MÔN: VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT NGỌT

ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT NGỌT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

MÔN: VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM
ĐỀ TÀI:

ỨNG DỤNG VI SINH VẬT
TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT NGỌT

Giảng viên hướng dẫn : Vũ Thị Lâm An
Lớp : DH11VT
Sinh viên thực hiện :
1.

Mai Phương Anh_11156020

2.

Dư Thị Giàu_11156029

3.

Đào Thị Tâm Hạnh_11156005

4.

Võ Thị Thảo Ly_11156043

5.

Võ Hồng Phụng_11156052

6.

Lê Thị Thảo_11156115

1


ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT NGỌT

MỤC LỤC
Trang
I. Giới thiệu sơ lược về bột ngọt .......................................................................................3
1. Lịch sử của bột ngọt...................................................................................................3
2. Công thức cấu tạo của acid glutamic..........................................................................3
3. Chức năng sử dụng trong thực phẩm: chất tăng vị (umani)........................................5
II. Quy trình sản xuất bột ngọt ...........................................................................................6
1. Chuẩn bị dịch lên men...............................................................................................7
2. Giai đoạn lên men......................................................................................................7
3. Tinh sạch acid glutamic..............................................................................................7
4. Sự tạo thành bột ngọt Acid.........................................................................................8
III. Tổng quan về quá trình lên men.....................................................................................8
1. Chủng loại, nguồn gốc vi sinh vật phân lập từ tự nhiên.............................................8
2. Phương pháp đột biến tạo chủng vi khuẩn tổng hợp thừa L-AG..............................10
2.1. Cơ chế phân tử của việc tổng hợp thừa L-AG ở C. Glutamicum............11
2.2. Cải biến di truyền ..................................................................................13
3. Quá trình ni giống và nhân giống.........................................................................14
4. Lên men...................................................................................................................16

4.1. Bản chất của q trình............................................................................16
4.2. Mơi trường lên men glutamic acid.........................................................16
4.3. Điều kiện lên men glutamic acid............................................................17
4.4. Quá trình lên men...................................................................................17
5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men...........................................................18
5.1. Ảnh hưởng của pH.................................................................................18
5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ.........................................................................18
5.3. Ảnh hưởng của thực khuẩn thể...............................................................19
5.4. Ảnh hưởng của dầu phá bọt....................................................................19
IV. Một số ứng dụng khác của Corynebacterium glutamicum..........................................19
KẾT LUẬN......................................................................................................................... 21
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................................22

2


ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT NGỌT

I.

Giới thiệu sơ lược về bột ngọt
1. Lịch sử của bột ngọt

Cách đây hàng ngàn năm người Nhật Bản bắt đầu dùng rong biển làm thực phẩm, họ đã
phát hiện ra loại rong lá Laminaria japonica là một loại gia vị hảo hạng. Hoạt chất của loại
rong lá này làm cho thức ăn có hương vị đậm đà.
Năm 1980, nhà bác học Rittenhausen (Đức) xác định được cơ cấu của các protein động
vật, đặc biệt là amino acid kể cả acid glutamic.
Tuy nhiên, việc phát hiện ra hoạt chất có trong rong biển làm cho thức ăn có mùi vị ngon
là Ikeda. Ông đã khám phá ra hoạt chất trích ly từ rong biển là monosodium glutamat, đây là

muối của acid glutamic. K.Ikeda đã đặt tên cho vị của acid glutamic là umani, một vị độc đáo
mà khoa học thời đó chưa miêu tả được, nó khác với các vị cơ bản ngọt, mặn, chua và đắng.
Từ năm 1909, acid glutamic được sản xuất bằng cách thủy phân các nguồn protein có
chứa nhiều acid glutamic như đậu nành, gluten của lúa mì nhưng hiệu suất rất thấp (chỉ đạt
50g/kg đậu). Năm 1957, Kinoshita đã phát hiện vi khuẩn có khả năng tổng hợp và tiết acid
glutamic với hàm lượng khá cao. Sau đó Asai cũng đã báo cáo về tổng hợp acid glutamic của
một số chủng vi khuẩn đặc biệt.
Năm 1962, Kinoshita đã trình bày cơ chế lên men từ Corynebacterium glutamicum một
cách hồn chỉnh. Từ đó đến nay hàng loạt nhà máy lên men acid glutamic đã và đang được
xây dựng tại hơn 20 nước trên thế giới như Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan, Trung Quốc, Thái
Lan, Việt Nam. Philipines, Pháp, Mỹ, Brasil, …
Nghiên cứu về bột ngọt (Monosodium Glutamat)
Bột ngọt (mì chính) có tên khoa học Natri Glutamat (C 5H8NO4Na), là muối Natri của acid
glutamic. Chất này có vị ngọt của nước ninh xương, nước luộc gà và nấm thơm, kích thích vị
giác mạnh. Acid glutamic là amino acid chiếm tỉ lệ lớn nhất trong các amino acid tạo protein
cơ thể (15-20% trọng lượng).
2. Công thức cấu tạo :
Công thức cấu tạo của Acid Glutamic :

3


ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT NGỌT

Cơng thức cấu tạo của Natri Glutamat :

Có nhiều cách gọi tên khác nhau: MSG, monosodium glutamat, muối L-Glutamic acid
Monosodium, Monosodium L-glutamat.
Tính chất Natri Glutamat:
• Hình dạng vật lý: tinh thể rắn

• Màu: trắng pha lê
• Tan trong nước và rượu
• Nhiệt độ nóng chảy: 2320C
• Nồng độ hịa tan: 100mg chất/100ml nước
• pH: 7.0 (0,2% dung dịch)
• Tính ổn định: ổn định dưới điều kiện bình thường.

