NGÔ THỊ DUYÊN xây DỰNG PHƢƠNG PHÁP sắc ký LỎNG KHỐI PHỔ để xác ĐỊNH một số CHẤT cấm TRONG mỹ PHẨM LUẬN văn THẠC sĩ dƣợc học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGÔ THỊ DUYÊN

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ
ĐỂ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHẤT CẤM
TRONG MỸ PHẨM
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGÔ THỊ DUYÊN

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ
ĐỂ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHẤT CẤM
TRONG MỸ PHẨM
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 8720210

Người hướng dẫn khoa học: TS. Tạ Mạnh Hùng
PGS.TS. Lê Đình Chi

HÀ NỘI 2020


LỜI CẢM ƠN
Tơi xin được bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Tạ Mạnh
Hùng – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, PGS.TS. Lê Đình Chi - Trường
Đại học Dược Hà Nội, hai người thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kinh
nghiệm quý báu và quan tâm giúp đỡ tơi trong suốt q trình thực hiện và hồn
thành luận văn này.
Tơi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô công tác tại Bộ môn Hóa Phân tích –
độc chất đã chỉ dạy và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung
ương đã tạo điều kiện cho tôi học tập và thực hiện luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các đồng nghiệp khoa Kiểm nghiệm Mỹ phẩm –
Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã tạo điều kiện và giúp đỡ tơi trong q trình
thực hiện luận văn.
Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè đã
giúp đỡ và động viên để tơi có đủ nghị lực, quyết tâm hồn thành luận văn.
Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn Q Thầy, Cơ, Cơ quan, Gia đình và
Bạn bè đã hỗ trợ và động viên, giúp tơi hồn thành luận văn này.
Hà Nội, ngày 15 tháng 04 năm 2020
Học viên: Ngô Thị Duyên


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ QUI ĐỊNH QUẢN LÝ MỸ PHẨM .................3
1.1.1. Quản lý mỹ phẩm trên thế giới ......................................................................3
1.1.2. Quản lý mỹ phẩm ở Việt Nam ......................................................................5
1.2. TỔNG QUAN VỀ NHĨM CHẤT GLUCOCORTICOID .............................5
1.2.1. Cơng thức cấu tạo và tính chất lý hóa ...........................................................5
1.2.2. Tác dụng dược lý ...........................................................................................8
1.2.3. Tác dụng không mong muốn .........................................................................8
1.2.4. Một số phương pháp định tính và định lượng GC trong mỹ phẩm ...............9
1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ ...........10
1.3.1. Bộ phận nạp mẫu .........................................................................................11
1.3.2. Nguồn ion hóa kiểu phun sương điện (ESI – Electrospray ionization).......11
1.3.3. Bộ phận phân tích khối ghép nối ba tứ cực .................................................11
1.3.4. Bộ phận phát hiện (detector) .......................................................................12
1.4. TỔNG QUAN THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CHẤT CẤM
TRONG MỸ PHẨM ...............................................................................................12
1.4.1. Tính đặc hiệu - chọn lọc ..............................................................................13
1.4.2. Giới hạn phát hiện (LOD) ...........................................................................13
1.4.3. Giới hạn định lượng (LOQ) .........................................................................14
1.4.4. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn .............................................................14
1.4.5. Độ chính xác ................................................................................................15
1.4.6. Độ đúng .......................................................................................................15
1.4.7. Xác định tỷ lệ dương tính giả, âm tính giả ..................................................15
1.4.8. Khẳng định định tính ...................................................................................16

BMD

MTF

4
5
6
TB
RSD
1
2
3
4
5
6
TB
RSD

0,042
0,041
0,046

1,84
1,83
1,89

0,028
0,027
0,046

0,039
0,035
0,039

11,17
11,00
14,17
13,00
12,33
13,00

90,0
89,4
92,4
97,1
8,1
76,3
75,1
96,8
88,8
84,2
88,8
85,0
9,7

1,400
1,493
1,507

18,40

19,54
19,71

0,935
0,911
0,835
0,861
0,809
0,851

162,33
158,33
145,67
150,00
141,33
148,33

(a): Tỷ lệ diện tích so với chuẩn nội.
(b): Nồng độ tính lại từ đường chuẩn (ng/ml).
(c): % thu hồi so với nồng độ thêm vào.

89,9
95,5
96,3
96,6
4,4
110,9
108,1
99,5
102,5

96,5
101,3
103,1
5,2

3,056
3,310
3,221

38,60
41,70
40,61

1,901
1,841
1,798
1,800
1,765
1,789

323,33
313,33
322,83
306,50
300,67
304,67

94,3
101,9
99,2

97,9
3,0
110,4
107,0
104,6
104,7
102,7
104,0
105,6
3,1


4.1. PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI 12 GC TRONG MỸ PHẨM
...................................................................................................................................50
4.1.1. Lựa chọn phổ khối MS/MS cho phân tích nhóm GC ..................................50
4.1.2. Phương pháp xử lý mẫu...............................................................................51
4.1.3. Phương pháp sàng lọc sơ bộ các GC bằng kỹ thuật LC – MS/MS .............51
4.1.4. Thẩm định phương pháp phân tích ..............................................................51
4.2. KẾT QUẢ DƢƠNG TÍNH GIẢ, ÂM TÍNH GIẢ TRONG PHÂN TÍCH
BẰNG PHƢƠNG PHÁP LC – MS/MS .................................................................52
4.3. KẾT QUẢ KIỂM TRA CÁC MẪU MỸ PHẨM TRÊN TRỊ TRƢỜNG ...53
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 55
KẾT LUẬN ..............................................................................................................55
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................56




DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số nội dung quản lý mỹ phẩm của Châu Âu, Mỹ, Nhật và ASEAN ..4

Bảng 1.2. Công thức cấu tạo của 12 GC nghiên cứu ..................................................6
Bảng 1.3. Tính chất lý hóa của các GC nghiên cứu ....................................................7
Bảng 1.4. Một số phương pháp định tính và định lượng GC ......................................9
Bảng 1.5. Số lượng mẫu cần phân tích để xác định FP, FN .....................................16
Bảng 2.1. Thơng tin chất chuẩn sử dụng ...................................................................17
Bảng 2.2. Nồng độ dãy đường chuẩn của các GC ....................................................21
Bảng 3.1. Chương trình gradient dung môi ..............................................................33
Bảng 3.2. Điều kiện detector khối phổ......................................................................33
Bảng 3.3. Thơng tin sử dụng phát hiện định tính các GC .........................................36
Bảng 3.4. Sự phù hợp hệ thống LC-MS/MS .............................................................37
Bảng 3.5. So sánh thời gian lưu của pic thu được từ mẫu tự tạo và mẫu chuẩn .......38
Bảng 3.6. Tỷ lệ cường độ ion của các pic thu được từ mẫu tự tạo và mẫu chuẩn ....39
Bảng 3.7. Kết quả phân tích mẫu ở LOD ..................................................................42
Bảng 3.8. LOD và LOQ của phương pháp ...............................................................43
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát đường chuẩn của PRS, DXM, PRA, CTA ....................44
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát đường chuẩn của HCTA, TAA, DXA, FLA ...............44
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát đường chuẩn của CBP, BMV, BMD, MTF ................45
Bảng 3.12. Kết quả độ đúng, độ lặp lại của phương pháp ........................................46
Bảng 3.13. Kết quả chính xác trung gian của phương pháp .....................................46
Bảng 3.14. Kết quả phân tích GC trong một số mẫu kem mỹ phẩm ........................48


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo chung của GC ................................................................5
Hình 1.2. Sơ đồ cấu tạo của một máy khối phổ ........................................................11
Hình 1.3. Cấu tạo và cơ chế hoạt động của phổ khối ghép nối ba tứ cực .................12
Hình 3.1. Phổ khối MS dung dịch chuẩn BMV với chế độ ESI (+) .........................24
Hình 3.2. Giản đồ tối ưu điện thế tập trung ion có số khối 477,24 Da .....................25
Hình 3.3 Phổ khối MS/MS phân mảnh ion [BMV + H]+ .........................................26
Hình 3.4. Giản đồ năng lượng phân mảnh ion m/z 477,24 → 355,14 ......................27

Hình 3.5. Giản đồ năng lượng phân mảnh ion m/z 477,24 → 337,13 ......................28
Hình 3.6. SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng cột Acquity UPLC BEH C8 (2,1 x 100 mm,
1,7 µm), pha động MeOH : acid formic 0,1 % (70:30) ............................................29
Hình 3.7. SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng cột Acquity UPLC BEH C18 (2,1 x 50 mm,
1,7 µm), pha động MeOH : acid formic 0,1 % (70:30) ............................................30
Hình 3.8. SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng pha động MeOH : acid formic 0,1 % (72:28)
...................................................................................................................................30
Hình 3.9. SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng chương trình gradient .................................30
Hình 3.10. SKĐ mẫu tự tạo sử dụng dung mơi ACN ...............................................32
Hình 3.11. SKĐ đại diện của độ đặc hiệu .................................................................40
Hình 3.12. Giá trị S/N tại LOD của một số chất đại diện .........................................41
Hình 3.13. Giá trị S/N tại LOQ của một số chất đại diện .........................................42
Hình 3.14. SKĐ đại diện một số mẫu kem có GC ....................................................49


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong quản lý chất lượng mỹ phẩm, kiểm sốt tính an tồn là u cầu chính
yếu nhất. Chính vì vậy, hiệp định hệ thống hịa hợp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm
quy định rõ những chất, nhóm chất khơng được phép sử dụng trong mỹ phẩm, trong
đó có nhóm glucocorticoid [11]. Tuy nhiên, do có thể tạo ra những kết quả có ích
cho cơng bố tác dụng của một số sản phẩm mỹ phẩm như làm trắng da,
glucocorticoid vẫn bị lạm dụng trái quy định trong sản phẩm mỹ phẩm [21], [22].
Mặc dù hàm lượng glucocorticoid trong mỹ phẩm không cao như trong các dạng
bào chế thuốc nhưng nó lại được dùng hàng ngày, trong thời gian dài và khơng có
sự kiểm sốt của bác sĩ dẫn đến ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe người sử dụng
[18], [22].
Như vậy, về góc độ quản lý mỹ phẩm, glucocorticoid là đối tượng cần quan
tâm giám sát, và về góc độ kiểm nghiệm mỹ phẩm, các phương pháp đáng tin cậy
để phát hiện glucocorticoid trong mỹ phẩm là yêu cầu thực tế quan trọng. Một số
phương pháp phát hiện Glucocorticoid trong mỹ phẩm đã được phát triển sử dụng

