XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG HOA VIOLET CHÂU PHI (SAINTPAULIA) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC YERSIN ĐÀ LẠT
KHOA SINH HỌC MƠI TRƯỜNG
---------o0o----------

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN
GIỐNG HOA VIOLET CHÂU PHI
(SAINTPAULIA) BẰNG PHƯƠNG
PHÁP NUÔI CẤY MÔ
TẾ BÀO


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................. Error! Bookmark not defined.
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.................................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................................ vi
LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 2
1.1. Tổng quan violet (Saintpaulia) ............................................................................. 2
1.2. Các phương pháp nhân giống hiện nay................................................................. 2
1.3. Đặc điểm sinh thái ................................................................................................ 2
1.4. Đặc điểm hình thái ................................................................................................ 2
1.5. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................. 3
1.5.1. Sơ lược lịch sử nuôi cây mô tế bào thực vật .................................................. 3
1.5.2. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật ..................................................... 5
1.5.3. Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vậy ......................................... 5
1.6. Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật .................................. 6
1.6.1. Ảnh hưởng của các thành phần trong môi trường nuôi cấy ........................... 6
1.6.2. Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý .................................................................... 8
1.7. Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng. .................................................................. 9

1.7.1. Auxin .............................................................................................................. 9
1.7.2. Cytokinin ...................................................................................................... 10
1.7.3. Giberellin...................................................................................................... 11
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ....................................................... 14
2.1. Vật liệu ................................................................................................................ 14
2.1.1. Nguồn mẫu thực vật ..................................................................................... 14
2.1.2. Hóa chất: ...................................................................................................... 14
2.1.3. Trang thiết bị, dụng cụ: ................................................................................ 14
2.2. Phương pháp ....................................................................................................... 14
2.2.1. Khảo sát nồng độ khoáng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của
cây Violet Châu Phi (Saintpaulia) trong điều kiện nuôi cấy mô. .......................... 14
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của Kinetin lên sự sinh trưởng và phát triển của cây
Violet Châu Phi (Saintpaulia) trong điều kiện nuôi cấy mô. ................................. 15


2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng Gibberillic lên sự sinh trưởng và phát triển của cây
Violet Châu Phi (Saintpaulia) trong điều kiện nuôi cấy mô. ................................. 15
2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của Auxin đến khả năng ra rễ của cây Violet Châu Phi
(Saintpaulia) trong điều kiện nuôi cấy mô. ........................................................... 15
2.2.5. Thu thập xử lý số liệu. ................................................................................. 16
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN................................................................ 17
3.1. Kết quả khảo sát nồng độ khoáng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển
của cây violet (Saintpaulia) trong điều kiện nuôi cấy mô. ........................................ 17
3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng Gibberillic lên sự sinh trưởng và phát triển của cây
violet (Saintpaulia) trong điều kiện nuôi cấy mô. ..................................................... 20
3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của Auxin đến khả năng ra rễ của cây violet
(Saintpaulia) trong điều kiện nuôi cấy mô. ............................................................... 21
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 24
4.1. Kết luận ............................................................................................................... 24
4.2. Kiến nghị ............................................................................................................. 24

TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 25


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
MS: môi trường Murashige và Skoog (1962)
¾ MS: mơi trường MS với thành phần khống đa lng gim ắ v vi lng gi
nguyờn.
ẵ MS: mụi trng MS với thành phần khống đa lượng giảm ½ và vi lượng giữ
ngun.
¼ MS: mơi trường MS với thành phần khống đa lượng giảm ¼ và vi lượng giữ
ngun
NAA: α-naphthaleneacetic acid
GA3: gibberellic acid
IAA : idole-3-acetic acid
TB: trung bình
NXB : nhà xuất bản


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Khảo sát nồng độ khoáng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của
cây Violet Châu Phi (Saintpaulia) trong điều kiện nuôi cấy mô................................... 17
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của Kinetin lên sự sinh trưởng và phát triển của
cây Violet Châu Phi (Saintpaulia) trong điều kiện nuôi cấy mô................................... 18
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát Gibberillic lên sự sinh trưởng và phát triển của cây Violet
Châu Phi (Saintpaulia) trong điều kiện nuôi cấy mô. ................................................... 20
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của Auxin đến khả năng ra rễ của cây Violet
Châu Phi (Saintpaulia) trong điều kiện nuôi cấy mô. ................................................... 22


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 3.1. Khảo sát mơi trường khống thích hợp cho cây Violet Châu Phi sinh trưởng
và phát triển. .................................................................................................................. 18
Hình 3.2. Kết quả khảo sát Kinetin lên sự sinh trưởng và phát triển của cây violet
(Saintpaulia) trong điều kiện ni cấy mơ. ................................................................... 19
Hình 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng Gibberillic lên sự sinh trưởng và phát triển của
cây violet (Saintpaulia) trong điều kiện nuôi cấy mơ. .................................................. 21
Hình 3.4. Kết quả khảo sát đến khả năng ra rễ của cây violet (Saintpaulia) trong điều
kiện nuôi cấy mô............................................................................................................ 23


