BC HÓA SINH KHẢO SÁT LIPID VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME

TỔNG LIÊN ĐỒN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG
KHOA DƯỢC

🙢✵🙠

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM
HĨA SINH
BÀI 2. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME
BÀI 4. KHẢO SÁT LIPID
GVHD: TS. Phạm Phước Điền
Sinh viên: Nguyễn Quỳnh Như

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, THÁNG 08 NĂM 2021


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

BÀI 2. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME
I.

LY TRÍCH VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA α-AMYLASE MẦM LÚA
1. Ly trích
Khoảng 100 hạt lúa nẩy mầm

Nghiền nhuyễn trong cối sứ với
50ml nước cất để hòa tan enzyme

Thu dịch lọc có chứa amylase

Lọc dịch bằng giấy lọc

2. Khảo sát hoạt tính tương đối của α-amylase mầm lúa
2.1. Tiến hành thí nghiệm và kết quả
 Chuẩn bị 8 ống nghiệm như trong bảng dưới đây.
 Ổn định nhiệt độ của bể điều nhiệt ở 50oC, sau đó cho các ống nghiệm từ 1 đến 4
vào ổn định 5 phút. Sau khi kết thúc thí nghiệm ống nghiệm 1, lấy ra khỏi bể điều
nhiệt và đưa ống 5 vào. Làm tương tự với các ống nghiệm từ 6 đến 8.
 Hút 1,6ml dịch enzyme ly trích được ở trên cho vào ống nghiệm 1, đồng thời ghi
nhận thời điểm đó. Dùng pipet loại 1 ml khuấy nhẹ dung dịch và lấy ra 1 giọt để thử
màu với iod. Khi màu của dung dịch iod khơng thay đổi thì sự thủy phân tinh bột
được coi là kết thúc. Ghi lại thời điểm kết thúc.
2

Email:


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

 Kết quả của các lần đo được ghi ở bảng sau:
Ống nghiệm
Dung dịch

1

2

3

4

5

6

7

8

1

1

1

1

1

1

1

1

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2

2

2

2

2

2

2

cho vào
Hồ tinh bột 1% (ml)
Nước cất (ml)
Dung dịch đệm pH 5 (ml)

Để ổn định ở 50oC
Thể tích dịch enzyme (ml)

1,6

1,4

1,2

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

Thời gian kết thúc thủy phân (s)

250

197

145

66

42

36

42

56

Thời gian kết thúc thủy phân (s)

300

Hoạt tính tương đối của enzyme amylase

250

200

150

100

50

0
1,6

1,4

1,2

1

0,8

0,6

0,4

0,2

Thể tích enzyme (ml)
2.2. Nhận xét
Nhìn vào đồ thị ta thấy rằng:
 Dịch chiết enzyme amylase thu được thường có họat tính xúc tác ít ổn định, hoạt
tính thay đổi tùy theo điều kiện thí nghiệm và các yếu tố mơi trường.

3

Email:


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

 Hoạt tính enzyme amylase ổn định nhất ở thể tích V = 1ml. Khi tăng dần thể tích
dịch enzyme trên 1ml (hay nồng độ enzyme tăng dần) thì thời gian kết thúc thủy
phân tăng dần (hay tốc độ thủy phân giảm dần). Khi giảm dần thể tích enzyme
dưới 1ml thì thời gian kết thúc thủy phân tăng chậm. Từ đó cho thấy nếu nồng độ
enzyme quá cao hoặc quá thấp có thể dẫn đến giảm hoạt tính xúc tác của enzyme.
2.3. Hiện tượng
Những giọt đầu tác dụng với iod cho màu xanh đen, những giọt sau tác dụng với iod
cho màu tím đến tím đỏ cuối cùng là khơng màu.
2.4. Giải thích
 Ban đầu, khi mới cho enzyme vào, tinh bột trong ống nghiệm chưa kịp bị thủy
phân, nên khi tác dụng với iod cho ra màu xanh đen chính là tinh bột chưa thủy
phân tác dụng với iod. Sau đó, enzyme xúc tác thúc đẩy nhanh quá trình thuỷ phân
tinh bột tạo thành amylodextrin (cho màu tím với iod), tiếp tục thuỷ phân tạo thành
erythrodextrin (cho màu tím đỏ với iod), tiếp tục tạo thành acrodextrin (không kết
hợp với iod nên không cho màu) tiếp tục tạo thành maltodextrin (không kết hợp
với iod) cuối cùng tạo thành maltose và glucose (không kết hợp với iod).
 Trong hồ tinh bột ở nhiệt độ thường, phân tử tinh bột và các sản phẩm thủy phân
của nó là dextrin tồn tại dưới dạng các chuỗi xoắn; cứ 6 phân tử glucose lập thành
1 bước xoắn có thể hấp phụ 1 phân tử iod làm cho dung dịch có màu. Màu này
thay đổi tùy thuộc vào cấu trúc của phân tử tinh bột (tỉ lệ amylose/amylopectin) và
chiều dài của phân tử. Amylose cho màu xanh dương đậm với iod trong khi
amylopectin lại cho màu tím đỏ với iod.
II. KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CƠ CHẤT LÊN TỐC ĐỘ THỦY GIẢI
CỦA AMYLASE
1. Tiến hành thí nghiệm và kết quả
 Chuẩn bị thí nghiệm theo bảng dưới, tiến hành tương tự thí nghiệm đầu.
 Kết quả các lần đo được ghi ở bảng sau:

4

Email:


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

Ống nghiệm

1

2

3

4

5

6

7

2

3

4

5

6

7

8

Hờ tinh bợt 1% (ml)

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

Nước cất (ml)

1,6

1,4

1,2

1,0

0,8

0,6

0,4

166

131

92

Dung dịch cho vào
Nồng độ tinh bột tương ứng
(mg/ml)

Dung dịch đệm pH 5 (ml)

2 ml
Để ổn định ở 50oC

Thể tích enzyme (ml)

1 ml

Thời gian kết thúc thủy phân (s)

241

222

216

201

ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CƠ CHẤT ĐẾN TỐC ĐỘ
THỦY PHÂN CỦA AMYLASE

Thời gian kết thúc thủy phân (s)

300

250

241

222

216
201

200
166
150

131
92

100

50

0
0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

Hồ tinh bột 1% (ml)

2. Nhận xét
 Khi tăng nồng độ cơ chất, thời gian kết thúc thủy phân giảm dần nghĩa là tốc độ
phản ứng tăng dần.

5

Email:

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

 Khi tăng nồng độ cơ chất lên đến một giới hạn xác định nào đó, tốc độ phản ứng
đạt giá trị cực đại Vmax, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất lên nữa thì tốc độ phản
ứng sẽ khơng tăng tiếp tục tăng.
3. Giải thích
 Trong q trình tạo phức trung gian enzyme – cơ chất, do ảnh hưởng của enzyme,
cơ chất được hoạt hóa, cấu tạo của cơ chất bị biến đổi, phân tử của cơ chất bị phân
cực, các electron được phân phối lại, do đó điện tích của cơ chất cũng thay đổi.
Các liên kết bên trong phân tử cơ chất trở nên lỏng lẻo hơn, năng lượng họat hóa
để vượt qua hàng rào năng lượng giảm, tốc độ phản ứng tăng lên.
 Khi tốc độ phản ứng đạt giá trị cực đại nếu ta tiếp tục thêm cơ chất vào thì tốc độ
sẽ khơng tăng nữa do tất cả các trung tâm hoạt động của enzyme đã được bão hòa
bởi cơ chất.
4. Kết luận
 Với cùng một lượng enzyme xác định, nếu tăng dần lượng cơ chất trong dung dịch
thì thoạt đầu hoạt tính của enzyme tăng nhưng đến một lúc nào đó thì sự gia tăng
về nồng độ cơ chất cũng khơng làm tăng hoạt tính enzyme. Đó là vì tất cả các trung
tâm hoạt động của enzyme đã được bão hòa bởi cơ chất.
 Tốc độ phản ứng của phần lớn các phản ứng biến đổi theo nồng độc của cơ chất
và nồng độ enzyme. Khi tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng tăng chỉ khi
nồng độ cơ chất tương đối thấp. Khi nồng độ cơ chất lớn tốc độ phản ứng ít phụ
thuộc vào nồng độ cơ chất và có khuynh hướng đạt cực đại do nồng độ enzyme có
mặt quyết định.
 Với một lượng cơ chất xác định, nồng độ enzyme càng cao thì tốc độ phản ứng
xảy ra càng nhanh. Tế bào có thể điều hồ tốc độ chuyển hố vật chất bằng việc
tăng giảm nồng độ enzyme trong tế bào.

