Khảo sát sự tồn tại của gen đề kháng kháng sinh trong nước thải ở 3 bệnh viện tại Tp. Hồ Chí Minh

KHẢO SÁT SỰ TỒN TẠI CỦA GEN ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH
TRONG NƢỚC THẢI Ở 3 BỆNH VIỆN TẠI TP. HỒ CHÍ MINH
Hồng Ngọc Hiếu, Phan Thị Thanh Tuyền, Lƣơng Thị Kiều Hải
Khoa Dược, Trường Đại học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh (HUTECH)

TĨM TẮT
Nước thải bệnh viện là một trong những nguồn chứa trung gian quan trọng phát tán các gen đề kháng
kháng sinh (Antibiotic resistant genes - ARGs) từ bệnh viện ra mơi trường bên ngồi. Mục tiêu của nghiên
cứu là khảo sát sự tồn tại của ARGs trong nước thải ở bệnh viện đại học Y Dược, bệnh viện Trưng
Vương và bệnh viện Columbia. Mỗi bệnh viện tiến hành lấy 12 mẫu tương ứng với 6 ngày. Các ARGs
(aadA1, aac(3)-IV, sul1, dfrA1, ere(A), qnrA, blaSHV, blaCMY, blaCTX-M-group1, blaTEM, blaVIM-2,
blaOXA-48, blaNDM-1, blaKPC-2) được kiểm tra theo hướng: cô lập trực tiếp DNA từ mẫu nước thải, sau
đó tiến hành PCR trên những DNA đã cô lập để kiểm tra sự tồn tại của ARGs. Kết quả cho thấy sự hiện
diện của các gen sul1 (100%), dfrA1 (66.6%), blaSHV (8.3%), blaCTX (50%), blaKPC (33.3%), blaVIM
(8.3%) tại bệnh viện đại học Y Dược; sul1 (100%), dfrA1 (33.3%), blaCMY (8.3%) tại bệnh viện Trưng
Vương; và sul1 (75%), dfrA1 (33.3%) tại bệnh viện Columbia. Gen đề kháng xuất hiện đối với các kháng
sinh thông dụng như Beta-lactam, Trimethoprim, Sulfonamide, và đáng lưu ý là Carbapenem.
Từ khóa: ARGs, gen đề kháng kháng sinh, kháng sinh, nước thải bệnh viện, PCR.

1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giới WHO (2014) về giám sát đề kháng kháng sinh trên toàn cầu, đề
kháng kháng sinh đang là mối đe dọa lớn đến sức khỏe cộng đồng liên quan sâu rộng đến nhiều quốc gia
và vùng lãnh thổ trên thế giới. Trong hơn 60 năm qua, việc sử dụng các loại thuốc kháng khuẩn đã trở
nên phổ biến. Tuy nhiên cách sử dụng không hợp lý đã dẫn tới sự chọn lọc và lây lan các chủng vi sinh
đề kháng. Do đó, mặc dù những nỗ lực sử dụng hợp lý kháng sinh trong điều trị lâm sàng, các loại thuốc
kháng khuẩn đã, đang và sẽ trở nên ít hiệu quả hơn hoặc thậm chí khơng cịn hiệu quả, dẫn đến tình
trạng gia tăng khẩn cấp về an ninh sức khoẻ toàn cầu (WHO 2014). Gần 50 năm sau thời kì hồng kim
của các kháng sinh, tưởng chừng đã được kiểm sốt thì cho đến nay bệnh nhiễm khuẩn lại trở thành
nguyên nhân của gần 16% ca tử vong trên toàn thế giới (số liệu của WHO 2015). Ước tính có ít nhất
25000 bệnh nhân ở châu Âu và 23000 bệnh nhân ở Hoa Kỳ tử vong mỗi năm do nhiễm khuẩn vi khuẩn
đề kháng kháng sinh (số liệu của CDC, ECDC) [12]. Một kỉ nguyên hậu kháng sinh – nơi mà các bệnh

