống nghiệm chứa một thể tích dịch
pha lỗng vơ trùng lớn gấp chính lần.
Để có độ chính xác tối ưu, khơng nhúng pipet vào huyền phù ban đầu sâu hơn 1 cm.
Không để pipet chứa chất cấy tiếp xúc với dịch pha lỗng vơ trùng.
Trộn kỹ, tốt nhất là dùng máy khuấy cơ để trộn trong 5 giây đến 10 giây để thu được
dung dịch pha loãng 10-2.
Nếu cần, lặp lại các thao tác này sử dụng dung dịch pha loãng 10 -2 và các dung dịch pha
lỗng tiếp theo, thì dùng một pipet vơ trùng mới ở mỗi độ pha loãng để thu được các
dung dịch pha loãng 10-3, 10-4.v.v.. cho đến khi thu được số lượng vi sinh vật thích hợp.
2.3. Cấy và ủ
19

1)1) Trong trường hợp này thể tích dịch pha lỗng đã dùng phải được ghi lại trong báo cáo thử nghiệm.


20
Dùng pipet hoặc micropipet vô trùng chuyển 1ml mẫu thử (nếu mẫu thử ở dạng lỏng)
hoặc 1ml dịch pha loãng ban đầu (10-1) (nếu sản phẩm ở dạng khác vào đĩa petri vô
trùng).
Cấy vào hai đĩa ở mỗi nồng độ pha lỗng.
Lặp lại q trình trên cho các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo, sử dụng một pipet
mới vơ trùng cho mỗi độ pha lỗng, nếu cần.
Rót vào mỗi đĩa petri khoảng 15ml môi trường TBX mà trước đó đã được làm nguội đến
khoảng từ 44 – 470C trên nồi cách thuỷ.
Trộn cẩn thận dịch cấy với môi trường và để yên cho hỗn hợp đông lại, để các đĩa petri
trên mặt phẳng mát nằm ngang.
Thời gian tính từ khi phân phối dịch cấy vào đĩa đến khi rót mơi trường khơng được q
15 phút.
Lật ngược các đĩa và để vào tủ ấm để ở 44 0C trong khoảng từ 18-24 giờ. Tổng thời gian ủ

không được quá 24 giờ.
Cảnh báo: nếu nghi ngờ có mặt các tế bào bị ức chế thì ủ giai đoạn đầu khoảng 4 giờ ở
khoảng 370C sau đó tăng nhiệt độ lên 44 0C ủ trong khoảng 18-24 giờ. Nhiệt độ ủ khơng
được q 450C.
2.4. Đếm các đơn vị hình thành khuẩn lạc.
Sau giai đoạn ủ ấm quy định, đếm các CFU điển hình của Escherichia coli dương tính βglucuronidaza trên mỗi đĩa thạch chứa ít hơn 150 CFU điển hình và ít hơn 300 CFU tổng
số (điển hình và khơng điển hình).
Nếu dịch cấy khơng thể tách riêng và khơng thể quan sát được các khuẩn lạc điển hình,
thì các đĩa chứa 0 CFU điển hình cần được xem xét theo các phương pháp tính khác nhau
như trong điều 10.
2.5. Biểu thị kết quả

20


21
2.5.1. u cầu chung
Việc tính tốn cần tính đến các trường hợp thường gặp nhất khi tiến hành theo thực hành
phịng thí nghiệm tốt. Cũng có một số trường hợp đặc biệt nhưng cũng hiếm khi xảy ra
(ví dụ như số lượng CFU rất khác nhau giữa hai đĩa từ cùng một dung dịch pha loãng,
hoặc các tỷ lệ khác nhau nhiều từ một hệ số pha loãng giữa các đĩa từ hai độ pha loãng
liên tiếp). Các kết quả đếm cần được người phân tích có năng lực kiểm tra, giải thích và
kết quả đó cũng có thể bị loại bỏ.
2.5.2. Tính tốn
Để có kết quả đúng, cần đếm các CFU điển hình trên ít nhất một đĩa chứa ít nhất 15 CFU
màu xanh điển hình.
Tính N, số lượng CFU của Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza có mặt trong
mẫu thử trên mililit hoặc trên gam sản phẩm từ hai độ pha lỗng liên tiếp sử dụng cơng
thức (1):
(1)

trong đó:
: là tổng số các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại sau hai độ pha lỗng
liên tiếp có ít nhất một đĩa chứa tối thiểu 15 CFU màu xanh;
n1 : là số đĩa được giữ lại tại độ pha lỗng thứ nhất;
V : thể tích dịch cấy đã dùng trên mỗi đĩa, tính bằng mililit;
n2 : là số đĩa được giữ lại tại độ pha loãng thứ hai;
d : hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại [d = 1 trong trường
hợp (các mẫu ở dạng lỏng) khi mẫu thử được cấy trực tiếp]
21
Làm tròn các kết quả đến hai chữ số có nghĩa [xem TCVN 6404 (ISO 7218)].


