Nghiên cứu đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR) liên quan đến ung thư đại trực tràng không polyp di truyền ở người Việt Nam

DẠI IIỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯ ỜN G ĐẠI MỌC KHOA H Ọ C TỤ NHIÊN
BÁO CÁO TÕ NG HỢP
T r ê n d ể tà i:
NVGIiIÊN CỨU ĐỘT BIÉN GEN SỬA CHỮA BA I CẶP SAI (MMR)
LIIÊN QUAN ĐẾN ƯNG THU ĐẠI TRựC TRÀNG KHÔNG POLYP
DI TRUYỀN Ở NGƯỜI VIỆT NAM
Mã số: QG.11.15
Chủ trì Đề tài: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
Các cán bộ tham gia: ThS. Trần Thị Thùy Anh
ThS. Lê Văn Quảng
CN. Hoàng Hải Yến
BS. Hà Hải Nam
H à N ộ i, 2 0 1 3
£ ồ ỉ CÃMÊL đ ễ t
Đ ể tà i Q G .1 1 .1 5 th ự c h i ệ n ã ư ợ c v ó i s ự h ỗ t r ợ v ề k i n h p h í c ủ a Đ ạ i h ọ c
Q u ố c g ia H à N ộ i . C h ú n g tô i x i n tr â n tr ọ n g c ả m ơ n s ự q u a n t â m h o t r ợ
c ủ a c á c c ấ p lã n h đ ạ o Đ ạ i h ọ c Q u ố c g ia H à N ộ i tr o n g q u á t r ì n h c h ú n g tô i
th ự c h i ệ n đ ề tà i.
C á c t h à n h v i ê n t h ự c h i ệ n đ ề tà i c h â n th à n h c ả m ơ n B a n G i á m h i ệ u v à
c á c P h ò n g c h ứ c n ă n g c ủ a T r ư ờ n g Đ ạ i h ọ c K h o a h ọ c T ự n h iê n v ề s ự g i ú p
đ ỡ v à tạ o đ iề u k i ệ n c h o v i ệ c n g h i ê n c ứ u đ ề tà i.
Đ ể tà i đ ư ợ c th ự c h iệ n v ó i s ự h ỗ t r ợ v ề c ơ s ở v ậ t c h ắ t, t r a n g t h i ế t b ị v à
s ự q u a n t â m ủ n g h ộ c ủ a K h o a S i n h h ọ c , P h ò n g t h í n g h i ệ m T r ọ n g đ iể m
C ô n g n g h ệ E n z y m v à P r o te in , T r ư ờ n g Đ ạ i h ọ c K h o a h ọ c t ự n h iê n . C h ú n g
tô i x i n c ả m ơ n v ề n h ũ n g đ ó n g g ó p q u ý b á u đó .
C h ú n g tô i c ũ n g x i n c h â n t h à n h c ả m o n cá c B á c s ĩ, n h â n v iê n y t ế c ô n g
tá c tạ i K h o a Ư n g b ư ớ u v à c h ă m s ó c g i ả m n h ẹ - B ệ n h v i ệ n Đ ạ i h ọ c Y H à
N ộ i v à B ệ n h v i ệ n K v ề s ự h ợ p tá c v à h ỗ t r ợ m ẫ u n g h i ê n c ứ u .
T ậ p t h ể c á n b ộ t h a m g ia đ ề tà i Q G .1 1 .1 5 x i n tr â n t r ọ n g c ả m ơ n .
Chủ trì đ ề tài

T S . N g u y ễ n T h ị H ồ n g V âa
BÁO CÁO TÓM TẮT
I. T ên đề tài:
Nghiên cửu độí biến gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR) liên quan ãến ung thư
đại trực tràng không polyp di truyền ở người Việt Nam
Mã số: Q G .l 1.15
II. Chủ trì đề tài: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
II I . C á c c áE b ộ th a m gia:
ThS. Trần Thị Thùy Anh (Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN-ĐHQGHN)
ThS.BS. Lê Văn Quảng (Bệnh viện Đại học Y Hà Nội)
CN. Hoàng Hải Yến (Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN-ĐHQGHN)
BS. Hà Hoài Nam (Bệnh viện K)
IV. M ục tiêu và n ội d u n g nghiên cứu
1. Mục tiêu: Xây dựng được quy trình phân tích nhằm phát hiện đột biến gen
sửa chữa bắt cặp sai hỗ trợ chấn đoán và sàng lọc ung Ihư đại trực tràng không polyp
di truyền và đánh giá các đột biến ở gen sửa chữa bắt cặp sai (MSH2) liên quan đến
ung thư đại trực tràng không polyp di truyền ở người Việt Nam.
2. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Tỏng quan tài liệu và thu thập mẫu nghiên cứu
- Hoạt động 1: Tra cứu thông tin, thu thập các bài báo khoa học liên quan đến
đề tài, viết phần tổng quan tài liệu.
- Hoạt động 2: Thu thập 50 mẫu máu, 50 mẫu mô bệnh phẩm từ các bệnh nhân
được chẩn đoán mắc ung thư đại trực tràng đến khám, điều trị tại Bệnh viện K, Bệnh
viện Đại học Y Hà Nội và 10 mẫu đối chứng (người khỏe mạnh, tuổi trên 60).
Nội dung 2: Nhân bản một số trình tự mã hóa của gen bằng PCR
- Hoạt động 1: Tách chiết ADN tổng số từ các mẫu máu và mô bệnh phẩm đã
thu thập được
- Hoạt động 2: Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho việc nhân bản một số phân
đoạn gen MSH2
- Hoạt động 3: Tối ưu hóa và thực hiện phản ứng nhân bản một số exon thuộc

gen MSH2 bằng PCR với những cặp mồi đặc hiệu.
Nội dung 3: Phát hiện các đột biến ở gen nghiên cứu bằng các kỹ thuật sinh học phân tử
- Hoạt động 1: Phân tích PCR-SSCP
- Hoạt động 2: Phân tích PCR-RFLP
- Hoạt động 3: Giải trình tự một số phân đoạn gen MSỈỈ2
Nội clung 4: Phân tích so liệu, viết báo cáo nghiêm thu.
V. Các kết quả đạt đuọc
]. Kết quả khoa học
- Đã thu thập được 50 mẫu bệnh phẩm (máu và mô bệnh phẩm ) từ các bệnh
nhân được chấn đoán mắc ung thư đại trực tràng, dạ dày đến khám, điều trị tại Bệnh
\ iện K, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội và 10 mẫu đối chứng.
- Đã tách chiết thành công A D N tổng số từ các mẫu m áu và mô bệnh phẩm thu
thập được
- Đã nhân bản thành công 9 phân đoạn gen MSH2 (exon 2, 3, 6, 7, 8, 12, 13, 14
và 15) băng các cặp mồi đặc hiệu.
- Đã phát hiện được 8 mô hình phân tách băng ADN sai khác ở các mẫu mô ung
thư cửa người bệnh so với người bình thường. Cụ thể là 1 mô hình của người bệnh số
35 (exon 2), 1 mô hình người bệnh sổ 14 (exon 3), 1 mô hình người bệnh số 30 (exon
7), 3 mô hình của người bệnh số 31, 34 và 36 (exon 8) và 2 mô hình của người bệnh số
4 (exon ] 5).
- Phân tích so sánh trình tự ADN của một số mẫu máu và mô ung thư cho thấy
chủng tôi đã phát hiện được 4 đột biến bao gồm: một đột biến mất nucleotide A tại vị
trí 73331 trên exon 3 của mô bệnh phẩm số 1, một đột biến mat nucleotide A tại vị trí
5293 (vùng intron nằm trước exon 2 gen MSH2)\ một đột biến thay thế nucleotide tại
vị trí codon 199 nucleotide G bị thay thế bởi T (c.199 G>T) ở exon 3 dẫn tới thay đổi
axit amin prolin (CCG) thành axil amin glutamin (CAG) trong chuỗi polypeptide do
gen MSH2 tạo ra và một đột biến thay thế O A tại vị trí 77942 (tương ứng codon 848
trên exon 15) thuộc gen MSH2.
2. Kết quả ứng dụng: 1 quy trình phân tích nhằm phát hiện đột biến gen sửa
chữa băt cặp sai có khả năng ứng dạng trong sàng lọc và chẩn đoán ung thư đại trực

tràng mang khuynh hướng di truyền ở người Việt Nam.
3. K ế t q u ả d à o tạ o
- Đã đào tạo được 02 cử nhân khoa học (ngành Công nghệ Sinh học) và 01 thạc
sĩ khoa học chuyên ngành Di truyền học.
4. Kết quả công bố: 02 bài báo đăng trên tạp chí Khoa học của Đại học Quốc
gia Hà Nội.
1) Nguyễn Thị Hồng Vân. Trần Thị Thùy Anh, Nguyễn Văn Đoài, Lê Văn Quảng
(2012). Sàng lọc đột biến trên các gen MLH1 và MSH2 từ các bệnh nhân ung thư đại
trực tràng. Tạp chí Khoa học, tập 28, số 2S, 2012, tr. 209-2015
2) Trần Thị Thùy Anh, Nguyễn Văn Đoài, Lê Văn Quảng, Nguyễn Thị Hồng Vân
(2012). Phát hiện đột biển trên gen MSH2 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng rải rác ở
Việt Nam. Tạp chí Khoa học, tập 28, số 2S, 2012, tr. 62-67
V I. T ìn h hìn h k inh p h ỉ cử a đề tả i: đã chi theo đún g dự toán đ ư ợc p hê duyệt
Đơn vị tỉnh: triệu đồng
STT
Nội dung
K inh phí íhục hiện
2011
2012
Tông
1
Thanh toán dịch vụ công cộng
3,2 3,6 6,8
2
Vật tư văn phòng
1,0
1,0
3
Thuê khoán chuyên môn
23 10