6

Email:


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

BÀI 4. KHẢO SÁT LIPID
I.

TÍNH HĨA TAN CỦA LIPID
1. Tính hịa tan của mỡ trung tính
1.1. Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị 4 ống nghiệm như bảng sau:
Ống nghiệm

1

2

3

4

Dầu thực vật

3 giọt

3 giọt

3 giọt

3 giọt

Dung môi

1 ml nước

1 ml Ethanol

1 ml Acetone

1 ml Ether

Hóa chất

Lắc đều, so sánh kết quả trong ống nghiệm 1 với các ống nghiệm còn lại
Đun cách thủy

5 phút

1.2. Hiện tượng

Ống 1: Dầu không tan trong nước, phân

Ống 3, 4: Lipid tan hoàn toàn trong

tách thành 2 lớp khác nhau, dầu ở trên,

dung mơi và khơng có sự tách lớp.

nước ở dưới.
Ống 1: Dầu không tan trong ethanol, phân
tách thành 2 lớp khác nhau, dầu ở dưới,
ethanol ở lớp trên.

7

Email:


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

Ống nghiệm 2 sau khi đun cách thủy thì
một phần lipid tan ra.

1.3. Giải thích
 Ống 1: Khơng tan, vì dầu thực vật là chất không phân cực, nước là dung môi phân
cực mạnh nên lipid và nước khơng hỗn hịa vào nhau. Lớp dầu nổi lên trên mặt nước
vì tỷ trọng của lipid nhỏ hơn tỷ trọng của nước.
 Ống 2: Khơng tan, vì dầu thực vật là chất không phân cực, ethanol là dung môi phân
cực nên dầu không thể tan trong ethanol. Lớp dầu chìm xuống đáy ống nghiệm vì
tỷ trọng của lipid lớn hơn tỷ trọng của ethanol.
 Ống 3: Dầu thực vật tan trong dung mơi acetone vì cả dầu và acetone đều là chất
không phân cực nên dễ dàng hòa tan vào nhau.

 Ống 4: Dầu thực vật tan trong dung mơi ether vì cả dầu và ether đều là chất không
phân cực nên dầu thực vật dễ dàng tan trong ether.
2. Tính hịa tan của Lecithin
2.1. Tiến hành thí nghiệm
 Dùng 2 ml lịng đỏ trứng đã đánh nhuyễn cho vào
1 ống nghiệm 25ml, thêm vào ống nghiệm 10ml
cồn tuyệt đối, khuấy đều.
 Đun cách thủy ở nhiệt độ 75- 80oC, tiếp tục khuấy
đều trong 10 phút.
 Lọc hỗn hợp trên qua ống nghiệm khô, dung dịch
chiết tiến hành thí nghiệm sau:

8

Email:


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

Ống nghiệm

1

2

Dịch chiết

1 ml

1 ml

Acetone

2 ml

-

Nước cất

-

2 ml

Dung dịch

2.2. Hiện tượng và giải thích
Giải thích
 Ống nghiệm 1 khơng đổi màu vì
lecithin khơng tan trong acetone.
 Ống nghiệm 2 đổi màu là do lecithin tan
trong nước cất dẫn đến sự chuyển màu
của dung dịch.

1

2

Ống 1: Khơng đổi màu.

Ống 2: Có màu vàng đục nhẹ.
2.3. Kết luận
Do cấu tạo như trên nên lecithin trong nước sẽ tạo thành dung dịch gọi là dung dịch giả.
Nhờ đặc tính vừa kỵ nước vừa ưa nước mà phospholipid tham gia trong việc đảm bảo
tính thấm một chiều trong mang cấu trúc tế bào.
II. CHỈ SỐ ACID CỦA LIPID
1. Tiến hành thí nghiệm
 Cân 0,3 g chất béo cho vào bình tam giác 100 ml, thêm 10 ml ethylic ether (5 ml
cồn 96% và 5 ml ether), lắc đều cho tan chất béo.
 Cho 2-3 giọt phenolphtalein vào và chuẩn độ bằng KOH 0,01N cho đến khi xuất
hiện màu hồng bền trong 30 giây.

