Xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid trong lá và nụ vối

Xây dựng phương pháp định tính, định lượng
flavonoid trong lá và nụ vối

Nguyễn Quốc Tuấn

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn Thạc sĩ ngành: Hoá phân tích; Mã số: 60 44 29
Người hướng dẫn: PGS.TS. Phương Thiện Thương
Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Tách được 2’,4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’,5’-dimethylchalcone (CO -1) từ
nụ vối. Xây dựng được phương pháp định tính flavonoid bằng phản ứng hóa học. Tìm
ra được hệ dung môi định tính flavonoid bằng sắc ký bản mỏng (TLC). Tìm ra được
điều kiện chạy HPLC định tính chất CO-1 từ nụ và lá vối. Xác định được flavonoid
toàn phần trong lá và nụ vối của một số mẫu dược liệu vối thu hái ở các tỉnh phía Bắc.
Xây dựng được phương pháp định lượng CO-1 bằng HPLC. Ứng dụng phương pháp
xây được trong việc định lượng các mẫu lá và nụ vối thu hái ở các tỉnh phía Bắc.

Keywords: Hóa học; Hóa phân tích; Cây Vối

Content
MỞ ĐẦU
Cây Vối, một loại cây quen thuộc của làng quê các tỉnh Đồng Bằng bắc bộ, có tên
khoa học là Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry thuộc họ Sim (Myrtaceae). Từ
lâu nhân dân ta đã biết dùng lá và nụ vối với cách chế biến đơn giản tạo thành loại trà nấu hay
hãm lấy nước uống hàng ngày vừa có tác dụng thanh nhiệt vừa có tác dụng kiện tỳ, tiêu thực.
Thành phần hóa học chính trong nụ vối là flavonoid, với khoảng hơn 20 flavonoid
khác nhau. Các flavonoid có nhiều tác dụng sinh học quý như chống ung thư, chống dị ứng,
chống co giật, giảm đau, nghẽn mạch, nghẽn phế quản, lợi mật, diệt nấm Trong dự thảo
Dược Điển Việt Nam V (dự kiến xuất bản năm 2013-2014) đã có chuyên luận về lá và nụ vối.
Tuy nhiên, trong các chuyên luận này chưa có tiêu chí về định tính và định lượng flavonoid

trong nụ vối, trong khi flavonoid là thành phần chính và có nhiều tác dụng quan sinh học
trọng.
Với thực trạng trên, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài “Xây dựng phƣơng pháp định
tính, định lƣợng flavonoid trong nụ và lá vối”. Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở cho việc xây
dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lượng dược liệu nụ và lá vối phục vụ việc quản lý chất lượng
dược liệu trên thị trường.
Các mục tiêu của đề tài gồm có:
• Phân lập được một flavonoid chính trong nụ vối dùng làm chất đối chiếu trong việc
định tính, định lượng flavonoid.

2
• Xây dựng được quy trình định tính và định lượng flavonoid trong dược liệu nụ và lá
vối.
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về cây vối
1.1.1 Tên gọi
- Tên tiếng Việt: Cây vối, vối nhà
- Tên Latin: Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry
- Tên đồng nghĩa: Eugenia operculata Roxb.
- Họ Sim (Myrtaceae).
1.1.2 Đặc điểm thực vật
Cây vối là loại cây gỗ nhỡ, cao 5-10 m, có khi hơn, vỏ thân nứt nẻ, màu nâu đen. Cành
nhánh có nhiều vảy, cành non tròn hay hơi hình 4 cạnh, nhẵn Lá đơn mọc đối, có cuống dài 1-
1,5 cm, dai, cứng, phiến lá hình trái xoan hay hình trứng, dài 8-20 cm, rộng 5-8 cm giảm nhọn
ở gốc, có mũi ngắn. Quả hình cầu hay hơi hình trứng, đường kính 7-12 mm, xù xì, khi chín có
màu tím, thể chất nạc, vị ngọt.

a) Cây vối

b) Nụ vối tươi

b) Nụ vối khô
ơ
Hình 1.1: Hình ảnh Cây và Nụ vối
1.1.3 Thành phần hóa học
Lá Vối chứa rất ít tanin, vết alcaloid (nhóm indolic) và tinh dầu, tinh dầu lá gồm nhiều
thành phần trong đó thành phần chính là (Z)-β-ocimen, myrcen, (E)-β-ocimen. Trong lá vối
có chứa flavonoid, coumarin, tanin, acid hữu cơ, đường tự do và sterol. Vỏ cây chứa triterpen
nhóm ursan là acid usolic. Nụ vối chứa nhiều flavonoid khác nhau, với nhiều thành phần đã
xác định cấu trúc hóa học.
1.1.4 Tác dụng sinh học của các flavonoid trong lá và nụ vối
Các flavonoid còn có khả tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng như những
chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hóa. Do đó, các chất flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ
thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, thoái hóa gan, tổn thương do bức
xạ.

3
Flavonoid còn có tác dụng bảo vệ hệ tim mạch, giảm nguy cơ tử vong do các bệnh lý
tim mạch như thiếu máu cơ tim, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, xơ vữa động mạch,…nhờ
khả năng chống oxy hóa không hoàn toàn cholesterol.
- Tác dụng ức chế sự phát triển của TB ung thư: 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-
dimethylchalcone phân lập từ nụ vối có tác dụng ức chế sự phát triển của TB ung thƣ
với các dòng TB ung thƣ khác nhau.
- Tác dụng làm giảm đường huyết: tác dụng ức chế maltase đường ruột làm giảm đường huyết
trên chuột gây bệnh tiểu đường.
- Tác dụng chống oxy hóa: ức chế các enzym α-glucosidase.
- Tác dụng chống Alzheimer: các flavonoid như quercetin, kaempferol, tamarixetin được phân
lập từ nụ vối có tác dụng chống Alzheimer thông qua ức chế acetylcholinesterase và
butyrylcholinesterase.
1.2 Các phƣơng pháp định tính, định lƣợng flavonoid