nhiễm trùng thơng thường hoặc các vết thương nhẹ có thể gây chết người – khơng chỉ cịn là một tương
lại xa vời, thay vào đó là các viễn cảnh thực tế cho thế kỉ 21.
Việt Nam được CDDEP (The Center for Disease Dynamics, Economics & Policy) xếp vào nhóm các nước
có tỉ lệ kháng kháng sinh cao nhất thế giới [5]. Tình hình đề kháng kháng sinh ở Việt Nam cũng theo xu
hướng chung của tình hình thế giới, khi các tác nhân có kết quả đề kháng cao với các kháng sinh quan
trọng vẫn là các vi khuẩn gram âm như Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii,
Enterobacteriaceae, và vi khuẩn gram dương như MRS. Tỉ lệ đề kháng cao đối với các kháng sinh thông
dụng cũng như các kháng sinh quan trọng điều trị nhiễm khuẩn tại bệnh viện như cephalosporins thế hệ
thứ 3 và thứ 4, fluoroquinolones, erythromycin, aminoglycoside, carbapenem... [1-4], [7]
Trong vòng khoảng 2 thập kỉ trở lại đây, các nhà nghiên cứu trên thế giới đã bắt đầu mở rộng trọng tâm
nghiên cứu về đề kháng kháng sinh ở mơi trường bên ngồi thay vì chỉ tập trung vào các yếu tố lâm sàng.
Đối tượng nghiên cứu có thể là nguồn đất, hồ nước, nước thải, chất thải bệnh viện, khu dân cư, chất thải
vật nuôi… đây là các nguồn chứa quan trọng của các gen kháng thuốc cũng như là nơi quá trình đề
521


kháng có thể xảy ra. Cách tiếp cận này cho thấy một vịng lặp khi các tác nhân ơ nhiễm này được xả thải
từ các nguồn bệnh sẽ làm gia tăng chung mức độ đề kháng và lượng gen đề kháng trong tự nhiên, từ đó
lại xâm nhập lại cơ thể con người thông qua hệ vi khuẩn hội sinh hoặc vi khuẩn gây bệnh, gia tăng mức
độ lây lan và hiệu lực đề kháng của các tác nhân, đã và sẽ làm suy giảm hiệu quả của các kháng sinh [6]
Tuy nhiên, các nghiên cứu về đề kháng kháng sinh ở Việt Nam chủ yếu tiếp cận theo góc nhìn lâm sàng,
đánh giá tình hình đề kháng ở hệ vi khuẩn tại bệnh viện và bệnh nhân, chưa có nhiều nghiên cứu đánh
giá ở mức độ môi trường và cộng đồng, cũng như chưa có nghiên cứu nào đề cập đến sự liên hệ giữa vi
khuẩn đề kháng trong lâm sàng và vi khuẩn đề kháng ngồi mơi trường – mà ở đó hệ thống nước thải
bệnh viện là một trong các bể chứa trung gian quan trọng. Xuất phát từ lý do đó, đề tài “Khảo sát sự tồn
tại của gen kháng kháng sinh trong nước thải ở một số bệnh viện tại TP. Hồ Chí Minh” được thực hiện để
khảo sát mức độ tồn tại các gen kháng thuốc ở hệ thống nước thải của một số bệnh viện tại TP. HCM, từ
đó bổ sung thêm dữ liệu cho tình hình đề kháng kháng sinh cũng như gợi ý những mối liên hệ giữa vi
khuẩn đề kháng trong lâm sàng và ngồi mơi trường, góp phần hợp lý hóa việc sử dụng kháng sinh, làm
chậm lại sự phát triển vi khuẩn kháng thuốc, bảo vệ hiệu lực của các kháng sinh dự trữ.