33
4
Chi phí nghiệp vụ chuyên môn của từng ngành:
52,8
76,4 129,2
- Vật tư
37
60
97
- In ấn, photo tài liệu
0,6 0,8
1,4
- Chi khác
3,2
3,6 6,8
- Phụ cấp chủ nhiệm đề tài
12,0
12,0 24,0
T ông cộng
80
90 170
KH O A QUẢN LÝ
CHỦ NHIỆM KHOA
PGS.TS.^ỚW í ỉ ữ u a n
CHỦ T R Ì Đ Ề TÀ I
TS. Nguyễn T hị H ồng Vân
TRƯ ỜN G Đ Ạ I H Ọ C KHOA HỌ C T ự N H ĨÊN
• • • •
S U M M A R Y
N am e of project: Mutation analysis o f mismatch repair gene (MMR) associated

with hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC) in Vietnamese
Code: QG. 11.15
P rin cip a l Investigator: PhD. Nguyen Thi Hong Van
P articip an t members: M.Sc. Tran Thi Thuy Anh
M.Sc. Le Van Quang
B.Sc. Hoang Hai Yen
Doctor Ha Hoai Nam
I. O b je c t s a n d c o n te n ts o f p r o je c t
Objectives. To analyze the mutations in a mismatch repair gene associated with
hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC) and establish the protocol for
identification of polymorphisms in the studied gene that can be used for assistance of
the diagnosis and screening of HNPCC in Vietnam.
Contents:
C o n te n t I : D e v e lo p m e n t o f re s e a rc h b a c k g r o u n d a n d m a te ria l c o lle c t io n
- Activity 1: Information reference, collection of publications related to the project.
Writing the research background.
- Activity 2: Collecting 50 blood and 20 tissue samples from patients who are
diagnosed as colorectal cancer patients at K hospital and Hospital o f Hanoi
Medical University and 10 controls.
Content 2: Amplification of coding sequences (exons) of one o f MMR genes by PCR
- Activity 1: Extraction o f total genomic DNA from blood and tissue samples.
- Activity 2: Design the specific primers for amplification of MSH2 coding
sequences.
- Activity 3: Optimization and operation of the amplification reactions o f some exons in
MSH2.
Content 3: Detection of mutations in MSH2 genes using some molecular techniques
- Activity 1 : PCR-SSCP analysis
- Activity 2: PCR-RFLP analysis
- Activity 3: DNA sequencing some exons and sequence comparison.
Content 4: Data analysis, writing the final report for final evaluation.

II. R esults
1. Scientific results
- C o llected 50 sam ples inclu din g diag nosed colorectal cancer and gatric cancer
patients and 10 controls for analysis.
Genom ic D N A were extracted and purified successfully
Amplified 9 exons o f MSH2 gene with specific primers by PCR (including the exons 2,
3, 6, 7, 8, 12, 13, 14, and 15).
- Analysis of PCR -RF LP showed 01 mutation in exon 3 (sample T l) that changed the
restriction site of Healll.
- Observed 7 abnormal SSCP patterns: one in exon 2, one in exon 3, three exon 8 and two
in exon 15 using PCR-SSCP technique.
Results o fD N A sequence analysis revealed 04 mutations: 01 deletion of nucleotide A
(delA73331) in exon 3 from tumor tissue o f patient numbered 1; 01 deletion of
nucleotide A at position 5293 (in intron before exon 2 of MSH2 gene); 01 substitution
mutation G >T at codon 199 in exon 3; and 01 substitution mutation C>A at position
77942 of exon 15 of MSH2 gene
2. Applied results: 01 procedure for genetic testing o f HN PCC based on detection o f germline
mutations in MSH2 gene
3. Training results: 01 MSc. and 2 BScs
4. Public results: 02 paper on Journal of Science
1) Nguyen Thi H ong Van, Tran Thi Thuy Anh, N guyen Van Doai, Le Van Quang
(2012). M utation screening o f MLH1 and MSH2 genes in colorectal cancer patients. Journal of
Science 2012, Vol. 28, No.2S, p. 209-2015
2) Tran Thi Thuy Anh. Nguyen V an Doai, Le V an Quang, Nguyen Thi Hong Van
(2.012), I Jetection o f mutat ion in HMSH2 gene from Vietnamese sporadic colon cancer patients.
Journal o f Science 2012, Vol. 28, No.2S, p. 62-67.
III. B u d get: One hundred and seventy million dong
M Ụ C L Ụ C
DAN H M Ụ C C H Ữ VIÊT T Á T 1
MỞ DÂU 2

CHƯƠNG 1. TỒNG QUAN TÀI LIỆU 4
]. Tổng quan về ung thư đại trực tràng không polyp di truyền (H N P C C ) 4
2. Tổng quan về gen sửa chữa bắt cặp sai 6
3. Một sổ kỹ thuật di truyền phân tử phân tích đột biế n 11
4. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế g iớ i 14
5. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 16
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VA PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

17
]. Vật liệu nghiên cứu 17
2. Phương pháp nghiên cứ u 17
2.2. Tách DNA í ổng s ố

17
2.3. Kiếm tra độ tinh sạch và chuẩn bị khuôn cho phản ứng PCR

18
2.4. Nhân bản các phân đoạn gen (exon) quan tâm bănq PCR

18
2.5. Các kỹ thuật phân tích đột biển sử dụng trong nghiên cứu 19
CHƯƠNG 3. KÉT QUẢ VÀ THÀO LUẬN
21
1. Kết quả tách chiết DNA tổng số 2 ì
2. Nhân bản các phân đoạn gen MSH2 bằng PCR
21
3. Phân tích đột biến ờ gen MSH2 bằng một số kỹ thuật sinh học phân tử

24
3.1. Kết quá phân tích đột biến bong PCR-RFLP 24

3.2. Ke í quà phân tích đột biến bằng SSCP và giải trình tự

29
KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO 36
PHỤ LỤC 38
0
DAN H M Ụ C C H Ử V IÉ T T Ấ T
T T
T iếng Việt Tiếng Anh
C h ữ
viết tắ t
1
Axit deoxyribonucleic Deoxyribonucleic acid
DNA
2 Kháng nguyên ung thư biểu mô
phôi
Carcino embryonic antigen CEA
3
Ung thư đại trực tràng Colorectal cancer
CMC
4
Sinh polyp 11 tuyên theo dòng họ Familial Adenomatous Polyposis
FAP
5
Ung thư đại trực tràng không
polyp di truyền
Hereditary nonpolyposis colorectal cancer
HNPCC
6

l-lóa mô miễn dịch 1 m m unoh istochem istry
m e
7
Gen tương đồng MutL 1
MutL homolog 1 ML III
8
Khuếch đại đa mẫu dò phụ thuộc
phản ứng gắn nối
Multiplex ligation-dependent probe
amplification
MLPA
9
Sửa chữa bắt cặp sai Mismatch repair M M R
10
Gen tương đồng MutS 2
MutS homolog 2
MS i n
11
Sự bất ổn vi vệ tinh Microsatellite instability
MSI
12
Phàn ứng chuỗi polymerase Polymerase chain reaction
PCR
13
Gen mã hóa endonuclease sửa
chữa bát cặp sai
Postmeiotic segregation increased 2
PMS2
14
Đa hình độ dài đoạn giói hạn