1.2.1 Phƣơng pháp định tính
a) Phương pháp ống nghiệm
Phản ứng với hơi amoniac
Nhiều flavonoid thay đổi màu khi gặp hơi NH
3
. Có thể quan sát sự biến đổi màu này
bằng mắt thường hoặc dưới ánh sáng tử ngoại.
Phản ứng cyanidin (phản ứng Shinoda).
Phản ứng do sự có mặt nhân γ-penzopyron trong đa số flavonoid. Thuốc thử là HCl
đặc và bột Magie kim loại.
Phản ứng bằng thuốc thử Sibata và dung dịch H
2
SO
4
đậm đặc
Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài mililit H
2
SO
4
đậm đặc, sau đó cho thêm 0,1
gam Mg, tiếp theo thêm từ từ rượu isoamylic theo thành ống nghiệm. Đun nóng, có màu hồng
từ từ xuất hiện rồi chuyển sang đỏ cam hoặc đỏ tím [6].
Phản ứng với dung dịch sắt (III) clorid 5%.
Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5%, lắc sẽ xuất
hiện màu xanh đen.
b) phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM)
SKLM là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua
pha tĩnh, trên đó ta đặt hỗn hợp các chất cần tách .
1.2.2 Phƣơng pháp định lƣợng flavonoid
a) Phương pháp cân: Ứng dụng khi nguyên liệu giàu có flavone hoặc flavonol và dịch

chất ít tạp chất.
b) Phƣơng pháp trắc quang
Nguyên tắc: Phương pháp xác định dựa trên việc đo độ hấp thụ ánh sáng của một dung
dịch phức tạo thành giữa chất cần xác định với thuốc thử vô cơ hay hữu cơ trong môi trường
thích hợp khi được chiếu bởi chùm sáng. Phương trình định lượng của phép đo dựa trên định
luật Lamber-Beer: A = K.C

4
Trong đó: A: Độ hấp thụ quang
K: Hằng số thực nghiệm
C: Nồng độ chất phân tích
Phương pháp này cho phép xác định nồng độ chất ở khoảng 10
-5
– 10
-7
M và là một
trong những phương pháp được sử dụng khá phổ biến.
Đối với flavonoid cho tạo màu khi phản ứng cyanidin, phản ứng kết hợp với muối
diazoni, tạo phức màu với AlCl
3
, muối titan…
Phương pháp trắc quang có độ nhạy, độ ổn định cũng như độ chính xác khá cao và là
phương pháp được sử dụng phổ biến trong phân tích.
c) Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp hóa lý dựa vào ái lực khác
nhau của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan với nhau, một pha
động và một pha tĩnh. Quá trình sắc ký xảy ra do các cơ chế: Hấp phụ, phân bố, trao đổi ion
hoặc rây phân tử.
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó ra
khỏi cột đạt giá trị cực đại cho pic trên sắc ký đồ.

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Nụ và lá vối nhà, Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr.et Perry thuộc họ Sim
(Myrtaceae) được thu hái ở các địa phương khác nhau, ở các tỉnh phía Bắc. Sau đó phơi và
sấy ở 50
0
C cho đến khô. Các mẫu nụ và lá vối được lưu ở Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn,
Viện Dược liệu
2.2 Nội dung nghiên cứu
- Phân lập một flavonoid chính từ nụ vối. Tinh chế hoạt chất đạt độ tinh khiết cần thiết
cho việc định tính, định lượng.
- Xây dựng phương pháp định tính flavonoid từ lá và nụ vối.
- Xây dựng phương pháp định lượng một flavonoid chính từ lá và nụ vối.
2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất, dung môi
2.3.1 Thiết bị, dụng cụ
- Cân kỹ thuật Precisa XT 620M
- Cân phân tích Precisa XT 220A
- Máy cất quay Buchi B481
- Tủ sấy Binder – FD 115
- Đèn tử ngoại
- Hệ thống HPLC _ LC10A, hãng Shimadzu (Nhật Bản)
- Máy TLC chấm mẫu bán tự động CAMAG LINOMAT5, CAMAG REPROSTAR3.
- Máy UV-VIS 1800, dải đo 190 nm-900 nm, hãng Shimadzu (Nhật Bản)
2.3.2 Hóa chất, dung môi

5
- Dung môi: methanol, n-hexan, ethyl acetat, toluen… dùng cho sắc ký đạt tiêu chuẩn
phân tích, dung môi dùng trong chiết xuất đạt tiêu chuẩn công nghiệp được chưng cất lại
trước khi dùng.
- Bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn Silica gel GF254 (Merck).

- Silica gel sắc ký cột pha thường, cỡ hạt 40-63µm (Merck).
- Hóa chất: các hóa chất để làm các phản ứng định tính bằng phương pháp hóa học, định
tính phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và định lượng bằng phương pháp đo quang,
HPLC.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Chiết xuất và phân lập một flavonoid chính từ nụ vối
3.1.1. Chiết xuất dƣợc liệu và phân đoạn
Cân 8 kg dược liệu (nụ vối) làm khô, chiết bằng ethanol 96% bằng phương pháp ngâm
lạnh, cho ethanol ngập hết dược liệu, thời gian ngâm là 1 tuần/lần rút dung dịch chiết, ngâm 3
lần (dịch đã nhạt màu). Dung dịch chiết thu được, đem cất thu hồi dung môi ethanol và cô
cách thủy, thu được cao toàn phần (1192 g). Lấy 1000 g cao đem hòa tan một lượng vừa đủ
0,5 lít ethanol 96%, và tiếp tục bổ xung thêm 1,5 lít nước cất để hòa tan. Quy trình chiết được
tóm tắt ở sơ đồ 3.1:


3.1.2 Phân lập flavonoid chính trong cao phân đoạn ethyl acetat
Cân khoảng 300g cao phân đoạn EtOAc Tiến hành chạy cột với hệ dung môi n-hexan:
ethyl acetat với độ phân cực tăng dần (tỉ lệ dung môi từ 49:1 đến 1:1). Dùng bình nón có thể
tích 250 ml để hứng dung dịch ra khỏi cột, thu được 32 bình (200 ml). Tất cả các bình hứng
đều được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng. Bằng cách này, ta thấy từ bình 04 đến bình 09 cho
sắc đồ giống nhau có 1 vết màu vàng (hình 3.1), gộp các bình này lại, cất thu hồi dung môi và
cô cách thủy đến khô thu được chất rắn có màu da cam, gọi là chất rắn CO-1 (4,329 g).

a) Hình ảnh SKLM

b) Hình ảnh chất CO-1
Hình 3.1: Hình ảnh SKLM và chất CO-1 phân lập từ nụ vối

6
3.1.3. Xác định cấu trúc chất phân lập

Chất rắn CO-1 là tinh thể có màu vàng da cam, có điểm nóng chảy 125-127
0
C. Kiểm
tra độ tinh khiết bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cho biết chất CO-1 phân lập
được có độ tinh khiết 98,21% tính theo diện tích pic, sắc ký đồ thể hiện ở hình 3.2

Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
mAU
0
100
200
34016
1457
5242
1199
1875
691
2476
66
6412
2036
1009
2351
1201
15949
4250687
506
116
160

102
142
300
197
358
314
146
113
259
545
258
165
179
252
83
251
206
966
581
381
144
9: 341 nm, 8 nm
nuvoistd
nu voi_stdCO55(0.11mg-ml)- 13042012 - 5uL -002.dat
Area

Hình 3.2: Sắc ký đồ HPLC của chất CO-1
Kết hợp số liệu các phổ UV, IR,
1
H-NMR và

13
C-NMR cho thấy chất CO-1 là 2',4'-
dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcon, có CTPT là C
18
H
18
O
4
và KLPT 298 amu.
Phổ khối MS cho pic ion phân tử ở [M+H]
+
, có m/z = 299; ở [M-H]
+
có m/z = 297, tương
ứng với khối lượng phân tử của chất rắn CO-1 là M = 298 amu.
Công thức cấu tạo của chất CO-1 được trình bày trong hình 3.3.