2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Tổng số mẫu gồm 12 mẫu nước thải của bệnh viện Đại học Y Dược, 12 mẫu nước thải của Bệnh viện
Columbia và 12 mẫu nước thải của Bệnh viện Trưng Vương. Tại mỗi bệnh viện tiến hành lấy mẫu trong 6
ngày, mỗi ngày lấy 2 mẫu gồm: mẫu đầu vào (chưa xử lý) và mẫu đầu ra (đã xử lý). Các mẫu nước thải
o
được chứa trong chai nhựa sạch có dung tích 500ml và được bảo quản trong điều kiện lạnh 4 C.

2.2 Tách chiết DNA
DNA trong nước thải bệnh viện được tách chiết theo phương pháp Phenol/Chloroform tham khảo từ
nghiên cứu của Chomczynski và Sacchi (1987) [13]. Mẫu nước thải được lọc lấy cắn, đem ly giải tế bào ở
o
60 C trong 1 giờ bằng CTAB buffer, loại bỏ protein bằng Phenol:Choloroform:Isoamylalcohol tỷ lệ 25:24:1
và tủa DNA bằng Ethanol 99%.

2.3 PCR và nhân bản theo gen mục tiêu
Các gen đề kháng kháng sinh mục tiêu được nhân bản bằng phương pháp PCR dựa vào các cặp mồi
tham khảo từ các nghiên cứu được trình bày ở bảng 1. Các gen aadA1, aac(3)-IV, sul1, dfrA1, ere(A),
qnrA, blaSHV, blaCMY được tham khảo từ nghiên cứu của Momtaz (2012) [8]. Các gen blaVIM-2,
blaOXA-48, blaNDM-1, blaKPC-2 được tham khảo từ nghiên cứu của Poirel (2011) [10]. Gen blaCTX-Mgroup 1 được tham khảo từ nghiên cứu của Pitout (2004) [9] và gen blaTEM được tham khảo từ nghiên
cứu của Sharma (2010) [11]. Phản ứng PCR được thiết kế với chu trình luân nhiệt dựa trên chu trình đề
nghị của bộ kit Mytaq Mix 2X của Bioline Reagents Ltd cùng với nhiệt độ bắt mồi đã tham khảo từ tài liệu.
Sản phẩm PCR sau cùng được kiểm tra trên gel agarose 1.5% và nhuộm DNA bằng GelRed.
Bảng 1. Danh sách và trình tự của các ARGs

Kích
thƣớc
sp (bp)

Kháng sinh

Gen đề
kháng

Streptomycin

aadA1

(F) TATCCAGCTAAGCGCGAACT
(R) ATTTGCCGACTACCTTGGTC

447

Gentamycin

aac(3)-IV

(F) CTTCAGGATGGCAAGTTGGT
(R) TCATCTCGTTCTCCGCTCAT

286

Sulfonamide

sul1

(F) TTCGGCATTCTGAATCTCAC
(R) ATGATCTAACCCTCGGTCTC

822

Trimethoprim

dfrA1

(F) GGAGTGCCAAAGGTGAACAGC
(R) GAGGCGAAGTCTTGGGTAAAAAC

367

522

Trình tự gen

Nhiệt độ
bắt cặp
(°C)
58
55
47
45


Kháng sinh

Gen đề
kháng

Erythromycin

ere(A)

Quinolones

qnrA

Beta-lactams

Kích
thƣớc
sp (bp)