Hình 1: Tinh thể bọt ngọt
Bột ngọt dạng tự nhiên trong thực phẩm cũng như trong các tế bào tồn tại dưới hai trạng
thái: trạng thái độc lập và trạng thái liên kết với các amino acid khác trong thành phần
protein. Khi trong trạng thái độc lập, bột ngọt mới có thể phát huy tác dụng tạo hương vị đậm
đà cho món ăn. Bên cạnh bọt ngọt truyền thống, cịn có một số chất được gọi là siêu bột ngọt (
IMP và GMP). Chất này tạo vị umani cao gấp khoảng 10 lần so với bột ngọt thường. Nó được
sử dụng rộng rãi trong các sản phẩm như mì ăn liền, hạt nêm,…

4


ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT NGỌT

3. Chức năng sử dụng trong thực phẩm: chất tăng vị (umani)
Bột ngọt có sẵn trong các thực phẩm tự nhiên như thịt, cá, sữa (kể cả sữa mẹ) và có trong
thành phần các loại rau củ quả như: cà chua. Đậu hà lan, bắp, cà rốt, …
Vai trò của acid glutamic:
-

Acid glutamic rất cần cho sự sống, là loại amino acid đóng vai trị quan trọng trong q
trình trao đổi chất của người và động vật, trong việc xây dựng protein, xây dụng các
cấu trúc của tế bào.

-

Đảm nhiệm chức năng tổng hợp nên các amino acid khác như alanin. Cystein, prolin,
…

-

Tham gia vào phản ứng chuyển amin, giúp cơ thể tiêu hóa nhóm amin và tách NH 3 ra
khỏi cơ thể.

-

Được dùng làm thuốc chữa các bệnh thần kinh và tâm thần, bệnh chậm phát triển ở trẻ
em, bệnh bại liệt.

-

Làm nguyên liệu khởi đầu cho việc tổng hợp một số hóa chất quan trọng:
+ N-acetylglutamat là chất hoạt động bề mặt, vi sinh vật có thể phân giải được,
ít ăn da, được sử dụng rộng rãi trong cơng nghiệp thực phẩm, xà phịng, dầu gội đầu.
+ Acid oxopyrolidicacboxylic, một dẫn xuất khác của acid glutamic được dùng
làm chất giữ ẩm trong mỹ phẩm.
+ Acetylglutamat được dùng trong xử lý ô nhiễm nước biển do dầu hỏa và dầu
thực vật gây nên.

Hình 2 : Một số sản phẩm bột ngọt trên thị trường

5

ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT NGỌT

II.

Quy trình sản xuất bột ngọt

Hình 3 : Quy trình sản xuất bột ngọt

6


ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT NGỌT

Quy trình cơng nghệ sản xuất bột ngọt đang được sử dụng rộng rãi hiện nay là áp dụng
công nghệ vi sinh trước hết tạo ra acid glutamic, sau đó dùng NaOH ở nồng độ cao để sản
xuất ra bột ngọt.
Đầu tiên, để tạo ra acid glutamic, người ta dùng các nguyên liệu chủ yếu là dịch có đường,
hoặc rỉ đường, hoặc các nguồn nguyên liệu tinh bột đã qua giai đoạn đường hóa. Hiện nay,
nguyên liệu tinh bột được sử dụng nhiều nhất là khoai mì (cây sắn).
Quá trình lên men vi khuẩn được xúc tác nhờ hệ enzym có sẵn trong vi khuẩn, chuyển hóa
qua nhiều giai đoạn trung gian với nhiều phản ứng khác nhau tạo ra nhiều sản phẩm phụ, và
cuối cùng là sản phẩm acid glutamic.
• Quy trình cơng nghệ tạo acid glutamic gồm các giai đoạn sau:
1.

Chuẩn bị dịch lên men:

Môi trường lên men được chuẩn bị sẵn từ các nguyên liệu đường hoặc tinh bột được phối
chế và bổ sung các dưỡng chất như muối phosphate, sunfat, biotin, vitamin B, muối amoni,
sau đó được khử trùng kỹ trước khi cấy vi khuẩn lên men glutamic vào - gọi là

corynebacterium glutamicum.
2.

Giai đoạn lên men:

Các dung dịch nhân sinh khối vi khuẩn, dung dịch lên men được chuyển vào các dụng cụ,
thiết bị lên men, sau cho vi khuẩn lên men vào, cho lên men trong điều kiện thống khí, giữ ở
nhiệt độ 32 – 37oC trong thời gian 38 – 40 giờ.Trong quá trình lên men, dịch đường được
chuyển hố thành dung dịch acid glutamic. Kết thúc quá trình lên men, lượng acid glutamic
có thể đạt 50 – 60 g/lít.
Trong thời gian lên men, pH sẽ chuyển dần sang acid do sự hình thành acid glutamic do
đó người ta thường bổ sung thêm dinh dưỡng vào môi trường nguồn amoni (NH 4Cl,
(NH4)2SO4, urê) để giữ ổn định độ pH cho vi khuẩn hoạt động tốt.
Không được để điều kiện lên men là yếm khí vì sản phẩm tạo ra sẽ là acid lactic. Để tạo
thống khí, trong các thiết bị lên men bố trí bộ phận khuấy trộn dịch với tốc độ V = 450
vịng/phút.
3.