kỹ thuật TLC [7] và HPLC-DAD [5]. Kỹ thuật TLC thường sử dụng thiết bị đơn
giản, chi phí thấp nhưng giới hạn phát hiện cao [7]. Kỹ thuật HPLC-DAD có hạn
chế về khẳng định định tính do độ đặc hiệu thấp của phổ hấp thụ UV-Vis nói chung
và của glucocorticoid nói riêng. Như vậy, với nền mẫu mỹ phẩm phức tạp có thể
dẫn đến kết quả dương tính giả, âm tính giả trong phân tích. Những hạn chế trên
cho thấy sự cần thiết cần phải nghiên cứu xây dựng một phương pháp có độ đặc
hiệu cao hơn, đảm bảo kết quả tin cậy hơn để kiểm tra sự có mặt của các
glucocorticoid trong mỹ phẩm [18], [19]. So với HPLC-DAD, LC-MS/MS cung cấp
nhiều thơng tin đặc hiệu cho đối tượng phân tích hơn, cho phép cải thiện độ tin cậy
khi kết luận định tính sự có mặt của glucocorticoid trong mẫu [16], [17]. Vì vậy,
đây là kỹ thuật được lựa chọn để thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp sắc ký
lỏng khối phổ để xác định một số chất cấm trong mỹ phẩm” với các mục tiêu:
1. Xây dựng được phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) xác định
một số chất cấm nhóm glucocorticoid (Prednison, prednison acetat, dexamethason,
dexamethason acetat, cortison acetat, hydrocortison acetat, triamcinolon acetonid,
1


fuocinolon acetonid, clobetasol propionat, betamethason valerat, betamethason
dipropionat, mometason furoat) trong mỹ phẩm dạng kem.
2. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để phát hiện glucocorticoid có mặt trái
quy định trong các mẫu mỹ phẩm dạng kem trên thị trường.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ QUI ĐỊNH QUẢN LÝ MỸ PHẨM
1.1.1. Quản lý mỹ phẩm trên thế giới
* Mỹ:

Ở Mỹ, mỹ phẩm được quản lý theo quy định của Cục Quản lý Thực phẩm và
Dược phẩm (USFDA). USFDA không yêu cầu các sản phẩm và thành phần của
chúng phải được phê duyệt trước khi ra thị trường, trừ chất phụ gia màu phải được
phê duyệt mục đích sử dụng. Song có đưa ra một số quy định về quản lý mỹ phẩm
như [8]:
- Phải ghi nhãn mác đúng quy định.
- Thông tin về sản phẩm rõ ràng, có hướng dẫn sử dụng.
- Sản phẩm có chứa các thành phần có thể gây kích ứng da cần phải được
kiểm tra sơ bộ theo hướng dẫn kèm theo.
- Sản phẩm không được chứa chất độc hại, chất gây ô nhiễm hoặc phân hủy
gây dị ứng cho người sử dụng.
* Châu Âu:
Các nước Châu Âu tuân thủ theo Chỉ thị quản lý mỹ phẩm của Liên minh
Châu Âu (The European Union Cosmetic Directive) được phê duyệt từ năm 1976,
trong đó có đưa ra các phụ lục sau [8]:
- Phụ lục I: Danh mục 20 nhóm sản phẩm.
- Phụ lục II: Danh mục các chất bị cấm: 1132 chất và nhóm chất.
- Phụ lục III: Danh mục các chất có giới hạn về hàm lượng, nồng độ và điều
kiện sử dụng: 396 chất.
- Phụ lục IV: Danh mục các chất màu được phép sử dụng.
- Phụ lục VI: Danh mục các chất bảo quản.
- Phụ lục VII: Danh mục các chất lọc tia UV.
Châu Âu yêu cầu tất cả các sản phẩm được bán trên thị trường phải đăng ký
thông tin trên cổng thông tin sản phẩm mỹ phẩm. Nhà sản xuất chịu trách nhiệm về
sự an toàn của các sản phẩm của mình.

3


* Nhật Bản:

Nhật Bản quản lý mỹ phẩm theo luật Quản lý Dược – PAL (Pharmaceutical
Affairs Law) được phê duyệt lần đầu tiên vào năm 1943, có sửa đổi vào những năm
1948, 1960 và 1979. Tuy nhiên, đến năm 2001, luật này đã được thay đổi nhiều và
có những quy định mới. PAL bãi bỏ quy định các sản phẩm mỹ phẩm phải được
phê duyệt hoặc cấp phép trước khi đưa ra thị trường. Các nhà sản xuất, nhà phân
phối phải có trách nhiệm đảm bảo tính an tồn của sản phẩm. Đồng thời, phải thông
báo tên của sản phẩm trước khi sản xuất hoặc nhập khẩu để các cơ quan có thẩm
quyền xác định được đặc điểm của từng sản phẩm [23].
* ASEAN:
Năm 2003, “Hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm”
đã được các nước trong khối ASEAN thông qua, ký kết và cam kết thực hiện.
Hướng dẫn mỹ phẩm ASEAN (Asean Cosmetics Directive, gọi tắt là ACD) dựa trên
quy định của Liên minh Châu Âu, cũng có quy định về danh mục các chất bị cấm
trong mỹ phẩm (Phụ lục II), danh mục các chất được sử dụng có giới hạn về hàm
lượng, nồng độ và điều kiện sử dụng (Phụ lục III), danh mục các chất màu sử dụng
trong mỹ phẩm (phụ lục IV), danh mục các chất bảo quản (phụ lục VI), danh mục
các chất lọc tia UV (phụ lục VII) [11].
* Tóm tắt những quy định chính về mỹ phẩm của Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản và
ASEAN [8], [23] được thể hiện ở bảng 1.1:
Bảng 1.1. Một số nội dung quản lý mỹ phẩm của Châu Âu, Mỹ, Nhật và ASEAN
Nội dung quản lý

Châu Âu

Mỹ

Nhật

ASEAN

Thơng tin sản phẩm

Có

Có

Khơng

Kiểm tra trên thị trường

Có

Khơng bắt buộc
(tự nguyện)
Có

Có

Có

An tồn sản phẩm (nhà

Có

Có

Có

Có

sản xuất chịu trách nhiệm)
Danh mục chất cấm

Có

Có

Có

Có

Danh mục chất màu

Có

Có

Có

Có

Danh mục chất bảo quản

Có

Khơng

Có

Có

Danh mục chất lọc tia UV

Có

Có

Có

Có

4


Danh pháp quốc tế thành
phần mỹ phẩm

Có

Có

Có

-

1.1.2. Quản lý mỹ phẩm ở Việt Nam
Ngày 02/9/2003, chính phủ Việt Nam đã ký “Hiệp định hệ thống hòa hợp
ASEAN trong quản lý mỹ phẩm. Theo Hiệp định này, 10 nước ASEAN đã cam kết
thực hiện tiến trình hịa hợp và từ ngày 01/01/2008, Hiệp định bắt đầu có hiệu lực
[8]. Gần đây nhất, ngày 20/1/2011, Bộ Y tế có thơng tư số 06/2011/TT-BYT của

của Bộ trưởng Bộ Y tế về việc ban hành “Quy định về quản lý mỹ phẩm” gồm 11
chương, 53 điều. Thông tư này qui định việc quản lý các sản phẩm mỹ phẩm sản
xuất trong nước, mỹ phẩm nhập khẩu để lưu thông trong lãnh thổ Việt Nam, bao
gồm: Công bố sản phẩm mỹ phẩm, hồ sơ thông tin sản phẩm, yêu cầu về an toàn
sản phẩm, ghi nhãn mỹ phẩm, quảng cáo mỹ phẩm, xuất khẩu, nhập khẩu mỹ phẩm,
lấy mẫu mỹ phẩm để kiểm tra chất lượng, kiểm tra, thanh tra và xử lý vi phạm,
trách nhiệm của tổ chức, cá nhân sản xuất, buôn bán sản phẩm mỹ phẩm tại Việt
Nam phải tuân thủ các quy định về quản lý mỹ phẩm trong thông tư này [3].
1.2. TỔNG QUAN VỀ NHĨM CHẤT GLUCOCORTICOID
1.2.1. Cơng thức cấu tạo và tính chất lý hóa
1.2.1.1. Cơng thức cấu tạo
- Các glucocorticoid (GC) có chung khung cấu trúc steroid như hình 1.1.

Hình 1.1. C ng thức cấu tạo chung của GC
5


- Công thức cấu tạo của 12 GC nghiên cứu với các nhóm thế ở vị trí R6, R9,
R11, R16, và R21 được trình bày cụ thể ở bảng 1.2:
Bảng 1.2. C ng thức cấu tạo của 12 GC nghiên cứu
TT
1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Tên GC

∆1,2

R6

R9

R11

R16

R17

R21

Prednison

Nối

-H

-H

=O

-H

-OH

-OH

(PRS)

đơi

Dexamethason

Nối

-H

-H

-H

-H

-OH

-OH

(DXM)

đơi

Prednison

Nối

-H

-H

=O

-H

-OH

-OCOCH3

acetat (PRA)

đơi

Cortison aceat

Bão

-H

-H

=O

-H

-OH

-OCOCH3

(CTA)

hịa

Hydrocortison

Bão

-H

-H

- OH

-H

-OH

-OCOCH3

acetat (HCTA)

hịa

Triamcinolon

Nối

-H

-F

-OH

acetonid (TAA)

đơi

Dexamethason

Nối

-H

-F

-OH

acetat (DXA)

đơi

Fluocinolon

Nối

-F

-F

-OH

acetonid (FLA)

đơi

Clobetasol

Nối

-H

-F

-OH

-CH3

-OCOC2H5

-Cl

propionat (CBP)

đơi

Betamethason

Nối

-H

-F

-OH

-CH3

-OCOC4H9

-OH

valerat (BMV)

