Nghiên cứu khả năng truyền đặc điểm đề kháng kháng sinh của probiotic sang vi khuẩn khác trong điều kiện in vitro

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 4 * 2021

Nghiên cứu

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TRUYỀN ĐẶC ĐIỂM
ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA PROBIOTIC SANG
VI KHUẨN KHÁC TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO
Lê Văn Hoài Trân1, Vũ Thanh Thảo1, Trần Cát Đơng1

TĨM TẮT
Đặt vấn đề: Một số chủng probiotic chứa gen kháng kháng sinh trên nhiễm sắc thể, có thể tiềm ẩn
nguy cơ truyền gen này sang vi sinh vật khác, đặc biệt là vi sinh vật gây bệnh bằng phương thức chuyển
gen theo chiều ngang.
Mục tiêu: Kiểm tra khả năng truyền gen đề kháng kháng sinh từ probiotic sang Bacillus subtilis PY79 in vitro.
Đối tượng và phương pháp: MIC của vi khuẩn probiotic và B. subtilis Y79 được xác định bằng phương
pháp pha loãng kháng sinh trong thạch. ADN nhiễm sắc thể của probiotic được chiết và biến nạp vào B. subtilis
PY79 bằng hóa biến nạp. Thể biến nạp được khảo sát hình thái khuẩn lạc, nhuộm Gram, xác định MIC và kiểu
gen bằng rep-PCR.
Kết quả: Khi chuyển gen của vi khuẩn probiotic vào B. subtilis Y79 thu được 12 thể biến nạp có MIC với
chloramphenicol cao gấp 4-32 lần so với MIC của B. subtilis PY79; 10 thể biến nạp có MIC với tetracyclin cao
hơn MIC của B. subtilis PY79. Trong số 22 thể biến nạp, 4 chủng có kiểu gen tương đồng khoảng 80% với B.
subtilis PY79, khơng có chủng nào có kiểu gen tương đồng 100% với B. subtilis PY79, chứng tỏ kiểu gen của các
thể biến nạp đã thay đổi.
Kết luận: Quá trình chuyển gen đề kháng kháng sinh theo chiều ngang có thể xảy ra từ probiotic sang B.
subtilis PY79 qua biến nạp in vitro.
Từ khóa: Đề kháng kháng sinh, Bacillus, probiotic, biến nạp, chuyển gen theo chiều ngang

ABSTRACT
STUDY ON TRANSFER OF ANTIBIOTIC-RESISTANCE
CHARACTERISTIC FROM PROBIOTICS TO OTHER BACTERIAL SPECIES IN VITRO
Le Van Hoai Tran, Vu Thanh Thao, Tran Cat Dong

* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 25 - No. 4 - 2021: 77 - 83
Background: Some probiotic strains possess intrinsic antibiotic-resistance genes have potential risk of
spreading these genes to other bacterial species, especially in case of pathogenic bacteria by horizontal gene transfer.
Objectives: Investigate the possibility of transformation antibiotic-resistance genes from probiotics to
Bacillus subtilis PY79 in vitro.
Methods: Minimal inhibitory concentration (MIC) of probiotics and B. subtilis PY79 were determined.
using agar dilution method. Genomic DNA of probiotic strains was extracted and transformed to B. subtilis
PY79 via chemical transformation. Transformants were characterized colony morphology, Gram stain,
determined MIC and genotype by rep-PCR.
Results: Transfer of probiotic’s D A to B. subtilis PY79 yield 12 transformants that showed MIC value for
chloramphenicol 4 to 32 times higher than the value of B. subtilis PY79, 10 transformants had MIC value for
tetracyclin higher than B. subtilis PY79. Among 22 transformants, there were 4 strains had approximately 80%
genotype similarity to B. subtilis PY79, none of these strains showed 100% genotype similarity to B. subtilis
Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: DS. Lê Văn Hoài Trân
ĐT: 0387861271
1

B - Khoa học Dược

Email:

77


Nghiên cứu

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 4 * 2021

PY79, indicated that genotype of transformants have changed.