Tinh sạch acid glutamic:

Kết thúc q trình lên men, acid glutamic được tạo thành cùng với một số tạp chất khác,
do đó cần phải tinh chế các tạp chất này ra khỏi dung dịch chứa acid glutamic. Phương pháp
thường dùng là nhựa trao đổi rezin. Nhựa trao đổi rezin có hai loại: rezin dương tính (mang
tính acid) và rezin âm tính (mang tính kiềm).
7


ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT NGỌT

Dịch lên men có chứa acid glutamic và tạp chất được cho chảy qua cột nhựa (có chứa

rezin – là chất được sử dụng làm tinh sạch acid glutamic).từ dưới lên với tốc độ 150 – 180 lít/
phút, thời gian chảy qua cột là 150 – 180 phút. Song song, người ta cho dòng nước chảy qua
cột cùng chiều với dung dịch lên men để rửa các vi khuẩn bám vào bề mặt rezin. Giữ nhiệt độ
trong cột trao đổi ion là 60 – 65oC. Sau khi kết thúc quá trình trao đổi ion, dùng NaOH 4 – 5%
để tách acid glutamic ra khỏi cột (tốc độ chảy NaOH là 5 – 6m/ giờ, lưu lượng 100lít/ phút).
Để khử màu, người ta sử dụng than hoạt tính. Sau đó, bằng cách điều chỉnh độ pH và nhiệt
độ phù hợp, người ta sẽ thu được tinh thể acid glutamic với lượng 77 – 88%, hoặc cao hơn.
4.

Sự tạo thành bột ngọt Acid:

Đến đây, người ta đã có acid glutamic.Từ acid glutamic, người ta tạo ra bột ngọt bằng
cách dùng NaOH 40 – 50% để trung hòa dung dịch acid glutamic đến pH = 6,8. Sau đó đem
lọc, cơ đặc, và kết tinh bằng phương pháp sấy chân không ở nhiệt độ thấp.
Sau khi sấy, bột ngọt đóng thành từng tảng, hạt tinh thể không đồng nhất nên yêu cầu phải
nghiền.
 Người ta sử dụng hệ thống nghiền bằng bi thép không rỉ để nghiền các tảng tinh thể
này thành bột.
 Sau đó, dùng rây làm bằng lụa hoặc sợi hóa học để rây, lọc thành các hạt có kích thước
đồng nhất. Yêu cầu chất lượng là sản phẩm phải là tinh thể màu trắng, có kích thước >
1mm, đồng đều, độ tinh khiết 80 – 99%, độ ẩm <1%.
 Do bột ngọt có tính chất dễ hút ẩm, dễ chảy rữa nên cần bao gói cẩn thận, tránh tiếp
xúc với khơng khí và hơi nước. Người ta tiến hành đóng gói bằng các loại bao bì như
chai thủy tinh, hộp sắt tráng thiếc, giấy không thấm, polyethylen với khối lượng 1kg,
0,5kg, 200g, 100g.

III.

Tổng quan về quá trình len men
1. Chủng loại, nguồn gốc vi sinh vật phân lập từ tự nhiên

Tham gia vào quá trình lên men sản xuất acid glutamic, chủng vi sinh thường sử dụng là:

Corynebacterium glutanicum, Brevibacterium lactofermentus, Micrococus glutamicus; nhưng
chủ yếu nhất vẫn là chủng Corynebacterium glutamicum (loại vi khuẩn này đã được nhà vi
sinh vật Nhật Bản Kinosita phát hiện từ 1956, có khả năng lên men từ tinh bột, ngơ, khoai,
khoai mì để tạo ra acid glutamic).

8


ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT NGỌT

Hình 4: Conrynebacterium glutamicum
Chủng vi khuẩn sử dụng: Corynebacterium glutamicum
Phân loại khoa học:
Giới: Bacteria
Ngành: Actinobacteria
Bộ: Actinomycetales
Họ: Corynebacteryaceae
Chi: Conrynebacterium
Loài: Conrynebacterium glutamicum
Giống vi khuẩn thuần khiết này được lấy từ ống thạch nghiêng tại các cơ sở giữ giống, sau
đó được cấy truyền, nhân sinh khối trong môi trường lỏng (như đã nói ở phần trên). Khối
lượng sinh khối đuợc nhân lên đến yêu cầu phù hợp cho quy trình sản xuất đại trà. Trước khi
nhân, cấy, môi trường lỏng phải được thanh trùng bằng phương pháp Pasteur.
Chủng vi khuẩn giống phải có khả năng tạo ra nhiều acid glutamic, tốc độ sinh trưởng
phát triển nhanh, có tính ổn định cao trong thời gian dài, chịu được nồng độ acid cao, môi
trường nuôi cấy đơn giản, dễ áp dụng trong thực tế sản xuất. (PGS.TS Trần Minh Tâm)
 Đặc điểm, hình thái sinh lý