Trình tự gen
(F) GCCGGTGCTCATGAACTTGAG
(R) CGACTCTATTCGATCAGAGGC

419

(F) GGGTATGGATATTATTGATAAAG
(R) CTAATCCGGCAGCACTATTTA

670

blaSHV

(F) TCGCCTGTGTATTATCTCCC
(R) CGCAGATAAATCACCACAATG

768

blaCMY

(F) TGGCCAGAACTGACAGGCAAA
(R) TTTCTCCTGAACGTGGCTGGC

462

(F) GACGATGTCACTGGCTGAGC
(R) AGCCGCCGACGCTAATACA

499

blaTEM

(F) AAAATTCTTGAAGACG
(R) TTACCAATGCTTAATCA

1080

blaVIM-2

(F) GATGGTGTTTGGTCGCATA
(R) CGAATGCGCAGCACCAG

390

blaOXA-48

(F) GCGTGGTTAAGGATGAACAC

(R) CATCAAGTTCAACCCAACCG

438

blaNDM-1

(F) GGTTTGGCGATCTGGTTTTC
(R) CGGAATGGCTCATCACGATC

621

blaKPC-2

(F) CGTCTAGTTCTGCTGTCTTG
(R) CTTGTCATCCTTGTTAGGCG

798

blaCTX-Mgroup 1

Carbapenem

Nhiệt độ
bắt cặp
(°C)
52
50
47
52
55

50
52
52
52
52

3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 Bệnh Viện Đại học Y Dƣợc
Sản phẩm PCR của 12 mẫu nước thải tại bệnh viện Đại học Y Dược được kiểm tra bằng phương pháp
điện di trên gel agarose 1,5% cho băng sản phẩm rõ (dương) chứng tỏ đoạn gen đã được nhân bản đặc
hiệu. Trong 14 gen đã được tiến hành, thì có 6 gen có xuất hiện kết quả dương tính (sul1; dfrA1; blaSHV;
blaCTX; blaKPC; blaVIM) và 8 gen có kết quả tồn bộ các mẫu âm tính (aadA1; aac(3); ere(A); qnrA;
blaCMY, blaTEM; blaOXA; blaNDM). Trong đó các mẫu dương tính chiếm tỉ lệ với các gen lần lượt là:
sul1 100%, dfrA1 66.6%, blaSHV 8.3%, blaCTX 50%, blaKPC 33.3 %, blaVIM 8.3%. Các mẫu dương
tính đầu ra chiếm tỉ lệ 23,6% trên tổng tất cả các mẫu dương tính (17/72 mẫu) . Kết quả điện di các mẫu
dương tính đại diện tại hình 1, hình 2, hình 3, hình 4, hình 5, hình 6. Nghiên cứu trên 12 mẫu đối với 6
gen cho kết quả dương tính được tổng hợp tại Bảng 2.
Bảng 2: Nghiên cứu trên 12 mẫu nước thải đối với 6 gen cho kết quả dương tính tại
Bệnh viện Đại học Y Dược TP. HCM

Mẫu

A1
V

A1
R

A2
V

A2
R

A3
V

A3
R

A4
V

A4
R

A5
V

A5
R

A6
V

A6
R

Sulfonamide

sul1

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Trimethoprim

dfrA1

+

+

-

+

-

+

+

+

-

-

+

+

blaSHV

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

blaCTX-M

-

+

-

+

-

+

+

+

-

-

+

-

blaVIM-2

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

blaKPC-2

+

-

-

+

-

-

-

-

-

-

+

+

Beta-lactams
Carbapenem

Chú thích: A: bệnh viện Đại học Y Dược | 1, 2, 3, 4, 5, 6: mẫu ngày 1, 2, 3, 4, 5, 6 | V: đầu vào ; R:
đầu ra
523