Restrition fragment length polymorphism
RFLP
15
Phản ứng chuỗi polymerase nhò'
Reverse transcriptase - Polymerase chain
RT-
enzyme phiên mã ngược
reaction
PCR
16
Đa hình câu hình sợi đơn
Single strand conformation polymorphism
SSCP
1
đầu thường dựa vào các triệu chứng xuất hiện hoặc nhờ vào quá trình tầm soát. Một số
trường hợp ung thư được chẩn đoán tình cò' nhờ vào quá trình đánh giá các bệnh lý
không liên quan khác.
Hiện nay, mặc dù ung thư đại trực tràng là một trong những dạng ung thư phố biến
nhất và gây tử vong cao ở Việt Nam, song nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh ở mức
độ phân tử và áp dụng xét nghiệm di truyền trong chẩn đoán và sàng lọc ung thư này
còn khá hạn chế. Ờ nuủc ta, xét nghiệm di truyền gen liên quan đến ung thư chưa được
áp dụng phổ biến. Cho tới nay, hầu như chưa có nghiên cứu nào đi sâu tìm hiểu các
đột biến ở nhũng gen sửa chữa bẳt cặp sai liên quan tới ung thư đại trực tràng không
polyp di truyền ở người V iệt Nam. Do vậy, việc tìm hiểu sự biến đổi di truyền ỏ’ một
số gen liên quan đến các dạng ung thư khác nhau, trong đó có ung thư đại trực tràng ở
người Việt Nam là một vấn đề có tính cấp bách xuất phát từ thực tế.
Như trên đã nêu, các gen sửa chữa bắt cặp sai được cho là liên kết chặt với hội
chứng IĨN PCC , liên quan đến nhiều loại ung thư thuộc hội chứng HN PCC , trong đó có
ung thư đại trực tràng. Các công trình nghiên cứu đã khẳng định, các đột biến dòng
m ầm ở các gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2 liên kết khá chặt

với IIN PCC [5, 10], Tại Việt N am , hiện chưa có nghiên cứu nào đi sâu tìm hiểu vê
nhóm gen này. Trong một nghiên cứu gần đây, gen MLHl, một trong các gen M M R
cũng đã bước đầu được phân tích và phát hiện đột biến từ bệnh nhân ung thư đại trực
trảng tại Việt Nam [13, 22J. Trên CO' sỏ' đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu (lột
biến gen su'd child bat cặp sai (MMR) liên quan đến ung llnr đại trực tràng không
polyp di truyền ở người Việt N am ”. Đe tài này sử dụng một số kỹ thuât phân tích đột
biến gen nhăm phát hiện một sô đột biên ở gen MSH2, một trong ba gen được cho là
gen chỉ thị liên kết với hội chứng ung thư này. Ket quả thu được góp phần định hướng
ứng (lụng các kỹ thuật di truyền phân tử vào chẩn đoán, sàng lọc ung thư đại trực tràng
cũng như các dạng ung thư khác, như là m ột phương pháp chẩn đoán hỗ trợ chính xác
cho các phương pháp hóa sinh, m iễn dịch hiện nay.
3
C H Ư Ơ N G 1. T Ỏ N G Q IJAN T À I L IỆ U
1. Tống quan về ung thư đại trực tràng không polyp di truyền (IÍNPCC)
Ung thư đại trực tràng là một loại ung thư biếu m ô chiếm tỷ lệ khá cao, đứng thứ
bu trong các bệnh ung thư ở nam giới và thứ tư trong các bệnh ung thư ở phụ nữ.
Trong số các dạng ung thư đường tiêu hóa, ung thư đại trực tràng đứng thứ hai về
nguyên nhân dẫn đến tử vong do ung thư [4],
Bcn cạnh các yếu tố làm tăng nguy CO' ung thư đại trực tràng như chế độ ăn nhiều
chất béo, viêm loét đại tràng mãn tính, yếu tố di truyền với tiền sử gia đình ung thư đại
trực tràng và polyp là nguyên nhân quan trọng, chiếm khoảng 20% các trường hợp ung
thư dại trực tràng. Tương tự như các loại ung thư khác, cơ chế di truyền phân tử gây ra
ung thư đại trực tràng là các đột biến phát sinh trong quá trình phát triển cá thể (ung
thư rải rác) hoặc được di truyền theo gia đình. Các nghiên cứu sàng lọc gen ung thư
hiệu năng cao đã giúp xác định được đột biến xảy ra ở trên 1000 gen khác nhau ở hai
dạng ung thư phổ biến là ung thư đại trực tràng và ung thu vú. Sự di truyền của các
gen ung thư này gây nên 2 hội chứng: Hội chứng u tuyến polyp theo dòng họ (FAP-
familial adenomatous polyposis) và Hội chứng ung thư ruột kết không polyp di truyền
(HN PCC), chiếm 5-10% trong ung thư đại trực tràng [17],
I lội chứng Lynch - được đặt tên theo tên nhà ung thư học đã có công đầu nghiên

cứu bệnh này - được mô tả lần đầu vào năm 1913. Đây là hội chứng về khuynh hướng
không chỉ ung thư đại trực tràng mà cả các dạng ung thư ở ít nhất 7 cơ quan khác nhau
(nội mạc tử cung, dạ dày, buồng trứng, ruột non, biếu mô gan mật, biếu mô niệu đạo
và não), trong đó với 80% trường hợp mắc ung thư đại trực tràng (colorectal cancer -
CRC), 50% mắc ung thư nội mạc tử cung và 10% nguy cơ hình thành ung thư dạ dày
và buồng trứng [9]. HNPC C là dạng ung thư đại trực tràng di truyền chiếm khoảng 5%
tông sô trường hợp ung thư đại trực tràng và gần đây mới được xem như một bệnh di
truyên tương đổi phổ biến [17], Đây là bệnh do gen trội trên nhiễm sắc thể thường gây
ra, trong đó các đột biến dòng m ầm làm bất hoạt các gen liên quan đến hệ thống
MMR.
Sự khác biệt giữa HNPCC và ung thư đại trực tràng polyp là ở những tổn thương
phăng cua dạng ung thư này. Các tổn thương phang này là những tổn thương tiền ung
thư ruột, dễ bị bỏ sót lúc thăm khám nội soi, nhưng dễ trở thành ung thư nhất. Trong
lòng ruột có những tổn thương bàng phẳng. thường có kích thước nằm trong giới hạn
nhìn thấy được của mat thường, có cùng màu sắc như phần còn lại của niêm mạc ruột.
N hững tôn thương này được gọi là những tổn thương “không polyp” (nonpolyp). Các
tòn thương này hoặc hơi nhô cao lên hoặc như những hố nhỏ nông, khác hẳn với các
polyp ruột xuât hiện dạne nấm có cuống và dễ nhìn thấy. M ặc dù vậy, các hố phang
4
I.ày lại có nguy cơ biến đối thành ung thư nhanh hơn so với các polyp có cuống [9],
N hững bệnh nhân H N PC C phát triển thành ung thư khi còn trẻ, điển hình ở lứa tuổi
t iCra 40, cá biệt có trường hợp sớm ỏ' tuổi thanh thiếu niên. Tuổi trung bình của người
mắc bệnh ung thư đại trực tràng rải rác là 61 tuổi, trong khi các bệnh nhân H N PC C
đều phát triển ung thư ở độ tuổi trung bình là 42. Những người mang các đột biến
HN PCC dòng m ầm cũng dễ bị ung thư ỏ' các biểu m ô như tử cung, ruột non, buồng
trứng, dạ dày, ống tiết niệu, tụy, ống mật và não. Đối với phụ nữ, 20-60 % bệnh nhân
J INPCC có nguy CO' mắc ung thư nội mạc tử cung. Tuổi trung bình của chẩn đoán ung
thư nội mạc tử cung là 46-62 tuổi. Trong số những phụ nữ có HNPCC phát triển thành
cả ung thư ruột kết và ung thư nội mạc tử cung, khoảng 50% xuất hiện ung thư nội
mạc tử cung trước [10].

Being I. Thông kê các bệnh ung thư liên quan đến HNPCC [10]
Ung thư liên quan dên HNPCC
Tỷ lệ mắc HNPCC Nguy CO' mắc bệnh Tu ôi phát bệnh
Đại trực tràng
5.5%
80%
44
Nội mạc tử cung
2.7%
20-60% 46
Dạ dày
< 1% 11-19%
56
Buông trứng
1.6% 9-12%
42.5
Đường tiết niệu
< 1% 4-5% 55
Ruột non
< 1% 1-4% 49
Não hộ, hệ thần kinh trung ương
< 1% 1-3% 50
Qua thống kê ở Bảng 1 ta có thể thấy, tỷ lệ người bị dột biến gen H N PC C bị mắc
ung thư đại trực tràng là rất cao (80%). Khi chấn đoán, các mẫu mô trực tràng có thế
dược phân lập để phân tích DNA. Nhờ tính phổ biến và dễ tiếp cận, các khối 11 trực
tràng là mô hình lí tưởng đê nghiên cứu về các gen đóng góp vào sự phát sinh khối u.
Năm 1990, nhóm họp tác quốc tế về H NPCC đã thiết lập một hệ thống các tiêu chí
chọn lọc các dòng họ m ang hội chứng Lynch (Tiêu chuẩn Amsterdam I): 1) ít nhất ba
người trong dòng họ mắc ung thư đại trực tràng; 2) một người phải có quan hệ 1 đời
với hai người còn lại; 3) ít nhất hai thế hệ liên tiếp bị ảnh hưởng của bệnh này; 4) ít