Hình 5: Conrynebacterium glutamicum
9


ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT NGỌT

Đặc điểm chủng Conrynebacterium Glutamicum:
• Trực khuẩn thẳng hoặc cong
• Gram dương
• Kích thước tế bào 0,6-1,2 micromet
• Khơng có bào tử
• Khơng có tiêm mao nên bất động
• Có khả năng oxi hóa acid glutamic ra ketoglutarat thấp nhất
• Hoạt tính gluco hydrogenase cao
• Vi khuẩn phát triển trên môi trường cần biotin
Hiện nay, Corynebacterium glutamicum đang được sử dụng phổ biến trong công nghiệp,
hầu hết đều là chủng đột biến. Các chủng này có khả năng tạo từ 40-50g/l glutamic acid trong
dung dịch lên men. Trong điều kiện phịng thí nghiệm có thể thu được 100g/l glutamic acid
trong dung dịch.
2. Phương pháp đột biến tạo chủng vi khuẩn tổng hợp thừa L-AG
Trong điều kiện sống bình thường, lượng amino acid do vi sinh vật tổng hợp thường vừa
đủ để đáp ứng nhu cầu sinh lý của bản thân vi sinh vật. đó là tính chất tự điều hịa và cân đối
của vi sinh vật. chính vì vậy cần sử dụng các phương pháp chọn lọc và tác động tới cơ chế di
truyền của vi sinh vật để chúng tổng hợp lượng amino acid dư thừa so với nhu cầu và bài tiết
amino acid đó ra ngồi mơi trường.
Sau khi tìm ra một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp acid glutamic cao,
người ta nghiên cứu các điều kiện cần thiết để nuôi cấy chủng đó để cho hiệu suất thu hồi acid
glutamic cao nhất. Conrynebacterium glutamicum không tổng hợp thừa L-AG dưới điều kiện
ni cấy thơng thường mà cần có 1 trong số các điều kiện sau đây:
• Hạn chế biotin.

• Bổ sung chất hoạt động bề mặt.
• Bổ sung kháng sinh dịng β-lactam.
Các nhà khoa học đã nghiên cứu cơ chế phân tử về ảnh hưởng của những tác nhân này
với việc tổng hợp thừa L-AG. Những kết quả nghiên cứu cho thấy các tác nhân này đã thay
đổi 2 yếu tố ở C. glutamicum dẫn đến việc tổng hợp thừa L-AG và L-AG đượ tiết ra ngồi
mơi trường : thay đổi chuỗi phản ứng tổng hợp L-AG và thay đổi tính thấm của màng tế bào.

10


ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT NGỌT

2.1.
Cơ chế phân tử của việc tổng hợp thừa L-AG ở C. glutamicum
a) Thay đổi chuỗi phản ứng tổng hợp L-AG: Tác nhân hạn chế biotin và bổ sung
chất hoạt độ bề mặt.

Hình 6: Chu trình Krebs sinh tổng hợp L-AG
Tại một nhánh của chu trình TCA, 2 enzym là ODHC và GDH cạnh tranh cơ chất 2oxoglutarate, một nhánh tạo thành L-AG và một nhánh tạo thành Succinyl – CoA. Trong đó:
ODHC: 2-oxoglutarate dehyrogenaza
GDH: Glutamate dehyrogenaza
Dưới điều kiện hạn chế biotin trong mơi trường ni cấy, hoạt tính của ODHC giảm,
trong khi đó hoạt tính GDH khơng thay đổi, dẫn đền việc tổng hợp thừa L-AG.
Tương tự, khi bổ sung chất hoạt động bề mặt Tween 40 ngay cả khi có mặt biotin thì
hoạt tính của ODHC cũng giảm trong khi hoạt tính GDH khơng thay đổi.
Như vậy, bằng cách hạn chế biotin hoặc bổ sung chất hoạt động bề mặt (Tween 40), hoạt
tính của ODHC bị giảm bớt trong khi hoạt tính GDH khơng thay đổi, từ 2-oxoglutarate sẽ
thiên về tạo thành L-AG hơn đi theo nhánh tạo Succinyl – CoA.
Hiện nay, cơ chế của việc hạn chế biotin và thêm chất hoạt động bề mặt đến việc giảm
hoạt tính của ODHC vẫn đang được tiếp tục làm rõ.

b)

Thay đổi cấu trúc của màng tế bào: Tác nhân hạn chế biotin và bổ sung chất

hoạt động bề mặt hoặc kháng sinh.
11


ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT NGỌT

Ngay cả khi L-AG đã được tổng hợp thừa trong nội bào, nếu L-AG khơng được bài tiết
ra ngồi mơi trường thì cũng khơng đạt được hiệu quả mong muốn. Để L-AG được bài tiết ra
ngoại bào, cần có sự thay đổi tính thấm của màng tế bào.
Ba tác nhân trên có tác dụng làm thay đổi cấu trúc của màng tế bào, giúp bài tiết L-AG
ra ngoại bào theo hình sau:

Hình 7: Cơ chế tác động tới màng tế bào vi khuẩn của các tác nhân
-

Protein DtsR1 có cấu trúc giống với tiểu phần β của acetyl – coA cacboxylaza.