Hình 3.3: Công thức cấu tạo chất CO-1
Kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC, đo nhiệt độ nóng chảy của CO-1 nhiều lần đều cho
kết quả ổn định ở 125-127
o
C. Như vậy, có thể sử dụng mẫu chất CO-1 phân lập được làm
chất đối chiếu trong phép xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid và chất này
trong các mẫu nụ và lá vối.
3.2 Xây dựng phƣơng pháp định tính flavonoid trong lá và nụ vối
3.2.1 Định tính bằng phản ứng hóa học
Bảng 3.1: Kết quả định tính flavonoid trong nụ và lá vối
3.2.2 Định tính bằng TLC
3.2.2.1 Định tính flavonoid trong dược liệu nụ và lá vối
a) Chuẩn bị mẫu chấm sắc ký

Dung dịch thử: Lấy 1 gam bột dược liệu (nụ, lá vối) cho vào bình nón, thêm 50 ml
methanol (MeOH) rồi đem siêu âm 30 phút, lọc qua giấy lọc, dịch lọc để làm các phép định
tính.

7
Dung dịch đối chiếu: Dung dịch flavonoid chính (tách được ở nụ vối) trong MeOH
(hàm lượng khoảng 1 mg/ml).
b) Hệ dung môi sắc ký: Tiến hành khảo sát triển khai sắc ký cho các hệ dung môi sau:
Hệ 1: Toluen:EtOAc:Aceton:Acid formic =5:2:2:1 (v:v:v )
Hệ 2: EtOAc:Acid acetic:Acid formic:Nước =10:1:1:2 (v:v:v:v )
Hệ 3: n-Hexan : EtOAc : Acid formic =6:3:0,1 (v:v:v )
Hệ 4: EtOAc : Toluen : Acid formic : Nước = 7:3:1,5:1 (v:v:v)





Hình 3.4: Sắc ký đồ định tính flavonoid trong nụ và lá vối
C: Chất chuẩn CO-1 N: Nụ vối L: Lá vối
Các sắc ký đồ hình (A,B,C) cho thấy flavonoid trong nụ, lá vối cho các vết màu đen
xám khi soi dưới UV-254 nm và UV-366 nm. Sau khi phun thuốc thử H
2
SO
4
10%

/ethanol và
sấy ở 105
0
C, ở miền ánh sáng trắng cho các vết có màu vàng (R

f
=0,47) đặc trưng của
flavonoid.
Như vậy có thể sử dụng hệ 3 làm hệ dung môi cho việc triển khai sắc ký để định tính
flavonoid trong việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu nụ, lá vối.
3.2.3 Định tính bằng HPLC
* Chuẩn bị dung dịch lá vối: Cân chính xác khoảng 1g bột dược liệu, thêm chính xác
khoảng 25,00 ml methanol, đem siêu âm 30 phút, làm lặp 2 lần, để nguội, bổ sung lượng
methanol đã mất cho đủ 50,00ml. Lọc, đem đi xác định hàm lượng.
* Chuẩn bị dung dịch nụ vối: Cân chính xác khoảng 1g bột dược liệu, thêm chính xác
khoảng 25,00 ml methanol, đem siêu âm 30 phút, làm lặp 2 lần, để nguội, bổ sung lượng
methanol đã mất cho đủ 50,00 ml. Lọc, hút ra chính xác 1ml đem hòa tan định mức thành
10,00ml bằng methanol, sau đó đem đi tiêm sắc ký.
* Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn: Cân chính xác 1,10 mg chất CO-1, thêm chính xác
1,00 ml methanol, sau đó đem siêu âm trong 10 phút. Hút chính xác 0,50 ml đem pha loãng
bằng methanol tới 5,00 ml để được nổng độ của CO-1 là 0,11 mg/ml, sau đó đem tiêm sắc ký.

8
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
mAU
0
100
200
34016
1457
5242
1199
1875
691

2476
66
6412
2036
1009
2351
1201
15949
4250687
506
116
160
102
142
300
197
358
314
146
113
259
545
258
165
179
252
83
251
206
966

581
381
144
9: 341 nm, 8 nm
nuvoistd
nu voi_stdCO55(0.11mg-ml)- 13042012 - 5uL -002.dat
Area

Sắc ký đồ chất đối chiếu (C)
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
mAU
0
20
40
60
80
1885
597620
40768
31034145292
37467
107289
68840
63088
52777
35304
1652910
5215
4829

5537
3529
77788
54358
3252
2988
5471
1672
1178
1307
425
227
61169
429
452
254
93
140
171
155
9: 341 nm, 8 nm
nuvoihungyen
nuvoihungyenm2(4mg.ml)- 25042012 - 10uL -001.dat
Area

Sắc ký đồ của nụ vối (N)
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
mAU
0

100
200
300
400
9: 341 nm, 8 nm
lavoi
lavoibacgiang(20mg.ml)- 29052012 - 10uL -003.dat
Area

Sắc ký đồ của lá vối (L)
Hình 3.5 : Sắc ký đồ của mẫu đối chiếu CO-1 và nụ, lá vối
Qua tiến hành thí nghiệm tìm ra điều kiện định tính CO-1 trong nụ và lá vối bằng sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thông qua thời gian lưu t
R
.
3.3 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid trong lá và nụ vối
3.3.1 Xây dựng bằng phƣơng pháp trắc quang
3.3.1.2 Độ lặp lại của phƣơng pháp
Để xác định độ lặp lại của phương pháp tiến hành với 6 thí nghiệm riêng biệt cho mẫu
nụ vối Hưng yên.
Bảng 3.2: Kết quả độ lặp lại của phương pháp trắc quang
STT
1
2
3
4
5
6
m
mẫu

(g)
1,0041
1,0064
1,0110
1,0365
1,0189
1,0831
Abs
0,174
0,181
0,184
0,191
0,196
0,193
Số liệu thống kê
SD = 0,83.10
-2
; RSD = 4,45%

Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy phương pháp có độ lặp lại có thể chấp nhận được thông
qua RSD = 4,45% (< 5%).
3.3.1.3 Xây dựng đƣờng chuẩn
Xây dựng đường chuẩn bằng chất đối chiếu CO-1: Tiến hành pha một dãy dung dịch
đối chiếu CO-1 (chất tách được từ nụ vối) với nồng độ chính xác là 12, 24, 36, 48 , 72 và 100
mg/l. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 Dựa trên phần mềm excel để vẽ đồ thị đường chuẩn ở
(hình 3.6).