nhât một thành viên của dòng họ bị ung thư đại trực tràng được chẩn đoán bị mắc bệnh
ở lứa tuổi trước 50 và 5) sự hình thành polyp tuyến theo dòng họ cần được loại trừ.
Các vị trí ban đâu khác nhau đã được mô tả trong các dòng họ đã được chẩn đoán mac
hội chứng Lynch: nội mạc, dạ dày. ruột non, niệu đạo, vùng chậu, não và ống mật.
Trong sô các khối u ở vị trí này, ung thư nội mạc tử cung, niệu đạo, vùng chậu và ruột
non thê hiện nguy cơ cao nhất, và vì vậy là những dạng đặc thù nhất của hội chứng
Lynch. Sau đó các tiêu chí này được coi là quá hạn chế cho các mục đích lâm sảng và
được sửa đôi đê phù hợp với các bệnh ung thư khác có liên quan đến HNPCC (tiêu
chuân A m sterdam
II). Vào năm 1998, các nhà khoa học đã thiết lập m ột hê thông tiêu
chuân lâm sàng mới, được gọi là tiêu chuẩn Amsterdam II: 1) ít nhất ba người trong
dòng họ mắc ung thư liên kết với I1NPCC (đại trực tràng, nội mạc tử cung, dạ dày,
buóng trứng, niệu đạo hoặc khung chậu - thận, não, ruột non. ống mật, hoặc da (các
khói II tuyến nhờn); 2) Một người trong ba người đó phải có quan hệ một đời với hai
người còn lại. 3) It nhất hai thế hệ liên tiếp bị ảnh hưởng của bệnh này; 4) ít nhất một
trong những người bị ung thư đại trực tràng phải đưọ'c phát hiện trước tuổi 50; 5) Sự
hình thành polyp tuyến theo dòng họ phải được loại trừ ở bất kỳ người nào bị ung thư
đại trực tràng: 6) Các khối u cần được kiểm tra bất kỳ lúc nào [5],
Do vậy, việc chẩn đoán của HNPCC có thể được thực hiện trên cơ sở các tiêu
chuân lâm sàng Am sterdam hoặc bằng cách kiểm tra di truyền phân tử của các đột
b iến dòng mầm trong các gen MMR.
2. Tông quan về gen sửa chừa bắt cặp sai
Trong số các gen liên quan tới ung thư, phải kể đến các gen sửa chữa bắt cặp sai
(VIMR genes). Đây là những gen chịu trách nhiệm cho việc sửa chữa những sai sót
xảy ra trong sao chép DNA. Trong quá trình sao chép DNA, các bazơ bắt cặp sai sẽ
được sưa chữa nhò' hoạt tính đọc sửa của enzyme DNA polymerase. Bên cạnh hoạt
tinh dọc sửa của DNA polymerase, tế bào còn có hệ thống sửa chữa bắt cặp sai. Chức
năng cơ bản của hệ thống sửa chữa DNA là loại bỏ sự bắt cặp sai thêm hoặc mat base
do hậu quả của các lỗi DNA polymerase trong quá trình tống hợp DNA. Hệ thống
M M R này hoạt động được nhờ sự phối họp của rất nhiều protein. Các protein M M R

s ửa chữa các sai SÓI trong DNA bằng cách xác định các nucleotide bị bắt cặp sai. Một
s>0 enzyme xác định được vị trí bắt cặp sai hoặc có thể trực tiếp sửa chữa chúng. Hệ
th ống này có thể xác định được base nào bị bắt cặp sai nhờ phân biệt mạch DNA làm
khuôn có trình tự đúng với sợi mới tổng họp mang trình tự đột biến, thông qua hoạt
đìộng methyl hóa base Adenine (A) và Cytosine (C) của mạch khuôn. Enzyme DNA
m ethyl transferase theo sau chạc sao chép khoảng vài ngàn nucleotide và đánh dấu
nnạch làm khuôn nhò' hoạt động methyl hóa. Phản ứng methyl hóa xảy ra với các
niucleotide c và A ở các trình tự tương ứng là GmATC và Cm C(A/T)GG. Cơ chế sửa
c.hfra bàt cặp sai diễn ra ngay trong quá trình sao chép DNA. Do vậy, các gen sừa chữa
biắt cặp sai (mã hóa các protein MMR) có các chức năng liên quan đến sự ổn định di
tiruyên. đảm bảo độ chính xác của tái tổ hợp di truyền hay việc tham gia vào các bước
nnỏ' đầu của các đáp ứng chết theo chương trình đối với nhiều nhóm tổn thương DNA
lchác nhau [5],
Khi các gen m ã hóa các protein này bị đột biến, protein được mã hóa tạo thành bị
biất hoạt, khiến hệ thống không còn khả năng đọc sửa các base bắt cặp sai, do đó làm
nnất tính ổn định di truyền của tế bào. Các tế bào có đột biến ỏ’ các gen M M R có tỷ lệ
đtội biến tăng 2 - 4 lân so với các tế bào bình thường. Đối với bệnh ung thư đại trực
6
tràng rái rác, các đột biến ở các gen M M R này có thể xuất hiện dưới các tác nhân đột
biến từ môi tnrờng. Vó'i các trường họp ung thư mang khuynh hướng di truyền, các
đột biến dòng m ầm được truyền lừ bổ mẹ sang thế hệ con, dẫn tới làm tăng nguy cơ
ung thư ở đời con cháu. Ở các cá thể dị họp tử về các đột biến, khi alen kiểu dại bị đột
biến som a ở một tế bào đích, chăng hạn biêu mô đại trực tràng, ung thư có thê hình
thành. Tác động thứ cấp này có thể xảy ra bằng đột biến mất đoạn (mất tính dị họp từ),
đột biến hoặc methyl hóa các đảo CpG ở promoter của các gen M M R. Sự thiếu hụt
chức năng M M R cũng định lượng kiểu hình đột biến làm cơ sở cho sự hình thành tỷ lệ
clột biến cao ở các dạng ung thư đòi hỏi nhiều biến đối di truyền. Hậu quả của sự thiếu
hụt M M R là sự hình thành bất ổn vi vệ tinh (MSI) ở các khối u. Đây là một dạng biến
động về kích thước của các trình tự vi vệ tinh - thường là các trình tự lặp lại đơn hoặc
hai nucleotide, năm phân tán ở khắp hệ gen. MSI là một biếu hiện kiểu hình ở mức độ

phân tử của khối u m ang đột biến các gen MMR. Thông thường, sản phẩm protein của
các gen M M R này giúp tế bào sửa chữa những sai sót trong sao chép D NA do sự trượt
qua, bỏ quãng của DN A polym erase hoặc các trình tự dễ bị gãy như các vi vệ tinh.
Những sai hỏng ở các enzyme sửa chữa DNA liên kết với những đột biến mất hoặc
xen ở các vi vệ tinh, dẫn tới những độ dài khác nhau của các trình tự này. Những bệnh
nhân bị hội chứng Lynch cho thấy có sự có mặt của hàng loạt nhũng đoạn lặp các đơn
vị vi vệ tinh 112], Do vậy mức độ MSI có thể được xem như là sự biểu thị của bất ổn
hệ gen chung và là chỉ thị tuyệt vời đánh giá sự thiếu hụt chức năng M M R, giúp chẩn
đoán ung thư đại trực tràng.
base băt cặp sai
Hình 1. Cơ chê sửa chữa bắt cặp sai ờ E .co li
(Nguồn: http://m m r.m ed.ohio-state.edu/rfishel/RF2.htmn
♦ Các gen sủa chữa bắt cặp sai trong ang thư đại trực tràng nhóm HNPCC
Việc sửa chừa D N A bẳt cặp sai đóng vai trò quan trọng do nó duy trì tính on định
nguyên vẹn của hệ gen, bởi vậy, nó cũng liên kết với sự hình thành những đột biến liên
quan đến ung thư, trong đó có HNPCC. Đã có nhiều nghiên cứu công bố rằng những
sai hỏng trong sửa chữa bắt cặp sai dẫn đến hàng loạt các trường hợp ung thư di truyền
hoặc không di truyền. Các dạng đột biến chủ yếu đưọ’c phát hiện là đột biến nhầm
7
nghĩa (missense), đột biến vô nghĩa (nonsense), đột biến dịch khung (frameshift) và
các đội biến ở những vị trí cắt nối exon-intron. N hững đột biến này có thể dễ dàng
phát hiện được bằng giải trình tự tự động hoặc MSI có thể được chẩn đoán ở các khôi
II bằng phương pháp dựa vào PCR dựa vào DNA hệ gen đã được tách chiết [1,9, 12].
A
( lì h it micleotit
T's
5' G A A A A A A A A c A c A c A 0 A c A
3 ’ I I ĩ ì r i 1 I í G í G 1 G í G T n T
V
c )