Vì biotin là cofacter của acetyl – coA cacboxylaza nên việc hạn chế biotin cũng như bổ sung
chất hoạt động bề mặt có thể ảnh hưởng đến phức hợp biotin – enzyme có chứa DtsR1. Phức
hợp này tham gia vào quá trình tổng hợp thành phần acid béo của màng tế bào, do vậy việc
hạn chế chế biotin cũng như bổ sung chất hoạt động bề mặt có thể ảnh hưởng đến việc tổng
hợp lipid màng và làm thay đổi sức căng của màng tế bào.
-

Penicillin ức chế việc tổng hợp thành tế bào bằng cách bám vào các protein gắn

penicillin ( penicillin binding protein – PBP). Các protein này tham gia vào nhiều giai đoạn
trong quá trình tổng hợp peptidoglican của thành tế bào vi khuẩn.

12


ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT NGỌT

-

Bằng cách thay đổi cấu trúc, sức căng và tính thấm của thành và màng tế bào vi

khuẩn, các tác nhân này làm thay đổi cấu trúc GluE là protein vận chuyển L-AG ra ngoại bào
– một kênh tương đồng nhạy cảm cơ học (Mechanozasitive channel – Msc – homolog). Nhờ
đó, L-AG được vận chuyển ra ngồi tế bào. Protein này được mã hoá bởi gene NCgl1221.
2.2.

Cải biến di truyền

Trong điều kiện sản xuất thực tế, việc phải bổ sung các tác nhân để vi sinh vật tổng hợp
thừa L-AG có một số nhược điểm sau:
-

Tăng chi phí sản xuất.

-

Phải tiến hành tinh chế và loại bỏ tác nhân khỏi thành phẩm.

-

Việc hạn chế biotin mâu thuẫn với việc vi khuẩn C. glutamicum cần có biotin cho
nhu cầu tăng trưởng, ngồi ra ngun liệu mật mía đường dùng để sản xuất L-AG
có chứa một lượng đáng kể biotin.

Các nhà khoa học đã tiến hành cải biến gene của C. Glutamicum để chủng vi sinh vật
này tổng hợp thừa L-AG ngay dưới những điều kiện sản xuất thông thường mà không cần bổ
sung tác nhân.
a. Thay đổi chuỗi phản ứng tổng hợp L-AG bằng cách giảm hoạt tính ODHC

•

Điều kiện này được thực hiện bằng cách loại bỏ gene OdhA. Chủngvi khuẩn

thiếu gene OdhA khơng có hoạt tính ODHC và sẽ tổng hợp thừa L-AG ngay dưới những
điều kiện bình thường, không cần hạn chế biotin hoặc bổ sung hoạt tính bề mặt.
•
Phương pháp tạo chủng vi khuẩn khuyết gene OdhA:
o Nhân đoạn gene chứa OdhA bằng PCR
o Sử dụng enzym giới hạn cắt bỏ đoạn gene OdhA
o Phần gene còn lại được gắn vào plasmid bằng ligaza
o Đưa plasmid vào vi khuẩn
b. Điều chỉnh khả năng bán thấm của màng tế bào

Điều chỉnh khả năng bán thấm của màng tế bào bằng cách cải biến gene NCgl1221 mã
hóa protein màng GluE.
Khuếch đại gene bằng PCR, qua đó gia tăng sự bài tiết L-AG.tuy nhiên, với cách cải
biến này vẫn còn những tác nhân hạn chế biotin, bổ sung chất hoạt động bề mặt hoặc
penicillin để kích thích bài tiết L-AG.
Đột biến gene quá trình bài tiết L-AG diễn ra mà không cần bổ sung các tác nhân. Tạo

thể đột biến bằng cách nhân dịng đoạn gene NCgl1221, sau đó cắt đoạn gene bằng một số
loại enzyme giới hạn khác nhau và gắn vào plasmid. Tiến hành chọn lọc những chủng dột
biến có khả năng bài tiết L-AG mà khơng cần có tác nhân.
13


ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT NGỌT

Tại Việt Nam đang sử dụng chủng vi khuẩn Khuyết gene OdhA và Đột biến gene GluE.
3. Quá trình nuôi giống và nhân giống:
Người ta sử dụng ống giống thạch nghiêng để giữ cho giống khơng bị thối hố và biến
dạng, khả năng sinh tổng hợp acid glutamic với mức độ khơng đổi, thuần hố, huấn lun và
lựa chọn giống tốt. Thường giống được bảo quản ở 5 - 7oC, khi cấy chuyền để chúng sinh sản
tốt ta phải qua giai đoạn hoạt hoá giống bằng cách để ống nghiệm trong tủ ấm ở nhiệt độ 30 32oC trong thời gian 30 phút đến 1 giờ.
Môi trường thạch nghiêng:
Pepton 1%
Cao thịt bò 1%
NaCl tinh chế 0,5%
Thạch 2%
Ta chuẩn bị mơi trường xong thì lấy ống giống đã hoạt hố cấy chuyển sang, giữ các ống
này ở nhiệt độ 32oC trong 24 giờ, ta được giống đời 2, từ đời 2 – cấy sang đời 3…
 Nhân giống cấp 1
-

Môi trường :
Glucoza tinh khiết 2,5%
Rỉ đường 0,25%
Nước chấm 0,3%
MgSO4 (đá pha 10%) 0,04%
(Mn2+, Fe2+)SO4 2g/lít

Urea 0,5%
B1 pha 150g/lít 1,5ml/1lít
pH 6,7.