Bảng 3.3: Kết quả xây dựng đường chuẩn theo chất đối chiếu CO-1
Nồng độ (mg/l)
12

24
36
48
72
100
A
510
(Abs)
0,042
0,082
0,120
0,160
0,231
0,332


9
y = 0.0033x + 0.0026
R
2
= 0.999
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0 20 40 60 80 100 120

Nồng độ CO-1 (mg/l)
Độ hấp thụ quang

Hình 3.6: Đường chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo CO-1
Từ kết quả ở bảng 3.5 và hình 3.7 kết quả khảo sát trên cho thấy với nồng độ của chất
đối chiếu CO-1 từ 12-100 mg/l có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ
quang. Ta được y = 0.0033x + 0.0026 với hệ số tương quan R
2
= 0.9990. Dựa trên phần mềm
Originpro 7.5 tính được độ lệch chuẩn của phương trình hồi quy là S
y
= 0,00366 và S
A
=
5,04.10
-5
; S
B
= 0,0028. Tra bảng ta t(0,95; 5) = 2,571
phƣơng trình hồi quy đầy đủ: y = (0,0033 ± 1,30.10
-4
)x + (0,0026± 0,0072)
Xây dựng đường chuẩn bằng chất chuẩn catechin: Tiến hành pha một dãy dung dịch
chuẩn catechin (Sigma) với các nồng độ chính xác là 45, 90, 180, 360 và 450 mg/l. Kết quả
được trình bày ở bảng 3.6. Dựa trên phần mềm excel để vẽ đồ thị đường chuẩn ở (hình 3.7).
Bảng 3.4: Kết quả xây dựng đường chuẩn theo chất chuẩn catechin
Nồng độ (mg/l)
45
90
180

360
450
Độ hấp thụ quang A
510
(Abs)
0,107
0,214
0,457
0,890
1,091


y = 0.0024x + 0.0022
R
2
= 0.9993
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 100 200 300 400 500
Nồng độ Catechin (mg/l)
Độ hấp thụ quang

Hình 3.7: Đường chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo catechin
Kết quả ở bảng 3.6 và hình 3.8 kết quả khảo sát trên đã chỉ ra rằng với nồng độ của
chất chuẩn catechin từ 45-450 mg/l có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ

quang. Ta được y = 0,0024x + 0,002 với hệ số tương quan R
2
= 0.9993. Tra bảng được t(0,95;
4) = 2,776. Dựa trên phần mềm Originpro 7.5 ta tính được độ lệch chuẩn của phương trình hồi
quy như sau: S
y
= 0,01289 và S
a
= 3,70.10
-5
; S
b
= 0,01013.
Phƣơng trình hồi quy đầy đủ là: y = (0,0024 ± 1,07.10
-4
)x + (0,002 ± 0,0028)
3.3.1.4 Giới hạn phƣơng pháp.
a) Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ:

10
Để tiến hành xác định LOD và LOQ tiến hành chuẩn bị các dung dịch mẫu trắng bằng
cách lấy vào 10 bình định mức cỡ 10 ml: Cho vào bình có chứa sẵn khoảng 4 ml nước cất +
0,3 ml NaNO
2
5% + 0,3 ml AlCl
3
10% + 2 ml NaOH 1M sau đó định mức bằng nước cất hai
lần, sau khoảng 10 phút thì đem đi đo độ hấp thụ quang của dãy dung dịch trên ở bước sóng
510 nm (với dung dịch so sánh là nước cất) ta thu được kết quả như trong bảng 3.7.
Bảng 3.5: Kết quả xác định độ lệch chuẩn của mẫu trắng

STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
A
510
0,002
0,002
0,003
0,002
0,004
0,002
0,003
0,002
0,002
0,004

Kết quả trên ta tính được giá trị trung bình:
O
A
= 0,0026
Giá trị độ lệch chuẩn: SD = 0,843.10
-3

Giới hạn phát hiện LOD và LOQ của phương pháp khi dùng chất CO-1 làm chất đối
chiếu:
LOD = 3.
Y
S
b
= 3.
3
0,843.10
0,0033

= 0,77 mg/l
LOQ = 10.
Y
S
b
= 10.
3
0,843.10
0,0033

= 2,55 mg/l
Giới hạn phát hiện LOD và LOQ của phương pháp khi dùng chất chuẩn catechin làm chuẩn:
LOD = 3.
Y
S
b
= 3.
3

0,843.10
0,0024

= 1,05 mg/l
LOQ = 10.
Y
S
b
= 10.
3
0,843.10
0,0024

= 3,51 mg/l
b) Giới hạn LOL: Xác định bằng cách nới rộng nồng độ ở điểm trên của đường chuẩn
cho đến khi tương quan giữa nồng độ và độ hấp thụ quang không còn tuyến tính nữa.
Đối với chất đối chiếu CO-1:
Bảng 3.6: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL của chất đối chiếu CO-1
Nồng độ CO-1 (mg/l)
48
72
100
110
120
130
A
510
0,160
0,231
0,332

0,351
0,376
0,381


11
Giới hạn LOL
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0 50 100 150
Nồng độ CO-1 (mg/l)
Độ hấp thụ quang

Hình 3.8: Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL của CO-1
Kết quả bảng 3.6 và hình 3.8 cho thấy nồng độ giới hạn LOL là 120 mg/l, tại nồng độ
này trở đi thì đồ thị của độ hấp thụ quang theo nồng độ không còn tuyến tính. Như vậy
khoảng tuyến tính của phương pháp xác định theo chất đối chiếu CO-1 là khoảng từ 2,55 –
120 mg/l.
Đối với chất chuẩn catechin:
Bảng 3.7: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL của catechin
Nồng độ catechin (mg/l)
500
900
1000
1100
1200

1300
A
510
1,217
2,246
2,534
2,712
2,798
2,834

Giới hạn LOL
0
1
2
3
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
Nồng độ catechin (mg/l)
Độ hấp thụ quang

Hình 3.9: Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL của catechin
Kết quả ở bảng 3.7 và hình 3.9 cho thấy nồng độ giới hạn LOL là 1000 mg/l, tại nồng
độ này trở đi thì đồ thị của độ hấp thụ quang theo nồng độ không còn tuyến tính.
Như vậy khoảng tuyến tính của phương pháp xác định theo chất chuẩn catechin là
khoảng từ 3,51 – 1000 mg/l.
3.3.1.5 Độ đúng của phƣơng pháp
Để xác định độ đúng thực hiện với một dung dịch mẫu đối chiếu CO-1 có nồng độ
chính xác 12 mg/l. Sau đó tiến hành phân tích mẫu chuẩn đó lặp lại 6 lần, kết quả được ghi ở
bảng 3.7
Bảng 3.8: Kết quả xác định độ đúng của phương pháp
STT