lt.it c.i|> soi them hiicleotit fj
hMSH2 i Ỉ1MSH2 hMSH2
hMLHl hMSHG IlMLHl hMSH3 hMLHl hMSH3
DPWS2 : HWLH3 hPMS2
V A A A A |\ Ậ .Í, A c A c A c A c A c. A 3'
■V I I I 1 i T ì I r G I G 1 G I G 1 G I 5 ’
Hình 2. Mô hình sửa chữa bắt cặp sai
Sơi phía trên của DNA kép dị hơp chửa ba đột biến được sửa bởi hê thống gen sửa chữa bắt cặp
sai: bắt cặp sai bazơ - bazơ, nút thắt thêm một nucleotide trên sợi phía trên (mồi) và nút thẳt do mãt
hai nucleotide ở sợi phía dưới (sợi khuôn). Tất cả ba đột biến này đều là đích cúa các phức hợp sửa
chữa MSH2/MSH6 - MLH1/PMS2 tạo nên sản phẩm DNA ở phía dưới của hình.
Có hơn 450 đột biến gen M M R khác nhau và hơn 100 đa hình trong gen, tác động
đến hầu hết các gen MMR, bao gồm MLH1, MSH2, và MSH6 đã được nêu trong dữ liệu
về đột biến HNPCC quốc tế (). Trong số các gen MMR, MLH1,
MSH2, PMS2 và MSH6 được cho là liên kết chặt với hội chứng HNPCC. Những đột
biến dòng mầm trong các gen M M R này có thể cho phép xác định các dòng họ HNPCC,
giúp cho việc điều trị sớm hơn và giảm tỷ lệ chết. Do dó, việc sàng lọc các đột biến gen
M M R có ý nghĩa lâm sàng quan trọng cho việc tư vấn và giám sát y tế những gia đình
HN PCC . Các đột biến dòng mầm tại ít nhất một trong các gen sửa chữa đã được phát
hiện trong hơn 80% các cá thể mắc hội chứng Lynch. Các đột biến ở các gen M M R này
cũng được tìm thấy ở khoảng 15% các khối u ác tính đại trực tràng không di truyền (rải
rác) xuât hiện liên quan với những bất ổn định vi vệ tinh [8].
Các đột biến dòng mầm ở các gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1, MSH2, MSH6 và
MSII3). Dạng protein phức hợ p này sẽ xác định chính xác vị trí xảy ra nh ững sai hỏng
trong quá trình sao chép DNA. Cuối cùng, domain tương tác với dạng tương đồng mut
L (từ exon 13 đến exon 16) mã hóa phần protein có nhiệm vụ tương tác với dạng
tương đông mutL (Hình 4). Và việc sửa chữa những lỗi sai hỏng sẽ chỉ diễn ra khi có
sự tham gia của phức hợp protein MLH1 - PMS2. Vì the, gen MSH2 được xem là
thành phần của tập hợp các gen sửa chữa bắt cặp sai MMR [26].
1

-
*
<
5
6
7 8 I
9
10
llị 12 13
14
-
16
i m \ hzt'dtnz íimit ì:i
hMSHLT
imrrartio
h-MS
n iln
H6
main
MutL homo logs
interaction
___
iiiunajji
__
Hình 4 . Sơ đô protein được mã hóa bởi MSH2
Các hộp màu đỏ, vàng và xanh đại diện cho các vùng chức năng khác nhau của protein MSH2.
(nguồn: i
Khoảng 40% các trường hợp bị hội chứng Lynch với một đột biến được xác
định có liên quan đến đột biến gen MSH2. Các dạng đột biến chủ yếu gồm thay thế
nucleotide (50 - 80%), mất hoặc sắp xếp lại trình tự các nucleotide (17 - 50%) (Hình 5).

Đột biên HIMPCC
Hàng trăm đột biến gen này có khả năng dẫn đến làm cho con người bị ung thư
đại trực tràng và các loại ung thư khác liên quan đến HNPCC. Những đột biến này có
thể gây ra việc sản xuất một loại protein bất thường hoặc làm cho gen MSH2 bị bất
hoạt và không thể thực hiện chức năng bình thường của nó. Khi các protein do gen
MSH2 tổng hợp bị thiếu hụt hoặc hoạt động không hiệu quả sẽ dẫn đến những sai hỏng
tăng lên đáng kể trong quá trình phân chia tế bào mà không được sửa chữa. Nếu các tế
bào này tiếp tục phân chia, các lỗi được tích lũy trong DNA ngày càng nhiều sẽ làm
cho các tế bào không thể hoạt động hiệu quả và có thể tạo thành khối u trong ruột kết
hoặc một khối u nào đó trong cơ thể. Những người bị đột biến ở gen MSH2 có khả
năng làm gia tăng một sổ khối u hiếm gặp trên da ngoài bệnh ung thư đại trực tràng.
Đây là một sự kết hợp gọi là hội chứng Muir - Torre. Những khối u da hiếm gặp này
PMS2 gây nên hội chứ ng Lynch, với độ thâm nhập khoảng 80% đối với ung thư đại trực
tràng, 60% đối với ung thư nội mạc tử cung và dưới 20% đối với các dạng ung thư khác.
Các mất đoạn lớn thường gặp ở MSH2 (10-20% toàn bộ các đột biến), ít gặp hơn ở
MIH2 và được coi là hiếm gặp ở MSH6 [15, 16]. Sự định vị các đột biến trong các gen
này không ảnh hưởng đến độ thâm nhập của chúng hay độ biểu hiện, cho thấy rằng hầu
hết các đột biến này là những đột biến không (null) hoặc mất chức năng mà không phải
là làm mất một phần hoặc giành chức năng mới của protein. Tuy nhiên, sự tồn tại các
alcn ẩn này không cho thấy sự thay đổi nào về trình tự nhưng dẫn đến sự biểu hiện giảm
sút đã được ghi nhận. Tác động hạn chế với cùng alen trong tất cả các tế bào, những
thay đổi trình tự trong các intron hoặc vùng điều hòa gây nên sự biểu hiện khác thường
hoặc sự thoái hóa của bản mã sao chắc chắn gây nên những tác động này.
G en MSH2
Gen MSH2 nằm ở cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 2 (2pl6) với 16 exon, kích
thước khoảng 80,10kb (Hình 3). Protein MSH2 đóng vai trò cơ bản trong việc nhận
biết và bám của các base bắt cặp sai, trong khi MSH3 và MSH6 xuất hiện để sửa đổi
tính đặc hiệu của sự nhận biết này
AT(ỉ Hop
1 2 i 4 5 6 7 80X0 11 1 2 u 14 15 M

68 211 r* 147 150 134 200 no 124 151 <* u* 205 H8 rí Pl m
*99K 3MI ro* 18" 1331: 17373 jWJJ *1» .Wế: 109« roo 2176 1907
Hình 3 . Sơ dô gen MSH2Ờ người
Hộp màu xanh biếu thị các exon, khoảng trống biểu thị các intron.
(nguồn: )
Đây là gen quy định tổng hợp một loại protein đóng vai trò quan trọng trong
quá trình sửa chữa DNA. cấu trúc gen gồm 3 domain mã hóa cho 3 phần protein với
chức năng các phần khác nhau. Khi DNA sao chép để chuẩn bị cho tế bào phân chia,
domain bám DNA (từ exon 1 đến exon 6) của gen MSH2 sẽ quy định tổng hợp một
phần protein có chức năng bám vào vị trí bắt cặp nhầm của các đơn nucleotide. Riêng
domain tương tác với gen MSH3/MSH6 (từ exon 7 đến exon 12) mã hóa phần protein
có vai trò kết họp với một trong hai loại protein do gen MSH3 và MSH6 để tạo nên
một phức hợp protein hoạt động là mutSa (MSH2 - MSH6) hoặc m utsp (MSH2 -
bao gồm u tuyến bã nhờn vả ung thư da. Nguyên nhân là do tại các tuyến da (tuyến bã
nhờn) sản xuất một chất nhờn gợi là sebum. Chính dạng chất nhờn này đã gây nên các
khối II trên da. Các khối u này có thể phát triển nhanh chóng gây ra hiện tượng gai
bướu sừng khi tiếp xúc trực tiếp với ánh nắng mặt tròi.
Bên cạnh MLH1 và MSH2, MSH6 cũng đóng vai trò quan trọng trong chức
nàng MMR. Tuy nhiên, số lượng đột biến MSH6 được phát hiện ở hội chứng HNPCC
là tương đối thấp và chưa được nghiên cứu thấu đáo. Hiện nay, đột biến ỏ' gen MSH6
đã (tược phát hiện ỏ' m ột sổ trường hợp hội chứng Lynch không điển hình và chiếm
10% trong số các dạng đột biến gen ở những người mắc hội chứng Lynch. Các đột
biến dòng mầm ở gen này cũng được báo cáo ở nhũng dòng họ có nhiều thành viên bị
ung thư nội mạc tử cung [3, 7, 15]. Ngoài ba gen kể trên, còn có hai gen PMS1
(M IM //600258) và PMS2 (M IM #600259) tương ứng nằm trên nhiễm sắc thể 2q31-q33
và 7p22, với kích thước tương ứng 16 Kb và 15 exon. Theo dữ liệu đã công bố, chủng
chiếm 5% trong các trường họp hội chứng Lynch. Mặc dù gen PMS2 cốt yếu trong hệ
thống sửa chữa, những đột biến ở gen này lại hiếm được công bố trong bệnh sinh hội
chứng Lynch, hoặc ở hội chứng Turcot (một biến thể của hội chứng Lynch). Iíiện nay
vần có những tranh cãi liên quan tới cơ chế bằng cách đó PM SỈvà PMS2 có thể hoạt

