Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất thứ cấp phân lập từ chủng vi nấm biển penicillium oxalicum CLC MF05

NGUYỄN THUỶ TIÊN

BỘ GIÁO DỤC
VIỆN HÀN LÂM
VÀ ĐÀO TẠO
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Nguyễn Thuỷ Tiên

SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM CỦA MỘT SỐ
HỢP CHẤT THỨ CẤP PHÂN LẬP TỪ CHỦNG VI NẤM
BIỂN Penicillium oxalicum CLC-MF05

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Sinh học thực nghiệm

2021
Hà Nội - 2021


BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Nguyễn Thuỷ Tiên

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM CỦA MỘT SỐ HỢP
CHẤT THỨ CẤP PHÂN LẬP TỪ CHỦNG VI NẤM BIỂN
Penicillium oxalicum CLC-MF05

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm
Mã số : 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH
SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
TS. Trần Hồng Quang

Hà Nội - 2021


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn này là cơng trình nghiên cứu của tơi dưới sự
hướng dẫn khoa học của TS. Trần Hồng Quang. Các số liệu, kết quả nghiên
cứu đảm bảo trung thực và khách quan nhất. Đồng thời, các kết quả này chưa
được công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Tác giả

Nguyễn Thuỷ Tiên


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS. Trần Hồng
Quang, Viện Hoá sinh Biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam, người đã định hướng khoa học, trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo,
giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tơi trong suốt q trình nghiên cứu
và thực hiện đề tài.
Đồng thời tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các anh chị, bạn
bè trong phịng Dược liệu Biển, Viện Hố sinh Biển, Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam đã ủng hộ, giúp đỡ để tơi hồn thành tốt được đề tài.
Tôi xin trân trọng cảm ơn tất cả các thầy cô, cán bộ, thành viên Học
viện Khoa học và Công nghệ đã giảng dạy, cung cấp các kiến thức mới để tơi
hồn thành các học phần và các chun đề trong chương trình đào tạo.
Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, những người
thân yêu đã luôn ở bên, động viên và giúp đỡ tôi cả về mặt vật chất lẫn tinh
thần trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Mặc dù đã cố gắng rất nhiều,
song do thời gian và kiến thức cịn hạn hẹp nên luận văn của tơi khơng thể
tránh được những thiếu sót tơi rất mong sẽ nhận được sự đóng góp ý kiến từ
phía thầy giáo, cơ giáo cùng toàn thể các bạn để bài báo cáo của tơi được
hồn thiện hơn.
Luận văn được giúp đỡ về mặt kinh phí và thực hiện trong khn khổ
Nhiệm vụ Hợp tác quốc tế cấp Viện Hàn lâm KHCNVN: “Nghiên cứu hoạt
tính kháng viêm in vitro của các chủng vi nấm biển phân lập từ hải miên thu
thập ở quần đảo Cù Lao Chàm – Việt Nam”. Mã số: QTKR01.03/20-21.

Hà Nội, ngày 20 tháng 9 năm 2021
Học viên

Nguyễn Thuỷ Tiên


MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................ iii
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................. iv
MỤC LỤC .................................................................................................... v
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 3
1.1. Giới thiệu về viêm và một số yếu tố quan trọng trong phản ứng viêm 3
1.1.1. Sơ lược về viêm ................................................................. 3
1.1.2. Một số yếu tố quan trọng trong quá trình viêm ................... 4
1.2. Vi nấm và ứng dụng của vi nấm ......................................................... 5
1.3. Vi nấm biển và các hợp chất thứ cấp từ vi nấm biển .......................... 9
1.3.1. Sơ lược về vi nấm biển ......................................................... 9
1.3.2. Lịch sử nghiên cứu các hợp chất từ vi nấm biển ................. 13
1.3.3. Tiềm năng của các hợp chất từ vi nấm biển ........................ 14
1.4. Penicillium oxalicum .......................................................................... 23
1.4.1. Tổng quan về Penicillium oxalicum .................................... 23
1.4.2. Các hợp chất thứ cấp từ Penicillium oxalicum .................... 25
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 30
2.1. Chủng vi khuẩn .................................................................................. 30
2.2. Hoá chất và thiết bị nghiên cứu .......................................................... 30
2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 30
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy vi nấm ............................................ 30
2.3.2. Phương pháp lên men, tạo dịch chiết và phân lập các hợp
chất ........................................................................................................ 31
2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất ...................... 32
2.3.4. Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm .............................. 32
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................... 35


3.1. Kết quả nhân sinh khối và tạo cao chiết tổng chủng vi nấm Penicillium
oxalicum CLC-MF05 ................................................................................ 35

3.2. Kết quả phân lập các hợp chất ............................................................ 36
3.3. Kết quả xác định cấu trúc hoá học các hợp chất.................................. 38
3.3.1. Kết quả xác định cấu trúc hóa học hợp chất 1 ..................... 38
3.3.2. Kết quả xác định cấu trúc hóa học hợp chất 2 ..................... 43
3.3.3. Kết quả xác định cấu trúc hóa học hợp chất 3 ..................... 46
3.4. Kết quả hoạt tính kháng viêm của hợp chất ........................................ 49
3.4.1. Ảnh hưởng của hợp chất 1-3 đến khả năng sống sót của tế
bào BV2 ................................................................................................. 49
3.4.2. Ảnh hưởng của hợp chất 1-3 đến việc sản xuất NO và PGE2
do LPS gây ra trong tế bào BV2 ............................................................. 51
3.4.3. Ảnh hưởng của hợp chất 1-3 đến biểu hiện protein iNOS và
COX-2 ................................................................................................... 54
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 58


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ADN

Deoxyribonucleic acid

Axit deoxyribonucleic

BGC-823

Gastric adenocarcinoma cell
line

Tế bào ung thư dạ dày

CC

Column chromatography

Sắc ký cột

CD

Circular dichroism
Spectroscopy

Phổ lưỡng sắc tròn

C-NMR

C-Nuclear magnetic
resonance spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt
nhân cacbon 13

COSY

Correlation spectroscopy

Phổ tương tác hai chiều
đồng hạt nhân

DEPT

Distortionless Enhancement by
Polarization Transfer

Phổ DEPT

EtOAc

Ethyl acetate

Ethyl acetate

GC-MS

Gas chromatography – mass
spectrometry

Sắc ký khí – khối phổ

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond
Correlation

Phổ tương tác đa liên kết

dị hạt nhân

HMQC

Heteronuclear MultipleQuantum Coherence

Phổ kết hợp đa lượng tử dị
hạt nhân

H-NMR

Proton nuclear magnetic
resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt
nhân proton

HPLC

High performance liquid
chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HR-ESITOF-MS

High-resolution electrospray
ionisation time-of-flight mass
spectrometry

Phổ khối lượng phân giải
cao phun mù điện tử thời
gian bay

13

1

13

IC50

Inhibitory concentration

K562

Human leukemic cell line

Nồng độ ức chế 50%
Tế bào ung thư bạch cầu

MCF-7

Human breast carcinoma cell
line

Tế bào ung thư vú ở người

MIC

Minimum inhibitory
concentration

Nồng độ ức chế tối thiểu


NOESY

Nuclear overhauser effect
spectroscopy

Phổ NOESY

PDA

Potato Dextrose Agar

Môi trường thạch khoai
tây

TLC

Thin layer chromatography

Sắc ký lớp mỏng

TMV

Tobacco mosaic virus

Virut khảm thuốc lá


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Một số chất hợp thứ cấp từ nấm được sản xuất thương mại ............ 8
Bảng 1.2: Các hợp chất kháng viêm phân lập từ vi nấm biển trong giai đoạn
2000-2018 .................................................................................................... 17
Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất 1 .................................. 43
Bảng 3.2: Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất 2 .................................. 45
Bảng 3.3: Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất 3 .................................. 49
Bảng 3.4: Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO và PGE2 của hợp
chất 1-3 ........................................................................................................ 53


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Một số hợp chất thứ cấp từ nấm sử dụng trong y học ...................... 7
Hình 1.2: Các hợp chất mới từ vi nấm biển được phân chia theo nguồn gốc. 12
Hình 1.3: Các hợp chất mới từ vi nấm viển được phân chia theo cấu trúc .... 12
Hình 1.4: Các hợp chất mới từ vi nấm biển được phân chia theo hoạt tính ... 13
Hình 1.5: Cấu trúc hoá học của Cephalosporin C, Glitoxin và Indanonaftol A
..................................................................................................................... 14
Hình 1.6: Cấu trúc hố học của Aspergillitine, Aspergione A, Aspergione F,
Sorbicillactone A.......................................................................................... 15
Hình 1.7: Cấu trúc hố học của Pestalone, Ascochital, Trichoderins A, A1 và
B .................................................................................................................. 16
Hình 1.8: Một số lồi nấm thuộc chi Penicillium .......................................... 24
Hình 1.9: Cấu trúc hoá học của hợp chất 1-11 đã được cơng bố từ P. oxalicum
..................................................................................................................... 27
Hình 1.10: Cấu trúc hố học của hợp chất 12-32 đã được công bố từ P.
oxalicum ....................................................................................................... 29

Hình 3.1: Sơ đồ tạo cao chiết tổng P.oxalicum CLC-MF05 .......................... 35
Hình 3.2: Siêu âm và tạo dịch chiết tổng ...................................................... 36
Hình 3.3: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao chiết tổng Penicillium oxalicum
CLC-MF05 ................................................................................................... 37
Hình 3.4: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC () và COSY (—) chính
của hợp chất 1 .............................................................................................. 38
Hình 3.5: Phổ HR-ESI-TOF-MS của hợp chất 1........................................... 39
Hình 3.6: Phổ 1H NMR (400 MHz, CDCl3) của hợp chất 1 .......................... 39
Hình 3.7: Phổ 13C NMR (100 MHz, CDCl3) của hợp chất 1 ......................... 40
Hình 3.8: Phổ HMQC (400 MHz, CDCl3) của hợp chất 1 ............................ 41
Hình 3.9: Phổ HMBC (400 MHz, CDCl3) của hợp chất 1............................. 41
Hình 3.10: Phổ COSY (400 MHz, CDCl3) của hợp chất 1 ............................ 42
Hình 3.11: Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 ................................................. 43
Hình 3.12: Phổ HR-ESI-TOF-MS của hợp chất 2......................................... 44
Hình 3.13: Phổ 1H NMR (400 MHz, CD3OD) của hợp chất 2 ...................... 44
Hình 3.14: Phổ 13C NMR (100 MHz, CD3OD) của hợp chất 2 ..................... 45
Hình 3.15: Cấu trúc hóa học của hợp chất 3 ................................................. 46


Hình 3.16: Phổ HR-ESI-TOF-MS của hợp chất 3......................................... 47
Hình 3.17: Phổ 1H NMR (400 MHz, CD3OD) của hợp chất 3 ...................... 47
Hình 3.18: Phổ 13C NMR (100 MHz, CD3OD) của hợp chất 3 ..................... 48
Hình 3.19: Cấu trúc hố học của hợp chất 1-3 từ P. oxalicum CLC-MF05 ... 49
Hình 3.20: Ảnh hưởng của hợp chất 1-3 đến khả năng sống sót của tế bào
BV2 .............................................................................................................. 50
Hình 3.21: Ảnh hưởng của hợp chất 1-3 đến sự sản xuất quá mức NO ở tế bào
BV2 được kích thích bởi LPS ....................................................................... 52
Hình 3.22: Ảnh hưởng của hợp chất 1-3 đến sự sản xuất quá mức PGE2 ở tế
bào BV2 được kích thích bởi LPS ................................................................ 53
Hình 3.23: Ảnh hưởng của 1-3 đối với sự biểu hiện quá mức của iNOS và

COX-2 do LPS gây ra ở tế bào BV2 ............................................................. 55


1
MỞ ĐẦU
Các hợp chất trao đổi thứ cấp tự nhiên ln được xem đóng một vai trị
quan trọng trong nghiên cứu phát triển các loại thuố c mới hoặc là mơ hình,
khn mẫu cho các nghiên cứu tổng hợp hữu cơ, tổng hợp hóa dược. Với diện
tích hơn 70% bề mă ̣t trái đấ t, môi trường biển là nguồn cung cấp các sinh vật
và vi sinh vâ ̣t biển đa dạng quý giá với nhiều hoạt động sinh học phong phú.
So với các sinh vật trên cạn, các sinh vật biển thường sản sinh ra các hợp chất
trao đổi thứ cấp có cấu trúc độc đáo và hoạt tính sinh học mạnh mẽ, giúp
chúng thích nghi với những mơi trường cực kỳ khó khăn. Nhờ sự đa da ̣ng của
hê ̣ sinh thái biể n cùng với sự khắ c nghiê ̣t của môi trường số ng nên các hơ ̣p
chấ t từ vi sinh vâ ̣t biể n cũng vô cùng đa da ̣ng về cấ u trúc cũng như hoa ̣t tiń h
sinh ho ̣c.
Vi nấm biển là mô ̣t trong những nguồn sản xuấ t quan tro ̣ng các chất
chuyển hóa thứ cấp hữu ích trong nghiên cứu phát triể n thuốc. Vi nấ m biể n
rấ t đa da ̣ng, chúng xuấ t hiê ̣n hầ u hế t ở trong các hê ̣ sinh thái biể n bao gồm
nước biể n, bo ̣t biể n, trầ m tích biể n, tảo, san hô, rong biể n và các sinh vâ ̣t biể n
khác. Nhờ khả năng chố ng chiụ với điề u kiê ̣n số ng như đô ̣ mă ̣n cao, áp suấ t
cao, dinh dưỡng thấ p đồ ng thời ca ̣nh tranh với các sinh vâ ̣t khác, nên vi nấm
biển có thể tổ ng hơ ̣p các hơ ̣p chấ t thứ cấ p có hoa ̣t tính sinh ho ̣c mạnh hơn, ưu
viê ̣t hơn loài trên ca ̣n. Các hoa ̣t tính sinh ho ̣c của các chấ t chuyể n hóa thứ cấ p
của vi nấ m rất đa dạng, bao gồ m kháng viêm, kháng khuẩ n, kháng virut,
chố ng oxy hóa và gây độc tế bào ung thư ... Những hợp chất được tạo ra chủ
yếu từ các loài vi nấm thuộc chi Penicillium, Aspergillus và một số lồi vi
nấm thuộc các chi ít phổ biến hơn như Acremonium, Emericella, Epicoccum,
Exophiala, Paraphaeospaeria, Phomosis và Halarosellinia. Trong lịch sử
nghiên cứu phát triển thuốc trên thế giới, vi nấm là một trong những nguồn

cung cấp thuốc tự nhiên quan trọng, bằng chứng là có nhiều loại thuốc đang
được sử dụng như paclitaxel, camptothecin, vincristin, axit torreyanic và
cytarabine đã được phân lập từ vi nấm.
Viê ̣t Nam là quố c gia nằ m ở khu vực nhiệt đới với bờ biển dài 3260km
và diê ̣n tić h mă ̣t nước hơn 1 triê ̣u km² do đó sở hữu mô ̣t nguồ n tài nguyên
sinh vâ ̣t biể n vô cùng phong phú và quý giá. Tuy nhiên theo các báo cáo cho


2
thấ y số lươṇ g công trin
̀ h nghiên cứu còn ha ̣n chế so với tiề m năng nguồ n khai
thác nấ m biể n ở Viê ̣t Nam. Với mu ̣c đić h nghiên cứu xác đinh
̣ các hoa ̣t chấ t
thứ cấ p có hoa ̣t tính kháng viêm để tìm ra nguồ n dươ ̣c liê ̣u mới góp phầ n
phu ̣c vu ̣ sức khỏe cô ̣ng đồ ng tôi lựa cho ̣n đề tài “Nghiên cứu hoa ̣t tính
kháng viêm của mô ̣t số hơ ̣p chấ t thứ cấ p phân lâ ̣p từ chủng vi nấ m biể n
Penicillium oxalicum CLC-MF05”.
Mục tiêu của luận văn:
Xác định được thành phần và cấu trúc hố học của một số hợp chất có
mặt trong chủng vi nấm biển Penicillium oxalicum CLC-MF05, đánh giá hoạt
tính kháng viêm của các hợp chất đó.
Nội dung luận văn bao gồm:
1. Lên men sinh khối lượng lớn, tạo cao chiết tổng của chủng nấm
Penicillium oxalicum CLC-MF05
2. Phân lập các hợp chất từ cao chiết tổng của chủng Penicillium oxalicum
CLC-MF05.
3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được.
4. Đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được.

3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Giới thiệu về viêm và một số yếu tố quan trọng trong phản ứng
viêm

1.1.1. Sơ lược về viêm
Viêm là một đáp ứng miễn dịch bảo vệ cơ thể trước sự tấn công của tác
nhân bên ngoài (vi sinh vật, tác nhân hóa, lý, cơ) hoặc của tác nhân bên trong
(hoại tử do thiếu máu cục bộ, bệnh tự miễn). Đây là một đáp ứng miễn dich
̣ tự
nhiên. Quá trình viêm thường kèm theo các triệu chứng sưng, nóng, đỏ và
đau, do các mạch máu giãn nở, đưa nhiề u máu và các tế bào bạch cầu đến nơi
tổ n thương. Các bạch cầu cũng theo mạch máu xâm nhập vào mô, sản sinh ra
các tác nhân nhằm tiêu diệt hoặc trung hòa các tác nhân gây tở n thương. Viêm
khơng kiểm sốt được có thể như một yếu tố dẫn đến các bệnh mãn tính. Hiện
nay, thuốc dùng để quản lý các cơn đau và viêm là các thuốc thuộc dịng
nacotics, khơng thuộc dịng nacotics, và corticosteroids. Tất cả những loại
thuốc này đều có tác dụng phụ.
Trong quá trình viêm, các tế bào đơn nhân và đại thực bào miễn dịch
được kích thích sẽ kích hoạt q trình chuyển hóa một số yếu tố phiên mã
quan trọng. Con đường tín hiệu viêm được biết đến nhiều là con đường tín
hiệu NF-κB được gọi là con đường kinh điển [1]. NF-κB nằm trong tế bào
chất bao gồm hai tiểu đơn vị (p50 và p65) như một liên kết heterodimer
không hoạt động với IκB-α, là một protein ức chế. Trong điều kiện được kích
thích, q trình phosphoryl hóa và phân giải protein của IκB-α cho phép
chuyển vị NF-κB vào nhân để điều chỉnh phiên mã gen đích bằng cách liên
kết với vị trí κB trong cấu trúc của DNA [2]. Sự chuyển hóa NF-κB sẽ làm
tăng hoạt động của các phản ứng hạ lưu như các cytokine tiền viêm (như IL1β IL-6 và TNF-α), các enzyme tiền viêm quan trọng (như iNOS và COX- 2)

và sản phẩm thu được tương ứng của chúng là NO và PGE2 [3]. Ngồi kích
hoạt NF-κB, một con đường quan trọng khác, con đường tín hiệu MAPK như
kinase điều chỉnh tín hiệu ngoại bào (ERK), p38 MAPK và cJun NH2terminal kinases (JNK), cũng có thể được kích hoạt bởi q trình viêm và
điều chỉnh sự phiên mã của các gen liên quan đến viêm khác nhau sau đó biểu
hiện quá mức phản ứng viêm hạ nguồn [4]. Lượng chất trung gian gây viêm


4
và các yếu tố liên quan đến tổn thương tế bào và gây viêm như mẩn đỏ, đau,
sốt và sưng [5]. Do đó, việc ức chế sự sản xuất quá mức của những chất này
là một mục tiêu quan trọng trong điều trị bệnh viêm. Các nhà nghiên cứu
thường đánh giá hoạt động chống viêm bằng cách ức chế sự biểu hiện của các
cytokine tiền viêm, enzyme chống viêm của COX-2, iNOS và các protein liên
quan đến viêm khác nhau trong các đường dẫn tín hiệu NF-κB và MAPK
trong bạch cầu đơn nhân và đại thực bào miễn dịch (tế bào BV2, tế bào
RAW264.7) được kích thích bởi LPS in vitro [6].
1.1.2. Một số yếu tố quan trọng trong quá trình viêm
Nitric oxide (NO) là một trung gian tiền viêm, một phân tử tín hiệu
đóng vai trị quan trọng trong quá trình sinh bệnh của viêm. NO liên quan đến
đáp ứng miễn dịch bởi các đại thực bào kích hoạt cytokine. Sự sản sinh NO
được điều khiển bởi nitric oxide synthase (NOS), trong đó bao gồm nitric
oxide synthases cảm ứng (iNOS), nitric oxide synthases nội bào (eNOS) và
nitric oxide synthases thần kinh (nNOS). NO được sinh ra từ quá trình chuyển
hóa L-Arginine thành L-citruline, xúc tác bởi iNOS. NO ở nồng độ cao gây ra
chứng viêm quá mức trong các tình huống bất thường. NO cịn tác động vào
q trình sinh bệnh viêm khớp, viêm ruột và viêm phổ i. Do đó, ức chế sản
sinh NO là yếu tố quan trọng trong việc điều trị các bệnh viêm [7].
PGE2 là một trung gian viêm quan trọng khác và được sản xuất từ các
chất chuyển hóa arachidonic acid bởi sự xúc tác của cyclooxygenase-2
(COX2) [8]. Cyclooxygenases (COX) nhường 2 phân tử oxy cho arachidonic

acid để tạo thành prostaglandin G2 (PGG2) bởi peroxidation, sau đó lần lượt
chuyển hóa thành prostaglandin H2 (PGH2) dẫn đến sự hình thành của PGE2,
thơng qua kích hoạt phối hợp của PGE synthanse (PGES). Trong các đại thực
bào, sự có mặt của LPS sẽ kích hoạt các dẫn truyền tín hiệu cho q trình
phiên mã các gen COX-2, iNOS, từ đó gây nên các đáp ứng viêm đặc trưng.
Do vậy, sự thay đổi nồng độ NO và PGE2 thông qua sự ức chế hoạt động của
iNOS và COX-2 là một phương tiện quan trọng để đánh giá hiệu quả của các
hoạt chất kháng viêm.
Microglia là các tế bào thần kinh đệm có chức năng như các tế bào hiệu
ứng chính trong việc bảo vệ miễn dịch và phản ứng viêm trong hệ thần kinh


5
trung ương (CNS) [9, 10]. Các tế bào này được kích hoạt để đáp ứng với căng
thẳng mơi trường và tạo ra các phân tử hoạt tính sinh học khác nhau, bao gồm
nitric oxide, prostaglandin E2, các loại oxy phản ứng và các cytokine gây
viêm, chẳng hạn như interleukin (IL) -1β, IL -6, và yếu tố hoại tử khối u
(TNF) -α, có chức năng khơi phục cân bằng nội mơi của thần kinh trung ương
bằng cách dọn sạch các tế bào và mảnh vỡ bị hư hỏng [11, 12]. Giống như các
microglia khác, BV-2 cũng là một tế bào thần kinh đệm có thể được kích hoạt
để giải phóng các cytokine gây viêm do stress oxy hóa hoặc các yếu tố gây
viêm. Kích thích như vậy có thể gây ra rối loạn thối hóa thần kinh như bệnh
Alzheimer và bệnh Parkinson, do đó BV-2 được sử dụng rộng rãi như một hệ
thống mơ hình thay thế cho mơ hình microglia ngun phát và bệnh thối hóa
thần kinh in vitro.
Lipopolysaccharide (LPS) là thành phần chính của nội độc tố, bắt đầu
một số tác động tế bào chính đóng vai trị quan trọng trong cơ chế bệnh sinh
của các phản ứng viêm và được sử dụng để gây ra sự hoạt hóa tế bào vi mơ
trong q trình nhiễm vi khuẩn Gram âm. Do đó, sự kích thích LPS của
microglia là một mơ hình hữu ích để nghiên cứu các cơ chế làm nền tảng cho

tổn thương tế bào thần kinh thông qua các yếu tố gây viêm và độc tố thần
kinh khác nhau do microglia hoạt hóa tiết ra, chẳng hạn như oxit nitric (NO),
prostaglandin E2 (PGE2), các loại oxy phản ứng. (ROS), interleukin (IL) -1β,
IL-6, và hoại tử khối u hệ số (TNF)-α [13].
1.2.

Vi nấm và ứng dụng của vi nấm

Trước đây, các nhà khoa học luôn chú trọng đến xạ khuẩn vì khả năng
sản xuất kháng sinh của chúng. Trên thực tế, nhiều chất chuyển hóa của nấm
trên thị trường dược phẩm cho thấy tiềm năng của vi sinh vật là nguồn cung
cấp thuốc chì có giá trị, ví dụ như kháng sinh polyketide griseofulvin
(Likuden M®), axit terpenoid fusidic kháng khuẩn (Fucidine®), penicillin bán
tổng hợp hoặc tổng hợp và cephalosporin, macrolid, statin cũng như các
ancaloit ergot như ergotamine (Ergo-Kranit®) [14].
Vi nấm là những sinh vật đặc biệt tạo ra một loạt các chất chuyển hóa
thứ cấp và các hoạt động hóa học của chúng có lịch sử lâu đời [15]. Việc
Fleming phát hiện ra penicillin được phân lập từ vi nấm Penicillium notatum


6
vào mùa thu năm 1928, và được ông báo cáo vào năm 1929, đã cách mạng
hóa dược phẩm sau một thời gian dài. Và sau đó, sự bùng nổ của Chiến tranh
thế giới thứ II càng làm tăng tính cấp thiết mà nghiên cứu đã được tiến hành
để thành công. Sản lượng của penicillin đã được tăng lên vào năm 1940 và đủ
nguyên liệu đã được sử dụng cho thử nghiệm đầu tiên trên người vào tháng 2
năm 1941, dẫn đến một bước đột phá trong việc điều trị các bệnh nhiễm trùng
do vi khuẩn. Sau khám phá thú vị về penicillin, các cơng ty dược phẩm và các
phịng thí nghiệm hàn lâm đã chú ý hơn đến vi nấm như một nguồn cung cấp
các hợp chất chì. Vì vậy, vi nấm đã trở thành một nguồn phát hiện thuốc quan

trọng để điều trị các bệnh khác nhau [16].
Kể từ đó, nhiều chất chuyển hóa mới với cấu trúc khung carbon khá đa
dạng đã được phân lập từ vi nấm. Động lực chính là việc tìm kiếm các chất
chuyển hóa của vi nấm có hoạt tính sinh học để sử dụng trong dược phẩm,
không chỉ làm thuốc kháng sinh mà còn cho các lĩnh vực điều trị khác, và
điều này đã dẫn đến một số hợp chất đã đạt được tầm quan trọng về mặt
thương mại đó là lovastatin được phân lập từ Aspergillus terreus được sử
dụng như một chất làm giảm cholesterol [13], cyclosporin A được phân lập từ
Cylindrocarpon lucidum và Tolypocladium được sử dụng rộng rãi như một
chất ức chế miễn dịch [17], aphidicolin được phân lập từ Cephalosporium
aphidicola được sử dụng như một chất ức chế mạnh DNA polymerase alpha
đã được kiểm tra như một chất ức chế khối u tiềm năng và tác nhân chống vi
rút, pleuromutilin từ Pleurotus mutilus là cốt lõi của kháng sinh thiamulin
[18], ngoài các chất kháng khuẩn nổi tiếng là axit fusidic, griseofulvin, và axit
mycophenolic được sử dụng làm chất ức chế miễn dịch [19]. Mặc dù vậy, vi
nấm vẫn sẽ chịu trách nhiệm cho bước đột phá lớn tiếp theo trong y học [20].


7

Penicillin G

Cyclosporine
A A
Cyclosporine

Pleuromutilin

Griseofulvin

Lovastatin

Aphidicolin

Fusidic axit

Mycophenolic axit

Hình 1.1: Một số hợp chất thứ cấp từ nấm sử dụng trong y học


8
Ngồi những ứng dụng trong y học, vi nấm cịn được sử dụng trong
nhiều nhiều lĩnh vực như công nghiệp chế biến thực phẩm dùng để sản xuất
tương, chao, xì dầu…, các loại axit hữu cơ như citric acid, oxalic acid, các
enzyme thực phẩm như protease, pectinase, amylase. Trong nông nghiệp, vi
nấm được ứng dụng trong sản xuất các chất kích thích tăng trưởng kéo dài
ngọn, lá, rễ cho cây trồng như gibberellin, auxin, các chế phẩm phân bón hữu
cơ, phân vi sinh giúp tăng độ màu mỡ, cải tạo đất hoặc là thiên địch chống lại
côn trùng.
Bảng 1.1: Một số chất hợp thứ cấp từ nấm được sản xuất thương mại
Chất chuyển hoá

Nguồn gốc nấm

Ứng dụng

TLTK

Penicillins

P. chrysogenum

Kháng khuẩn

[21]

Cephalosporins

Acremonium

Kháng khuẩn

[22]

chrysogenum
Griseofulvin

P. griseofulvum

Kháng nấm

[23]

Fusidin

Fusidium
coccineum

Kháng khuẩn

[24]

Cyclosporins

Tolypocladium spp. Thuốc ức chế miễn
dịch

Zearalenone

Gibberella zeae

Chất thúc đẩy tăng [26]
trưởng gia súc

Strobilurins

Strobilurus

Kháng nấm

[27]

[25]

tenacellus, các chi
Basidiomycete,
Ascomycete,
Bolinea lutea
Gibberellins

Gibberella
fujikuroi

Hóc mơn thực vật

[28]

Lovastatin

Monascus ruber,
Aspergillus terreus

Chống mỡ máu

[29]


9
1.3.

Vi nấm biển và các hợp chất thứ cấp từ vi nấm biển
Hiện nay phần lớn nguồn nguyên liệu làm thuốc, đặc biệt thuốc y học

cổ truyền được lấy từ các sinh vật hoang dã hoặc nuôi trồng trên đất liền, chỉ
một phần nhỏ được khai thác từ các sinh vật sống biển. Nguồn nguyên liệu từ
sinh vật hoang dã trên mặt đất ngày càng cạn kiệt, còn nguồn từ sinh vật biển
vô cùng phong phú và đa dạng, nhưng cịn ít được khai thác và sử dụng.
Trong khi đó biển và đại dương chiếm 71% bề mặt trái đất, là nơi chứa
đựng nhiều sinh vật biển khác nhau. Do các điều kiện vật lý và hóa học đặc

biệt trong môi trường biển, hầu hết mọi lớp sinh vật biển đều hiển thị nhiều
loại phân tử với các đặc điểm cấu trúc độc đáo [30]. Trong những năm gần
đây, một số lượng đáng kể các chất chuyển hóa mới có tiềm năng dược lý đã
được phát hiện từ các sinh vật biển, chẳng hạn như polyketide, alkaloid,
peptide, protein, lipid, shikimate, glycoside, isoprenoids và hybrid, có hoạt
tính sinh học bao gồm chống ung thư, kháng u, chống tăng sinh, chất kháng
khuẩn, chất độc tế bào, chất bảo vệ hình ảnh, cũng như các đặc tính kháng
sinh và chống hà [31]. Trong số đó, các vi sinh vật biển, chẳng hạn như vi
khuẩn, xạ khuẩn, nấm và vi khuẩn lam đã được chú ý nhiều hơn với tư cách là
những nhà sản xuất hợp chất tiềm năng. So với các động vật không xương
sống ở biển, chúng là nguồn tái tạo và có thể tái sản xuất, vì chúng có thể
được ni cấy và thậm chí có thể được coi là nhà máy sản xuất vi sinh vật
tuyệt vời cho các sản phẩm tự nhiên [32].
Mặc dù đã có nhiều loại thuốc quan trọng đang sử dụng được phân lập
từ vi nấm biển, nhưng số lượng các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học
có nguồn gốc từ vi nấm biển vẫn tăng rất chậm. Chỉ từ cuối những năm 1980,
các nhà nghiên cứu mới tập trung vào các loại nấm có nguồn gốc từ
biển. Trên thực tế, vi nấm biển rất quan trọng cho các chất chuyển hóa thứ
cấp có hoạt tính sinh học mới có thể được sử dụng làm thuốc.
1.3.1. Sơ lược về vi nấm biển
Vi nấm là một trong những sinh vật đa dạng và quan trọng trên thế giới.
Đã có khoảng 70.000 lồi nấm được mơ tả và trong đó gần 1.500 lồi có
nguồn gốc từ biển [33,34].


10
Theo một định nghĩa cổ điển, vi nấm biển được chia thành nấm biển bắt
buộc và nấm biển tự sinh. Nấm biển bắt buộc là những loài chỉ phát triển và
sinh sản trong môi trường biển hoặc cửa sông trong khi nấm biển tự sinh là
những loài từ nước ngọt hoặc trên cạn có thể phát triển và cũng có thể sinh

sản trong mơi trường biển [33,35].
Vi nấm biển có thể được phân lập từ các chất vô cơ như nước biển, đất,
trầm tích và mơi trường sống trên cát. Việc phân lập từ các nguồn như vậy
thường sẽ yêu cầu các quy trình cơ đặc, có thể là lọc một lượng lớn nước biển
qua các đĩa lọc vi sinh hoặc cho vật liệu rắn vào nước muối và thực hiện ly
tâm phân đoạn [36]. Còn các mẫu từ bọt biển và động vật không xương sống
ở biển như san hô, giáp xác, cũng như tảo biển, cỏ biển, thực vật bậc cao khác
bao gồm cả thực vật rừng ngập mặn thì ngược lại sẽ cần khử trùng bề mặt
thích hợp để đảm bảo rằng khơng có nấm bám vào được phân lập [37].
Hầu hết các loài vi nấm phân lập được từ mơi trường biển thuộc các
ngành nấm chính như Ascomycota, Basidiomycota, và Chytridiomycota.
Trong đó, các lồi vi nấm biển thuộc ngành Ascomycota có số lượng nghiên
cứu nhiều nhất, cụ thể như các chi Aspergillus, Penicillium, Cephalosporium,
Fusarium, và Talaromyces [38].
Vi nấm biển có tầm quan trọng lớn trong hệ sinh thái đại dương [39].
Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng vi nấm biển đóng vai trị quan trọng trong các
chu trình dinh dưỡng gồm phân hủy các chất hữu cơ trong hệ sinh thái biển và
tái tạo chất dinh dưỡng [40]. Ngồi ra, vi nấm biển cịn có các vai trò sinh thái
khác nhau như ký sinh và cộng sinh với các sinh vật biển [41] hoặc liên quan
đến quá trình khử nitơ trong trầm tích biển [42]. Vi nấm biển còn được xem là
quần thể vi sinh vật thống trị và tham gia chính vào chu trình nitơ trong hệ
sinh thái rạn san hô [43]. Điều này chứng tỏ sự cần thiết của vi nấm biển đối
với hệ sinh thái biển cũng như sự tồn tại của nhiều nhóm sinh vật mà chúng
kết hợp [44].
Sự phân bố và đa dạng của vi nấm biển bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố
như nhiệt độ môi trường, độ mặn của nước, chất nền hoặc sinh vật chủ, áp
suất và lượng oxy hoà tan. Sự khác biệt về nhiệt độ nước biển ở những vùng
biển khác nhau là do ảnh hưởng bởi cường độ của bức xạ mặt trời, sự bốc hơi,

11
dòng chảy nước ngọt và dòng thủy triều từ các vùng ở khoảng giữa vùng
duyên hải và thềm lục địa. Nhìn chung, vi nấm biển thường sinh trưởng và
phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 25-30oC. Ở một số trường hợp, vi nấm yêu
cầu nhiệt độ cao hơn như các chủng thuộc loài A. niger, A. terreus và
Cladosporium herabrum phân lập từ rừng ngập mặn Pichavaram. Trong khi
đó, một số loài vi nấm biển được phân lập từ vùng biển Nam Cực như
Thraustochytrium antarticum, Leucosporidium anatartica, và Spathulospora
antartica lại có khả năng phát triển ở nhiệt độ rất thấp, dưới 10oC [45].
Trong những năm gần đây, vi nấm biển đang ngày càng thu hút sự quan
tâm của cộng đồng khoa học. Chúng được coi như là một nguồn cung cấp dồi
dào các hợp chất có hoạt tính sinh học cho nhiều ứng dụng [46, 31]. Mặc dù
vi nấm biển ít được khám phá hơn so với các loài trên cạn, nhưng nhờ khả
năng chố ng chiụ với điề u kiê ̣n số ng như đô ̣ mă ̣n cao, áp suấ t cao, dinh dưỡng
thấ p đồ ng thời ca ̣nh tranh với các sinh vâ ̣t khác nên chúng có thể tổ ng hợp các
hơ ̣p chấ t thứ cấ p có hoa ̣t tiń h sinh ho ̣c mới, ưu viê ̣t hơn loài trên cạn. Vi nấm
biển là nguồn quan trọng cho các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh
học mới như ancaloit, glycoside, lipid, polyketides, peptide, protein,
terpenoids và nhiều trong số đó có đặc tính kháng vi-rút, kháng u, kháng
khuẩn và kháng nấm [47, 48, 49, 50].
Theo khảo sát của Jin và cộng sự năm 2016, trong giai đoạn từ 20142016 khoảng 3/4 tất cả các hợp chất mới được báo cáo từ vi nấm biển có
nguồn gốc từ sự phân lập từ vật chất sống tức là động vật biển (30,1%) và
thực vật biển (42,5%), trong khi các hợp chất còn lại được lấy từ các nguồn
phi sinh vật là trầm tích (22,9%), sinh cảnh rừng ngập mặn (25,5%), tảo
(14,4%), và bọt biển (9,2%) (Hình 1.2). Ngồi ra cịn có biển sâu là môi
trường khắc nghiệt với nhiệt độ thấp, áp suất thủy tĩnh cao, thiếu ánh sáng,
nồng độ cao của kim loại trong miệng phun thủy nhiệt và điều kiện thiếu oxy,
điều này có thể giúp nấm biển tạo ra các chất chuyển hóa có cấu trúc độc
đáo. Tuy nhiên, rất ít báo cáo liên quan đến mơi trường sống này vì nguồn
cung khan hiếm [51].

12

Trầm tích
22.9%

Nước biển
4.6%

Tảo
14.4%

Khác
2.6%

Rừng ngập
mặn
25.5%
Động vật biển
30.1%

Hình 1.2: Các hợp chất mới từ vi nấm biển được phân chia theo
nguồn gốc
Bên cạnh đó, khảo sát này cịn cho thấy alkaloid (27,0%) và polyketide
(25,7%) là các lớp chất chính được tìm thấy ở các loài nấm biển. Ngoài ra là
peptit (13,8%), tecpen (9,9%), lacton (3,9%) và steroid (3,3%) (Hình 1.3).
Các hoạt tính sinh học của các hợp chất này chủ yếu tập trung vào các lĩnh
vực gây độc tế bào (37,5%) và hoạt tính kháng khuẩn, bao gồm hoạt tính
kháng khuẩn (18,4%), hoạt tính kháng nấm (7,9%) và hoạt động kháng vi-rút

(7,2%) (Hình 1.4). Hơn nữa, các hoạt động chọn lọc khác bao gồm các hoạt
động chống oxy hóa, chống viêm, chống hà, giảm lipid, khử độc tố chống lại
các tác động của nước muối đối với tơm, v.v. [51].

Lactones Steroids
3.3%
3.9%
Terpenes
9.9%

Alkaloids
27.0%

Peptides
13.8%

Polyketides
25.7%

Hình 1.3: Các hợp chất mới từ vi nấm viển được phân chia theo cấu trúc


13

Hoạt tính khác
18.4%
Gây độc tế bào
37.5%

Giảm lipid

5.3%
Chống oxy hố
5.3%

Kháng virut
7.2%
Kháng nấm
7.9%
Kháng khuẩn
18.9%

Hình 1.4: Các hợp chất mới từ vi nấm biển được phân chia theo hoạt tính
1.3.2. Lịch sử nghiên cứu các hợp chất từ vi nấm biển
Vào cuối những năm 1940, Giuseppe Brotzu đã phân lập và nuôi cấy
loại nấm Cephalosporium acremonium từ mẫu nước biển gần cửa xả nước
thải ở Sardinia [52]. Nhưng phải mất gần mười năm cho đến khi Newton và
Abraham tại Đại học Oxford mới phát hiện ra cephalosporin C, một loại
kháng sinh tự nhiên thuộc loại β-lactam, chịu trách nhiệm về hoạt động kháng
khuẩn của loại nấm này [53, 54]. Cephalosporin C là đại diện cho kháng sinh
đầu tiên phân lập từ vi nấm biển.
Mãi đến năm 1977, chất chuyển hóa tiếp theo từ vi nấm biển mới được
phân lập. Chủng Aspergillus được phân lập từ một mẫu trầm tích dưới đáy
biển ngồi khơi đảo Seto, đã tạo ra gliotoxin. Gliotoxin có tác dụng kháng
khuẩn chống lại Staphylococcus aureus và đặc biệt ức chế yếu tố phiên mã
NF-κB [55].
Từ đó, một số lượng lớn các sản phẩm tự nhiên mới từ vi nấm biển đã
được phân lập và mô tả, chủ yếu là từ các chi Penicillium, Aspergillus,
Fusarium và Cladosporium [46]. Phần lớn các chất kháng sinh (khoảng 50%)
thuộc nhóm polypeptide, tiếp theo là các nhóm alkaloid, terpene và peptide
chiếm 14 – 20% [56].

14
Hợp chất kháng sinh đầu tiên từ nấm men biển là indanonaftol A, một
dẫn xuất spiro-indanone từ vi nấm biển Aureobasidium sp. với hoạt tính yếu
chống lại vi khuẩn Gram dương [57, 58].

Cephalosporin C

Glitoxin

Indanonaftol A
Hình 1.5: Cấu trúc hố học của Cephalosporin C, Glitoxin và
Indanonaftol A
Kể từ những năm 1980, số lượng các hợp chất kháng sinh được phân
lập từ vi nấm biển dần được phát hiện. Đến cuối năm 1992, chỉ có 15 chất
chuyển hóa của nấm được báo cáo [59] và khoảng 270 hợp chất đã được mô
tả cho đến năm 2002 [52]. Trong giai đoạn 2000-2005, khoảng 100 chất
chuyển hóa vi nấm biển mới đã được liệt kê [60] và con số này tăng lên 690
trong giai đoạn từ năm 2006 cho đến năm 2010. Các nghiên cứu về nấm biển
vẫn tiếp tục gia tăng với 223 hợp chất mới được báo cáo trong năm 2013 và
318 được báo cáo vào năm 2014 [61] trong năm 2017, tổng cộng 448 hợp
chất mới đã được báo cáo [62].
1.3.3. Tiềm năng của các hợp chất từ vi nấm biển
Các hợp chất tự nhiên từ vi nấm biển rất đa dạng về khung cấu trúc và
kết hợp với một loạt các nhóm thế khác nhau, điều đó dẫn đến một số hoạt
tính sinh học vơ cùng phong phú. Nhiều nghiên cứu cho thấy một số hợp chất
chỉ được phân lập từ vi nấm biển mà không thấy xuất hiện trong cùng chủng ở