1
2
3
4
5
6

12
A
510
0,043
0,042
0,044
0,041
0,041
0,042
Hàm lƣợng
12,367
12,000
12,700
11,700
11,700
12,000
Số liệu thống kê
m
= 12,78; SD = 0,86

Ta có t
tn
=

2
12 12,78
0,86
6

= 2,22
Tra bảng t(0,95;5) = 2,57 > t
tn
= 2,22.
Như vậy : t
c
> t
tn
: Không có sự khác nhau về kết quả của giá trị trung bình so với giá
trị tham chiếu ở mức ý nghĩa α = 0,95, tức là phương pháp có độ đúng đạt yêu cầu → Phƣơng
pháp không mắc sai số hệ thống.
3.3.1.6 Độ ổn định của phƣơng pháp
Tiến hành đo độ hấp thụ quang của chất CO-1 có nồng độ 12 mg/l và của catechin có
nồng độ 100 mg/l. Sau đó dùng hàm chuẩn studen (t) để đánh giá. Kết quả được thể hiện ở
bảng 3.9
Bảng 3.9 : Kết quả đánh giá độ ổn định của phương pháp theo cách 1
STT
1
2
3
4
5
6
A
510

CO-1
0,043
0,042
0,044
0,041
0,041
0,042
Catechin
0,242
0,242
0,243
0,242
0,241
0,243

Ta có : Đối với chất CO-1:
510
A
1
= 0,0422 ; S
1
= 11,70.10
-4

Đối với chất catechin :
510
A
2
= 0,2422 ; S
2

= 7,54.10
-4

Ta có: F
tn
=
2
1
2
2
S
S
=
42
42
(11,70.10 )
(7,54.10 )


= 1,55 > 1 . Ta So sánh F
tn
với F
c
(0,05 ;5 ;5).
Tra bảng ta có F
c
(0,05 ;5 ;5) = 5,0503 > F
tn
= 1,55 : Như vậy hai phương sai không có sự khác
nhau có ý nghĩa, hai phương pháp có độ lặp lại tương đồng.

Kết quả định lƣợng flavonoid toàn phần trong nụ và lá vối
Hàm lượng flavonoid toàn phần trong nụ và lá vối được tính theo khối lượng chất
chuẩn catechin (g) và chất đối chiếu CO-1 (g). Được tính trong 1 g khối lượng mẫu dược liệu
khô tuyệt đối. Giá trị kết quả của hàm lượng flavonoid toàn phần được làm lặp lại 3 lần và kết
quả ở bảng 3.12 được biểu diễn :
m
± SD
Bảng 3.10 : Kết quả xác định flavonoid toàn phần

STT

Tên mẫu
(nơi thu hái)

m
mẫu
(g)
Hàm lƣợng
flavonoid toàn phần
tính theo Catechin
(mg/g)
Hàm lƣợng
flavonoid toàn phần
tính theo
CO-1 (mg/g)

Các mẫu lá

13
1
Bắc Giang
1,0028
30,33 ± 1,060
22,42 ± 1,060
2
Bắc Ninh
1,0017
20,73 ± 1,040
15,44 ± 1,040
3
Hà Đông (HN)
1,0028
21,81 ± 1,230
16,23 ± 1,230
4
Hòa Bình
1,0180
29,70 ± 1,320
21,99 ± 1,320
5
Phú Thọ
1,0066
23,74 ± 1,160
17,62 ± 1,160
6
Quảng Ninh
1,0221

22,61 ± 0,840
16,81 ± 0,840
7
Thái Bình
1,0380
22,69 ± 0,840
16,87 ± 0,840

Các mẫu nụ



8
Chợ Đồng Xuân(HN)
1,0020
39,23 ± 1,630
28,91 ± 1,630
9
Hưng Yên
1,0014
42,11 ± 1,630
30,99 ± 1,630
10
Nam Định
1,0032
40,93 ± 2,230
30,13 ± 2,230
11
Hải Dương
1,0045

39,23 ± 2,200
28,88 ± 2,200
12
Hà Đông (HN)
1,0052
34,98 ± 1,620
25,79 ± 1,620
13
Hà Nam
1,0066
38,51 ± 1,160
28,36 ± 1,160
14
Thái Nguyên
1,0013
37,43 ± 1,620
27,57 ± 1,650
Hàm lượng flavonoid toàn phần xác định theo chất chuẩn CO-1: Trong các mẫu lá vối
trong khoảng 15,443 – 22,418 mg/g. Trong nụ vối khoảng từ 25,791 – 30,995 mg/g.
Hàm lượng flavonoid toàn phần xác định theo chất chuẩn catechin: Trong các mẫu lá
vối trong khoảng 20,728 – 30,331 mg/g. Trong nụ vối khoảng từ 34,978 – 42,114 mg/g.
Qua bảng 3.10 nhận thấy hàm lượng flavonoid toàn phần trong nụ vối cao hơn so với
hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá vối.
3.3.2 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid chính bằng HPLC
3.3.2.1 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống
Để đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký, tiến hành pha một mẫu đối chiếu có
nồng độ 0,053 mg/ml, tiến hành sắc ký 6 lần với điều kiện sắc ký đã lựa chọn. Kết quả khảo
sát tính thích hợp của hệ thống được ghi ở bảng 3.11.
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống
Lần

tiêm
Thời gian lƣu
Diện tích pic
Các thông số thống kê
1
9,12766
2190950


14
2
9,07053
2186244
SD = 21052
RSD = 0,95 (%)
3
9,18479
2205546
4
9,47704
2245278
5
9,53417
2214240
6
9,41771
2213154
Kết quả trên cho thấy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống HPLC là phù hợp
và đảm bảo sự ổn định của phép phân tích định lượng CO-1.
3.3.2.2 Khoảng tuyến tính của phƣơng pháp

Chuẩn bị một dãy gồm 5 dung dịch mẫu đối chiếu CO-1 có nồng độ chính xác
khoảng 0,0055 mg/ml đến 0,11 mg/ml rồi tiến hành chạy sắc ký như điều kiện đã mô tả. Kết
quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.15 và đường chuẩn lập được, được thể hiện ở hình
3.12.
Bảng 3.12: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính
Dung dịch
Nồng độ (mg/ml)
Diện tích pic (AU.s)
1
0,11
4575033
2
0,055
2483455
3
0,0275
1138335
4
0,011
529218
5
0,0055
269653
6
0
27465
Sử dụng phần mềm origin 7.5 vẽ đường chuẩn và tính toán
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12
0
1000000

2000000
3000000
4000000
5000000
Ph-¬ng tr×nh: Y = A + B * X
Th«ng sè Gi¸ trÞ Sai sè