động dẫn tói khuynh hướng ung thư [5],
3. Một số kỹ thuật di truyền phân tử phân tích đột biến
Phân tích đột biến là một hướng được sử dụng khi ta biết gen nào đó chịu trách
nhiệm cho một tình trạng đã xác định và những đột biến đặc thù trong gen đã được IT1Ô
tả. Những kỹ thuật được sử dụng để phát hiện các đột biến này là rất khác nhau, bao
gồm phân tích lai oligonucleotide đặc thù alen, phân tích sợi kép heteroduplex, phân
lích Southern blot, m ultiplex PCR và giải trình tự trực tiếp. Người ta sử dụng phân tích
đột biến trực tiếp khi xác định các dột biến đặc hiệu và không cần kiểm tra các thành
viên khác của gia đình hoặc bố m ẹ của đối tượng, ở đây, chúng tôi nêu ra một sô
phương pháp phân tích đột biến được sử dụng phổ biến ở nhiêu phòng thí nghiệm.
• Nhân bản gen bằng PCR (Polymerase chain rection)
PCR là một phương pháp nhân bản gen in v itro đơn giản, hiệu quả được sử dụng
phổ biến ở hầu hết các phòng thí nghiệm di truyền phân tử. Kỹ thuật này dựa trên
nguyên tắc D NA polym erase có thế xúc tác cho tổng hợp phân tử DNA mới từ trình tự
DNA khuôn trong sự có mặt của các tiền chất dNTP và một số yếu tố bổ sung, dựa vào
cặp mồi oligonucleotide có trình tự ngắn bổ sung với đoạn DNA đầu 5’ của mạch
khuôn. Trong mỗi chu kỳ PCR. phân tử D NA khuôn được biến tính bởi nhiệt (khoảng
trên 90°C), tiếp theo là sự gắn mồi và kéo dài chuồi xảy ra khi nhiệt độ được hạ xuống
ở những mức thích họp. Ket quả là sau mỗi chu kỳ nhiệt như vậy, số bản sao phân tử
D N A cần nhân bản được tăng gấp đôi. Do vậy, đây là một kỹ thuật có độ nhạy cao,
11
hiệu quả cho việc nhân bản tạo nên lượng lớn bản sao D NA từ m ột lượng rất nhỏ DN A
ban đầu. PCR được áp dụng để nhân nhanh số lượng bản sao DNA xác định, nhằm
mục đích phái hiện sự có mặt của gen hoặc dùng cho các nghiên cứu tiêp theo (giải
trình tự DNA, phân tích đột biến ).
• PCR-RFLP
Rl'LP (Restrition Fragment Length Polymorphism) là sự đa hình chiều dài các
phân đoạn DNA được cắt bởi enzyme giói hạn. Đây là một chỉ thị được sử dụng hiệu
quả trong việc lập bản đồ gen (bản đồ giói hạn) và phát hiện các đột biến trên phân tử
DNA. Sự xuất hiện đột biến, làm sự sai khác về trình tự DNA tại các vị trí nhận biết

của enzyme giói hạn có thể làm mất hoặc xuất hiện vị trí nhận biết của enzyme giới
hạn. Khi đó, việc xử lý nó với cùng enzyme giới hạn sẽ tạo nên các phân đoạn D N A bị
cát độ dài là khác nhau và thể hiện sự đa hình trên bản điện di. Do vậy, đây là chỉ thị
cho biết sự có mặt của đột biến ở cá thể, cũng như các đa hình do những đột biến tự
nliiôn gây ra tạo ra đặc điểm riêng biệt ở mọi giống, loài thậm chí mỗi cá thể. Đây là
một phương pháp hiệu qua cho việc phát hiện những sai khác do đột biến gen, bởi
phân đoạn DNA có kích thước gần như nhau không thể phân biệt được trên điện di đồ,
nhưng nếu chúng được cắt bàng các enzyme giới hạn thành các phân đoạn có nhỏ hơn
có kích thước khác nhau thì có thể phân biệt được trên điện di đồ. PCR-RFLP là kỹ
thuật được áp dụng phối hợp bằng việc thực hiện phản ứng PCR để nhân bản đoạn
DNA quan tâm, sau đó xử lý sản phẩm P CR với các enzyme giới hạn và điện di trên
gel (thường là polyacrylam ide) để phát hiện các mô hình sai khác.
• PCR-SSCP (Polymerase chain rection-single strand conformational polymorphism)
SSCP phát hiện những sai khác dựa trên khả năng di chuyển khác nhau của các
đoạn DNA sợi đơn có cùng kích thước nhưng trình lự khác nhau. Chuyển động của
DN A trong gel điện di phụ thuộc vào kích thước và cấu hỉnh không gian của chúng.
Một sự thay đổi nucleotide nhỏ (thêm, mất, thay thế nucleotide) của một trong hai sợi
dơn của DNA sơi kép rất khó có thể phân biệt trên gel điện di, bởi vì các tính chất vật
lý cùa các sợi cặp đôi ià gần như giống nhau nên chuyển động của DN A sợi kép trong
gel điện di gần như không thay đổi. Tuy nhiên các chuyển động của sợi đơn lại bị ảnh
hưởng bởi những thay đổi dù là rất nhỏ trong trình tự (có thể là thay đổi 1 nucleotide
trong số vài trăm nucleotide).
PCR-SSCP (đa hình cấu hình sợi đo'n dựa PCR) là một kỹ thuật đơn giản và hiệu
quả cho việc xác định những thay đổi trình tự ỏ' đoạn D N A được khuếch đại bang
PCR. Đây là kỳ thuật ban đầu được Orita et al. (1989) [14] đưa ra và được coi như là
một phương pháp nhanh và nhạy để phát hiện các đột biến hoặc sự đa hình của phân tử
DNA. Sau khi biến tính DNA sợi kép, do tính chất tương đối không ổn định của DN A
sợi đon khi vắng mặt của một sợi bổ sung, các trình tự DNA trên sợi đơn có thể gặp
12
các trình tự bố sung nằm ngay trên sợi DNA đó. kết quả quả là chúng bắt cặp với

nhau, tạo ra những vòng hoặc nếp gấp, tạo ra những cấu cấu hình không gian khác
nhau, sự khác biệt về hình dạng giữa hai sợi đơn với trình tự khác nhau sẽ làm chúng
di chuyến khác nhau trên cùng một bản gel điện di, mặc dù số lượng nucleotide là như
nhau. Mặt khác gcl điện di sử dụng trong SSCP là gel polyacrylamide phép phân tách
được những băng có sai khác nhỏ chỉ 1 nutcleotit nên những đột biến thêm, mât
nucleotide cũng sẽ được phát hiện thông qua kỹ thuật này. Kỹ thuật PCR-SSCP có ưu
điểm là chi phí thấp, tiện lợi và độ nhạy khá cao dể xác định các đột biến gen. ơ điều
kiện tối ưu, khoảng 80% - 90% các đột biến được phát hiện nhờ kỹ thuật SSCP.
Nhược điểm của phương pháp này là tốn khá nhiều thời gian.
® Giải trình tự DNA
Có thể phát hiện trực tiếp các đột biến bằng cách xác định trình tự bazơ nitơ của
phân tử DNA. Có hai phương pháp giải trình tự DNA khác nhau được mô tả năm
1977. Phương pháp của Allan M axam và Walter Gilbert là phương pháp hóa học, phân
cắt bộ khung đường - phôtphat của đoạn DNA dược đánh dấu phóng xạ tại những
bazơ đặc thù bằng những hóa chất nhất định. Fred Sanger và cộng sự đã đưa ra phương
pháp giải trình tự DNA dựa trên phản ứng sao chép DNA sử dụng DNA polymerase.
Nguyên tắc của phương pháp này là thực hiện phản ứng PCR với việc bô sung các 2’,
3 'diđeoxynucleotidc (ddNTPs). Hiện nay, người ta có thể thực hiện việc giải trình tự
bằng máy giải trình tự D NA tự động, trong đó các ddNTP được đánh dấu huỳnh quang
có bước sóng khác nhau. Các phản ứng giải trình tự có thể thực hiện trong m ột ống và
sàn phẩm được điện di trong một làn duy nhất hoặc sử dụng ống mao quản chứa gel.
Cưởng độ và độ dài bước sóng phát huỳnh quang được đo khi đoạn DNA di chuyển
qua thiết bị phát hiện huỳnh quang và laser ở đáy gel. Thông tin này được truyền trực
tiếp vào máy tính và từ đó trình tự này được lưu lại tự động. N hư vậy, với kỹ thuật giải
trình lự DNA, người ta có thể phân tích kết quả thu được dựa trên so sánh trình tự,
phát hiện những đột biến ở gen quan tâm.
Bôn cạnh các kỹ thuật sàng lọc đột biến ở các gen MMR, còn có kỹ thuật nhuộm
hóa mô miễn dịch (im m unohistochem istry - IHC). Hiện nay, những phân tích phân tử,
mô học và hóa mô miễn dịch cung cấp những tiêu chí chặt chẽ cho việc xác định hội
chứng Lynch. Chẳng hạn, trung bình chỉ khoảng 50% (trong phạm vi 30 - 80%) các