Conclusions: Horizontal transfer of antibiotic-resistance genes is possible from probiotic strains to B.
subtilis PY79 through in vitro transformation.
Keywords: antibiotic-resistance, Bacillus, probiotic, transformation, horizontal gene transfer
gen đề kháng kháng sinh có nguồn gốc từ ADN
ĐẶT VẤNĐỀ
nhiễm sắc thể của probiotic qua con đường biến
Probiotic và sản phẩm có chứa probiotic như
nạp hoặc tiếp hợp. Jose và cộng sự cho rằng các
men vi sinh hỗ trợ tiêu hóa hay sản phẩm lên
gen này không thể truyền theo chiều ngang cho
men từ sữa... được chứng minh có nhiều tác
các lồi khác(7), Bozdogan và cộng sự(12) khơng
động có lợi cho người sử dụng như tái cân bằng
thực hiện thành công việc chuyển gen kháng
hệ vi sinh vật đường ruột, kích thích hệ thống
macrolid trên ADN của Bacillus clausii sang
miễn dịch của cơ thể(1). Tác động có lợi của
Enterococcus faecalis JH2-2, E. faecium HM1070 và
probiotic đối với vật chủ thông qua nhiều cơ chế
B. subtilis UCN19 trên in vitro.
khác nhau như sự cạnh tranh bám dính lên
đường tiêu hóa, điều hịa miễn dịch và khả năng
tiết ra các chất kháng khuẩn kìm hãm sự phát
triển của các vi sinh vật khác(2,3). Nhóm vi khuẩn
lactic (Lactic Acid Bacteria-LAB) biểu hiện nhiều
loại protein màng ngoài với vai trị trung gianh
bám dính lên chất nhầy và tế bào biểu mô ruột(4).
Tương tác giữa vi khuẩn và tế bào biểu mơ ruột
làm tăng khả năng bám dính của chúng đồng
thời cũng tăng thải loại các vi khuẩn gây bệnh ra

khỏi đường tiêu hóa(5). Một số vi khuẩn thuộc chi
Lactobacillus trong hệ tiêu hóa người tiết
bacteriocin như lactacin B từ L. acidophilus hoặc
nisin từ L. casein có khả năng kìm hãm sự phát
triển của các vi khuẩn khác trong cùng môi
trường sống(6).

Nghiên cứu này nhằm kiểm tra rằng đặc tính
đề kháng kháng sinh từ probiotic Bacillus clausii
và Enterococcus faecalis Có khả năng truyền cho B.
subtilis PY79 thơng qua biến nạp ở điều kiện in
vitro hay khơng.

Ngồi các cơ chế nêu trên, khả năng đề
kháng kháng sinh là một lợi thế nhằm tăng khả
năng cạnh tranh của probiotic với vi khuẩn
trong đường ruột, nhất là trong trường hợp sử
dụng chung probiotic với kháng sinh trong điều
trị một số bệnh lý(7). Tuy nhiên, probiotic là sản
phẩm có thể dùng hằng ngày nên hệ tiêu hóa trở
thành nơi tích lũy gen và probiotic đề kháng
kháng sinh(8). Thông qua con đường tiếp hợp
hoặc biến nạp, các gen này có thể được truyền
cho vi khuẩn khác trong hệ vi sinh vật đường
ruột(8). Nhiều nghiên cứu in vitro và in vivo
chứng minh gen đề kháng kháng sinh từ
plasmid của probiotic có khả năng truyền cho vi
khuẩn khác thơng qua tiếp hợp(9-11). Tuy nhiên
chưa có nghiên cứu nào báo cáo về sự truyền

Hóa chất, mơi trường
TSA (HiMedia-Ấn Độ), TSB (HiMedia-Ấn
Độ), MHA (HiMedia-Ấn Độ); Ampicillin (Sigma
Aldrich), Chloramphenicol (Sigma Aldrich),
Amikacin (Sigma Aldrich), Gentamycin (Sigma
Aldrich),
Tetracyclin
(Sigma
Aldrich),
Erythromycin (Sigma Aldrich); Oxacillin (Fluka),
Levofloxacin (Fluka). Kit định danh vi khuẩn
API 20 E (bioMérieux-Pháp)

78

ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU
Vật liệu

Chủng vi sinh vật
Bacillus subtilis PY79 (Phòng thí nghiệm Vi
Sinh Cơng Nghệ Dược, Khoa Dược, ĐH Y
Dược Thành phố Hồ Chí Minh-PTN); Bacillus
clausii, Enterococcus faecalis phân lập từ chế
phẩm probiotic chứa chủng vi khuẩn tương
ứng trên thị trường.

Kit chiết ADN
Wizard ® Genomic DNA Purification Kit
(Promega).
Mồi cho PCR

MBO
REP1
(Qiagen)
CCGCCGTTGCCGCCGTTGCCGCCG-3’).

(5’-

B - Khoa học Dược


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 4 * 2021
Định danh vi khuẩn probiotic
Cấy ria hai chủng vi khuẩn probiotic trên
môi trường TSA để được khuẩn lạc đơn. Định
danh vi khuẩn E. feacalis bằng kit API 20 E kết
hợp với phản ứng lên men lactose và lên men
pyruvate. Probiotic B. clausii được định danh
bằng giải trình tự 16S rADN.
Xác định MIC của kháng sinh
MIC của probiotic và B. subtilis PY79 được
xác định theo hướng dẫn của CLSI về thử
nghiệm nhạy cảm kháng sinh cho các vi khuẩn
hiếu khí bằng phương pháp pha lỗng(13).
Các kháng sinh được chọn là đại diện cho
nhựng nhóm kháng sinh đang sử dụng trong lâm
sàng: ampicillin, oxacillin (nhóm beta lactam);
amikacin, gentamycin (nhóm aminoglycosid);
chloramphenicol (nhóm phenicol); erythromycin
(nhóm macrolid); levofloxacin (nhóm quinolon);
tetracyclin (nhóm cyclin).

Chuẩn bị môi trường
Pha stock từng loại kháng sinh với nồng độ
gấp 20 lần nồng độ cao nhất trong Bảng 1. Từ
dung dịch stock (dung dịch số 0), pha loãng theo
cấp số 2 để dược dãy 8 dung dịch (1-8) có nồng
độ kháng sinh gấp 10 lần nồng độ thử nghiệm.
Pha lỗng dung dịch 1-8 trong mơi trường MHA
với tỉ lệ 1:9 để đạt tới nồng độ thử nghiệm. Dãy
nồng độ các kháng sinh được thể hiện trong
Bảng 1.
Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn
Pha loãng trực tiếp vi khuẩn trong nước
muối sinh lí, chỉnh độ đục của huyền dịch vi
khuẩn về 0,5 McFarland (giá trị OD600 của huyền
dịch nằm trong khoảng 0,08-0,1), sau đó pha
lỗng 10 lần bằng nước muối sinh lý. Huyền
dịch sau khi pha lỗng có mật độ vi khuẩn
khoảng 107 CFU/ml(13).
Chấm khoảng 2 µl huyền dịch vi khuẩn lên
môi trường MHA chứa kháng sinh, theo dãy
nồng độ trong Bảng 1. Ủ môi trường ở 35± 2 °C.
Đọc kết quả sau 16 – 20 giờ. MIC là giá trị thấp
nhất của nồng độ kháng sinh bổ sung vào môi
trường mà tại đó vi khuẩn khơng phát triển

B - Khoa học Dược

Nghiên cứu
được. Từ các giá trị MIC, xác định kháng sinh

làm mơi trường chọn lọc cho thí nghiệm.
Bảng 1. Nồng độ các kháng sinh dùng trong thử nghiệm
STT
Tên kháng sinh
1
Ampicillin (Amp)
2
Oxacillin (Oxa)
3
Amikacin (Ami)
4
Gentamycin (Gen)
5 Chloramphenicol (Chl)
6
Erythromycin (Ery)
7
Levofloxacin (Lev)
8
Tetracyclin (Tet)

Khoảng nồng độ (µg/ml)
0,016 – 4,0
0,03 – 8
0,5 – 128
0,25 – 64
0,25 – 64
0,06 – 16
0,06 – 16
0,125 – 32

Biến nạp ADN nhiễm sắc thể của vi khuẩn
probiotic vào B. subtilis PY79 khả nạp

Chiết ADN của probiotic
Vi khuẩn probiotic được tăng sinh trong môi
trường TSB. Sau 16 giờ,thu dịch nuôi cấy và
chiết ADN bằng Wizard® Genomic DNA
Purification Kit (Promega).
Xác định nồng độ háng sinh cho môi trường
chọn lọc
Tế bào B.subtilis PY79 khả nạp được chuẩn bị
qua hai bước trong môi trường dinh dưỡng tối
thiểu(14). Trải 100 µL tế bào khả nạp lên mơi
trường MHA có bổ sung kháng sinh với nồng độ
tăng dần từ MIC của B. subtlis PY79, ủ trong 1620 giờ ở nhiệt độ 35 ± 2 °C. Chọn nồng độ kháng
sinh bổ sung mà tại nồng độ đó tế bào khả nạp
khơng mọc được.
Biến nạp
500 µl tế bào khả nạp B. subtilis PY79 được
cho vào eppendorf 1,5 ml; thêm vào 20 µg ADN
probiotic; lắc eppendorf 200 vịng/phút trong 30
phút ở 37 °C; trải 100 µl huyền dịch vi khuẩn lên
mơi trường MHA có chứa nồng độ kháng sinh
đã được xác trước đó.
Kiểm tra kiểu hình, tính nhạy cảm kháng sinh
và kiểu gen của thể biến nạp

Kiểm tra kiểu hình
Cấy ria các thể biến nạp lên mơi trường
TSA, sau 24 giờ quan sát hình dạng, kích thước,

màu sắc của khuẩn lạc. Nhuộm Gram và quan
sát thể biến nạp qua kính hiển vi với độ phóng

79


Nghiên cứu

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 4 * 2021

đại 1000X, chụp lại mẫu bằng phần mềm
ToupView 2.0. Ghi nhận các đặc điểm về; kích
thước, cách sắp xếp của tế bào vi khuẩn trên
mẫu nhuộm Gram.

Tính nhạy cảm kháng sinh
Thể biến nạp được xác định MIC. So sánh
khả năng đề kháng kháng sinh của thể biến
nạp với chủng probiotic và B. subtilis PY79.

KẾT QUẢ
Định danh vi khuẩn probiotic
Dựa vào kết quả phản ứng sinh hóa theo kit
API 20 E, phản ứng lên men lactose dương tính,
phản ứng lên men pyruvate dương tính, xác
định probiotic là E. faecalis(16).
Kết quả giải trình tự 16S rADN cho kết quả
probiotic là B. clausii.

Kiểm tra sự thay đổi của kiểu gen

Xác định MIC của kháng sinh

ADN của thể biến nạp, B. subtilis PY79
được chiết bằng Wizard® Genomic DNA
Purification Kit (Promega). Thực hiện phản
ứng rep-PCR (50 µl) với mồi MBO REP1 (5’CCGCCGTTGCCGCCGTTGCCGCCG-3’)(15).
Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR như
sau: biến tính ADN ở 94 °C trong 5 phút,
thực hiện 32 chu kỳ với 94 °C trong 1 phút,
52 °C trong 1 phút, 72 °C trong 4 phút, kết
thúc 72 °C trong 5 phút. Điện di sản phẩm
rep-PCR trên gel polyacrylamide 5%. So sánh
các kết quả điện di bằng phần mềm
Bionumeric V3.00.

MIC và biện giải của các vi khuẩn thử
nghiệm được thể hiện trong Bảng 2.
Giá trị biện giải cho chi Bacillus được lấy từ
tài liệu CLSI M45-A, 2006(17) và giá trị biện giải
cho chi Enterococcus lấy từ CLSI M100-S23,
2013(18).
Kháng sinh được chọn bổ sung vào môi
trường chọn lọc phải thỏa tiêu chí (1) B. subtilis
PY79 nhạy cảm và (2) probiotic đề kháng với
kháng sinh được chọn. Từ Bảng 2, oxacillin,
chloramphenicol và erythromycin được dùng
chọn lọc thể biến nạp từ thí nghiệm chuyển gen
B. clausii; amikacin, gentamycin, tetracyclin dùng
chọn lọc thể biến nạp trong chuyển gen E. faecalis.

Bảng 2. Kết quả MIC của các chủng vi khuẩn với kháng sinh thử nghiệm
Chủng vi khuẩn
B. subtilis PY79
B. clausii
E. faecalis

Amp
S
0,12
S
0,5
S,a
0,5

Oxa
S,a
0,25
R,a
8
-

Ami
S
0,5
S
0,25
R,b
64

MIC (µg/ml)
Gen
Chl
S
S
0,06
2
S
R
0,25
64
R,b
S
16
8

Ery
S
0,06
R
32
S
4

Lev
S
0,25
S
0,25
S

1

Tet
S
2
S
1
R
32

Chú thích: R: Kháng; I: Trung gian; S: Nhạy; a: Khơng có giá trị biện giải cho chi Bacillus, dựa theo giá trị biện giải
cho S. aureus; b Biện giải theo chi Bacillus; “-“ không thực hiện
trường và ủ ở nhiệt độ 35 ± 2 °C. Sau 20 giờ,
Biến nạp ADN của vi khuẩn probiotic vào tế
khơng có khuẩn lạc nào xuất hiện.
bào khả nạp

Xác định nồng độ háng sinh cho môi trường
chọn lọc
Trải 100 µl tế bào khả nạp lên mơi trường
MHA bổ sung kháng sinh đã được chọn với
nồng độ tăng dần từ MIC của B. subtilis PY79.
Sau khảo sát, nồng độ kháng sinh bổ sung vào
môi trường được thể hiện ở Bảng 3.
Tại các nồng độ kháng sinh tương ứng trong
bảng trên, khi trải 100 µl tế bảo khả nạp trên môi

80

Bảng 3. Nồng độ kháng sinh bổ sung vào môi trường

chọn lọc
Tên kháng sinh
Oxacillin

Nồng độ bổ sung (µg/ml)
1

Amikacin

25

Gentamycin

7,5

Chloramphenicol

5

Erythromycin

5

Tetracyclin

7,5

B - Khoa học Dược

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 4 * 2021
Biến nạp ADN vi khuẩn probiotic
Thí nghiệm thu được 12 thể biến nạp trên
mơi trường có chứa kháng sinh chloramphenicol
và 10 thể biến nạp trên môi trường có tetracyclin.
Trên các mơi trường có kháng sinh khác khơng
thấy xuất hiện thể biến nạp.

Nghiên cứu
Nhuộm Gram và quan sát thể biến nạp trên
kính hiển vi cho thấy tất cả chỳng u l trc
khun Gram dng, kớch thc 2,4-4ì0,8 àm,
sp xếp riêng lẻ hoặc thành chuỗi (Hình 2).
Khơng có sự khác biệt về vi thể giữa thể biến
nạp và B. subtilis PY79.

Kiểm tra các đặc điểm của thể biến nạp

Kiểm tra sự thay đổi về kiểu hình
Đối với 12 chủng C1-C12, 4 chủng C8, C10C12 cho hình thái khóm giống với B. subtilis PY79.
Trong số 10 chủng T1-T10, 7 chủng T3-T6, T8-T10
có hình thái khuẩn lạc tương tự Những thể biến
nạp cịn lại có hình thái thay đổi so với B. subtilis
PY79. Hình thái khuẩn lạc có sự khác biệt rõ rệt
giữa chủng T1, C9 khi so sánh với B. subtilis PY79
(Hình 1). Ở chủng T1, kích thước đa số khuẩn lạc
dưới 1 mm nhỏ hơn nhiều so với B. subtilis PY79.
Đối với chủng C9, kích thước khóm nhỏ hơn và
hình dạng khóm là đa giác so với khóm trịn của
B. subtilis PY79. Đặc điểm khuẩn lạc của thể biến

nạp được mơ tả trong Bảng 4.

Hình 1. Hình thái khuẩn lạc B. subttilis PY79
(PY79) và một số thể biến nạp
Bảng 4. So sánh hình thái khuẩn lạc của các thể biến
nạp với B. subtilis PY79
Chủng

Hình thái khuẩn lạc
Dẹt bằng, bìa trịn, đường kính 3-4 mm,
B. sutilis PY79
màu trắng ngà
C1, C2, C3, C4, C5, Lồi, bìa trịn, đường kính 3-4 mm màu
C6, C7
trắng ngà
Dẹt bằng, bìa đa giác, đường kính 1-3
C9
mm, màu trắng ngà
Dẹt
bằng,
bìa trịn, đường kính 3-5 mm,
C8, C10, C11, C12
màu trắng ngà
Lồi,
bìa
trịn,
đường kính 0,5-1 mm,
T1, T2, T7
màu trắng ngà.
T3, T4, T5, T6, T8, Dẹt bằng, bìa trịn, đường kính 3-5 mm,

T9, T10,
màu trắng ngà

B - Khoa học Dược

Hình 2. Hình ảnh nhuộm Gram B. subtilis PY79
(PY79) và một số thể biến nạp

Tính nhạy cảm kháng sinh
Chủng C1 – C12, T1 – T10 được kiểm tra tính
nhạy cảm với kháng sinh tương ứng là
chloramphenicol và tetracyclin (Bảng 5). Giá trị
MIC của chủng C1-C12 đối với chloramphenicol
và chủng T1-T10 đối với tetracyclin của đều cao
hơn so với B. subtilis PY79.
Với kháng sinh chloramphenicol, 12 thể biến
nạp có giá trị MIC ở mức 16 – 64 µg/ml, trong đó có
5 chủng kháng ở mức trung gian (MIC = 16 µg/ml)
và 7 chủng đề kháng (MIC ≥ 32 µg/ml). Chủng C9
có mức đề kháng ngang với probiotic B. clausii
(MIC =64 µg/ml). Đối với tetracyclin, 10 thể biến
nạp có giá trị MIC ở mức 16 - 64 µg/ml, 7 chủng
kháng ở mức trung gian (MIC = 16 µg/ml) và 3
chủng đề kháng (MIC ≥ 32 µg/ml). Trong đó
chủng T4 có mức kháng cao hơn so với
probiotic E. faecalis (MIC = 32 µg/ml).
Kiểm tra sự thay đổi về kiểu gen
Theo cây phả hệ (Hình 3) của chủng C1 –
C12, có hai kiểu gen chính thể hiện sự tương
đồng trên 65% là A (với 7 chủng: C1, C2, C3, C5,

C6, C7, C9) và B (5 chủng: C8, C10, C11,C12,
B. subtilis PY79). Kết quả này còn cho thấy có sự
tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình: thể biến
nạp có kiểu gen A cho khuẩn lạc lồi và kháng

81


Nghiên cứu

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 4 * 2021

chloramphenicol, trong khi đó thể biến nạp có
kiểu gen B cho khuẩn lạc dẹt bằng và đề kháng ở
mức trung gian với chloramphenicol.
Đối với chủng T1 – T10 (Hình 4), có sự tương
đồng cao về kiểu gen của các chủng này với
nhau, thể hiện ở phần trăm tương đồng của 2
nhóm chính C và D đều là 80%. Tuy nhiên,
không thấy được sự tương quan giữa kiểu gen
và kiểu hình của các thể biến nạp. Chủng T7 có
kiểu gen tương đồng cao với T3, T4, T6, T8 nhưng
hình thái khuẩn lạc có sự khác biệt; hay chủng T2
có kiểu gen gần nhất -tương đồng khoảng 86%với B. subtilis PY79 nhưng kích thước khuẩn lạc
lại có sự khác biệt nhiều (Bảng 4).
Xét trên hai cây phả hệ, khơng có thể
biến nạp nào có kiểu gen tương đồng 100%
với B. subtilis PY79, chứng tỏ kiểu gen của thể
biến nạp đều có sự khác biệt khi so sánh với B.
subtilis PY79 ban đầu.

Bảng 5. MIC của các thể biến nạp
Thể biến nạp
C1, C2, C3, C4, C5,
C6, C7
C8, C10, C11, C12
C9
T1, T2, T5, T6, T7,
T9, T10
T3, T8
T4

Giá trị MIC (µg/ml)
Chloramphenicol
Tetracyclin
R

-

I

16
R
64

-

-

16

-

32
R
64

32

I

R

C, T: lần lượt là ký hiệu cho các thể biến nạp thu được
trên môi trường chứa các kháng sinh tương ứng là
chloramphenicol và tetracyclin; R, I, lần lượt ký hiệu
cho “Kháng”, “Trung gian”, “-“ khơng thực hiện.

Hình 3. Cây phả hệ của thể biến nạp C1 – C12,
B. subtilis PY79 (PY79) và B. clausii (A, B là kí hiệu
các kiểu gen; Bên trái: cây phân loài; Bên phải: kết quả
điện di đã được xử lý b i phần mềm Bionumeric)

82

Hình 4. Cây phả hệ của thể biến nạp T1 – T10, B.
subtilis PY79 (PY79).(C, D là ký hiệu các kiểu gen
Bên trái: cây phân loài; Bên phải: kết quả điện di đã
được xử lý b i phần mềm Bionumeric)

BÀNLUẬN

Đa số những nghiên cứu được công bố trước
đây xem xét khả năng truyền gen kháng kháng
sinh nằm trên plasmid của probiotic qua con
đường tiếp hợp(9,10), hoặc những đoạn nhiễm sắc
thể mang gen đề kháng sang lồi khác(12,19). Khác
với các cơng bố trên, nghiên cứu này xem xét
khả năng biến nạp của tất các phân mảnh của bộ
gen nhiễm sắc thể của probiotic sang cho một vi
khuẩn khác là B. subtilis PY79. Trong điều kiện
này, q trình biến nạp xảy ra hồn toàn ngẫu
nhiên và thực tế đã thu được các thể biến nạp
trên môi trường chọn lọc.
Từ kết quả MIC và các cơng bố trước đây(19-22),
có thể dự đốn rằng ADN nhiễm sắc thể của
probiotic B. clausii và E. faecalis trong nghiên cứu
này mang gen kháng kháng sinh. Tuy nhiên với
kích thước của đoạn gen mã hóa cho
chloramphenicol acetyltransferase khoảng 2,3
kb(19) và gen kháng tetracyclin có kích thước
khoảng 2 kb 83(20,21,23), khả năng biến nạp được
vào B. subtilis PY79 là rất thấp(24,25). Do đó có thể
dự đốn nếu các gen này hiện diện ở probiotic sẽ
được chuyển vào B. subtilis PY79 qua biến nạp
cùng với đoạn gen có kích thước lớn hơn. Vì vậy,
ngồi khả năng gia tăng sự đề kháng với kháng
sinh, thể biến nạp tạo thành cịn có kiểu gen thay
đổi khi so sánh với B. subtilis PY79.
Trong nghiên cứu này không xác nhận sự
hiện diện của các gen đề kháng kháng sinh của

B - Khoa học Dược


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 4 * 2021
probiotic bằng các phương pháp sinh học phân
tử mà dựa vào sự đề kháng của probiotic đối với
kháng sinh và nhiều nghiên cứu của các tác giả
khác đã cơng bố trước đó. Vì vậy, cần xác nhận
lại gen kháng kháng sinh có trong nhiễm sắc thể
của probiotic và kiểm tra sự hiện diện của gen
này trong thể biến nạp bằng giải trình tự gen để
có thể khẳng định quá trình biến nạp đã xảy ra
trong điều kiện thử nghiệm.

KẾT LUẬN
Từ kết quả thử nghiệm tính nhạy cảm kháng
sinh và so sánh kiểu gen của thể biến nạp so với
chủng B. subtilis PY79, nghiên cứu cho thấy rằng
đặc điểm đề kháng kháng sinh của probiotic có
thể truyền sang B. subtilis PY79 bằng con đường
biến nạp trong điều kiện phịng thí nghiệm.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Văn Thanh, Trần Cát Đông (2008). Công nghệ lên men.
In: Công Nghệ Sinh Học Dược, pp.73-88. Nhà Xuất Bản Giáo dục
Việt Nam, Hà Nội.
2. Schiffrin EJ, Blum S (2002). Interactions between the microbiota
and the intestinal mucosa. Eur J Clin Nutr, 56(S3):S60-64.
3. Keersmaecker SC de, Verhoeven TL, Desair J, et al (2006). Strong
antimicrobial activity of Lactobacillus rhamnosus GG against

Salmonella typhimurium is due to accumulation of lactic acid.
FEMS Microbiol Lett, 259(1):89-96.
4. Tassell ML van, Miller MJ (2011). Lactobacillus adhesion to
mucus. Nutrients, 3(5):613-636.
5. Ouwehand AC, Salminen S, Tolkko S, et al (2002). Resected
human colonic tissue: new model for characterizing adhesion of
lactic acid bacteria. Clin Diagn Lab Immunol, 9(1):184-186.
6. Nielsen DS, Cho GS, Hanak A, et al (2010). The effect of
bacteriocin-producing Lactobacillus plantarum strains on the
intracellular pH of sessile and planktonic Listeria
monocytogenes single cells. Int J Food Microbiol, 141(S1):S53-S59.
7. Jose NM, Bunt CR, Hussain MA (2015). Implications of
antibiotic resistance in probiotics. Food Reviews International,
31(1):52-62.
8. Gueimonde M, Sánchez B, G de Los Reyes-Gavilán C, et al
(2013). Antibiotic resistance in probiotic bacteria. Frontiers in
Microbiology, 4:202-202.
9. Gevers D, Huys G, Swings J (2003). In vitro conjugal transfer of
tetracycline resistance from Lactobacillus isolates to other grampositive bacteria. FEMS Microbiol Lett, 225(1):125-130.
10. Jacobsen L, Wilcks A, Hammer K, et al (2007). Horizontal
transfer of tet(M) and erm(B) resistance plasmids from food
strains of Lactobacillus plantarum to Enterococcus faecalis JH2-2 in

B - Khoa học Dược

Nghiên cứu

11.

12.

13.

14.
15.

16.
17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.

25.

the gastrointestinal tract of gnotobiotic rats. FEMS Microbiol Ecol,
59(1):158-166.
Morelli L, Sarra PG, Bottazzi V (1988). In vivo transfer of pAM
beta 1 from Lactobacillus reuteri to Enterococcus faecalis. J Appl
Bacteriol, 65(5):371-375.

Bozdogan B, Galopin S, Leclercq R (2004). Characterization of a
new erm-related macrolide resistance gene present in probiotic
strains of Bacillus clausii. Appl Environ Microbiol, 70(1):280-284.
Clinical and Laboratory Standards Institute (2012). Methods for
dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow
aerobically. 9th ed. Approved Standard, USA.
Cutting SM, Horn V (1990). Molecular biological methods for
Bacillus. Wiley, Chichester.
Rusenova N, Parvanov P, Stanilova S (2013). Molecular typing
of Paenibacillus larvae strains isolated from Bulgarian
apiaries based on repetitive element polymerase chain
reaction (Rep-PCR). Curr Microbiol, 66(6):573-7.
Cowen S (1993). Cowan and Steel's manual for the identification of
medical bacteria. 3rd ed, pp.61-63. Cambridge University Press, USA.
Hindler JA (2016). Methods for antimicrobial dilution and disk
susceptibility testing of infrequently isolated or fastidious
bacteria: Approved guideline. 3rd ed. Clinical and Laboratory
Standards Institute, USA.
Institute CaLS (2013). Performance standards for antimicrobial
susceptibility testing. V33(1), 23rd ed. Clinical and Laboratory
Standards Institute, USA.
Galopin S, Cattoir V, Leclercq R (2009). A chromosomal
chloramphenicol acetyltransferase determinant from a probiotic
strain of Bacillus clausii. FEMS Microbiol Lett, 296(2):185-189.
Ayeni FA, Odumosu BT, Oluseyi AE, et al (2016). Identification
and prevalence of tetracycline resistance in enterococci isolated
from poultry in Ilishan, Ogun State, Nigeria. J Pharm Bioallied Sci,
8(1):69-73.
Tian Y, Yu H, Wang Z (2019). Distribution of acquired antibiotic
resistance genes among Enterococcus spp. isolated from a

hospital in Baotou, China. BMC Res Notes, 12(1):27.
Rice LB (1998). Tn916 family conjugative transposons and
dissemination of antimicrobial resistance determinants.
Antimicrob Agents Chemother, 42(8):1871-1877.
Nishimoto Y, Kobayashi N, Alam MM, et al (2005). Analysis of
the prevalence of tetracycline resistance genes in clinical isolates
of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium in a Japanese
hospital. Microb Drug Resist, 11(2):146-153.
Lorenz MG, Wackernagel W (1994). Bacterial gene transfer by
natural genetic transformation in the environment. Microbiol
Rev, 58(3):563-602.
Morrison DA, Guild WR (1972). Transformation and
deoxyribonucleic acid size: extent of degradation on entry varies
with size of donor. J Bacteriol, 112(3):1157-1168.

Ngày nhận bài báo:

15/12/2020

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

08/03/2021

gày bài báo được đăng:

20/08/2021

83