-

Điều kiện nhân giống :
Bình tam giác 1 lít
Chứa 250 ml môi trường
Nuôi trên máy lắc tốc độ 90 - 96 vịng/phút
Thời gian ni cấy 16 - 18 giờ
Nhiệt độ ni cấy 30 - 32oC.

-

Chỉ tiêu giống cấp 1:
pH 6,5
14


ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT NGỌT

OD 0,64 - 0,74
Đường còn lại 0,12 - 0,28%
Trạng thái giống: Béo, khoẻ, đều sắp xếp chữ V.
 Nhân giống cấp 2
-

Môi trường :
Glucoza tinh khiết 3,5%

MgSO4 0,04%
H3PO4 + KOH 0,1%
Nước chấm 0,5%
Rỉ đường 1%
Urea 0,8%
Dầu lạc 0,1%
B1 0,03g/100ml
pH 6,5 - 6,7

-

Điều kiện nhân giống:
Nồi lên men V= 50 lít đựng 35 lít
Thanh trùng thiết bị 130o/30 phút
Thanh trùng môi trường 120o/20 phút
Lượng cấy giống 2%
Nhiệt độ nuôi cấy 30 - 32oC
Thơng khí: 1 phút đưa 0,5 lít khơng khí vào 1 lít mơi trường
Khuấy trộn đều 340 vịng/phút
Thời gian nhân giống 8 - 9 giờ

15


ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT NGỌT

-

Chỉ tiêu giống cấp 2
pH 7,1 - 7,2

OD 0,6 - 0,7
Đường còn lại 2%
Trạng thái giống: Béo, khoẻ.
4. Lên men
4.1.

Bản chất của quá trình

Acid glutamic sản xuất bằng phương pháp lên men vi khuẩn, với nguyên liệu là đường.
Quá trình này được xúc tác nhờ enzyme có sẵn trong vi khuẩn, chuyển hóa qua nhiều giai
đoạn trung gian với nhiều phản ứng khác nhau tạo ra nhiều sản phẩm phụ và cuối cùng là sản
phẩm acid glutamic.
Thực chất của q trình này là đường được chuyển hóa ( q trình đường phân theo
Enbden – Meyerhoff), rồi sau đó thơng qua chu trình Krebs của q trình hơ hấp hiếu khí của
vi khuẩn, sản phẩm acid glutamic được hình thành. Sự hình thành acid glutamic phụ thuộc
vào sự tích tụ acid acetoglutaric trong tế bào vi khuẩn và sự có mặt của NH 3 và enzyme xúc
tác là glutamate dehydrogenaza.
4.2.

Môi trường lên men glutamic acid:

Nguồn cacbon: Nguyên liệu hiện đang được sử dụng nhiều nhất là mật rỉ đường mía hoặc
củ cải đường và tinh bột khoai mì được xử lí để tạo thành dung dịch glucose nhờ amylase.
Nguồn nitrogen: Mỗi VSV đòi hỏi một tỉ lệ nhất định giữa cacbon và nitrogen, thông
thường tỉ lệ C/N khoảng 100/15 đối với nhu cầu của vi khuẩn lên men glutamic acid. Trong
lên men glutamic acid, nitrogen có thể được cung cấp từ nguyên liệu vô cơ và hữu cơ, gồm
ammonium sulphate, ammonium chloride, ammonium phosphate, khí ammonia.
Nguồn dinh dưỡng khống được bổ sung vào môi trường dưới dạng muối sulphate hoặc
phosphate để đảm bảo các nhu cầu về P, K, S cũng như các nguyên tố khoáng đại lượng và vi
lượng khác cần cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật (thường đã có trong mật rỉ

đường).
Vitamin: Biotin đóng vai trị quan trọng nhất trong lên men glutamic acid. Biotin khơng
chỉ là chất kích thích sinh trưởng mà còn quyết định thành phần và số lượng các sản phẩm lên
men.
4.3.

Điều kiện lên men glutamic acid
16


ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT NGỌT

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men glutamic acid, nhưng 3 yếu tố (pH,
chế độ thơng khí, nhiệt độ) là quan trọng nhất và cần kiểm sốt suốt q trình lên men để thu
được glutamic acid như mong muốn.
− pH mơi trường thích hợp là vào khoảng 7 – 8
− Chế độ thơng khí theo lí thuyết:
1 mol Glucose + 2.33 mol O2 > 0.82 mol Glutamic acid + 1.94 mol CO2
− Nhiệt độ tối ưu cho lên men glutamic acid là khoảng 30-35oC
_ Các dụng cụ, thiết bị, hệ thống ông dẫn phải đảm bảo u cầu vơ khuẩn.
4.4.