trường hợp hội chứng Lynch theo tiêu chí truyền thống liên quan đến đột biên dòng
m ầm có thể phát hiện được ở gen M MR. Vì vậy, nếu một người dược xác định mang
hội chứng Lynch và m ang đột biến dòng mầm M M R phát hiện được, chỉ 2,5% trong
tât cả các CRC được tí nil là gây nên hội chứng Lynch [7].
13
ư n g thư dại trực tràng, trong đó có HNPCC là dạng ung thư có tỷ lệ mắc phải
cao ở các nước phát triển và ngày một tăng ỏ' các nước đang phát triển. Các nghiên cứu
vô gen sửa chữa bắt cặp sai liên kết ung thư đại trực tràng di truyền đã được thực hiện
ở khá nhiều nước trên thế giới. D ữ liệu về đột biến các gen M M R góp phần đưa ra các
quy trình chẩn đoán và sàng lọc dạng ung thư này. Hiện nay, có tới hơn 250 đột biên
dòng mầm khác nhau đã dược xác định, trong đó phần lớn các đột biến này được phát
hiện ỏ' gen MLH1 và MSH2 và được khẳng định có liên kết vói HNPCC. Đáng chú ý là
chỉ có một ít hoặc không có sự khác biệt về độ biểu hiện đã được phát hiện giữa các
đột biến MLHÌ và MSH2, cho thấy rằng cả hai gen này quan trọng như nhau đối với
chức năng MM R.
Felipe et al. đã đánh giá 25 gia đình người Brazil có hội chứng Lynch. Người ta
thấy rằng 10 gia đình (40%) trong số đó có những đột biến ở các gen MLH1 và MSH2:
8 gia đình có đột biến ở MLH1 (80% ) và hai gia đình có đột biến ở MSH2 (20%).
Trong đó có 5 đột biến nhầm nghĩa, một đột biến vô nghĩa, ba đột biến dịch khung và
một sai hỏng ỏ' vi trí cắt nối [5]. L ynch et al [9] đã xác định các đột biến tại những gen
này ỏ' 18 trong số 56 các thể (32,1%). Gần dây, nghiên cứu của Hendriks et al. đã xác
địnlì ctược 7 đột biến ở gen PMS2, bao gồm bốn đột biến sắp xếp lại hệ gen và ba đột
biến điếm. Trong số 7 cá thể có đột biến này, sáu cá thể thể hiện mô hình di truyền trội
trên nhiễm sắc thề thường [7], Theo Pistorius el củ [15], sự sắp xếp lại hệ gen có mặt ỏ'
một tỷ lệ đáng kế trong toàn bộ những đột hiến có khả năng gây bệnh ở các gen M M R
trong các bệnh nhân mắc hội chứng Lynch. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, sự
sấp xếp lại hệ gen có mặt ỏ' 15 - 55% trong tất cả các đột biến ở các gen MMR.
Pistorius et cú đã tìm thấy 14 đột biến tái sắp xếp hệ gen trong 85 người (16,5%) trong
đó có 4 người mang đột biến ỏ' gen MLH1 và 10 người còn lại ỏ' gen MSH2. Timm
Goecker et al đã phân tích mối liên quan giữa kiểu gen đột biến ở các gen sửa chữa băt

cặp sai MSH2 và kiểu hình HNPCC và đã xác định dược 294 đột biến trong số 259 cá
thể người bị ung thư này. Tỷ lệ ung thư đại trực tràng ở giai đoạn còn trẻ cho tới trung
niên cho thấy việc xác định chiến lược chẩn đoán và điều trị cho những người bị ung
thư khởi phát là cần thiết [21], Bốn đột biến mới đã được phát hiện ờ gen
MSH2/MLHỊ từ các dòng họ H N PCC ngưòi Bồ Đào Nha trong một nghiên cứu của G.
Isido et ci/ [6], Bằng kỹ thuật PC R-SSCP, các tác giả đã thu được các mô hình phân ly
DNA bất thường. Việc giải trình tự các exon MSH2 đã cho thấy có hai đột biến nhầm
nghĩa ở gen AÍSH2. Đó ià đột biến thay thế nucleotide 208 9T ->c ở codon 697 và đột
biến dị hoán ở nucleotide 2074 G~> c . Ngoài ra, một đột biến thay thế nucleotide khác
là 2152 C -> T ở gen MSH2 làm thay thế bộ ba mã hóa axit amin glutamine thành bộ ba
kết thúc. M ột đột biến mất đoạn dài 12 bp cũng được phát hiện ỏ' một gia đình khác,
4. Tình hình nghiên cửu trong nuóc và trên thế giói
14
làm mất đoạn nucleotide từ nucleotide 292 303 ỏ' trình tụ' cDNA. Yoshihito et al. đã
nghiên cứu một trường họp bệnh nhân HNPCC bằng việc sử dụng phân tích MSI và
II 1C ở gen MLH1 và MSH2 ở nội mạc bình thường, nội mạc tăng sản và nội mạc ung
thư. Kết quả cho thấy có sự thay đổi theo trình tự thời gian về MSI và sự biểu hiện
MSI 12 ở nội mô ỏ' bệnh nhân này. [23]
Với việc tìm ra kỹ thuật khuếch đại đa m ẫu dò phụ thuộc phản ứng gắn nối
(multiplex ligation-dependent probe amplification (M LPA)), có thể nhận thấy, một tỷ
lệ lớn các đột biến dẫn tới sự tái sắp xếp hệ gen của một hoặc nhiều mất đoạn exon ảnh
hircmg tới các gen MLH1 và MSH2. Ainsworth et al [2] đã tìm thấy tỷ lệ tái sắp xếp hệ
gen ỏ' 10 trong sô 67 người Anh (15%), với 5 dạng tái sắp xếp khác nhau. Zhang el al
[25] đã đánh giá 16 cá thể người Thụy Sĩ có quan hệ họ hàng có hội chứng Lynch,
nhưng không m ang các đột biến dòng mầm ỏ' hai gen MLH1 và MSH2, tuy nhiên lại có
5 người trong đó (31% ) mang các mất đoạn hệ gen khác nhau. So sánh giữa các gia
đình mang các đột biến dòng mầm ở MLH1 hay MSH2 và các gia đình mang đột biến
ỏ' MSH6 cho thấy rằng đột biến ở MSH6 thể hiện ở giai đoạn muộn hơn của ung thư
đại trực tràng (ở tuổi 54, so vói ở tuổi 44 đổi với MLH1 hay MSH2). Nhiều nghiên cứu
cũng cho thấy phụ nữ mang đột biến ở MSH6 có nguy cơ hình thành ung thư đại trực

trùng thâp (30% cho tới tuổi 71), nhưng lại có nguy cơ hình thành ung thư nội mạc tử
cung (71% cho tới tuổi 71) [15, 16]. M ột số nghiên cứu khác đã chứng minh rằng
những người m ang dột biến ờ MSH2 có nguy CO' cao hơn hình thành ung thư ỏ’ ống tiết
niệu, dạ dày và buồng trứng, so với những người mang đột biến ở MLH1.
Mặc dù nhiều nghiên cứu về những bất thường di truyền ở vùng mã hóa của các
gen M M R trong các trường hợp hội chứng Lynch, những bất thường di truyền ở
promoter trong các gen này lại rất ít được nghiên cứu. N hững nghiên cứu gần đây đang
xác định và mô tả những đột biến dòng mầm ở vùng trung tâm các promoter của
những gen này. Shin et cil [20] đã đánh giá 141 bệnh nhân Hàn Quốc mắc hội chứng
Lynch và và đã tìm thấy ba đột biến ở vùng promoter của gen MSH2. Những đột biến
này ở các cá thể không có các đột biến dòng mầm. Những đột biến này ở promoter làm
giảm đáng kế hoạt tính của chúng, do đó ảnh hưởng đến vị trí mở đầu phiên mã và vị
trí bám của nhân tố phiên mã, tạo nên phức hợp DNA-protein mới. Những kết quả này
chỉ ra rằng, những đột biến ở promoter MSH2 chịu trách nhiệm cho quá trình mở đầu
hình thành khôi u ở một số nhỏ các trường hợp hội chứng Lynch.
I liện nay, mặc dù ung thư đại trực tràng là một trong những dạng ung thư phổ
biến nhất và gây tử vong cao ở Việt Nam, song nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh ỏ'
m ức độ phân tử và áp dụng xét nghiệm di truyền trong chẩn đoán và sàng lọc ung thư
này còn khá hạn chê. Trong những năm gần đây, đã có một số công trinh nghiên cứu
cua các tác giả trong nước về hướng nghiên cứu một số gen liên quan đến ung thư.
Chẳng hạn, N guyễn Thị Vinh Hà và cộng sự (2006) đã nghiên cứu kiểu sen của vi rút
15
v.êin gan B trên bệnh nhân ung thư gan bằng kỹ thuật sinh học phân tử; môi liên quan
gììữa sự hiến đôi gen đặc trưng vói một số đặc điềm lâm sàng và huyết học ở bệnh
nhân lơ xê mi cấp dòng tuỷ cũng đã được nghiên cứu bởi nhóm các tác giả Phạm
Qaiang V inh và cộng sự (2008). Đối với bệnh ung thư đại trực tràng, gần đây vào năm
2009, Lê Trần Ngoan đã công bố kết quả nghiên cứu tứ vong do ung thư đại - trực
tràng ỏ' 8 vùng sinh thái nước ta trong 2 năm 2005-2006. Cho tới nay, hầu như chưa có
nghiên cứu nào đi sâu tìm hiểu các đột biến ỏ' những gen sửa chữa bắt cặp sai liên quan
tòi ung thư đại trực tràng không polyp di truyền ỏ' người Việt Nam. Trên thực tế, mới