đôi

Betamethason
dipropionat
(BMD)
Mometason

Nối

-H

-F

-OH

-CH3

-OCOC2H5

-OCOC2H5

-H

-Cl

-OH

-CH3

furoat (MTF)

đôi

-OH

-CH3

-OH

-OCOCH3

-OH

đôi
Nối

6

-Cl


1.2.1.2. Tính chất lý hóa
Cơng thức phân tử và tính chất lý hóa [15] của các GC nghiên cứu được liệt
kê ở bảng 1.3.
Bảng 1.3. Tính chất lý hóa của các GC nghiên cứu
Tên
GC

CTPT

Khối lƣợng
phân tử

PRS

C21H26O5

358,4

DXM

C22H29FO5

CTA

C23H30O6

Tính chất

Độ tan

392,5

Bột kết tinh trắng
hay gần như
trắng, đa hình
Bột kết tinh trắng
hay gần như trắng

402,5

Bột kết tinh trắng
hay gần như
trắng, đa hình
Bột kết tinh trắng
hay gần như trắng

Khơng tan trong nước, khó
tan trong EtOH 96 % và
methylen clorid
Không tan trong nước, hơi
tan trong EtOH khan, khó
tan trong methylen clorid
Khơng tan trong nước, dễ
tan trong methylen clorid,
tan trong dioxan, hơi tan
trong aceton, khó tan trong
EtOH 96 % và MeOH
Không tan trong nước, hơi
tan trong EtOH khan và
methylen clorid
Không tan trong nước, hơi
tan trong EtOH 96 %

HCTA

C23H32O6

404,5

TAA

C24H31FO6

434,5

DXA

C24H31FO6

434,5

FLA

C24H30F2O6

452,5

CBP

C25H32ClFO5

467,0

Bột kết tinh trắng
hay gần như
trắng, đa hình
Bột kết tinh trắng
hay gần như

trắng, đa hình
Bột kết tinh trắng
hay gần như
trắng, đa hình
Bột kết tinh trắng
hay gần như trắng

BMV

C27H37FO6

476,3

Bột kết tinh trắng
hay gần như trắng

504,6

Bột kết tinh trắng
hay gần như trắng

521,4

Bột kết tinh trắng
hay gần như trắng

BMD

MTF

C28H37FO7

C27H30Cl2O7

7

Không tan trong nước, dễ
tan trong EtOH 96 %, khó
tan trong methylen clorid
Tan trong aceton và EtOH,
không tan trong nước
Không tan trong nước, dễ
tan trong aceton, hơi tan
trong EtOH 96 %
Không tan trong nước, dễ
tan trong aceton và
methylen clorid, tan trong
EtOH 96 %
Không tan trong nước, dễ
tan trong aceton và
methylen clorid, hơi tan
trong EtOH 96 %
Khơng tan trong nước, tan
trong aceton và methylen
clorid, khó tan trong EtOH
96 %


* Nhận xét: Các GC không tan trong nước, tan được trong các dung môi như
ethanol, aceton và methanol. Đây chính là cơ sở để lựa chọn dung mơi chiết các GC

trong quá trình xử lý mẫu mỹ phẩm.
1.2.2. Tác dụng dƣợc lý
Glucocorticoid có nhiều tác dụng dược lý quan trọng như chống viêm, chống dị
ứng và ức chế miễn dịch,... nên được sử dụng trong nhiều chỉ định y khoa khác
nhau [2], trong đó có chỉ định dùng tại chỗ để kiểm soát viêm da cơ địa, eczema và
các viêm da khác [1].
1.2.3. Tác dụng không mong muốn
Các GC có thể gây ra nhiều tác dụng khơng mong muốn như loét dạ dày, tá
tràng, phù, tăng huyết áp, tăng đường huyết, loãng xương, xốp xương, gây hội
chứng Cushing,...[2].
Đặc biệt, khi dùng tại chỗ (trong trường hợp điều trị các bệnh về da hoặc sử
dụng mỹ phẩm có chứa corticoid) trong thời gian dài có thể gây ra nhiều tác dụng
không mong muốn [1], [2], [16] như:
- Mỏng da, teo da.
- Rạn da (nách, háng, bẹn).
- Xuất huyết dưới da.
- Giãn mạch máu.
- Rậm lông, lông mọc dài ra.
- Viêm da quanh miệng, trứng cá đỏ do GC.
- Vảy nến thể mủ.
- Khi ngừng GC tại chỗ có thể gây ra các tổn thương như:
+ Da đỏ, bừng, nóng (viêm da so GC hoặc chứng phụ thuộc GC).
+ Viêm da sẩn, mụn mủ (trứng cá đỏ do GC, viêm da quanh miệng, viêm da
quanh mắt).
Theo Hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm, GC nằm
trong danh mục các chất, nhóm chất bị cấm sử dụng trong các sản phẩm mỹ phẩm
(nhóm chất số 300, Annex II – Các chất, nhóm chất khơng được phép dùng trong
mỹ phẩm) [10].
8