A 54599.803 46041.88268
B 4.16056E7 890693.07305

R SD N P

0.99908 83327.81606 6 <0.0001

DiÖn tÝch PÝc
Nång ®é (mg/ml)

Hình 3.10: Đường chuẩn xác định hàm lượng CO-1 trong nụ và lá vối

15
Δa = t(0,95, 4).S
a
= 2,131841*46041,883 = 98153,9739
Δb = t(0,95, 4).S
b
= 2,131841*890693,073 = 1898815,935
Phương trình hồi quy đầy đủ của đường chuẩn có dạng y = a + b.x có dạng như sau : y
= a + b.x = (a ± Δa) + (b ± Δb).x
y
i

= (54599,803 ± 98153,9739) + (4,16056x10
7
± 1898815,935). C
C.01
(1)
3.3.2.3 Độ lặp lại của phương pháp
Độ lặp lại của phương pháp được xác định bằng cách tiến hành 6 thí nghiệm riêng biệt
cho mẫu chứa chất đối chiếu CO-1 có nồng độ 0,042 mg/ml (Bảng 3.13A) và mẫu thực nụ vối
Hưng yên (Bảng 3.13B).
Bảng 3.13A: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu CO-1
Lần tiêm
1
2
3
4
5
6
PIC
S
(AU.s)
1663046
1712229
1725100
1730613
1666705
1727390
Các thông số thống kê
SD = 31102; RSD = 1,82(%)
Bảng3.13 B: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu thực
Tên mẫu thử

Số mẫu định
lƣợng
Hàm lƣợng tìm
thấy %
Các số liệu thống kê
Nụ vối Hưng Yên
6
1,86
SD = 0,0346 ;
RSD = 1,696%
3.3.2.4 Độ đúng của phƣơng pháp
Thêm vào mẫu thử (nụ vối Hưng Yên) đã được xác định hàm lượng một lượng chính
xác chất chuẩn sao cho tổng nồng độ của chúng vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát.
Hiệu suất thu hồi được tính theo công thức sau :
H(%) = 100%.(C
có thêm chuẩn
- C
nền
)/C
chuẩn được thêm vào


Bảng 3.14: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp
Tên mẫu
thử
Số lần
định
lƣợng
Lƣợng
thêm vào

(mg)
Lƣợng tìm
lại đƣợc
trung bình
% tìm lại đƣơc
trung bình
Số liệu thống kê
Mẫu nụ vối
Hưng Yên
6
0,044
0,043
97,73
RSD = 2,16 %
Qua bảng trên cho thấy, phương pháp phân tích định lượng HPLC có khả năng thu hồi
lại cao hơn 90% có thể chấp nhận được. Như vậy phương pháp này có độ đúng cao.
3.3.2.5 Giới hạn của phƣơng pháp

16
Phân tích mẫu chuẩn ở nồng độ 44 μg/ml, sau đó pha loãng dần đến khi dung dịch
chuẩn không còn xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Tiến hành phân tích theo các điều kiện
đã lựa chọn, ở nồn độ 0,031 μg/ml được coi là giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp
(Bảng 3.20) thể hiện qua việc tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu đường nền (S/N) đạt trong khoảng
2-3.
Ta có S/N =
2H
h
=
2.0,6
0,4

=3

Hình 3.11: Chiều cao tín hiệu phát hiện LOD
Qua bảng 3.20 và hình 3.12 xác định được giới hạn phát hiện (LOD) của phương
pháp xác định CO-1 là 0,031 μg/ml.
Như vậy suy ra giới hạn định lượng LOQ = 3,3 × LOD = 0,1023 μg/ml.
Xác định giới hạn LOL: Xác định bằng cách nới rộng điểm trên của đường chuẩn cho
đến khi tương quan giữa nồng độ và diện tích píc không còn tuyến tính nữa.
Bảng 3.15: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL
Nồng Độ
(mg/ml)
0,11
0,1375
0,22
0,275
0,367
0,55
Diện tích Píc
4575033
7119423
12105281
14809513
16490167
20791750

Giới hạn LOL
0
5000000
10000000
15000000

20000000
25000000
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Nồng độ CO-1 (mg/ml)
Diện tích Píc

Hình 3.12: Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL
Từ kết quả (Bảng 3.15 và Hình 3.12) cho thấy nồng độ giới hạn LOL là 0,275 mg/ml,
tại nồng độ này trở đi trên đồ thị cho thấy diện tích píc và nồng độ không còn tuyến tính. Như
vậy, khoảng nồng độ tuyến tính CO-1 để định lượng cho kết quả tốt nhất được xác định nằm
trong khoảng 0,1-275 μg/ml.
Bảng 3. 16: Kết quả định lượng hoạt chất trong một số mẫu nụ và lá vối
STT
Tên mẫu
Khối
Độ
Pic
S
(A
Hàm lƣợng chất CO-1

17
(nơi thu hái)
lƣợng
cân (g)
ẩm
(%)
U.s)
(mg/g)
(%

kl/kl)

Các mẫu nụ vối





1
Chợ Đồng Xuân (HN)
1,0709
12,62
1324731
16,81 ± 0,058
1,68
2
Hưng Yên
1,0007
11,18
1377958
18,61 ± 0,184
1,86
3
Nam Định
1,0113
11,14
1022567
13,45 ± 0,160
1,35
4

Hải Dương
1,0032
7,65
1143549
14,69 ± 0,093
1,47
5
Hà Đông (HN)
1,0057
6,77
1048407
13,24 ± 0,030
1,32
6
Hà Nam
1,0266
8,00
1066353
13,36 ± 0,125
1,34
7
Thái Nguyên
1,0003
7,85
1067456
13,74 ± 0,173
1,37

Các mẫu lá vối

8
Bắc Giang
1,0020
9,30
3447931
4,661 ± 0,058
0,47
9
Bắc Ninh
1,0017
11,50
3158279
4,376 ± 0,053
0,44
10
Hà Đông (HN)
1,0028
11,10
3178280
4,377 ± 0,029
0,44
11
Hòa Bình
1,0180
15,10
3379762

4,792 ± 0,030
0,48
12
Phú Thọ
1,0066
8,70
3449983
4,625 ± 0,045
0,46
13
Quảng Ninh
1,0221
11,50
3312138
4,493 ± 0,023
0,49
14
Thái Bình
1,0380
10,90
3258986
4.327 ± 0,029
0,43

Kết quả định lượng các mẫu thu hái tại một số địa phương ở miền bắc Việt Nam cho
biết hàm lượng CO-1 trong lá vối nằm trong khoảng 0,43 - 0,49%, thấp hơn nhiều so với hàm
lượng trong nụ vối trong khoảng 1,32 – 1,86%. Kết quả nghiên cứu này gợi ý cho việc xây
dựng tiêu chuẩn cho dược liệu nụ và lá vối để kiểm nghiệm chất lượng dược liệu vối sử dụng
cho y học cổ truyền.