chỉ có số liệu hạn chế liên quan đến việc phòng ngừa di truyền trong HNPCC. Thực tế
cho thấy, chẩn đoán và điều trị ung thư đại trực tràng ở độ tuổi càng sớm thì sẽ có
nlhiôu cơ hội thành công.
5- M ục tiêu và nội dung nghiên cứu
5.1. Mục tiêu nghiên cứu
Xây dựng được quy trình phân tích gen nhằm phát hiện dột biến gen sửa chữa bắt
cặp sai (gen MSH2) để hỗ trợ chấn đoán và sàng lọc ung thư đại trực tràng không
piolyp di truyền và đánh giá được các đột biến ở gen sửa chữa bắt cặp sai MSH2 liên
qman đến ung thư đại trực tràng không polyp di truyền ở người Việt Nam.
5 :2. N ộ i (lu n g n g h iê n c ử u
Đề tài được thực hiện với các nội dung chính bao gồm:
- Thu thập mẫu nghiên cứu: Thu thập 50 mẫu máu và mô bệnh phẩm từ các bệnh
nhân được chẩn đoán mắc ung thư đại trực tràng đến khám, điều trị tại Bệnh viện
K và Bệnh viện Đại học Y Hà Nội. 10 mẫu đối chứng là máu của người có độ tuổi
trên 60, không mắc bệnh ung thư.
- Tách chiết DNA tống sô từ các mẫu máu và mô bệnh phẩm đã thu thập được
- Thiếl kế các cặp mồi đặc hiệu cho việc nhân bản một số phân đoạn gen MSH2.
- Tối ưu hóa và thực hiện phản ứng nhân bản các exon đã lựa chọn thuộc gen MSH2
bằng PCR.
- Phát hiện các đột biến ở gen nghiên cứu bằng các kỳ thuật PC R-SSCP, PCR-RFLP
và giải trì nil tự DNA.
16
CH Ư ƠN G 2. ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cử u
1. Vật liệu nghiên cứu
Đ ô i tư ợ n g n g h iê n c ử u và đ ịa d iê m t h í n g h iệ m
Đôi tượng thí nghiệm bao gồm mẫu m áu và mô của 50 người mac bệnh ung thư đại
trực tràng và ung thư dạ dày được thu thập từ K hoa U ng bướu và chăm sóc giảm nhẹ
Bệnh viện Đại học Y và Bệnh viện K.
Đê tài nghiên cửu đưọc thực hiện tại Bộ môn Di truyền học, Phòng phân tích Di
truyền - Trung tâm nghiên cứu Khoa học Sự sống, Khoa Sinh học và Phòng thí nghiệm

Trọng điểm công nghệ Enzyme và Protein - Trường Đại học Khoa học T ự nhiên, Đại
học Quốc gia Hà Nội.
Hóa chất và thiết bị
Kit tách chiết DNA tổng số được cung cấp bởi hãng R&D (Hàn Quốc). Các hóa
chất và dụng cụ dùng trong các thí nghiệm đều được cung cấp bởi các hãng có uy tín
trên thê giói như Fermentas, Promega, Sigma, Invitrogen, Bioneer, Corning
Thiết bị dùng cho nghiên cứu bao gồm: Các hệ thống điện di đứng và ngang của
BioRad (M ỹ), bể ổn nhiệt, máy ly tâm lạnh Kyratec và máy ly tâm nhiệt độ thường
(Eppendorf), máy PCR (Perkin Helmer), tủ lạnh -80°c, tủ lạnh thường, cân phân tích
2. Phương pháp nghiên cứu
2.1. Thu thập và bảo quản mâu
Mau m áu được thu thập trong các ống chuyên dụng, được chống đông bằng EDTA,
đảm bảo không bị nhiễm các chất khác, không bị lẫn các mẫu với nhau.
Các mẫu mô được thu và bảo quản ngay ở nhiệt độ -20°c.
Cả mẫu máu và mô được bảo quản trong điều kiện -20°c cho đến khi được sử dụng
để tách chiết và phân tích DNA.
Các m ẫu được lưu giữ với lý lịch mẫu rõ ràng, được dán nhãn theo nguyên tắc:
Mầu máu: B + số thứ tự mẫu, chẳng hạn: Bl, B2 ; Mau mô: T + số thứ tự mẫu,
chẳng hạn: T l, T2
2.2. Tách DNA tổng số
DNA tông số từ mẫu mô được tách chiết theo quy trình hướng dẫn đi kèm bộ kit
tách DNA tổng số R & D (Hàn Quốc).
Với các m ẫu máu, DN A tổng số được tách theo quy trình của của Sambrook và
cộng sự (2001) [19],
I

-
ĐẠI HỌC QUQC GIA HÀ NÔI j
TRUNG ĨÂM THÔNG TIN ỈHƯ VIEN ■
17

2.3. Kiếm tra độ tinh sạch và chuẩn bị khuôn cho phản ứng PCR
Kiểm tra DNA thu dược trong quá trình tách chiết bằng phương pháp điện di trên
gel agarose nồng độ 0,8% pha trong đệm TBE, sử dụng thang chuẩn D N A }JHind\\\
với điện thế 80V, đồng thời tiến hành phương pháp đo quang phổ thông qua chỉ số OD
260nm. 0 các bước sóng 260nm và 280nm, các mẫu có chỉ so O D 260/O D 280 từ 1 ,6 - 2
được coi là đạt yêu cầu và được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR. Những mẫu đạt
độ tinh sạch được tính nồng độ và pha loãng với nước khử ion vô trùng đê đạt tới nông
độ DN A cuối cùng 100|ig/ml.
2.4. Nhân bản các phàn đoạn gen (exon) quan tâm bang PCR
Gen MSH2 gồm 16 exon. Trong phạm vi nghiên cứu của đề tải, chúng tôi lựa chọn
các exon dựa trên các công bố đã có, m ang các đột biến được cho là liên kết với ung
thư đại trực tràng dạng HN PCC . 9 exon được phân tích trong nghiên cứu này bao gồm:
exon 2, 3, 6, 7, 8, 12. 13, 14, và 15. Việc thiết kế các cặp mồi đặc hiệu nhằm nhân bản
các phân đoạn chứa cả trình tự vùng ranh giói exon - intron.
Trình lự các cặp mồi đặc hiệu cho việc nhân ban các exon gen MSH2
Dựa trên trình tự gen MSH2 đã được công bố trên G enBank (AC079775.6), sử
dụng công cụ Primer blast ( chúng
tôi đã xác định trình tự nucleotide của các cặp mồi nhằm nhân bản 9 exon của gen này.
Trình tự mồi cụ thể cho việc nhân từng exon, thành phần phản ứng và chu trình nhiệt
được thể hiện tương ứng ở Bảng 2 và B ảng 3. Phản ứng PCR được thực hiện trên toàn
bộ các m ẫu DNA đã tách chiết được sau khi tiến hành tối ưu hóa các điều kiện phản
ứng.
Bảng 2. Trình tự mồi, kích thước tính toán theo lý thuyết sản phẩm nhân bản các
exon gen MSH2
Exon
T rình tụ (5’ - 3 ’)
Sản phẩm P C R (bp)
2
Xuôi
TG A A G TC C A G C TA A TA C A G T G C

345
Ngược
G TG TCT C A A A CCA T TC TACT A TCA
3
Xuôi
C TT A G G CTTCT CCT G G CAATC TC TC
281
Ngược
TC TCA G T TTC C C C A TG TCT CCAGCA
6
Xuôi
T G TT C CTCT GTTTTTC AT GGCG
279
Ngược
TG GT AT AATCATGTGG GTAACTGC
7
Xuôi
G TT G A G A CTTAC G TG C TT AG TTGAT
351
Ngược
TG A G G A C A G C A C A TTG C C A A G
8
Xuôi
GT A A C T T T G G AG ACCT GC T GT A CT
365
Ngược CATC CA CTG T C C A C A A A G G T G C T
18