1.2.4. Một số phƣơng pháp định tính và định lƣợng GC trong mỹ phẩm
Hiện nay, đã có nhiều phương pháp như phương pháp TLC [7], [10], phương
pháp HPLC với detector UV- VIS [5], [10], phương pháp LC – MS/MS [16], [19],
[21], [22] đã được sử dụng để định tính và định lượng GC trong mỹ phẩm.
Tóm tắt một số phương pháp định tính, định lượng GC được trình bày trong bảng
1.4.
Bảng 1.4. Một số phương pháp định tính và định lượng GC
PP

PP xử lý mẫu

- Mẫu kem: chiết mẫu với
MeOH bằng cách để trên
cách thủy ấm, ly tâm, để
lạnh → lấy lớp dịch trong
bay hơi và hòa tan cắn trong
MeOH
- Mẫu lỏng: chiết mẫu với
ethyl acetat → bay hơi trên
cách thủy → hòa tan cắn
trong MeOH
HPLC Giống PP TLC
TLC
5g chế phẩm được chiết với
MeOH → Đặt trên cách
thủy → làm lạnh trong nước
đá 1 giờ → Lọc, bốc hơi
cách thủy tới khơ → Hịa
lại cắn trong 5 ml MeOH

HPLC Mẫu được chiết với HH
dicloromethan-MeOH (9:1)
→ đặt trên cách thủy ấm →
làm lạnh trong nước đá →
Bốc hơi đến khô → Hòa tan
cắn trong HH ACN-MeOHH2O (20:30:30)
LC-MS Mẫu được phân tán trong

KTT
(µg/ml)

LOD
(µg/g)

LOQ
(µg/g)

Thời
gian
phân
tích
(phút)

TL
TK

TLC

-

[10]

20-50

70-160

-

200

-

0,2-1,2

0,1-2,0
(µg/ml)

0,3-6,0
(µg/ml)

9

35

[7]

60

[5]

LCMS/MS
LCMS/MS
LCMS/MS

THF → lắc siêu âm → pha
loãng với HH acid formic
0,1 %/ACN và acid formic
0,1%/Nước (20:80)
Mẫu được chiết với ACN

0,3- 100

12-35
(ng/ml)

35–95
(ng/ml)

30

[16]

0,1-10

1,4-2,4
(ng/ml)
0,0850,109

4,7-8,0

(ng/ml)
0,1020,212

25

[22]

10

[26]

2,5-90,0
(ng/ml)

25

[21]

Mẫu được chiết với ACN → 0,005ly tâm → lọc
0,25
1 g mẫu được chiết với 20
ml MeOH có chứa 1 ml acid 0,1 – 2,0 0,8 -30,0
formic 0,1 %, lắc siêu âm
(ng/ml)
30 phút → ly tâm ở 2000
vòng trong 10 phút → lọc

” – ”: Khơng có thơng tin.
* Nhận xét:
- Phương pháp TLC [7], [10] tiến hành đơn giản, chi phí thấp, dễ dàng so

sánh kết quả trên cùng một bản mỏng. Tuy nhiên, độ đặc hiệu còn hạn chế và giới
hạn phát hiện thường cao. Để khẳng định kết quả cần phải tiến hành thử trên một số
hệ dung môi khác nhau với các phương pháp phát hiện khác nhau. Do đó, thường
chỉ sử dụng để sàng lọc sơ bộ và kiểm tra nhanh [7].
- Phương pháp HPLC độ đặc hiệu đã cải thiện hơn so với PP TLC. Tuy
nhiên, thời gian phân tích dài, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng còn cao [5],
[10], chưa phù hợp để định lượng các chất cấm - thường được cho vào với hàm
lượng nhỏ trong mỹ phẩm [22]. Mặt khác, nền mẫu mỹ phẩm phức tạp nên việc tách
các chất ra khỏi nền mẫu cũng gặp nhiều khó khăn.
- Phương pháp LC – MS/MS có giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
thấp [13], [16], [26], [22], khoảng tuyến tính rộng và có thể cung cấp được thơng tin
cấu trúc các chất, phù hợp để phân tích các chất cấm trong mỹ phẩm. Tuy nhiên,
phương pháp của Fiori [16], Nam Sook Kim [21], Yun Sik Nam [22] và cộng sự
thời gian phân tích cịn dài.
1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ
Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) là một kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết hợp
giữa khả năng phân tách các chất của hệ thống HPLC và khả năng phân tích khối

10


của detector khối phổ [4].
Trong số các kỹ thuật LC-MS, kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối
với đầu dò khối phổ kiểu ghép nối ba tứ cực với bộ ion hóa kiểu phun điện (ESI) có
độ đặc hiệu - chọn lọc tốt và độ nhạy cao [6].
Sơ đồ khối của một máy khối phổ được miêu tả như trong hình 1.2.
Liquid
chromatograph

Ion

source

Mass
analyser

Detector

Hình 1.2. Sơ đồ cấu tạo của một máy khối phổ
1.3.1. Bộ phận nạp mẫu
Bộ phận nạp mẫu sẽ chuyển mẫu phân tích vào nguồn ion hóa của thiết bị khối
phổ. Với LC-MS, mẫu phân tích được nạp vào MS gián tiếp thông qua hệ thống
HPLC [4].
1.3.2. Nguồn ion hóa kiểu phun sƣơng điện (ESI – Electro spray ionization)
Nguồn ion hóa là nơi diễn ra q trình chuyển các hoạt chất cần phân tích
thành các ion/tiểu phân mang điện ở pha khí bằng các kỹ thuật ion hóa khác nhau.
Trong nguồn ion sử dụng kĩ thuật ion hóa kiểu phun sương điện (ESI), tại đầu ống
dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và sự hỗ trợ của khí mang, mẫu
được phun thành những hạt sương nhỏ mang điện tích ở bề mặt. Khí và nhiệt ở
xung quanh cung cấp nhiệt năng làm bay hơi dung môi ra khỏi giọt sương. Dung
môi bay hơi làm gia tăng mật độ điện tích tại bề mặt hạt sương. Khi mật độ điện
tích này tăng đến điểm giới hạn (giới hạn ổn định Rayleigh), lực đẩy lớn hơn sức
căng bề mặt sẽ chia hạt sương thành những hạt nhỏ hơn. Quá trình này được lặp lại
nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ chứa các tiểu phân mang điện. Từ những
hạt rất nhỏ mang điện tích này, các ion phân tích được chuyển thành thể khí rồi đi
vào bộ phận phân tích khối. Những tiểu phân khơng bị ion hóa sẽ bị hút ra khỏi
buồng ion qua bơm chân không của thiết bị khối phổ [6].
1.3.3. Bộ phận phân tích khối ghép nối ba tứ cực
Bộ phân tích khối sẽ tách các ion có số khối m/z khác nhau thành từng loại
riêng biệt nhờ tác dụng của điện trường.

11


Bộ phận phân tích khối kiểu ghép nối ba tứ cực gồm ba tứ cực Q1, Q2 và Q3
nối tiếp nhau. Mỗi tứ cực này được cấu tạo gồm có 4 thanh kim loại đặt song song
và sát nhau tạo thành hai cặp điện cực (hình 1.3).

Hình 1.3. Cấu tạo và cơ chế hoạt động của phổ khối ghép nối ba tứ cực
Dòng điện một chiều và điện thế xoay chiều cao tần được đặt vào từng cặp
đối diện của tứ cực. Dưới tác động của điện trường trong lòng ống điện cực, các ion
có số khối khác nhau di chuyển với tốc độ và quỹ đạo khác nhau. Ion có số khối
càng nhỏ thì di chuyển càng nhanh và ngược lại [6].
Các hợp chất với cấu tạo khác nhau sẽ có tỷ số m/z của ion mẹ cũng như cơ
chế phân mảnh và hình thành nên các ion con có số khối khác nhau. Vì vậy, có thể
định tính, định lượng các hoạt chất cần phân tích bằng phương pháp LC-MS/MS
[6].
1.3.4. Bộ phận phát hiện (detector)
Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân tích khối, các ion được đưa tới phần cuối của
thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận này cho phép phát hiện và
khuếch đại tín hiệu của các ion tương ứng về số lượng. Tín hiệu tạo ra sẽ được
chuyển đến máy tính và thu được hệ thống dữ liệu dưới dạng phổ đồ.
1.4. TỔNG QUAN THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CHẤT CẤM
TRONG MỸ PHẨM
Thẩm định phương pháp là một nội dung bắt buộc đối với các phương pháp
phân tích nói chung và phương pháp phân tích mỹ phẩm nói riêng. Mục đích của
thẩm định phương pháp là chứng minh phương pháp có đủ độ đặc hiệu, tin cậy và
lặp lại để phân tích các mẫu thực.
Theo hướng dẫn của USFDA [25] các chỉ tiêu tối thiểu cần thực hiện khi
thẩm định phương pháp phân tích chất cấm trong mỹ phẩm gồm: Độ đặc hiệu 12

chọn lọc, giới hạn phát hiện, xác định tỷ lệ dương tính giả, âm tính giả và khẳng
định định tính (confirmation of identity).
1.4.1. Tính đặc hiệu - chọn lọc
- Tính đặc hiệu - chọn lọc là khả năng nhận diện và phân biệt rõ ràng chất
phân tích với các thành phần khác có trong mẫu. Với phân tích định tính đó là phải
chứng minh được kết quả là dương tính khi có mặt chất phân tích, âm tính khi
khơng có mặt nó, đồng thời kết quả phải là âm tính khi có mặt các chất khác có cấu
trúc gần giống chất phân tích. Trong phép phân tích định lượng, là khả năng xác
định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố
khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác.
- Cách thực hiện:
+ Phân tích mẫu trắng (mẫu placebo), lặp lại tối thiểu 6 lần. Mẫu trắng phải
khơng có tín hiệu của chất phân tích.
+ Phân tích mẫu tự tạo ở nồng độ/hàm lượng gần LOQ, lặp lại tối thiểu 6 lần.
So sánh với mẫu placebo, phải cho tín hiệu của chất phân tích.
+ Phân tích mẫu chuẩn, các chất phân tích phải được nhận diện rõ ràng và
không bị ảnh hưởng bởi các chất khác.
- Với phương pháp LC-MS/MS sử dụng kỹ thuật MRM, độ chọn lọc đạt yêu
cầu khi:
+ Có 2 ion con đặc trưng và tỷ lệ cường độ tuyệt đối so với mẫu chuẩn tiến
hành trong cùng điều kiện khơng chênh lệch q 10 % [24].
+ Hoặc ít nhất 3 ion con đặc trưng và tỷ lệ cường độ ion tuyệt đối so với mẫu
chuẩn tiến hành trong cùng điều kiện không chênh lệch quá 20 % [24].
1.4.2. Giới hạn phát hiện (LOD)
- Giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể
phát hiện được.
- Để xác định LOD, có thể thực hiện theo nhiều cách:
+ Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N): Phân tích mẫu chuẩn hoặc mẫu tự
tạo ở nồng độ khác nhau thấp dần. Xác định tỷ lệ giữa tín hiệu chiều cao pic của