Hình 1: Kết quả điện di dương tính gen sul1

Hình 2: Kết quả điện di dương tính gen dfrA1

Hình 3: Kết quả điện di dương tính gen blaKPC

Hình 4: Kết quả điện di dương tính gen blaVIM

Hình 5: Kết quả điện di dương tính gen blaCTX

Hình 6: Kết quả điện di dương tính gen blaSHV

524

3.2 Bệnh Viện Trƣng Vƣơng
Sản phẩm PCR của 12 mẫu nước thải tại bệnh viện Trưng Vương được kiểm tra bằng phương pháp điện
di trên gel agarose 1,5% cho băng sản phẩm rõ (dương) chứng tỏ đoạn gen đã được nhân bản đặc hiệu.
Trong 14 gen đã được tiến hành, thì có 3 gen có xuất hiện kết quả dương tính (sul1; dfrA1; blaCMY) và
11 gen có kết quả tồn bộ các mẫu âm tính (aadA1; aac(3); ere(A); qnrA; blaTEM; blaCTX; blaOXA;
blaNDM; blaSHV; blaKPC; blaVIM). Trong đó các mẫu dương tính chiếm tỉ lệ với các gen lần lượt là: sul1
100%, dfrA1 33.3%, blaCMY 8.3%. Các mẫu dương tính đầu ra chiếm tỉ lệ 22.2% trên tổng tất cả các
mẫu dương tính (8/36 mẫu). Kết quả điện di các kết quả dương tính đại diện tại hình7, hình 8, hình 9.
Nghiên cứu trên 12 mẫu đối với 3 gen cho kết quả dương tính được tổng hợp tại Bảng 3.
Bảng 3. Nghiên cứu trên 12 mẫu nước thải đối với 3 gen cho kết quả dương tính tại bệnh viện Trưng Vương

Mẫu

B1
V

B1
R

B2
V

B2
R

B3
V

B3

R

B4
V

B4
R

B5
V

B5
R

B6
V

B6
R

Sulfonamide

sul1

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Trimethoprim

dfrA1

-

-

-

-

+

+

-

-

-

-

+

+

Beta-lactams

blaCMY

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

Chú thích: B: bệnh viện Trưng Vương | 1, 2, 3, 4, 5, 6: mẫu ngày 1, 2, 3, 4, 5, 6 | V: đầu vào ; R:
đầu ra

Hình 7. Kết quả điện di dương tính gen sul1

Hình 8. Kết quả điện di dương tính gen dfrA1

Hình 9. Kết quả điện di dương tính gen blaCMY

525


3.4 Bệnh Viện Quốc tế Columbia
Sản phẩm PCR của 12 mẫu nước thải tại bệnh viện Quốc tế Columbia được kiểm tra bằng phương pháp
điện di trên gel agarose 1,5% cho băng sản phẩm rõ (dương) chứng tỏ đoạn gen đã được nhân bản đặc
hiệu. Trong 14 gen đã được tiến hành, thì có 2 gen có xuất hiện kết quả dương tính (sul1; dfrA1) và 12

gen có kết quả tồn bộ các mẫu âm tính (aadA1; aac(3); ere(A); qnrA; blaTEM; blaCTX; blaOXA;
blaNDM; blaSHV; blaKPC; blaVIM; blaCMY ). Trong đó các mẫu dương tính chiếm tỉ lệ với các gen lần
lượt là: sul1 75%, dfrA1 33.3%. Các mẫu dương tính đầu ra chiếm tỉ lệ 12.5% trên tổng tất cả các mẫu
dương tính (3/24 mẫu). Kết quả điện di các kết quả dương tính đại diện tại hình 10, hình 11. Nghiên cứu
trên 12 mẫu đối với 2 gen cho kết quả dương tính được tổng hợp tại Bảng 4.
Bảng 4. Nghiên Nghiên cứu trên 12 mẫu nước thải đối với 2 gen cho kết quả dương tính tại bệnh viện Quốc tế
Columbia

Mẫu

C1
V

C1
R

C2
V

C2
R

C3
V

C3
R

C4
V

C4
R

C5
V

C5
R

C6
V

C6
R

Sulfonamide

sul1

+

+

+

-

+

+

+

-

+

-

+

+

Trimethoprim

dfrA1

+

-

+

-

+

-

-

-

-

-

+

-

Chú thích: C: bệnh viện Columbia | 1, 2, 3, 4, 5, 6: mẫu ngày 1, 2, 3, 4, 5, 6 | V: đầu vào ; R: đầu ra

Hình 10: Kết quả điện di dương tính gen sul1

Hình 11: Kết quả điện di dương tính gen dfrA

4. KẾT LUẬN
Kết quả ban đầu cho thấy tỷ lệ hiện diện của các ARGs là khá cao với các nhóm kháng sinh thông dụng
như Beta-lactam, Trimethoprim, và đặc biệt là Sulfonamide với gen đề kháng sul1 hiện diện 100% mẫu
trên cả hai bệnh viện Đại học Y dược và Trưng Vương. Gen đề kháng Carbapenem (blaVIM-2 và
blaKPC-2) xuất hiện tại mẫu của bệnh viện Đại học Y dược cũng là một kết quả đáng lưu ý khi đây là
nhóm kháng sinh quan trọng, được sử dụng để điều trị nhiễm trùng vi khuẩn gram âm đa kháng tại bệnh
viện hiện nay. Kết quả bước đầu cho thấy quy trình khảo sát sự hiện diện của ARGs trong mẫu nước thải
ở các bệnh viện của nhóm nghiên cứu là phù hợp, có thể tiếp tục mở rộng nghiên cứu cho các ARGs
khác cũng như tại các bệnh viện khác.
Nhóm nghiên cứu chân thành cảm ơn sự hướng dẫn của thầy Ds. Nguyễn Minh Quân.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]

Cao Minh Nga (2013), "Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn klebsiella spp. Và e. Coli sinh ESBL
phân lập tại bệnh viện 175", Y Học TP. Hồ Chí Minh. 17 (1), pp. 280-285.

[2]

Nguyễn Phú Hương Lan (2012), "Khảo sát mức độ đề kháng kháng sinh của Acinetobacter và
Pseudomonas phân lập tại bệnh viện bệnh Nhiệt đới năm 2010", THỜI SỰ Y HỌC. 68

526


[3]

Phạm Hùng Vân (2010) "Nghiên cứu đa trung tâm về tình hình đề kháng imipenem và meropenem
của trực khuẩn gram âm dễ mọc kết quả trên 16 bệnh viện tại Việt Nam".

[4]

Bộ Y Tế (2009), Báo cáo sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện Việt Nam năm
2008-2009, Dự án Hợp tác toàn cầu về kháng kháng sinh GARP Việt Nam và Đơn vị Nghiên cứu
Lâm sàng ĐH Oxford.

[5]

Antibiotic Resistance, ngày truy cập 1106-2018.

[6]

Czekalski N. et al. (2014), "Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the
sediment of a freshwater lake", Isme j. 8 (7), pp. 1381-1390.

[7]

Kim S. H. et al. (2012), "Changing trends in antimicrobial resistance and serotypes of Streptococcus
pneumoniae isolates in Asian countries: an Asian Network for Surveillance of Resistant Pathogens
(ANSORP) study", Antimicrob Agents Chemother. 56 (3), pp. 1418-1426.

[8]

Momtaz H. et al. (2012), Molecular detection of antimicrobial resistance genes in E. Coli isolated
from slaughtered commercial chickens in Iran, Vol. 57.

[9]

Pitout J. D. D. et al. (2004), "Phenotypic and Molecular Detection of CTX-M-β-Lactamases
Produced by Escherichia coli and Klebsiella spp", Journal of Clinical Microbiology. 42 (12), pp.
5715-5721.

[10]

Poirel L. et al. (2011), "Multiplex PCR for detection of acquired carbapenemase genes", Diagn
Microbiol Infect Dis. 70 (1), pp. 119-123.

[11]

Sharma J. et al. (2010), "Detection of TEM & SHV genes in Escherichia coli & Klebsiella
pneumoniae isolates in a tertiary care hospital from India", Indian J Med Res. 132, pp. 332-336.

[12]

Carlet J. (2014), "Antibiotic resistance: Protecting antibiotics - the declaration of the world alliance
against antibiotic resistance", Indian Journal of Critical Care Medicine : Peer-reviewed, Official
Publication of Indian Society of Critical Care Medicine. 18 (10), pp. 643-645.

[13]

Chomczynski P. et al. (1987), "Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium
thiocyanate-phenol-chloroform extraction", Anal Biochem. 162 (1), pp. 156-159. doi:
110.1006/abio.1987.9999.

527