Bước đầu nghiên cứu nhân giống in vitro cây hồ tiêu (piper nigrum l ) giống srilanka

DAI HOC HUE
TRUONG DAI HOC KHOA HOC
KHOA SINH HOC

BAO CAO TONG KET
DE TAI NGHIEN CUU KHOA HOC SINH VIEN
NAM 2019

Ten a tai: “BUOC DAU NGHIEN CUU

NHAN GIONG IN VITRO CAY HO TIEU
(Piper nigrum L.) GIONG SRILANKA”

Cán bộ cố vẫn khoa hoc : PGS. TS. TRUONG THỊ BÍCH PHƯỢNG
Chủ nhiệm đề tài
: LE THI TINH
TRAN VAN THAO
TRAN NGOC PHUOC
NGUYEN MINH THANH

Hué, 03/2019


LOI CAM DOAN

Chúng tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong đề
tài này là hoàn toàn trung thực, chưa từng được ai sử dụng để cơng bố
trong bất kỳ cơng trình nào khác. Các thong tin, tài liệu trích dẫn trong
báo cáo đã được ghi rõ ngn gơc.

Nêu có gì sai sót, chúng tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm.

Huế, tháng 03 năm 2019
Nhóm sinh viên thực hiện

Lê Thị Tình

Trần Văn Thảo
Trần Ngọc Phước
Nguyễn Minh Thanh


LOI CAM ON
Với lòng kinh trọng và biết ơn sâu sắc, chúng tôi xin duoc bày tỏ lời cảm
_ơn chân thành tới Ban

Giám hiệu, phịng Đào

tạo Đại học, Bộ mơn

Cơng

nghệ Sinh học, Bộ môn Sinh học Ứng dụng trường Đại học Khoa học - Đại
học Huế đã tạo mọi điễu kiện thuận lợi giúp đỡ chúng tơi trong quả trình học
tập và hồn thành đê tài.

Đặc biệt, chúng tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến PGS.TS.Trương Thi
Bích Phượng đã trực tiếp hướng dân tận tình, theo sát chúng tơi trong suốt
quá trình từ khi nhận thực hiện đề tài cho đến khi hoàn thành.
Xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Đức Tuấn cùng các anh chị e1n ở
phịng thí nghiệm bộ môn Sinh học Ứng dụng đã quan tâm giúp đỡ.

Cuối cùng, chúng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và các anh chị bạn

bè trong khoa đã ln đơng hành cùng chúng tơi trong suốt q trình học tập

và hồn thành đề tài.

Một lần nữa chúng tơi xin chân thành cảm ơn!

Huế, tháng 03 năm 2019
Nhóm sinh viên thực hiện

Lê Thị Tình

Trần Văn Thảo
Trần Ngọc Phước
Nguyễn Minh Thanh


MUC LUC
MO DAU .uessscosssccsssccsneccenssccsscsssssessssccssvssssssosssesssesscsnesssssscssnesssnessanecsansesssesesses 1
1. Ly do chon dé tai.............. mm.

1

2. Muc tiéu nghién À0 000057 ......................

2

3. Đối tượng nghiên cứu...................-.--2: +2++2t+2xt+xtertsrersrkrrkrrkrrrkerkerrereerkd 3

4. Phạm vi nghiên CỨU ...................... -. -- 5< 4 S4 3 13 9191100110101.x4 3
5. Phương pháp nghiên CỨU ......................--«c2 22391999 9131438211412... 3

6. Bố cục báo cáo.................--------s++22xt
kg HH HH0 re 3
Chương 1. TỎNG QUAN TÀI LIỆU ................................-.----°-c<5< se ss=ssessessee 4
1.1. Công nghệ nuôi cấy mô thực vật......................
.-.-------- + + ++x+erverxerrsererkd 4
L.1.1. Khai —............................. 4
1.1.2. Các giai đoạn ni cây mơ tế bào thực vật.....................---------s-scscce- 4

1.1.3. Vai trị của môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy mô tế bào
100100101757...
........ 6
1.1.4. Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cây mô tế bào
0500117077 ...........................

7

1.1.5. Một số vấn đề thường gặp trong nuôi cay mô tế bào thực vật......... 8

1.2. Giới thiệu chung về cây hỗ tiêu...................--.--- -55c5c+cccSzc+rterxerresrrervree 11
1.2.1. Ngudn gédc va phan b6.....cccccsessecssessessesseesecseestecsecnecneenseneeneeessentens 12
1.2.2. Hinh thai hoc... —............................

12

1.2.3. Sinh thái, sinh trưởng và phát triển .......................-.----- -s2c+ccsrxsrcxee 14
1.2.4. Công dụng của hồ tiêu.....................-.-+ 2c>t+ztztrererrerrrkrrrrrrriee 14
1.2.5. Các phương pháp nhân giống hồ tiêu....................------5-55+©5

1.2.6. Tình hình sản xuất và tiêu thụ hỗ tiêu ............................---ccscccrrrreee 16
1.3. Tinh hinh nghién ciru nhan gidng in vitro cay hồ tiêu........................-. 19

CHƯƠNG 2: ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 26
2.1. Đối tượng nghiên Cứu ......................-..
-- 52 2+22+tSEvr+ktrterrrrerkerrkerkrrkrrrkd 26


2.2. Phuong phap nghién ctru seccesuscssuccsseessecessecssesesusessecssuecssisesseessesssseesseten 26

2.2.1. Điều kiện và môi trường nuôi cấy ........................-..------s-csccxeczecrecrxee 26
2.2.2. Nghiên cứu tạo vật liệu ban GAU coecccececcscsesesscscsescccsesececececscseevevsceees 27
-2.2.3. Nghiên cứu khả năng tạo cụm chồi....................
sec se cevszrsrsesesesee 28
2.2.4. Nghiên cứu khả năng tạo callus từ nguồn mẫu vật i7 vifro............ 28

2.2.5. Nghiên cứu khả năng tạo rễ của chỗi ir vifro..........................------: 28

2.2.6. Xử lí số liệu thống kê.........................-¿2-2 5zS++ctrEEEEEkEEEEkrrrrrrrrree 28

Chương 3: KÉT QUÁ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN........................ 30
3.1. Giai đoạn tạo vật liệu ban đầu ...........................
-¿--- s sec ckreevEreesrrxree 30

3.1.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng mẫu..........................-.----+2 30

3.1.2. Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi..........................-----55-5ss5csecxeee 35
3.2. Nghiên cứu khả năng nhân chồi..............................---22 s©xcxe+zecrxrrxerseee 43
3.2.1. Ảnh hưởng của BAP

én kha nang nhan chéi in vitro cây hồ tiêu

trên môi trường \MMS................................--- HH HH HT
TH
kg 44
3.2.2. Ảnh hưởng của BAP kết hợp IBA lên khả năng nhân chỗi in vitro

cây hỗ tiêu trên môi trường MS...........................-----5-5++cxcrsktkrtkrrrrrrrrrerrieo 46
3.2.3. Ảnh hưởng của 2,5 mg/I BAP kết hợp 0,5 mg/1 IBA và than hoạt

tính lên khả năng nhân chồi in vitro cay hé tiêu trên môi trường MS..... 48
3.3. NUOi Cay ta0 CallUS...cccceecescessesssssessessesseeseesessesscssssecsecsesseesessseneeseeseeneens 50
3.3.1. Ảnh hưởng của 2,4-D và BAP đến khả năng tạo callus từ lá......... 51
3.3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D và BAP đến khả năng tạo callus từ cuống lá.....53
3.4. Ta

na ...............Ốố.ỐốỐỐ.ố.ố.ố.

55

3.4.1. Ảnh hưởng của NAA lên khả năng tạo rễ của chỗi in vitro trén méi
trường MS. . . . . . . . . . . . .

cọ

HH

nh

00 000

00104 55

3.4.2. Ảnh hưởng của NAA lên khả năng tạo rễ của chỗi in vitro trén mơi
trường 1⁄2 ÌMS. . . . . . . . . . . . .

..-- cọ HT

nh

H090

0

57

3.4.3. Ảnh hưởng của 0,3 mg/1 NAA kết hợp than hoạt tính lên khả năng
tao ré của chôi 7# v//ro trên môi trường 1⁄2 MS.........................--.--- «se

58


-

_“*——Sedee
keo.

ko NT,

KET LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
.
DL. KGt ain eccecceccsseeccssssssssssscssessssssscssessecssssssssssessesssesssssessssssessssssscssesssesses
2. Kiến nghi.sccsccssscsssssssecsesssesssssssssesssssssssscsssssssssesssssssssssssssssesssessssssessseess
"TÀI LIỆU THAM KHẢO

62
62
62
64


DANH MUC CAC KY HIEU VA CHU CAI VIET TAT
2,4-D

: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid

BA

: 6-bezyladenine

BAP

: 6-benzylamino purine

Cs

: Cộng sự

CW

: Coconut water (nước dừa)

DNA

: Deoxyribonucleic acid

DC

: Đối chứng

IAA

: 3-indoleacetic acid

IBA

: 3-indolebutyric acid

Kin

: Kinetin

KTST

: Kích thích sinh trưởng

MS

: Murashige and Skoog (1962)

NAA

: 1-naphthaleneacetic acid

SH

: Schenk and Hildebrand

TDZ

: Thidiazuron

WPM

: Woody plant medium


DANH MUC BANG BIEU

Bảng 3.1 | Hiệu quả khử trùng bằng HgC1; 0,1% đối với đoạn mắt

30

đôt

Bảng 3.2 | Hiệu quả khử trùng bằng HgC]; 0,1% kết hợp với NaOCl | 32
5% đối với đoạn mắt đốt

Bảng 3.3 | Hiệu quả khử trùng băng HgC]; 0,1% kết hợp với NaOCI | 34

5% đối với hạt tiêu chín

Bảng 3.4 | Ảnh hưởng của BAP lên khả năng tái sinh chỗi của đoạn |

36

mắt đôt tự nhiên
Bảng 3.5 | Ảnh hưởng của Kin lên khả năng nảy chổi của hạt

38

Bảng 3.6 | Ảnh hưởng của BAP lên khả năng nảy chỗi của hạt

40

Bảng 3.7 | Ảnh hưởng của TDZ lên khả năng nảy chồi của hạt

42

Bang 3.8 | Ảnh hưởng của BAP lên khả năng nhân chỗi cây hồ tiêu | 44
Bang 3.9 | Ảnh hưởng của BAP kết hợp 0,5 mg/1IBA lên khả năng | 46
nhân chồi cây hồ tiêu
Bảng 3.10 | Ảnh hưởng của 2,5 mg/1 BAP kết hợp 0,5 mg/IIBAvà | 48
than hoạt tính lên khả năng nhân chỗi cây hô tiêu
Bảng 3.11 | Ảnh hưởng của 2,4-D và BAP lên khả năng tạo callus

51

của lá

Bảng 3.12 | Ảnh hưởng của 2,4-D và BAP lên khả năng tạo callus

53

của cuống lá

Bảng 3.13 | Ảnh hưởng của NAA lên khả năng tạo rễ trên môi trường | 55
MS
Bảng 3.14 | Ảnh hưởng của NAA lên khả năng tạo rễ trên môi trường | 57
⁄2 MS
Bảng 3.15 | Ảnh hưởng của 0,3 mg/1 NAA kết hợp với than hoạt tính | 59

lên khả năng tạo rễ trên môi trường 1⁄2 MS


DANH MUC HINH VE

Hình 2.1 | Cây Hồ tiêu tự nhiên (Piper nigrum L.) giống Srilankal

26

ngồi tự nhiên

Hình 2.2 | Sơ đồ bố trí quy trình thí nghiệm

29

Hinh 3.1

| Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung|

31

| Biểu đồ anh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung|

32

dịch HgCl; 0,1% đến đoạn mắt đốt cây hơ tiêu

Hình3.2

dịch HgCl; 0,1% kết hợp với NaOCIl 5% trong 5 phút

đến đoạn mắt đốt cây hỗ tiêu

Hình 3.3 | Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung|
dịch HgCl; 0,1% kết hợp với NaOCl 5% trong 5 phút
đến hạt chín cây hồ tiêu

34

Hình 3.4 | Chi tái sinh từ đoạn mắt đốt trên môi trường MS bé|

37

sung 1 mg/l BAP

Hinh 3.5 | Chéi in vitro hinh thành từ hạt trên môi trường MS b6|

39

sung 1,5 mg/l Kin
Hinh 3.6 | Chỗi in viro hình thành từ hạt trên mơi trường MS bồi

41

sung 1,0 mg/l BAP

Hình 3.7 | Chéi in vitro hinh thành từ hạt trên môi trường MS bổ|

43

sung 0,15 mg/l TDZ

Hinh 3.8 | Cum chổi in vi/o trên môi trường MS bổ sung BAP|

45

sau 8 tuần ni cấy
Hình 3.9

Ì Cụm chỗi in vio trên môi trường MS

bồ sung tổ hợp|

47

BAP và 0,5 mg/1 IBA sau 8 tuần ni cây
Hình 3.10 | Cum chdi in vitro trén méi truong MS bé sung tô hợp

50

2,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l IBA va than hoạt tính sau 8
tuần ni cây

Hình 3.11 | Callus hình thành từ lá hồ tiêu trên mơi trường MS bổ|_
sung 3,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l 2,4-D

52


Hinh 3.12 | Callus hinh thanh tir cuéng 14 hé tiéu trén mdi truéng|

54

MS b6 sung 3,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l 2,4-D
Hình 3.13 | Rễ tạo thành trên mơi trường MS

bổ sung 0,3 mg/l|

56

Hình 3.14 | Rễ tạo thành trên mơi trường 1⁄2 MS bổ sung 0,3 mg/l}

58

NAA
NAA
Hình 3.15 | Rễ tạo thành trên môi trường 1⁄2 MS bổ sung 0,3 mg/1|

60

NAA +0,1 g/1 than hoạt tính

Hình 3.16 | Sơ đồ kết quả quy trình bước đầu nhân giống iw viro|
cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) giéng Srilanka

61


MO DAU

1. Ly do chon dé tai
Trong hơn 1000 loài thuộc chi Piper, hồ tiêu (Piper nigrum L.) là loại
cây cơng nghiệp có giá trị kinh tế cao. Hạt tiêu là một loại gia vị được u
thích trên tồn thế giới và được mệnh danh là vua của các loại g1a vi, c6 vi
nóng cay và mùi thơm vơ cùng hấp dẫn nên trở thành nhu cầu không thể thiếu
trong chế biến thực phẩm

[38], [47]. Ngoài ra, trong hạt tiêu cịn chứa rất

nhiều hợp chất quan trọng có thể được sử dụng trong y học, làm chất chống
côn trùng, bọ ve... và đặc biệt là chế biến nước hoa [28].
Hiện nay, ở nước ta ngồi những giống tiêu thơng thường như tiêu Vĩnh

Linh, Phú Quốc, Di Linh...thì tiêu Srilanka là giống mới được nhiều hộ trồng
tiêu lựa chọn. Tiêu Srilanka có xuất xứ từ đảo quốc Srilanka được trồng nhiều
ở khu vực phía Bắc Thái Lan đã du nhập vào Việt Nam và được trồng tại một
số khu vực các tỉnh Tây Nguyên (Đăk Lăk, Đăk Nông, Gia Lai, Lâm Đồng...)
và các tỉnh khác (Bình Phước, Bà Rịa Vũng Tàu...) cho năng suất rất cao

vượt trội hơn gấp khoảng hai lần so với các giống tiêu trong nước. Tiêu
Srilanka là giống tiêu có khả năng chống sâu bệnh tốt, sức đề kháng mạnh, bộ
rễ khỏe nên khả năng chống chịu với sự thay đổi thời tiết rất cao. Đặc biệt
năng suất từ 10 - 12 kg/trụ trong một năm, gấp khoảng

1,5 lần so với các

giống tiêu thông thường [50]. Tuy nhiên, hiện nay việc nhân giống tiêu tại
Việt Nam băng các biện pháp nhân giống thông thường như nhân giống bằng
hạt, giâm cành cho hệ số nhân thấp mà cây con không đồng nhất, và cho năng
suất-không cao như cây mẹ nhập khâu. Vì vậy đa phần giống tiêu Srilanka

được các hộ trồng tiêu sử dụng để trồng là giống nhập khẩu với giá tiền rất

cao từ 80.000 - 100.000 đồng/bầu vào năm 2017, hiện nay thì cịn khoảng

30.000 - 50.000 đồng/bầu tại trung tâm cây giống vườn ươm Lafarm viện
Eakmat của Việt Nam, gấp khoảng 5 lần so với các giống tiêu thông thường.


Trước thực trạng trên thì ni cây mơ thực vật là một giải pháp đem lại hiệu
quả thiết thực để nhân giống cây hồ tiêu Srilanka đáp ứng một số lượng giống
lớn, nhanh chóng và sạch bệnh, ồn định di truyền cho thế hệ sau, đảm bảo
_ chất lượng cây giống tốt, đồng đều như cây mẹ đã được chọn lọc [2], [14].
Trong những năm gần đây, hướng nghiên cứu nhân giống in vi#o cây hồ
tiêu đã được rất nhiều nhà khoa học trong nước cũng như trên thế giới quan
tâm: Nghiên cứu kỹ thuật tái sinh phôi soma cây tiêu (Piper nigrum L.) (Bùi
Thị Tường Thu và cs, 2007) [25], nghiên cứu sự phát sinh hình thái trong
ni cấy lát mỏng tế bào lá ở cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) (Dé Đăng Giáp và

cs, 2009) [6], nuôi cấy mô cây tiêu từ các bộ phận thân, lá và đỉnh chồi
(Hussain và cs, 2001) [35], nghiên cứu sự hình thành callus cây hồ tiêu (Piper
nigrum L.) (Dipali M Wankhade, 2014) [33], nuôi cây mô phân sinh để tái
sinh nhanh cây tiêu đen (Piper nigrum L.) (Umadevi va cs, 2015) [48]. Tuy
nhiên, hiện nay chưa có một cơng trình nghiên cứu khoa học nào về nhân
giống cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) giéng Srilanka.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Bước đầu nghiên
cứu nhân giống in vifro cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) giống Srilanka”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu chung: Bước đầu nghiên cứu quy trình nhân giống i vi/ro cây
hồ tiêu (Piper nigrum L.) giéng Srilanka.
Mục tiêu cu thé:

- Xác định chất khử trùng ứng với nồng độ và thời gian xử lý thích hợp
cho tỷ lệ mẫu sống cao.

- Xác định mơi trường tối ưu cho tạo chồi in viro cây hồ tiêu (Piper
nigrum L.) giéng Srilanka.

- X4ec dinh méi truéng téi uu cho nhan chdi in vitro cây hồ tiêu (Piper
nigrum L.) giông Srilanka.


- Xác định môi trường tối ưu cho qua trinh tao callus tir mau in vitro cay
ho tiéu (Piper nigrum L.) giéng Srilanka.
- Xác định môi trường tối ưu cho qua trinh tao ré in vio

cây hồ tiêu

(Piper nigrum L.) giéng Srilanka.

3. Đối tượng nghiên cứu
Cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) giống Srilanka thuộc:
+ Chi: Piper

+ Ho: Piperaceae

+ Bộ: Piperales

4. Phạm vi nghiên cứu
Địa điểm: Phịng thí nghiệm bộ mơn Sinh học Ứng dụng, khoa Sinh học,
Đại học Khoa hoc Hué.
Thời gian: Tháng 1/2018 đến tháng 12/2018.

5. Phương pháp nghiên cứu
Khảo sát thực nghiệm: Mẫu vật được cấy lên các mơi trường đinh dưỡng

có bố sung các chất kích thích sinh trưởng với các nồng độ khác nhau để thăm
do khả năng tạo chéi, tao cum chdi, tao callus, tao ré cia chi in vitro.
Xử lý thống kê: Kết quả thí nghiệm được xử lý để thu giá trị trung bình
và phan tich Duncan’s test bang phan mém SSPS

16.0 với mức xác suất có ý

nghĩa p < 0,05.
6. Bồ cục báo cáo

Mở đầu
Nội dung

- Chương 1: Tổng quan tài liệu
- Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

- Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Kết luận và kiến nghị
Tài liệu tham khảo