Q trình lên men

Đây là khâu quyết định dối với toàn bộ dây chuyên sản xuất
-

Mục đích: Thơng qua hoạt động sống của vsv trong điều kiện thích hợp để

chuyển đường glucoza và một số các hợp chất vô cơ và hữu cơ thành acid glutamic

- Yêu cầu : Hệ số chuyển hoá càng cao càng tốt tức là cùng tiêu hao một lượng
đường nhất định trong một đơn vị thể tích nhất định lượng acid glutamic tạo thành
càng nhiều càng tốt, thời gian lên men càng ngắn càng tốt.
- Nguyên liệu cho lên men gồm: Đường glucoza, MgSO 4, KCl( KOH), H3PO4,
nước chấm, rỉ đường , urea, dầu lạc, Na 2CO3 (NaOH) tất cả đều phải qua khâu thanh
trùng  làm nguội tới 32oC
- Tiến hành lên men: Trong thiết bị lên men phải có đầy đủ các chất cho q trình
len men và hiếu khí mơi trường
Q trình lên men là q trình vi khuẩn sinh sản phát triển sử dụng đường, đạm, vơ cơ và
muối khống để sinh khối và tạo ra acid glutamic khuếch tán vào mơi trường
 Q trình lên men có thể chia thành 3 giai đoạn:
Giai đoạn đầu: 8 - 12 giờ chủ yếu là sinh khối, làm cho vi khuẩn lớn lên, đạt kích
thước cực đại và bắt đầu sinh sản, phân chia.
Những biểu hiện của giai đoạn này:
•
•
•
•

Càng về cuối giai đoạn tốc độ tăng nhiệt càng nhanh
pH tăng dần từ 6,5 – 6,7 lên 7,5 – 8
Bọt tạo thành tăng dần
Lượng đường tạo thành tăng dần, thường 2 – 3 giờ đầu hao rất ít, càng về sau tốc độ

hao càng nhanh
• Lượng tế bào vi khuẩn tăng dần từ khoảng 0,13 – 0,14 đến 1 (số đo OD trên máy so
màu)
• Hàm lượng acid glutamic chưa có hoặc rất ít
17

ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT NGỌT

Giai đoạn giữa: từ 12 đến 24 giờ tiếp theo. Tạo acid glutamic mạnh. Giai đoạn này giữ
cho tế bào khơng tăng thêm nữa hoặc tăng rất ít, đường hao nhanh. Lượng acid glutamic tạo
thành lại hòa tan vào môi trường làm cho pH môi trường giảm dần, CO 2 bay ra nhiều, bọt
tăng ào ạt.  cần khử bọt, dùng một lượng dầu thích hợp để phá bọt ( dầu lạc thơ hay
polyglycol).
Giai đoạn cuối: Những giờ cịn lại tất cả biểu hiện đều giảm dần cho đến khi hàm
lượng đường chỉ cịn <= 1% thì lên men kết thúc.
Q trình lên men phải ln giữ ở 30 - 32 oC. P=1kg/cm2, lượng gió 37m3/giờ, cánh khuấy
180 vịng/phút.
Tổng thời gian len men 32 - 40 giờ
Yêu cầu sau lên men
-

Đường còn lại 1%

-

Acid glutamid 3 - 4,2%

-

Con men: 2%
5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

5.1.
Ảnh hưởng của pH:
pH tối ưu là trung tính hoặc hơi kiềm, tốt nhất là từ 6-8. Khi dùng môi trường saccharide

người ta phải chỉnh pH suốt quá trình lên men vì mơi trường ln có xu hướng trở nên acid
do sự tạo thành L- acid glutamic(L-AG) và các acid hữu cơ khác.
5.2.
Ảnh hưởng của nhiệt độ
Đa số vi khuẩn sinh L-AG sinh trưởng và tạo ra L-AG tốt ở 30-35oC, số ít ở 35-37oC, cá
biệt ở 41-43oC. Khi tiến hành q trình ni dưỡng chính ở 37oC và ni dưỡng phụ ở 30oC
thì hiệu suất chuyển hóa là 15% và kéo theo sự chuyển hóa của acid lactic, ảnh hưởng đến
lượng L-AG tạo ra. Khi q trình ni dưỡng chính phụ cùng nhiệt độ thì hiệu suất chuyển
hóa glucose thành L-AG là 45%.
5.3.

Ảnh hưởng của thực khuẩn thể

Thực khuẩn thể là yếu tố gây hại đối với các vi khẩn. Hầu hết các thực khuẩn thể phân lập
rất nhạy cảm với các tác nhân vật lí , hóa học, dễ bị bất hoạt ở 75 oC trong vòng 5-10 phút. Và
khi bền ở pH từ 6-9, sống hàng tháng với độ ẩm 10% và chết nhanh chóng với độ ẩm 90%
(tức trùng điều kiện sinh trưởng của vi khuẩn lên men)
5.4.

Ảnh hưởng của dầu phá bọt
18


ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT NGỌT

Do khuấy trộn, sụt khí và lên men tạo nhiều CO 2 nên bọt tạo nhiều, chúng làm giảm trao
đổi chất trong quá trình lên men và làm giảm hiệu suất sử dụng thiết bị. Do đó, phá bọt có tác
dụng tốt cho q trình lên men. Song, có nhiều dầu quá cũng gây nên những ảnh hưởng có
hại, dầu bám trên bề mặt tế bào ngăn cản quá trình trao đổi chất.

IV.