22
Lấy kết quả là số lượng Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza trên mililit (sản
phẩm dạng lỏng) hoặc trên gam (sản phẩm dạng khác) được biểu thị theo số nguyên đến
hai chữ số có nghĩa (dưới 100) hoặc theo số từ 1,0 đến 9,9 nhân lũy thừa của 10.
2.5.3. Ước tính các số lượng nhỏ
 Nếu có hai đĩa [của mẫu thử (nếu sản phẩm ở dạng lỏng) hoặc của huyền phù ban đầu

(nếu sản phẩm ở dạng khác) hoặc của độ pha loãng thứ nhất được cấy hoặc được giữ
lại] chứa ít hơn 15 CFU màu xanh, thì tính NE, số CFU của Escherichia coli dương
tính β-glucuronidaza có mặt trong mẫu thử là trung bình của hai đĩa song song theo
cơng thức (2):
(2)
trong đó
: là tổng các CFU màu xanh điển hình đếm được trên hai đĩa;
V : thể tích dịch cấy đã dùng trên mỗi đĩa, tính bằng mililit;
N : là số đĩa được giữ lại (trong trường hợp này n = 2);
d : hệ số pha loãng tương ứng với dung dịch huyền phù ban đầu hoặc độ pha loãng thứ
nhất được cấy hoặc được giữ lại [d = 1 trong trường hợp (sản phẩm dạng lỏng) khi mẫu

thử được cấy trực tiếp].
Làm tròn các kết quả đến hai chữ số có nghĩa [xem TCVN 6404 (ISO 7218)]
Biểu thị kết quả như sau:
Số lượng Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza ước tính trong một mililit (đối với
sản phẩm dạng lỏng) hoặc trong một miligam (sản phẩm dạng khác): NE = Y.
22

 Nếu hai đĩa của mẫu thử [(sản phẩm dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (sản phẩm

dạng khác) của độ pha loãng thứ nhất đã cấy hoặc giữ lại] khơng chứa bất kỳ CFU
màu xanh nào, thì biểu thị kết quả như sau:


23
Ít hơn 1/d Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza trong mililit (sản phẩm dạng
lỏng) hoặc trong gam (sản phẩm dạng khác);
Trong đó d là hệ số pha lỗng của huyền phù ban đầu hoặc độ pha loãng thứ nhất đã cấy
hoặc giữ lại [d = 1] trong trường hợp (sản phẩm dạng lỏng) mẫu thử được cấy trực tiếp.
 Nếu tất cả các CFU điển hình hoặc khơng điển hình trên hai đĩa ở độ pha loãng thứ

nhất d1 chứa nhiều hơn 300, có CFU màu xanh có thể nhìn thấy, hoặc nếu trên hai đĩa
ở độ pha loãng tiếp theo d2 chứa ít hơn 300 khuẩn lạc, khơng có CFU màu xanh nào
cần đếm, thì biểu thị kết quả như sau:
Ít hơn 1/d2 và nhiều hơn 1/d1 Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza có trong một
mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trong một gam (sản phẩm dạng khác);
Trong đó d1 và d2 là các hệ số pha loãng tương ứng với các dung dịch pha loãng d1 và d2.


Nếu tất cả các CFU điển hình hoặc khơng điển hình trên hai đĩa ở độ pha loãng thứ
nhất d1 chứa nhiều hơn 300, khơng có CFU màu xanh có thể nhìn thấy, hoặc nếu trên

hai đĩa ở độ pha loãng tiếp theo d 2 chứa ít hơn 300 khuẩn lạc, khơng có CFU màu
xanh cần đếm, thì biểu thị kết quả như sau:

Ít hơn 1/d2 các CFU của Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza có trong một mililit
(sản phẩm dạng lỏng) hoặc trong một gam (sản phẩm dạng khác);
Trong đó d2 là các hệ số pha loãng tương ứng với dung dịch pha lỗng d2.
2.5.4. Phương pháp tính: Các trường hợp đặc biệt
 Trong trường hợp trên hai đĩa ở độ pha loãng d 1 chứa nhiều hơn 150 CFU màu xanh,

trên hai đĩa ở độ pha lỗng tiếp theo d2 chứa ít hơn 15 CFU màu xanh:
-Nếu số lượng CFU màu xanh trên từng đĩa ở độ pha loãng d 1 nằm trong khoảng từ 150
23 tin cậy đối với giá trị trung bình bằng 150), thì sử dụng
đến 167 (giới hạn trên của khoảng
phương pháp tính đối với trường hợp chung .


24
-Nếu số lượng CFU màu xanh trên từng đĩa ở độ pha loãng d 1 nhiều hơn 167 (giới hạn
trên của khoảng tin cậy đối với giá trị trung bình bằng 150 CFU), thì chỉ tính đến kết quả
của số đếm của độ pha loãng d2 và thực hiện tiếp với việc đếm số lượng nhỏ .
 Trong trường hợp số đếm CFU màu xanh trên mỗi đĩa đối với tất cả các độ pha lỗng

đã cấy có nhiều hơn 150, thì biểu thị kết quả như sau:
Nhiều hơn 150/d Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza có trong mililit (sản phẩm
dạng lỏng) hoặc gam (sản phẩm dạng khác).
Trong đó d là hệ số pha loãng của dung dịch pha loãng đã cấy sau cùng.
 Trong trường hợp chỉ có hai đĩa ở độ pha loãng thấp nhất (nồng độ cao nhất) chứa ít

hơn 150 CFU điển hình, thì tính số N' các Escherichia coli dương tính βglucuronidaza có mặt trong mẫu thử là trung bình số khuẩn lạc đếm được trên hai đĩa,
sử dụng cơng thức (3):

(3)
trong đó
: là tổng số khuẩn lạc màu xanh đếm được trên hai đĩa, có ít nhất một đĩa chứa tối thiểu là
15 CFU điển hình;
V : là thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit;
n : là số đĩa được giữ lại (trong trường hợp này n = 2);
d : là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha lỗng được giữ lại.
Làm trịn kết quả đến hai chữ số có nghĩa [xem TCVN 6404 (ISO 7218)].
2.5.5. Các giới hạn tin cậy
Xem TCVN 6404 (ISO 7218).
2.6. Báo cáo thử nghiệm

24


25
Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:
 Mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
 Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
 Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
 Tất cả các điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là

tùy ý, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;
 Kết quả thử nghiệm thu được, nêu rõ phương pháp biểu thị đã sử dụng.
 Nếu đáp ứng được yêu cầu về độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

25