18
KẾT LUẬN
1. Đã phân lập được một flavonoid chính (2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone)
trong nụ vối làm chất đối chiếu trong xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid.
Xác định được độ tinh khiết của flavonoid chính bằng HPLC (98,21%).
2. Đã xây dựng được phương pháp định tính flavonoid trong nụ và lá vối bằng các phản ứng
hóa học, sắc ký bản mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Đã đưa ra các phản ứng định tính flavonoid trong nụ và lá vối gồm: phản ứng với các
thuốc thử NH
3
, NaOH, (Mg + HCl), và FeCl
3
.
Tìm ra được hệ dung môi định tính flavonoid trong sắc ký bản mỏng (TLC) gồm: Hệ
1: n-Hexan : EtOAc : Acid formic = 6:3:0,1 (v:v:v ) và hệ 2: Toluen : EtOAc : Acid formic =
6:4:1 (v:v:v).
Định tính được flavonoid chính bằng HPLC thông qua thời gian lưu (t
R
= 9,3 phút) và
so sánh với chất đối chiếu CO-1 được tách từ nụ vối.
3. Xây dựng được phương pháp định lượng flavonoid:
a) Bằng phương pháp trắc quang
Xây dựng được phương pháp định lượng flavonoid toàn phần theo chất đối chiếu CO-
1 (được tách từ nụ vối) và theo catechin.
Xác định được khoảng tuyến tính và đường chuẩn xác định lượng flavonoid là ; Giới
hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phép đo nằm trong khoảng LOD = 0,77 mg/l, LOQ
= 2,55 mg/l (theo chất đối chiếu CO-1) và LOD = 1,05 mg/l, LOQ = 3,51 mg/l (theo chất
chuẩn catechin) ; Độ đúng, độ ổn định của phương pháp phù hợp.
Đã xác định được hàm lượng flavonoid toàn phần trong 14 mẫu nụ và lá vối thu hái ở

các tỉnh miền bắc Việt Nam. Kết quả cho biết hàm lượng trong các mẫu nụ là 25,791 – 30,995
mg/g, mẫu lá 15,443 – 22,418 mg/g (tính theo chất đối chiếu CO-1). Tính theo chất chuẩn
catechin : mẫu nụ là 34,978 – 42,114 mg/g, mẫu lá 20,728 – 30,331 mg/g. Kết quả đã đánh
giá được hàm lượng flavonoid trong nụ vối cao hơn trong lá vối có ý nghĩa thống kê.
b) Bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Đưa ra được điều kiện, dung môi phù hợp chạy sắc ký trong việc định lượng flavonoid
chính trong nụ và lá vối
Xác định được khoảng tuyến tính (0,1 – 275 μg/ml) và lập đường chuẩn của
flavonoid.
Xác định được giới hạn phát hiện (LOD = 0,031 μg/ml) và giới hạn định lượng của
phép đo (LOQ = 0,1023 μg/ml) .
Đánh giá được sai số và độ lặp lại của phép đo.

19
Đã xác định được hàm lượng của 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone
trong một số mẫu lá (4,3272 – 4,7924 mg/g) và nụ vối (13,2437 – 18,6095 mg/g) thu hái ở các
tỉnh phía Bắc.

References
I. Tiếng việt
1. Bộ Y tế (2005), Kiểm nghiệm thuốc, NXB Y học, Hà Nội. tr. 72-79.
2. Bộ Y tế (2007), Hóa phân tích II, NXB Y học, Hà Nội. tr.13-20.
3. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung
Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn
Tập, Trần Toàn – Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập II
NXB Y học, tr. 1065-1066.
4. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr. 1330.
5. Dược điển Việt Nam 3, NXB Y học 2004.
6. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc,
NXB Y Học.

7. Đào Thị Thanh Hiền (2000), “Góp phần nghiên cứu cây vối (Cleistocalyx operculatus
(Roxb.) Merr. et Perry Myrtaceae)”, Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Dược học, Trường Đại học
Dược Hà Nội.
8. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Xuân Trung, Nguyễn Văn Ri (2003), Các phương
pháp phân tích công cụ, NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội.
9. Trần Hùng (2007), Giáo trình, Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Đại học Y Dược Tp
HCM.
10. Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y học, Hà Nội, tr. 423.
11. Phạm Luận (2000), Giáo trình, Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao, Đại Học Khoa
Học Tự Nhiên-ĐHQGHN
12. Phạm Luận (2004), Cơ sở lý thuyết của phương pháp phân tích phổ hấp thụ quang phân
tử UV-VIS, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên-ĐHQGHN
13. Hoàng Thị Lý (2011), Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu nụ vối, khóa luận tốt nghiệp dược sĩ,
Trường đại học Dược Hà nội.
14. Trương Thị Tuyết Mai, Nguyễn Thị Lâm, Nguyễn Công Khẩn, Nguyễn Văn Chuyển,
Nagashima Fumie “Tác dụng chống oxy hóa của nụ vối trên ống nghiệm và trên chuột tiểu
đường” Tạp chí Y học dự phòng, 2009, số 5 (104).

20
15. Hoàng Thị Tuyết Nhung (2012), Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế Conessin, Kaempferol,
Nuciferin từ dược liệu làm chất chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm thuốc, Luận án Tiến sỹ -
Trường Đại học Dược Hà Nội.
16. Nguyễn Văn Ri, giáo trình môn học, Các phương pháp tách, Đại học Khoa học Tự Nhiên
- ĐHQGHN
17. Ngô Văn Thu, Bài giảng dược liệu, tập 1, Bộ y tế và Bộ giáo dục Hà Nội.
18. Nguyễn Thị Kim Tuyến, Nguyễn Văn Thanh, Hoàng Văn Lựu, Chu Đình Kính (2010).
“Tách và xác định cấu trúc một số hợp chất từ nụ và hoa cây vối (Cleistocalyx operculatus
(Roxb) Merr. et Perry) ở Nghệ An”. Tạp chí Dược học 405, tr. 44-46.
19. Tạ Thị Thảo, giáo trình môn học, Thống kê trong hóa phân tích, Đại học Khoa học Tự
Nhiên-ĐHQGHN.

20. Trần Quang Vinh (2009), Sự thay đổi hàm lượng flavonoid trong lá của cây chùm ngây
(Moringa oleifera Lam.) theo các giai đoạn phát triển, Luận văn thạc sĩ Trường Đại học hoa
Khọc Tự Nhiên - ĐHQG HCM
21. Viện Dược liệu (2008), Chiết xuất dược liệu, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. tr. 11-
29, 39-49, 66-76.
22. Viện Dược liệu – Sở Y tế tỉnh Nghệ an (2009), Cây thuốc Nghệ an, tr. 606-608.
23. Viện Dược liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà
Nội, tr. 494.
24. Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, Thẩm định phương pháp trong
phân tích hóa học và vi sinh vật, NXB khoa học và kỹ thuật Hà nội.
II. Tiếng anh
25. Arvouet A., B. Vennat, A. Pourrat and Legret (1994), “Sandardisation of an extract of
Propolis and identification of the major compounds”, J. Pharm. Belgg., Vol. 49 pp. 462-468.
26. Brás H. de Oliveira , Tomoe Nakashima ,José D. de Souza Filho and Fabiano L. Frehse
(2001), “HPLC Analysis of Flavonoids in Eupatorium littorale” J. Braz. Chem. Soc., Vol. 12,
No. 2, pp. 243-246.
27. Byung-Sun Min, To Dao Cuong, Joo-Sang Lee, Beom-Soo Shin, Mi Hee Woo, Tran
Manh Hung (2010), “Cholinesterase Inhibitors from Cleistocalyx operculatus Buds”, Archives
of Pharmacal Research 33(10), pp. 1665-1670.
28. Byung Sun Min, To Dao Cuong, Joo-Sang Lee, Mi Hee Woo, and Tran Manh Hung
(2010), “Flavonoids from Cleistocalyx operculatus Buds and their Cytotoxic Activity” Bull.
Korean Chem. Soc., Vol.31, No.8. pp. 2392-2394

21
29. Chun-Lin Ye ,Jian-Wen Liu , Dong-Zhi Wei Yan-Hua Lu , Feng Qian (2005), “In vivo
antitumor activity by 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone in a solid human
carcinoma xenograft model”, Cancer Chemotherapy and Pharmacology 56(1), pp. 70-74.
30. Chun-Lin Ye, Jian-Wen Liu, Dong-Zhi Wei, Yan-Hua Lu, Feng Qian (2004), “In vitro
anti-tumor activity of 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone against six
established human cancer cell lines”, Pharmacological Research 50(5), pp. 505-510.

31. Chun-Lin Ye, Yan-Hua Lu, Dong-Zhi Wei (2004), “Flavonoids from Cleistocalyx
operculatus”, Phytochemistry 65(4), pp. 445–447
32. C-L Ye, Y-H Lu, X-D Li, D-Z Wei (2005), “HPLC analysis of a bioactive Chalcone and
tritecpence in the buds of Cleistocalys operculatus” South African Journal of Botany, 71
(3&4) pp. 312-315.
33. Dao Trong Tuan et al. (2010), “C-Methylated flavonoids from Cleistocalyx operculatus
and their inhibitory effects on novel influenza A (H1N1) neuraminidase”. Journal of Natural
Products 73, pp. 1636-1642.
34. Elisabetta Campeol, Serena Catalano, Roberto Cremon Ini and Ivano Morell (2000),
“Flavonoids analysis of Vicia species of Narbonensis complex: V. kalakhensis Khatt. Maxt &
Bisby and V.eristalioides Maxt” Caryologia Vol. 53, No.1, pp. 63-68.
35. Feng Quian, Chun-Lin Ye, Dong-Zhi Wei, Yan-Hua Lu, Song-Lin Yang (2005), “In vitro
and in vivo reversal of cancer cell multidrug resistance by 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-
dimethylchalcone”, Journal of Chemotherapy 17(3), pp. 309-314.
36. Han-Yao Huang, Jian-Lei Niu, Yan-Hua Lu (2012), “Multidrug resistance reversal effect
of DMC derived from buds of Cleistocalyx operculatus in human hepatocellular tumor
xenograft model”, Journal of the science of food and agriculture 92(1), pp. 135-140.
37. James M. Harnly, Robert F. Doherty, Gary R. Beecher, Oanne M.Holden, David B.
Haytowitz, Seema Bhagwat, and Susan Gebhardt,(2006), “Flavonoid Content of U.S. Fruits,
Vegetables, and Nuts” J. Agric. Food Chem. 54, pp. 9966−9977.
38. Lui Alberto Lira Soares, Valquíria Link Bassani, George González Ortega & Pedro Ros
Petrovick (2003), “Total Flavonoid Determination for the Quality Control of Aqueous
Extractives from Phyllanthus niruri L.” Lat. Am. J. Pharm. 22 (3), pp. 203-207.
39. L Tao, Z-T.Wang, E Y.Zhu, Y H.Lu, D Z.Wei (2006), “HPLC analysis of bioactive
flavonoids from the rhizome of Alipinia officinarum” South African Journal of Botany 72
(2006), pp. 163-166.

22
40. Marica Medić-Šarić, Ivona Jasprica, Asja Smolčić-Bubalo and Ana Mornar (2004),
“Optimization of chromatographic conditions in thin layer chromatography of flavonoids and

phenolic acids” Croat. Chem. Acta 77(1-2), pp. 361-366.
41. Mudasir Sultana, Pawan Kumar Verma, Rajinder Raina, Shahid Prawez & M A Dar
“Quantitative Analysis of Total Phenolic, flavonoids and Tannin Contents in Acetone and n-
hexane Extracts of Ageratum conyzoides” International Journal of ChemTech Research
CODEN( USA): IJCRGG ISSN : 0974-4290 Vol. 4, No.3, pp. 996-999
42. Nguyen Thi Dung , Jung Min Kim, Sun Chul Kang (2008), “Chemical composition,
antimicrobial and antioxidant activities of the essential oil and the ethanol extract of
Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr and Perry buds”, Food and Chemical Toxicology 46,
pp. 3632–3639.
43. Tevini, M., Iwanzik, W., Teramura, A.H. (1983), “Effects of UV-B radiation on plants
during mild water stress-II. Effects on growth, protein and flavonoid contcent”, Z.
Pflanzenphysiol. 110, pp. 459-467.
44. T. Sathishkumar, Baskar.R, Shanmugam.S, Rajasekaran.P, Sadasivam.S and
Manikandan.V “Optimization of flavonoids extraction from the leaves of Tabernaemontana
heyneana Wall. using L16 Orthogonal design” Nature and Science, 6(3), 2008, ISSN: 1545-
0740
45. Truong Tuyet Mai, Nguyen Van Chuyen (2007), “Anti-hyperglycemic activity of an
aqueous extract from flower buds of Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr and Perry”,
Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 71(1), pp. 69-76.
46. Truong Tuyet Mai, Nghiem Nguyet Thu, Pham Gia Tien, Nguyen Van Chuyen (2007),
“Alpha-Glucosidase inhibitory and antioxidant activities of Vietnamese edible plants and their
relationship with polyphenol contents”, Journal of Nutritional Science and Vitaminology
53(3), pp. 267-276.
47. Waksmundzka H. M., Sherma J., Kowalska T. (2008), “Thin layer Chromatography in
Phytochemistry”, CRC Press, Florida. pp. 3-15.