Một số ứng dụng khác của Corynebacterium glutamicum
Vì sự hữu ích của Corynebacterium, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để cố gắng sửa

đổi nó một cách nào đó để làm cho nó hữu ích hơn cho con người.
• Một lĩnh vực nghiên cứu C. glutamicum là cách để tăng sản xuất của acid L-glutamic,
được sản xuất hàng năm ở mức khoảng 1,5 triệu tấn. Một cách là để loại bỏ CO 2 , mà sẽ làm
tăng sản xuất acid L-glutamic. Để làm như vậy, phosphoketolase đã được sử dụng thay cho sự
tổng hợp CO2 như thông thường. Sản lượng của acid L-glutamic được tăng 9% tính theo trọng
lượng và năng suất tăng 10. Kỹ thuật này có thể được tiếp tục phát triển, cũng như chuyển
giao để tăng sản lượng khác C. glutamicum sản phẩm, chẳng hạn như amino acid khác.
• Trong một nghiên cứu có liên quan, một nhóm khác đã cố gắng để tăng sản lượng Lserine trong C. glutamicum . Khoảng 300 tấn serine được sản xuất hàng năm, có rất nhiều
quan tâm trong nghiên cứu sản xuất. Một trong những quá trình nội bào ức chế sự sản xuất Lserin liên quan đến một enzyme gọi là serine hydroxymethyltransferase (SHMT), mà hoạt
động có thể được kiểm sốt bởi 5,6,7,8-tetrahydrofolate (THF). Bằng cách xóa các gen để
tổng hợp THF, một nguồn acid folic bên ngoài là cần thiết cho sự phát triển
của C. glutamicum , nhưng sử dụng SHMT được kiểm soát. Điều này dẫn đến tăng năng suất
của L-serine.

19


ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT NGỌT

• Trong sản xuất L-tryptophan. Đối với C. glutamicum, sự tổng hợp L-tryptophan được
điều chỉnh bằng hoạt đông của DAHP synthetaza và anthranilat synthetaza. DAHP synthetaza
xúc tac scho phản ứng ngưng tụ erythroza-4-phosphat và phosphoenol pyruvate, có tác dụng
ức chế ngược do phenylalanin và tyrosin. Tryptophan tăng ức chế vì vậy hoạt độ của DAHP
synthetaza bị ức chế đến 90% khi có mặt 3 loại amino acid. Anthranilat synthetaza – loại
enzyme đầu tiên của quá trình tổng hợp tryptophan sau điểm phân nhánh, cho thấy ức chế

ngược và ức chế do L-tryptophan.DAHP synthetaza của C. glutamicumPx-115-97 rất nhạy vói
sự điều chỉnh của phenylalaninevà tyrosin. Hiệu quả tối đa được không chỉ do tác động của cơ
chế điều chỉnh mà còn do tác dụng của các enzym trong chuỗi sinh tổng hợp.
• Trong sản xuất L-leucine. Với C. glutamicum có thể chuyển hóa α-ketoisocaproic. Khi
bổ sung tiên fchất này vào mơi trường vói nồng độ 20g/lít thì chủng vi khuẩn sẽ sinh ra 16g
L-leucine sau 57h lên men, hiệu suất đạt 91%. Nếu dùng phương pháp này lên men bán liên
tục thì có thể đạt 24g/lít L-leucine sau 23h.

20


ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT NGỌT

KẾT LUẬN
Hiện nay, vi sinh vật ngày càng có vai trò quan trong trong đời sống nhân loại. Các
phương hướng phát triển khoa học kĩ thuật dựa vào vi sinh vật , mở rộng để tạo ra hàng loạt
các sản phẩm có lợi ích, giá trị cao. Một số sản phẩm đã trở nên thông dụng và không thể
thiếu trong đời sống vật chất và tinh thần xã hội.
Bột ngọt là chất điều vị trong chế biến thực phẩm, làm gia vị cho các món ăn, cháo, mì ăn
liền.. nhờ đó sản phẩm hấp dẫn hơn và acid glutamic được đưa vào cơ thể. Làm tăng khả năng
lao động trí óc và chân tay của con người.
Nhiều tổ chức y tế và sức khoẻ hàng đầu thế giới đã kết luận bột ngọt là an toàn cho sức
khoẻ khi được sử dụng dưới dạng gia vị. Mã số quốc tế cho loại gia vị này là E621.
Bột ngọt là một chất tự giới hạn, do đó cho nhiều hơn khơng chắc là ngon hơn. Ngồi ra,
trong bột ngọt, lượng Natri chiếm khoảng 13%, ăn bột ngọt nhiều đồng nghĩa với ăn nhiều
Natri, không tốt cho sức khỏe; chưa kể một số người có thể bị triệu chứng nóng rát ở cổ,
người bần thần. … khi ăn thức ăn có nhiều bột ngọt. Mặc dù bột ngọt từ lâu đã được coi là
phụ gia an tồn, nhưng cũng khơng nên lạm dụng nhất là trong các thức ăn dành cho trẻ em.

21

ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT NGỌT

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Các q trình cơng nghệ cơ bản trong sản xuất thực phẩm - Lê Bạch Tuyết ( Chủ biên)
– Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam.
2. Công nghệ sản xuất acit amin và ứng dụng - PGS.TS. Quản Lê Hà ( Chủ biên) –
GS.TS Nguyễn Thị Hiền - Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam.
3. Bài giảng môn Công nhệ vi sinh thực phẩm – Th.s Vương Thị Việt Hoa.
4. Web :
/>X&ei=LslHUuDON8mOigeHgAE&ved=0CCkQgQMwAA
/> />%E1%BA%A3n-xu%E1%BA%A5t-m%C3%AC-ch%C3%ADnh

22