9

Email:


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

2. Tính tốn kết quả
Thể tích KOH 0,01N đã dùng là: V = 0,1 ml.
mKOH = 0,1 𝑥 0,01 𝑥 56 = 0,056 (g).
Chỉ số acid là số miligam KOH cần để trung hòa acid
béo tự do có trong 1g chất béo.
Chỉ số acid của lipid là: A =

0,056 𝑥 1000
0,3

≈ 187

III. ĐỊNH LƯỢNG THEO PHƯƠNG PHÁP SOXLET
1. Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị mẫu để chiết rút mẫu:
+ Cân 1 g lạc khô cho vào cối sứ, nghiền nhỏ, chuyển qua bao giấy, gấp miệng bao quanh
cho lạc khỏi rơi vãi.
+ Sấy lại bao đựng mẫu ở nhiệt độ 105oC trong 30 phút. Lấy ra để nguội trong bình hút
ẩm, cân lại bao có chứa mẫu, xác định khối lượng bao mẫu.
Chuẩn bị mẫu trên máy Soxlet:
+ Đặt bình đun trên nồi cách thủy, lắp bình chiết khớp với miệng của bình đun, đặt bao
đựng mẫu vào đáy bình chiết, lắp ống sinh hàn khớp với miệng của bình chiết, đặt phễu
thủy tinh lên miệng ống sinh hàn, lắp các ống cao su theo nguyên tắc bình thơng nhau.
+ Mở máy nước để nước chảy vào hệ thống sinh hàn. Đổ dung môi hữu cơ (ether) qua
phễu thủy tinh, sao cho lượng dung môi đủ ngập phễu và chiếm khoảng 2/3 dung tích bình
đun.
Chiết rút mỡ trên máy Soxlet:
+ Bật bếp cách thủy ở 45 – 50 oC, khi dung môi bắt đầu sôi mở kẹp ống cao su cho nước
lạnh chạy vào hệ thống sinh hàn làm ngưng đọng hơi dung môi thành giọt xuống bình
chiết chứa mẫu.
+ Cẩn thận điểu chỉnh kẹp cao su cho nước từ từ chảy ra ngoài.

10

Email:


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

+ Thời gian chiết khoảng 1,5 – 2 giờ, sau đó tháo bình chiết ra, hứng vài giọt ether trên
lam kính, hơ kính nếu lam kính trong suốt thì chứng tỏ mỡ trong ngun liệu đã được
chiết hết.
+ Tắt bếp cách thủy, khóa máy nước, tháo ống sinh hàn, dùng đũa thủy tinh gắp gói mẫu
ra khỏi bình chiết.
+ Đặt trên đĩa petri, để nơi thống gió để dung mơi bay hết. Sấy khơ gói mẫu ở nhiệt độ
105oC khoảng 30 phút, để nguội trong bình hút ẩm.
Cân, xác định khối lượng gói mẫu đã chiết rút lipid ở nhiệt độ khơ tuyệt đối.
2. Tính tốn kết quả
Hàm lượng lipid trong mẫu được tính theo cơng thức sau:

𝑿𝒑 =
Trong đó

(𝒂 − 𝒃) 𝒙 𝟐𝟖, 𝟎𝟓
𝒄

X: Hàm lượng lipid có trong ngun liệu ở độ khơ tuyệt đối.
a (g): Khối lượng gói mẫu ở độ khơ tuyệt đối.
b (g): Khối lượng gói mẫu đã chiết rút ở độ khô tuyệt đối.
c (g): Khối lượng mẫu đem phân tích.
Theo thực nghiệm ta được:
 Khối lượng mẫu khơ đem đi nghiền là 1 g.
 Khối lượng mẫu (bao gồm cả giấy bọc) sau khi sấy lại là 2,02 g.
 Khối lượng sau khi chiết rút lipid (bao gồm giấy bọc) là 1,50 g.
Suy ra:
Xp =

(2,02−1,50) 𝑥 28,05
1

= 14,586

Vậy hàm lượng lipid có trong 1 g lạc khơ là 14,586%.

11

Email: