BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA LUMBROKINASE Ở PICHIA PASTORIS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VŨ THỊ BÍCH NGỌC

BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA
LUMBROKINASE Ở PICHIA PASTORIS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VŨ THỊ BÍCH NGỌC

BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH
CHẤT CỦA LUMBROKINASE Ở PICHIA
PASTORIS

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số

: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. QUYỀN ĐÌNH THI

PGS. TS. TRỊNH HỒNG THÁI

Hà Nội - 2014


Luận văn thạc sĩ

Khoa Sinh học

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS. TS. Quyền Đình
Thi- Trưởng phịng Cơng nghệ sinh học Enzyme- Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm
khoa học và công nghệ Việt Nam, người thầy đã rất quan tâm, tận tình chỉ bảo, định hướng
nghiên cứu và hướng dẫn tơi trong suốt q trình cơng tác, học tập, tạo mọi điều kiện để
tơi có thể hồn thành tốt luận văn này.
Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Trịnh Hồng Thái- Trưởng
phòng Proteomic và Sinh học cấu trúc- Đại học Khoa học tự nhiên- Đại học quốc gia Hà
Nội, người thầy đã tạo nền tảng cho tôi từ những ngày đầu tiên làm quen với sinh học thực
nghiệm. Thầy đã rất nhiệt tình hướng dẫn, chỉ bảo tơi trong q trình học tập tại trường,
sửa chữa luận văn và động viên tôi trong thời gian nghiên cứu.
Để thực hiện tốt luận văn này, tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô
giáo trong khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học tự nhiên, đặc biệt là các thầy cô giáo
trong bộ mơn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh học đã tận tình giảng dạy và dìu dắt tơi trong
suốt thời gian học tập tại trường.
Trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự chỉ
bảo nhiệt tình, sự giúp đỡ, chia sẻ những kinh nghiệm trong công việc và cuộc sống của
TS. Đỗ Thị Tuyên, TS. Lý Thị Bích Thủy cùng các anh chị và các bạn học viên, sinh viên
làm việc tại Phịng Cơng nghệ sinh học Enzyme- Viện Cơng nghệ sinh học- Viện Hàn lâm
khoa học và công nghệ Việt Nam. Tôi xin chân thành cảm ơn.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên và luôn

bên tôi trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, tháng 10 năm 2014
Học viên

Vũ Thị Bích Ngọc

Vũ Thị Bích Ngọc

i

Cao học K20


Luận văn thạc sĩ

Khoa Sinh học

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN........................................................................................................... i
MỤC LỤC............................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC BẢNG...................................................................................... v
DANH MỤC CÁC HÌNH...................................................................................... vi
BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT.................................................... viii
MỞ ĐẦU.................................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH TẮC NGHẼN MẠCH MÁU................................. 3
1.1.1. Sơ lƣợc về bệnh tắc nghẽn mạch máu...................................................... 3
1.1.2. Q trình đơng máu và cơ chế tan huyết khối........................................... 3
1.1.3. Một số thuốc điều trị tắc nghẽn mạch máu............................................... 6

1.2. KHÁI QUÁT VỀ ENZYME THỦY PHÂN FIBRIN...................................... 9
1.2.1. Một số nguồn sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin.............................. 9
1.2.2. Phân loại enzyme thủy phân fibrin......................................................... 11
1.3. KHÁI QUÁT VỀ ENZYME LUMBROKINASE......................................... 12
1.3.1. Cấu trúc và đặc tính của lumbrokinase................................................... 12
1.3.2. Tình hình nghiên cứu lumbrokinase ở Việt Nam.................................... 15
1.3.3. Tình hình nghiên cứu lumbrokinase trên thế giới................................... 16
1.4. HỆ BIỂU HIỆN PICHIA PASTORIS............................................................. 19
1.4.1. Khái quát về hệ biểu hiện Pichia pastoris.............................................. 19
1.4.2. Chuyển gen ngoại lai vào genome nấm men........................................... 22
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP............................................... 24
2.1. VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT......................................................................... 24
2.1.1. Vật liệu................................................................................................... 24

Vũ Thị Bích Ngọc

ii

Cao học K20


Luận văn thạc sĩ

Khoa Sinh học

2.1.2. Hóa chất.................................................................................................. 24
2.1.3. Các dung dịch và đệm............................................................................. 25
2.1.4. Mơi trƣờng............................................................................................. 26
2.1.5. Máy móc và thiết bị................................................................................ 27
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................ 28

2.2.1. Phƣơng pháp nuôi cấy............................................................................ 28
2.2.2. Khảo sát điều kiện nuôi cấy biểu hiện LK tái tổ hợp..............................29
2.2.3. Tinh sạch protein tái tổ hợp.................................................................... 29
2.2.4. Tách fibrinogen....................................................................................... 30
2.2.5. Xác định hoạt tính thủy phân fibrin........................................................ 31
2.2.6. Xác định hàm lƣợng protein................................................................... 32
2.2.7. Xác định các yếu tố ảnh hƣởng lên hoạt tính và độ bền của enzyme.....33
2.2.8. Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)......................................................... 34
2.2.9. Phản ứng nối ghép gen ngoại lai............................................................. 35
2.2.10. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli............................................ 35
2.2.11. Tách chiết DNA plasmid từ tế bào E. coli............................................. 36
2.2.12. Điện di DNA trên gel agarose............................................................... 36
2.2.13. Xử lí DNA plasmid bằng enzyme cắt giới hạn...................................... 37
2.2.14. Tinh sạch DNA gel agarose.................................................................. 37
2.2.15. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào nấm men bằng phƣơng pháp xung
điện................................................................................................................... 38
2.2.16. Tách chiết DNA tổng số nấm men........................................................ 39
2.2.17. Điện di protein trên gel polyacrylamide ( SDS- PAGE)........................40
2.2.18. Nhận dạng protein ngoại lai bằng kĩ thuật MALDI- TOF (MS/ MS)
(Matrix-assisted laser desorption ionization- Time of flight)............................ 41

Vũ Thị Bích Ngọc

iii

Cao học K20


Luận văn thạc sĩ

Khoa Sinh học

2.2.19. Giải trình tự nucleotide......................................................................... 41
2.2.20. Xử lý số liệu......................................................................................... 42
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................... 43
3.1. NHÂN DỊNG GEN MÃ HĨA LUMBROKINASE.................................... 43
3.1.1. Thiết kế vector tách dòng pJET1.2 blunt/lk (pJLK)................................43
3.1.2. Thiết kế vector biểu hiện pPICZαA/LK (pPLK)..................................... 46
3.2. BIỂU HIỆN LUMBROKINASE TRONG P. PASTORIS X33......................49
3.2.1. Tạo chủng P. pastoris X33 mang gen lk.................................................. 49
3.2.2. Sàng lọc các dòng P. pastoris X33/pPLK tái tổ hợp...............................51
3.2.3. Biểu hiện P. pastoris X33/pPLK tái tổ hợp............................................. 52
3.2.4. Tối ƣu môi trƣờng biểu hiện.................................................................. 53
3.2.5. Tối ƣu nồng độ methanol....................................................................... 55
3.2.6. Tối ƣu thời gian biểu hiện...................................................................... 56
3.3. TINH SẠCH rLK.......................................................................................... 56
3.4. ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA rLK............................................................ 58
3.4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt tính và độ bền enzyme rLK...............58
3.4.2. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt tính và độ bền enzyme rLK.......................61
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................................. 64
PHỤ LỤC................................................................................................................. i

Vũ Thị Bích Ngọc

iv

Cao học K20


Luận văn thạc sĩ

Khoa Sinh học

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Hoạt tính thủy phân fibrin và casein của một số protease.......................12
Bảng 2.1. Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu........................................ 24
Bảng 2.2. Dung dịch sử dụng trong nghiên cứu...................................................... 25
Bảng 2.3. Môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu.................................................... 27
Bảng 2.4. Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu.....................................28
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR với thể tích 25 µl......................................... 34
Bảng 2.6. Thành phần gel polyacrylamide 12,5%................................................... 40
Bảng 3.1. Hoạt tính rLK ở các mơi trƣờng biểu hiện khác nhau............................. 53
Bảng 3.2. Hiệu suất tinh sạch rLK.......................................................................... 58

Vũ Thị Bích Ngọc

v

Cao học K20


Luận văn thạc sĩ

Khoa Sinh học

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Q trình hình thành cục máu đơng trong mạch máu................................4
Hình 1.2. Vai trị của antiplasmin (chất ức chế plasmin)........................................... 5
Hình 1.3. Sơ đồ chuyển hóa plasminogen................................................................. 6

Hình 1.4. Cấu trúc bậc 3 của lumbrokinase tách chiết từ các loài giun đất.............14
Hình 1.5. Cơ chế hoạt động của lumbrokinase........................................................ 15
Hình 1.6. Con đƣờng chuyển hóa methanol trong P. pastoris................................. 21
Hình 1.8. Hiện tƣợng tích hợp gen ngoại lai vào vị trí 5’AOX1 hoặc aox1::ARG4
của genome nấm men P. pastoris............................................................................ 23
Hình 2.1. Đƣờng chuẩn plasmin (Sigma)............................................................... 32
Hình 2.2. Đƣờng chuẩn BSA (Sigma).................................................................... 32
Hình 3.1. Điện di đồ sản phẩm PCR....................................................................... 43
Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm tách plasmid pJLK, sản phẩm cắt kiểm tra plasmid
pJLK với XbaI và XhoI........................................................................................... 44
Hình 3.3. Trình tự vector tách dịng pJLK............................................................... 45
Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm tinh sạch vector pPICZαA và gen lk , sản phẩm tách
plasmid pPLK , sản phẩm cắt plasmid pPLK với enzyme EcoRI và XbaI..............47
Hình 3.5. Trình tự vector biểu hiện pPLKvà trình tự amino acid tƣơng ứng..........48
Hình 3.6. Điện di đồ tinh sạch sản phẩm cắt plasmid pPLK với enzyme SacI........49
Hình 3.7. Điện di đồ sản phẩm tách DNA nấm men, sản phẩm PCR bộ gen nấm
men P. pastoris X33................................................................................................ 50
Hình 3.8. Đĩa thử hoạt tính thủy phân fibrin của dịch nổi thu từ các dòng P. pastoris
X33/ pPLK tái tổ hợp.............................................................................................. 52
Hình 3.9. Điện di đồ protein ngoại bào thu đƣợc từ dịch nuôi cấy chủng nấm men
tái tổ hợp................................................................................................................. 53
Hình 3.10. Điện di đồ protein ngoại bào thu đƣợc từ dịch tối ƣu môi trƣờng biểu
hiện X33/pPLK....................................................................................................... 54

Vũ Thị Bích Ngọc

vi

Cao học K20

Luận văn thạc sĩ

Khoa Sinh học

Hình 3.11. Ảnh hƣởng của nồng độ MeOH cảm ứng lên mức độ biểu hiện rLK....55
Hình 3.12. Tối ƣu thời gian biểu hiện rLK............................................................. 56
Hình 3.13. Điện di đồ sản phẩm tinh sạch rLK....................................................... 57
Hình 3.14. Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme rLK....................................60
Hình 3.15. Ảnh hƣởng nhiệt độ đến độ bền enzyme rLK....................................... 61
Hình 3.16. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt tính enzyme rLK...................................... 62
Hình 3.17. Ảnh hƣởng của pH lên độ bền enzyme rLK.......................................... 63

Vũ Thị Bích Ngọc

vii

Cao học K20


Luận văn thạc sĩ

Khoa Sinh học
BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt

Viết đầy đủ

2D- PAGE

Two dimention - polyacrylamide gel electrophoresis
(Điện di hai chiều trên gel polyacrylamide)

APS

Ammonium persulfate

ARN

Acid ribonucleic

BLAST

Basic local alignment search tool (Cơng cụ tìm kiếm liên kết
định vị cơ bản)

BSA

Bovine serum albumin (albumin huyết thanh bò)

Bp

Base pairs (Cặp bazo)

cs

Cộng sự

cDNA

Complement DNA

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

2’ Deoxynucleoside 5’ triphosphate

ĐC

Đối chứng

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

EtBr

Ethidium bromide

kb

Kilo base

kDa

Kilo dalton

M

Marker (Thang chuẩn)

MALDI- TOF

Matrix- assisted laser desorption/ionization- time of flight (ion
hóa mẫu hấp thụ dựa trên chất nền và năng lƣợng laser- thời
gian bay )

Vũ Thị Bích Ngọc
K20

viii

Cao học


Luận văn thạc sĩ

Khoa Sinh học

MS
OD

Mass spectrometry (Khối phổ)
Optical density (Mật độ quang học)

PBS

Phosphate buffered saline (Dung dịch đệm phosphate)

PCR

Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

RNA

Ribonucleic acid

RNase

Ribonuclease

rLK

Recombinant lumbrokinase (lumbrokinase tái tổ hợp)

Rpm

Revolutions per minute (Vòng quay/ phút)

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SDS- PAGE

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

Taq

Thermus aquaticus

TBE

Tris boric acid EDTA

TCA

Trichloroacetic acid

TE

Tris EDTA

TEMED

N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine

v/v

Volume/ volume (Thể tích/ thể tích)

w/v

Weight/ volume (Khối lƣợng/ thể tích)

YNB

Yeast nitrogen base

WHO

World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

Vũ Thị Bích Ngọc

ix

Cao học K20


Luận văn thạc sĩ

Khoa Sinh học

MỞ ĐẦU

Bệnh tim mạch là một trong nh ng nguyên nh n g y tử vong cao nhất trên
toàn thế giới. Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), hàng năm có khoảng trên 17 triệu
ngƣời chết vì bệnh tim mạch, dự tính lên tới 23,3 triệu ngƣời vào năm 2030. Trên
80% các ca tử vong xảy ra ở các nƣớc có thu nhập thấp và trung bình, điển hình là
các nƣớc đang phát triển tại vùng Nam Á và Đông Nam Á, nơi bệnh tim mạch đang
gia tăng cùng với tốc độ công nghiệp hóa, đơ thị hóa và nh ng thay đổi trong lối
sống [64]. Tại Việt Nam, theo thống kê của Viện tim mạch, tỷ lệ ngƣời d n mắc các
bệnh tim mạch và đột quỵ khoảng 16% d n số.
Có nhiều nguyên nh n dẫn tới rối loạn tim mạch và mạch máu não nhƣ:
chứng tràn máu não, tăng huyết áp, xơ cứng động mạch,….[34]. Trong tổng số các

bệnh nh n bị tai biến mạch máu não thì có đến 24% tử vong, 50% sống nhƣng bị
các di chứng nặng hoặc nhẹ, chỉ có 26% số bệnh nh n sống và làm việc bình
thƣờng. Nguyên nh n chủ yếu là do xuất hiện cục máu đông g y tắc mạch và cản trở
lƣu thơng máu. Do đó, việc làm tan cục máu đơng đóng vai trị quan trọng trong
việc điều trị bệnh này.
Vào khoảng nh ng năm 90, các nhà nghiên cứu tại Nhật Bản đã phát hiện
đƣợc 1 enzyme có hoạt tính thủy ph n fibrin cao từ giun đất Lumbricus rubellus,
bao gồm 6 izozyme đƣợc đặt tên chung là lumbrokinase (LK) [47,50]. Về phƣơng
diện l m sàng, LK đƣợc xem là thuốc tan huyết khối đặc hiệu, sử dụng làm thuốc
uống vì có thể đƣợc hấp thu từ ruột vào máu và hoạt hóa hệ thống fibrin nội sinh
[66]. Một ƣu điểm lớn của lumbrokinase so với các thuốc điều trị bệnh tắc nghẽn
mạch thông dụng khác - thƣờng đƣợc sử dụng làm thuốc tiêm (nhƣ tPA (tissue type
plasminogen activator), urokinase và streptokinase) [40,42] là khơng có tác dụng
phụ, không g y chảy máu hệ thống, giá thành rẻ.
Hiện nay, hầu hết các thuốc đặc trị tắc nghẽn mạch máu có mặt tại Việt nam
phải nhập khẩu từ nƣớc ngồi và có giá thành cao.
Vì vậy, nh ng năm gần đ y, nghiên cứu sản xuất các yếu tố chống tắc nghẽn
mạch máu dạng tự nhiên và tái tổ hợp bắt đầu đƣợc quan t m ở trong nƣớc. Trong

Vũ Thị Bích Ngọc

1

Cao học K20


Luận văn thạc sĩ

Khoa Sinh học

số đó, LK nhận đƣợc rất nhiều quan t m của các nhà khoa học do nh ng ƣu điểm
nổi bật của nó. Tuy nhiên, các nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở mức độ tinh sạch,
đánh giá tính chất l hóa của LK từ giun đất và tách dịng gen mã hóa LK, hiện chƣa
có cơng bố nào về nghiên cứu sản xuất lumbrokinase tái tổ hợp để làm thuốc.
Nhằm góp phần vào việc hạ giá thành sản phẩm và chủ động nguồn nguyên
liệu để sản xuất lumbrokinase, đề tài KC04.01/11-15 (2012-2014) “Nghiên cứu quy
trình cơng nghệ sản xuất lumbrokinase tái tổ hợp làm thuốc phòng chống tắc nghẽn
mạch máu’’ do PGS.TS. Quyền Đình Thi làm chủ nhiệm đã đề xuất x y dựng quy
trình cơng nghệ tạo các dịng tế bào sản xuất LK tái tổ hợp. Trong khuôn khổ đề tài
này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất
của lumbrokinase ở Pichia pastoris”, nhằm tiến tới x y dựng đƣợc quy trình cơng
nghệ tạo các dòng tế bào sản xuất LK tái tổ hợp dùng làm nguyên liệu thuốc cũng
nhƣ x y dựng quy trình cơng nghệ ổn định sản xuất LK tái tổ hợp. Với đề tài trên,
luận văn tập trung giải quyết các vấn đề sau:
1.

Sử dụng công nghệ gen và công nghệ protein để biểu hiện và tinh sạch
đƣợc enzyme lumbrokinase có hoạt tính thủy phân fibrin.

2.

Nghiên cứu một số tính chất của enzyme LK tái tổ hợp tinh sạch đƣợc.

Vũ Thị Bích Ngọc

2

Cao học K20

Luận văn thạc sĩ

Khoa Sinh học

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH TẮC NGHẼN MẠCH MÁU
1.1.1. Sơ lƣợc về bệnh tắc nghẽn mạch máu
Bệnh tắc nghẽn mạch máu g y ra rối loạn tim mạch và mạch máu não là một
trong nh ng nguyên nh n g y tử vong hàng đầu trên toàn thế giới. Liên đoàn tim mạch
thế giới đƣa ra thống kê cứ ba ngƣời tử vong trong đó có một ngƣời chết vì bệnh tim
mạch. Ở Mỹ, cứ 29 gi y có thêm một ngƣời bị bệnh mạch vành, và cứ 1 phút thì có một
ngƣời tử vong. Tử vong do bệnh tim mạch chiếm 42% tồn bộ các ca tử vong, phí tổn
do bệnh chiếm 128 tỉ USD/ năm. Hiện nay trên thế giới số ngƣời chết hoặc chịu di
chứng nặng nề từ các bệnh tim mạch và tai biến mạch máu não ngày càng gia tăng nhất
là ở các nƣớc đang phát triển. Ngồi ra cịn có rất nhiều bệnh liên quan đến tắc nghẽn
mạch máu nhƣ: tràn máu não, nhồi máu cơ tim, tắc động mạch phổi. Nguyên nh n chủ
yếu của các bệnh trên là do các cục máu đơng làm tắc nghẽn mạch máu. Do đó để hạn
chế thấp nhất tỷ lệ tử vong và các biến chứng do bệnh tim mạch g y ra, các nhà khoa
học đã đi theo hƣớng xử l các huyết khối hình thành trong thành mạch. Và việc làm tan
cục máu đông đóng vai trị quan trọng trong việc điều trị bệnh tim mạch [7].

1.1.2. Q trình đơng máu và cơ chế tan huyết khối
Đông máu là hiện tƣợng sinh lý xảy ra khi mạch máu bị tổn thƣơng, máu
đƣợc chuyển từ thể lỏng sang thể đặc. Quá trình bao gồm một chuỗi các phản ứng
xảy ra theo kiểu bậc thang đƣợc chia thành 3 giai đoạn: giai đoạn hình thành phức
hợp prothrombinase qua 2 con đƣờng nội sinh và ngoại sinh, giai đoạn hình thành
thrombin từ prothrombin và giai đoạn tạo mạng lƣới fibrin từ fibrinogen hình thành
cục máu đơng [1].
Cơ chế đông máu đƣợc bảo tồn khá chắc trong tiến hóa, riêng với lớp thú, hệ
thống đơng máu tồn tại 2 thành phần là tế bào (tiểu cầu) và protein (các yếu tố đông

máu). Rối loạn của 1 trong 2 thành phần gây rối loạn trong q trình đơng máu, tác
động tới việc máu đơng nhiều hoặc đơng q ít.

Vũ Thị Bích Ngọc

3

Cao học K20


Luận văn thạc sĩ

Khoa Sinh học

Khi chấn thƣơng làm tổn hại đến nội mạc mạch máu, tiểu cầu lập tức tạo nút
chặn cầm máu tại vết thƣơng, đ y đƣợc coi là quá trình cầm máu ban đầu. Quá trình
cầm máu thứ phát diễn ra đồng thời, các yếu tố đông máu trong huyết tƣơng đáp
ứng một loạt các chuỗi phản ứng để tạo các sợi huyết có vai trị củng cố nút chặn
tiểu cầu.
Đ y thực chất là chuyển fibrinogen dạng hịa tan thành fibrin dạng khơng hịa
tan, sau đó, các mạch máu sẽ tạo mạng lƣới chứa tiểu cầu sợi huyết hình thành cục
máu, gắn vào thành mạch để ngăn chặn sự mất máu và tạo điều kiện để liền vết
thƣơng (Hình 1.1).
Giai đoạn 1:
Tiểu cầu gắn vào
màng trong (thành
mạch máu)

Giai đoạn 2:
Tiểu cầu giải phóng

fibrin và bắt đầu bịt
kín thành mạch máu

Giai đoạn 3:
Mạng lƣới fibrin bắt gi
hồng cầu, bịt kín hồn
tồn thành mạch máu

Khối
fibrin
Tiểu cầu

Tế bào
hồng
cầu
Mơ liên
kết

Màng
trong
thành

Hình 1.1. Q trình hình thành cục máu đơng trong mạch máu

Bình thƣờng trong cơ thể, q trình đơng máu đƣợc kiểm sốt chặt chẽ bởi
q trình chống đơng máu để khu trú việc đông máu chỉ ở chỗ bị thƣơng mà khơng
lan rộng ra cả dịng máu. Tham gia q trình chống đơng máu là hàng loạt các chất
chống đông khác nhau và hiện tƣợng tiêu fibrin dƣới tác dụng của plasmin- enzyme
thủy phân fibrin của cơ thể [2]. Q trình đơng máu liên quan tới 1 hệ thống phản
ứng protease bao gồm khoảng 30 loại protein khác nhau, trong khi đó chỉ có 1

enzyme plasmin có thể phá vỡ cục máu đơng.

Vũ Thị Bích Ngọc

4

Cao học K20


Luận văn thạc sĩ

Khoa Sinh học

Cục máu đơng có thể tan trở lại nhờ quá trình tan huyết khối nhằm tái lƣu
thơng tuần hồn máu, đ y là q trình ngƣợc với q trình đơng máu. Có hai cơ chế
làm tan huyết khối là: cơ chế ph n hủy fibrin thơng qua hoạt hóa plasminogen thành
plasmin và cơ chế ph n hủy trực tiếp fibrin (Hình 1.3).
Đối với cơ chế tan huyết khối thơng qua hoạt hóa plasminogen có sự tham
gia của các yếu tố gồm: plasminogen, plasmin và các chất hoạt hóa. Plasmin gồm 2
chuỗi polypeptide nối với nhau bằng một cầu nối disulfide, chuỗi nhẹ gắn serineprotease, chuỗi nặng có vị trí gắn fibrin. Yếu tố này đƣợc tạo ra dƣới dạng không
hoạt động là plasminogen ở gan. Đ y là một chuỗi polypeptide chứa 791 amino acid.
Chất hoạt hóa plasminogen của mơ (tPA) chuyển plasminogen thành plasmin,
plasmin xúc tác phản ứng cắt fibrin thành các sản phẩm tan đƣợc, đƣợc gọi là sản
phẩm thoái giáng của fibrin (FDPs). Các sản phẩm này có tác dụng cạnh tranh với
thrombin làm chậm sự chuyển hóa fibrinogen thành fibrin (làm chậm sự tạo thành
cục máu). Trong máu ngƣời bình thƣờng, plasmin tồn tại song song với yếu tố ức
chế là antiplasmin (Hình 1.2). Nó có nồng độ cao hơn 30 lần so với plasmin trong
huyết tƣơng, chống lại tác động của plasmin tới việc ph n hủy protein trong huyết
tƣơng [7]. Trong máu có 2 yếu tố hoạt hóa plasminogen tự nhiên là yếu tố hoạt hóa
mơ (tPA) và urokinase (uPA), các hoạt động tiêu sợi huyết tự nhiên đƣợc kiểm sốt

bởi các chất ức chế hoạt hóa plasminogen (ví dụ PAI-1: plasminogen activator
inhibitor – 1, một chất ức chế tác dụng nhanh của t-PA và u-PA) và các chất ức chế
plasmin (ví dụ a1- antiplasmin, a2-macroglobulin) [22].

Hình 1.2. Vai trị của antiplasmin (chất ức chế plasmin)

Vũ Thị Bích Ngọc

5

Cao học K20


Luận văn thạc sĩ

Khoa Sinh học

Nhờ cơ chế trên mà cơ thể gi

đƣợc sự ổn định và c n bằng gi a q trình

đơng máu và tan huyết khối.
Yếu tố hoạt hóa
plasminogen nội
mơ (tPA)
Yếu tố XIa,
XIIa

Yếu tố ức chế hoạt hóa

Sản phẩm thối
giáng của fibrin
Thrombin- yếu tố ức
chế q trình thuỷ ph n
Hình 1.3. Sơ đồ chuyển hóa plasminogen

Cơ chế tan huyết khối thông qua ph n hủy trực tiếp fibrin đƣợc xem là cơ chế
an toàn hơn cơ chế hoạt hóa plasminogen vì plasmin có liên quan đến hệ thống cầm
máu của cơ thể, nếu lƣợng plasminogen đƣợc hoạt hóa thành plasmin mất c n bằng
so với antiplasmin thì sẽ nguy hiểm với nh ng vết thƣơng chảy máu. Ngồi các yếu
tố lumbrokinase, t-PA và u-PA khơng có yếu tố nào có thể ph n hủy trực tiếp fibrin
mà đều phải thơng qua hoạt hóa plasminogen [46].
Ý nghĩa của quá trình thủy phân fibrin là rất lớn vì fibrin có thể đƣợc
thải loại từ dịng máu, tạo các kháng đơng và kháng kết dính có hoạt tính cao.
1.1.3. Một số thuốc điều trị tắc nghẽn mạch máu
Hiện nay trên thế giới, do nh ng thay đổi trong môi trƣờng và lối sống, số
bệnh nhân tử vong do bệnh tim mạch ngày càng tăng cao, đặc biệt là ở nh ng nƣớc
đang phát triển. Do vậy, nhu cầu về thuốc ch a bệnh tim mạch là rất lớn.

Vũ Thị Bích Ngọc

6

Cao học K20


Luận văn thạc sĩ

Khoa Sinh học

Trong hầu hết các thể khác nhau của bệnh nhƣ: bệnh tràn máu não, nhồi máu
cơ tim hay tắc nghẽn động mạch phổi đều có nguyên nhân tắc nghẽn mạch do việc
hình thành cục máu đông trong mạch máu [51]. Việc điều trị thƣờng tập trung vào
kìm hãm sự tạo thành fibrin hoặc g y tác động để chuyển hóa plasminogen thành
plasmin.
Trƣớc đ y, các thuốc kháng đơng có bản chất hóa học nhƣ heparin và
coumarin thƣờng đƣợc sử dụng trong việc xử l bệnh nghẽn mạch với tác dụng kìm
hãm sự tạo thành cục fibrin [64]. Khi tiêm heparin với liều 0,5-1 mg/kg trọng lƣợng
cơ thể có thể kéo dài thời gian đơng máu tới trên 30 phút. Heparin có tác dụng ngay
tức thời nên nhanh chóng ngăn cản sự phát triển của huyết khối. Tác dụng của
heparin kéo dài trong vòng 3- 4 giờ rồi bị phá hủy bởi heparinase có trong máu.
Tiêm coumarin vào cơ thể, coumarin sẽ tác dụng cạnh tranh với vitamin K nh ng vị
trí hoạt động trong các phản ứng enzyme để dẫn đến sự tạo thành bốn yếu tố II, VII,
IX, X. 12 giờ sau khi tiêm coumarin, hoạt tính đơng máu giảm xuống cịn 50% và
sau 24 giờ chỉ cịn bằng 20% so với bình thƣờng. Nhƣ vậy, coumarin khơng có tác
dụng chống đơng ngay lập tức vì cịn phải đợi cho các yếu tố đơng máu có sẵn trong
huyết tƣơng tiêu thụ hết. Ba ngày sau khi chấm dứt điều trị bằng coumarin thời gian
đông máu mới trở lại bình thƣờng [1].
Ngồi ra, các nhà điều trị còn sử dụng aspirin trong việc ngăn ngừa nhồi máu
cơ tim. Các thuốc atropine, papaverine và nitroglyceryl giúp ngăn ngừa hoặc giảm
co thắt mạch vành. Cho đến nh ng năm 1950 các phƣơng pháp chỉ là để làm giảm
nhẹ chứ chƣa phải điều trị [15,55].
Sau khi nhận thấy có thể kìm hãm sự tạo thành fibrin trong cơ thể sống bằng
cách chuyển hóa plasminogen dạng khơng hoạt động thành plasmin hoạt động, các
nghiên cứu l m sàng đã chỉ ra cách tiếp cận tốt nhất để điều trị nghẽn mạch là tiêm
trực tiếp vào tĩnh mạch 1 enzyme có khả năng chuyển hóa plasminogen thành
plasmin. Các enzyme đang đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc điều trị là
streptokinase (từ vi khuẩn α- haemolytic Streptococcus), urokinase (từ nƣớc tiểu
của ngƣời) và tPA (chất hoạt hóa plasminogen của mơ) tái tổ hợp [40].

Vũ Thị Bích Ngọc

7

Cao học K20


Luận văn thạc sĩ

Khoa Sinh học

Nattokinase: là một loại enzyme tự nhiên đƣợc chiết xuất từ môi trƣờng lên
men của vi khuẩn Bacillus natto. Nattokinase làm tan fibrin gấp 4 lần plasmin nội
sinh trong cơ thể. Nattokinase giúp duy trì và tăng cƣờng khả năng ph n hủy fibrin
bình thƣờng của cơ thể nhằm hỗ trợ điều trị và phòng ngừa các bệnh liên quan đến
huyết khối nhƣ nhồi máu cơ tim, thiếu máu lên não, đột quỵ [56,59].
Streptokinase: là một protein có khối lƣợng 47 kDa, sinh ra từ vi khuẩn αhaemolytic Streptococcus. Streptokinase xúc tác chuyển hóa plasminogen ngƣời
thành plasmin qua sự thủy ph n liên kết L-arginyl-L-valyl [42,50].
t-PA: là yếu tố hoạt hóa mơ, có thể sản xuất bằng con đƣờng tái tổ hợp
nhƣng giá thành cao. Đầu tiên t-PA gắn với fibrin, phức này sau đó gắn vào
plasminogen tạo thành phức hợp hoạt hóa plasminogen để thủy ph n fibrin [27,31].
Urokinase: đƣợc tổng hợp bởi tế bào biểu mơ hình ống trong thận ngƣời và
thu đƣợc trong nƣớc tiểu, do đó việc sản xuất và khai thác l m sàng bị hạn chế
(2300 lít nƣớc tiểu mới thu đƣợc 29 mg urokinase tinh khiết) [63]. Urokinase cũng
hoạt động nhƣ một chất hoạt hóa plasminogen, thủy ph n liên kết ester ở L-lysine
và L-arginine [50], thƣờng đƣợc dùng để tiêu hủy huyết khối tại chỗ, ngoài ra còn
dùng để điều trị tắc nghẽn phổi, huyết khối tĩnh mạch s u.Việc sử dụng các enzyme
này đã tỏ ra rất hiệu quả tuy nhiên nó vẫn chƣa thể giải quyết đƣợc hết các vấn đề
nảy sinh trong điều trị nghẽn mạch máu nhƣ sốt, tăng chảy máu cao, tạo kháng
ngun, khó xác định liều lƣợng thích hợp (streptokinase), giá thành cao (t-PA tái tổ

hợp và urokinase) và không hiệu quả khi uống qua đƣờng miệng [37].
Bên cạnh việc hoạt hóa plasminogen thành plasmin, các nhà khoa học cịn
nghiên cứu và tìm kiếm nh ng tác nh n có khả năng thủy ph n trực tiếp fibrin và giải
quyết đƣợc nhƣợc điểm của các loại thuốc đã sử dụng trƣớc đó. Các enzyme này
phổ biến trong tự nhiên từ con ngƣời, động vật, thực vật, vi khuẩn và đã đƣợc sử
dụng thành công trong việc xử l tắc mạch, cứu sống nhiều trƣờng hợp tắc mạch
phổi và nhồi máu cơ tim.

Vũ Thị Bích Ngọc

8

Cao học K20


Luận văn thạc sĩ

Khoa Sinh học

1.2. KHÁI QUÁT VỀ ENZYME THỦY PHÂN FIBRIN
1.2.1. Một số nguồn sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin
Xu hƣớng nghiên cứu tìm ra các enzyme thủy ph n fibrin có nguồn gốc từ
nhiều đối tƣợng khác nhau ngày càng phổ biến.
Năm 1987, Sumi và cs, sau nhiều năm nghiên cứu về enzyme ph n giải cục
nghẽn và tìm kiếm một tác nh n tự nhiên có thể hịa tan cục nghẽn liên quan tới nhồi
máu cơ tim và tai biến mạch máu não, đã phát hiện ra nattokinase- một enzyme có
khả năng thủy ph n fibrin mạnh. Nattokinase đƣợc chiết và tinh sạch từ một loại
thực phẩm lên men truyền thống là Natto, đã đƣợc sử dụng ở Nhật Bản trên 2000
năm nhƣ một vị thuốc d n gian cho các bệnh về tim mạch và tê phù. Natto đƣợc sản
xuất thông qua một quá trình lên men bằng cách bổ sung B. natto, một vi khuẩn có

lợi vào dịch đậu tƣơng đã đƣợc nấu sơi. Khi đó B. natto sẽ sản xuất ra enzyme
nattokinase. Sau khi thử nghiệm trên 173 loại thức ăn tự nhiên đƣợc xem là có tác
dụng đối với các bệnh liên quan tới hiện tƣợng nghẽn mạch máu, Sumi đã tìm đƣợc
điều mà ơng mong muốn khi natto đƣợc nhỏ lên cục nghẽn nh n tạo làm từ fibrin
trên một đĩa petri và để yên ở 37C. Cục nghẽn xung quanh natto đã tan dần và tan
hoàn toàn trong 18 giờ. Ông đã đặt tên cho enzyme mới phát hiện này là
“nattokinase”, có nghĩa là “enzyme ở natto” [56].
Đến năm 1991, Mihara và cs đã tách chiết đƣợc enzyme có hoạt tính thủy ph
n fibrin cao từ giun đất Lumbricus rubellus, một thành phần chính để ch a nh ng cơn
sốt và nhận ra rằng enzyme này gồm có 6 isozyme, ông đã đặt tên chung cho 6
enzyme này là lumbrokinase [47].
Có thể nói, việc nghiên cứu phát hiện các enzyme có hoạt tính thủy ph n
fibrin cao là một trong nh ng vấn đề hiện nay rất đƣợc quan t m. Sau nh ng phát
hiện đầu tiên về enzyme thủy ph n fibrin và triển vọng ứng dụng của nó trong việc
điều trị bệnh tim mạch, hàng loạt nghiên cứu trên các đối tƣợng khác nhau đã đƣợc
công bố. Các enzyme thủy ph n fibrin không chỉ đƣợc tách chiết từ các loại thuốc,
thức ăn truyền thống mà còn từ nhiều lồi động vật, thực vật khác.

Vũ Thị Bích Ngọc

9

Cao học K20


Luận văn thạc sĩ

Khoa Sinh học

Năm 1996, Kim và cs đã tinh sạch đƣợc một enzyme có hoạt tính thủy ph n

fibrin mạnh từ Bacillus sp. CK 11-4, ph n lập từ nƣớc sốt đậu tƣơng ChungkookJang - một loại thực phẩm lên men truyền thống của Hàn Quốc [38] .
Coll-Sangrona và Arocha-Pinango (1998) đã tách chiết enzyme thủy ph n
fibrin từ một loại s u bƣớm Lonomia achelous thu thập trên cánh đồng. Các tác giả
đã kết luận rằng có sự tồn tại một enzyme có khả năng ph n giải cục nghẽn có ích ở
L. achelous và họ đang tiến hành nghiên cứu sử dụng enzyme này làm thuốc ch a
bệnh tắc nghẽn mạch máu [14].
Dametto và cs (2000) đã tách chiết enzyme thủy ph n fibrin từ Haematobia
irritans, một trong nh ng lồi ruồi có nhiều ở Bắc và Nam Mỹ thƣờng g y hại cho
vật nuôi. Ngƣời ta thấy rằng trong số các enzyme thủy ph n protein đƣợc tiết ra
trong q trình tiêu hóa thức ăn (máu) của nó, có các enzyme tƣơng tự trypsin đóng
vai trị trung t m và xuất hiện tƣơng đối muộn (khoảng 8 giờ sau khi hút máu). Hoạt
tính trypsin tăng nhanh và đạt tới mức cao nhất vào khoảng 7-8 giờ sau khi ăn, sau
đó giảm dần tới 15 giờ [18].
Năm 2001, Choi và Sa đã tách chiết và xác định đặc tính của enzyme thủy ph
n fibrin từ loài bèo tấm Spirodela polyrhiza-một thành phần trong bài thuốc d n tộc
ở phƣơng Đông. Bài thuốc này đƣợc sử dụng để làm giảm áp lực máu và giải độc
cho các trƣờng hợp bị rắn cắn [13].
Năm 2004, Wang và cs đã tách chiết enzyme thủy ph n fibrin từ nọc rắn
Agkistrodon acutus. Các enzyme thủy ph n fibrin từ nọc rắn có thể ph n hủy trực
tiếp fibrin và fibrinogen. Enzyme thủy ph n fibrin đầu tiên đƣợc tách chiết từ nọc
rắn A. acutus có hoạt tính g y xuất huyết [63].
Vào năm 2007, các nhà khoa học Nhật Bản đã chỉ ra tác động chống huyết
khối của bột tỏi không mùi ở cả 2 điều kiện in vitro và in vivo. Bột tỏi không ảnh
hƣởng đến yếu tố tPA và các chất ức chế tiết từ tế bào nội mô tĩnh mạch cuống rốn
của ngƣời, tăng cƣờng hoạt động của plasmin nhờ tPA trong thủy ph n fibrin và
trong các xét nghiệm sinh màu khoảng 1,8- 8,7 lần. Ngồi ra, bột tỏi đƣợc xem là

Vũ Thị Bích Ngọc

10

Cao học K20


Luận văn thạc sĩ

Khoa Sinh học

thực phẩm chức năng trong việc kháng tiểu cầu [48], giảm fibrinogen trong máu [8],
làm dày, mịn và thay đổi cấu trúc thành động mạch liên quan đến lão hóa và xơ v a
động mạch, giảm huyết áp [23]. Đ y đƣợc xem là sản phẩm y học tiềm năng chiết
xuất từ thực vật không g y ra các tác dụng phụ [52].
1.2.2. Phân loại enzyme thủy phân fibrin
Fibrin có bản chất là protein nên enzyme thủy ph n nó thuộc lớp 3
(hydrolase), nhóm protease theo cách ph n loại của Hội Hóa sinh quốc tế (năm
1960), xúc tác phản ứng thủy ph n liên kết peptide, tạo thành các peptide ph n tử
thấp và các amino acid. Các enzyme có phản ứng thủy ph n fibrin cao đã nghiên cứu
chủ yếu thuộc nhóm serine protease (trung t m hoạt động bao gồm một bộ ba xúc
tác Asp…His…Ser, duy chỉ có enzyme tách chiết từ nọc rắn A. acutus thuộc nhóm
metalloprotease [63].
Nói chung, chƣa có sự ph n biệt rõ ràng gi a enzyme thủy ph n fibrin và các
enzyme khác thuộc nhóm protease. Ngƣời ta thƣờng nhận ra chúng nhờ vào hoạt
tính thủy ph n fibrin mạnh (đƣợc so sánh với hoạt tính của plasmin). Do thuộc
nhóm protease nên hầu hết các enzyme thủy ph n fibrin đã đƣợc nghiên cứu đều có
hoạt tính thủy ph n casein. Tuy nhiên khơng phải enzyme có hoạt tính thủy ph n
casein cao thì hoạt tính thủy ph n fibrin cũng cao và ngƣợc lại (Bảng 1.1) [38]. Đ y
chính là tính đặc hiệu cơ chất của enzyme.
Mặc dù khơng có một ranh giới rõ ràng gi a enzyme thủy ph n fibrin với các
protease khác, nhƣng nghĩa của các nghiên cứu về nó đều có một điểm chung là:
tìm một enzyme có hoạt tính thủy ph n fibrin mạnh có thể làm thuốc ch a tắc nghẽn

mạch máu. Rõ ràng, khơng phải enzyme có hoạt tính thủy ph n fibrin nào cũng có
thể đáp ứng đƣợc yêu cầu ấy. Bởi vì khi vào mạch máu, enzyme chịu ảnh hƣởng
của rất nhiều yếu tố có trong máu (ví dụ nhƣ 2--macro globulin là chất kìm hãm
protease) cũng nhƣ có nh ng tác động ngƣợc lại đối với máu dẫn đến nh ng ảnh
hƣởng không mong muốn [30].

Vũ Thị Bích Ngọc

11

Cao học K20


Luận văn thạc sĩ

Khoa Sinh học

Bảng 1.1. Hoạt tính thủy phân fibrin và casein của một số protease

Loại protease

Hoạt tính thủy
phân casein (U)

Hoạt tính thủy
phân fibrin (U)

Protease từ Bacillus sp. CK 11-4
Protease từ B. licheliformis (type VIII)

352
423

257
41

Protease từ A. oryzae (type XIII)

127

35

Trypsin tụy bò (type I)

334

75

Subtilizin Carlsberg (type VIII)

325

30

1.3. KHÁI QUÁT VỀ ENZYME LUMBROKINASE
1.3.1. Cấu trúc và đặc tính của lumbrokinase
Lumbrokinase là tên gọi chung chỉ một nhóm gồm 6 isozyme có tác dụng
thủy ph n fibrin, làm tan cục máu đơng. Khối lƣợng ph n tử trung bình của
lumbrokinase từ 25 đến 32 kDa [46]. Lumbrokinase là nh ng chuỗi polypeptide đơn
giàu asparagine hoặc aspartic acid, rất ít proline và lysin, không chứa thành phần

đƣờng. Chúng đƣợc xếp vào serine protease kiềm giống trypsin. Tuy nhiên chúng
giàu asparagine và aspartic acid hơn so với các serine protease khác đã biết.
Lumbrokinase đƣợc tìm thấy trong ruột, dịch mơ và dịch ruột của rất nhiều
lồi giun đất. Chúng có tác dụng tiêu sợi huyết mạnh, ngƣời ta giải thích sự có mặt
của nó trong các loại giun là do chúng cần để tiêu hóa thức ăn là nh ng mảnh vụn
thực vật và các chất h u cơ trong đất nên chúng sản xuất LK nhƣ một serine
protease [46].
Một số nghiên cứu gần đ y cho rằng các enzyme thủy ph n fibrin có thể hịa
tan cục máu đơng và hạn chế đƣợc khả năng vón cục [19,35]. Tuy nhiên, hầu hết
các nghiên cứu đều đi vào tách chiết, tinh sạch, đánh giá tính chất l hóa và ứng dụng
l m sàng của enzyme thủy ph n fibrin từ giun đất L. rubellus, L. bimastus, E.

Vũ Thị Bích Ngọc

12

Cao học K20


Luận văn thạc sĩ

Khoa Sinh học

fetida hoặc E. Andrei [28,66,67]. Một số tác giả thử nghiệm tác dụng chống tắc
nghẽn mạch ở mức độ s u trên động vật thực nghiệm, nghiên cứu biến đổi hóa học
nhằm mục đích làm enzyme bền hơn, nghiên cứu các đặc tính và biến đổi hóa học
của enzyme khi đƣa vào cơ thể [50].
Từ năm 2002 đến 2003, các nhà khoa học Trung Quốc cũng tách chiết đƣợc
enzyme có hoạt tính thủy ph n fibrin cao từ loài giun E. fetida [45,60]. Họ đã chứng
minh rằng các enzyme này có thể sử dụng làm thuốc uống thay thế một số thuốc ch

a bệnh tim mạch rất đắt trên thị trƣờng hiện nay nhƣ urokinase và tPA.
Cho và cs (2004) đã tinh sạch đƣợc 6 ph n đoạn lumbrokinase (F1 đến F6) từ
giun đất L. rubellus có hoạt tính thủy ph n fibrin bằng phƣơng pháp tủa muối
ammonium sulfate và sắc k cột. Hoạt tính thủy ph n protein trên cơ chất casein của
6 isoenzyme này đạt đƣợc từ 11,3-167,5 U/mg xếp theo thứ tự hoạt tính
F2>F1>F5>F6>F3>F4. Hoạt tính thủy ph n fibrin của 6 ph n đoạn này trên đĩa
fibrin

đạt

đƣợc

từ

20,8-207,2

U/mg

xếp

theo

thứ

tự

tƣơng

ứng

F6>F2>F5>F3>F1>F4. Khối lƣợng ph n tử của các isozyme đƣợc xác định bằng
điện di SDS-PAGE tƣơng ứng là 24,6 (F1); 26,8 (F2); 28,2 (F3); 25,4 (F4); 33,1
(F5) và 33,0 kDa (F6). Nhiệt độ tối ƣu của 6 isozyme là 50C, và pH tối ƣu trong
vùng pH 4-12. Bốn isozyme (F1-F4) hoàn toàn bị ức chế bởi PMSF. Hai enzyme
F5-F6 hoàn toàn bị ức chế bởi aprotinin, N-p-torsyl-L-lysine chloromethyl ketone
(TLCK), N-torsyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK), soybean trypsin
inhibitor (SBTI), lima bean trypsin inhibitor (LBTI) và leupeptin [12].
Sun và cs (2006) đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ của lumbrokinase chống lại
chứng thiếu máu cục bộ cơ tim ở chuột và tiến tới nghiên cứu cơ chế của nó. LK đã
làm giảm chứng nhồi máu cơ tim phụ thuộc vào các liều khác nhau. Tốc độ hạn chế
của LK ở các liều 20, 40 và 80 mg/kg thể trọng tƣơng ứng là 7,7%; 34,6% và
46,2%. Các nghiên cứu về điện t m đồ cho rằng, khi dùng LK ở nồng độ 10 và 50
l ở 10 mV, dòng canxi dạng L (ICa-L) của cơ tim đã giảm rõ ràng tƣơng ứng từ 14,42±1,5 pA/pF tới -11,33±1,4 pA/pF (giảm tới 21,4%, có nghĩa thống kê với
p<0,01) và -9,92 ± 1,31 pA/pF (giảm 36,5%, có nghĩa thống kê với p<0,01). Cơ

Vũ Thị Bích Ngọc

13

Cao học K20


Luận văn thạc sĩ

Khoa Sinh học

chế chống chứng thiếu máu cục bộ làm giảm dòng canxi dạng L (ICa-L) của cơ tim
ở t m thất chuột nhắt trắng [58].
Ƣu điểm lớn nhất của enzyme thủy ph n fibrin từ giun đất là có thể hấp thụ
qua đƣờng ruột vào máu. Khi vào trong máu, enzyme này vừa có tác dụng hoạt hóa

hệ thống thủy ph n fibrin, vừa có hoạt tính plasmin hịa tan trực tiếp fibrin. Đ y
chính là nh ng cơ sở của các nghiên cứu ứng dụng enzyme thủy ph n fibrin từ giun
đất làm thuốc uống ch a bệnh tim mạch [21,50,57].

Hình 1.4. Cấu trúc bậc 3 của lumbrokinase tách chiết từ các loài giun đất

Từ việc ph n tích protein của các lồi giun đất cho thấy, cấu trúc bậc 3 của
các isoenzyme lumbrokinase từ lồi L. rubellus có rất nhiều điểm giống nhau so với
các protein từ loài E. fetida ở các xoắn α, nếp gấp β và các đoạn cuộn xoắn (Hình
1.4) [46]. Một phần trình tự acid amin của LK giống với trình tự amino acid cùng vị
trí của các serine protease tƣơng tự trypsin bao gồm: elastase, yếu tố đông máu IX,
trypsin, kallikrien và chymo trypsin [49].
Cơ chế hoạt động của lumbrokinase bao gồm việc kích hoạt plasminogen
giống nhƣ các yếu tố hoạt hóa mơ t-PA khác và ph n hủy trực tiếp fibrin (Hình 1.5),
nhƣng khơng ph n hủy các protein huyết tƣơng bao gồm plasminogen và albumin.
.

Vũ Thị Bích Ngọc

14

Cao học K20