13


chất cần phân tích và cường độ nhiễu nền tại lân cận pic chất cần phân tích. Nồng
độ chất cần phân tích tại đó S/N xấp xỉ 3 được coi là LOD [9].
+ Dựa trên đường chuẩn: LOD được xác định dựa vào độ dốc của đường
chuẩn và độ lệch chuẩn của tín hiệu đo [9].
LOD = 3,3 x SD/a.
Trong đó:

SD: Độ lệch chuẩn của tín hiệu
a: Độ dốc của đường chuẩn.

1.4.3. Giới hạn định lƣợng (LOQ)
- LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất trong mẫu thử có thể định lượng
bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chính xác mong muốn.
- LOQ cũng có thể xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu, dựa vào đường
chuẩn hoặc dựa vào công thức: LOQ = 3,3 x LOD.
1.4.4. Khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn
- Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa
tín hiệu đo được và nồng độ chất phân tích. Khoảng tuyến tính phải có tối thiểu 6
nồng độ khác nhau, bắt đầu từ giới hạn định lượng (điểm thấp nhất) và kết thúc là
giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất) [9].
- Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa tín hiệu đo của thiết bị và nồng
độ của chất phân tích có trong mẫu. Có thể xây dựng đường chuẩn trên chuẩn tinh
khiết, trên mẫu placebo thêm chuẩn hoặc trên mẫu thử thêm chuẩn.
- Giới hạn chấp nhận của đường chuẩn:
+ Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,995 ≤ r ≤ 1.
+ Độ chệch của các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn: Không được

vượt quá ± 15% cho tất cả các nồng độ, riêng ở nồng độ LOQ có thể chấp nhận giới
hạn ± 20% [9]. Tính các giá trị độ chệch theo công thức sau:
∆i = (Ct – Cc)/Cc x 100
Trong đó: ∆i: Độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn
Ct : Nồng độ xác định được từ đường chuẩn của các điểm chuẩn
Cc : Nồng độ lý thuyết của các điểm chuẩn.

14


1.4.5. Độ chính xác
Độ chính xác bao gồm độ lặp lại và độ chính xác trung gian.
- Độ lặp lại được xác định bằng cách phân tích lặp lại ít nhất tại 3 mức nồng
độ, mỗi nồng độ thực hiện ít nhất 6 lần lặp lại nếu thực hiện trên 1 nền mẫu và ít
nhât 2 lần nếu thực hiện trên 3 nền mẫu. Giá trị RSD của các kết quả phân tích phải
đáp ứng yêu cầu của USFDA [25].
- Độ chính xác trung gian được tiến hành tương tự độ lặp lại nhưng khác
ngày và khác kiểm nghiệm viên.
1.4.6. Độ đúng
Độ đúng có thể được đánh giá qua việc xác định qua độ thu hồi, bằng cách
thêm chuẩn vào nền mẫu khơng chứa chất phân tích ở ít nhất 3 mức nồng độ là mức
thấp, mức trung bình và mức cao (tương ứng với 0,5 lần, 1 lần và 2 lần giới hạn cho
phép), làm lặp lại 6 lần, tính độ thu hồi theo cơng thức:
R (%) = Ctt/Cc x 100
Trong đó:

R (%): Độ thu hồi, %
Cc: Nồng độ chuẩn thêm vào (lý thuyết)
Ctt: Nồng độ chất phân tích trong mẫu nền thêm chuẩn (thực tế)

Kết quả độ thu hồi phải đạt yêu cầu của USFDA [25].
1.4.7. Xác định tỷ lệ dƣơng tính giả, âm tính giả
- Theo hướng dẫn của USFDA [25], với phân tích định tính cần xác định tỷ
lệ dương tính giả (FP), âm tính giả (FN) của phương pháp. Để xác định tỷ lệ FP cần
tiến hành xác định sự có mặt của các chất phân tích trong các mẫu đã được khẳng
định là âm tính. Để xác định tỷ lệ FN cần tiến hành xác định sự khơng có mặt của
các chất phân tích trên các mẫu đã được khẳng định là dương tính.
- Cách thực hiện:
+ Xác định tỷ lệ FP: tiến hành phân tích các mẫu khơng chứa chất phân tích
cần nghiên cứu (các mẫu nền - mẫu âm tính).
+ Xác định tỷ lệ FN: tiến hành phân tích các mẫu tự tạo ở nồng độ LOD
(mẫu dương tính).
Số lượng mẫu cần phân tích phụ thuộc vào độ tin cậy và tỷ lệ FP, FN cần đạt
15