Lời mở đầu

LỜI MỞ ĐẦU
Hiện nay, các loại hoa trồng chậu trang trí ngày càng được ưa chuộng và phổ
biến, đặc biệt ở các nước phát triển. Khi cuộc sống đang ngày càng được đơ thị hố,
các loại hoa trồng chậu đã góp phần đáng kể trong việc cải tạo mơi trường sống, đáp
ứng nhu cầu trang trí, thay đổi không gian sống và làm cho cuộc sống con người gần
gũi với thiên nhiên hơn. Có rất nhiều loại hoa trồng chậu phổ biến và được người tiêu
dùng ưa chuộng như Begonia, Cineraria, Geranium, Saintpaulia,... Trong đó, cây
Saintpaulia hay cịn gọi là Violet Châu Phi là loại cây đẹp, đa dạng về màu sắc, có tác
dụng lọc khơng khí, trang trí, điều hịa tinh thần và giải tỏa áp lực. Dù trong bất cứ
khơng gian nào thì cây cũng sẽ đem lại cho chúng ta một cảm giác dễ chịu. Cây khơng
những có tác dụng lọc khơng khí mạnh mà cịn có thể hút các loại chất có hại trong
khơng khí như Aldehyde, amoniac, trichloroethylene...
Phương pháp ni cấy mơ tế bào thực vật giúp ngành nông nghiệp sản xuất được
một lượng lớn cây giống, đồng đều về mặt di truyền, trong thời gian ngắn, tiết kiệm
được chi phí mua giống. Việc nhân giống trong phịng thí nghiệm bằng phương pháp
ni cấy mơ tế bào giúp chúng ta kiểm sốt dịch bệnh cây giống và đáp ứng đủ nhu
cầu trang trí cho người tiêu dùng. Để đáp ứng việc cung cấp giống cho sản xuất với số
lượng lớn, cây con khỏe và sạch bệnh, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Xây dựng

quy trình nhân nhanh giống violet Châu Phi (Saintpaulia) bằng phương pháp
nuôi cấy mô tế bào”.

1


Chương 1. Tổng quan

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan violet (Saintpaulia)
– Tên khoa học: Saintpaulia
– Tên gọi khác: violet Châu Phi
– Bộ: Lamiales
– Họ: Gesneriaceae (tai voi)
– Chi: Saintpaulia
Nguồn gốc và phân bố: Violet Châu Phi (Saintpaulia) có nguồn góc từ Tanzania
và Đơng Nam giáp Kenya nhiệt đới ở phía đơng châu phi. Lồi hoa này rất được ưa
chuộng tại châu Âu, châu Mỹ.
Violet là loài hoa đẹp dễ trồng dễ trang trí nhưng đang có nguy cơ tuyệt chủng
cao. Với giá trị kinh tế cao thị trường cây trồng trong chậu của Hoa Kỳ đạt giá trị 788
triệu đô la Mỹ trong năm 2014 ; 810 triệu đô la Mỹ năm 2015 (USDA, 2016); trong đó
hoa violet Châu Phi chiếm 4,07 triệu đô la Mỹ (4,16 triệu đô la Mỹ năm 2015; với
mức tăng 1% so với năm 2013 (USDA, 2015).
1.2. Các phương pháp nhân giống hiện nay.
Violet châu Phi (Saintpaulia ionantha H. Wendl) là một loại cây cảnh trồng trong
chậu phổ biến, dễ trồng ex vitro và in vitro so với các loài cây cảnh thân thảo khác.
Chất lượng này làm cho nó trở thành một đối tượng lý tưởng cho thí nghiệm tái sinh
in vitro.
1.3. Đặc điểm sinh thái
Violet châu Phi (Saintpaulia ionantha H. Wendl.) có nguồn gốc từ Tanzania và

Đông Nam giáp Kenya nhiệt đới ở phía đơng Châu Phi. Saintpaulias mọc cao từ 6-15
cm và có thể rộng từ 6-30 cm. Các lá thn trịn thành hình bầu dục, dài 2,5-8,5 cm
với một cuống 2-10 cm, lông mịn và với kết cấu nhiều thịt. Các hoa có đường kính 2-3
cm, với một thùy tràng hoa và có 3-10 bơng hoặc nhiều hơn trên một cành hoa mảnh
mai. Màu hoa ở các lồi hoang dã có thể là: tím, xanh nhạt hoặc trắng. Cây khơng chịu
được ánh sáng trực tiếp, sau 3 đến 4 tháng trồng cây bắt đầu cho nụ và trổ hoa.
1.4. Đặc điểm hình thái
Violet châu Phi (Saintpaulia ionantha H. Wendl.) là một chi bao gồm khoảng 20
lồi biến thể. Có nhiều loại khác nhau bao gồm kích cỡ, màu sắc hoa và kiểu tán lá.

2


Chương 1. Tổng quan

Trên thực tế có hàng ngàn cây lai với nhiều màu sắc, dạng hoa và kiểu lá khác nhau.
Tuy nhiên, chúng cũng có một số đặc điểm cơ bản về các loại và kích thước.
Tiêu chuẩn: loại tiêu chuẩn thường phát triển với đường kính khoảng 8-16 inch
hoặc có thể hơn và hiển thị hầu hết các màu mà loại hoa violet Châu Phi có thể nở.
Cánh hoa và lá: có rất nhiều sự kết hợp màu sắc khác nhau dành cho cánh hoa,
từ hồng đến hoa Candy Dandy kép nhiều màu. Các cánh hoa cũng có hình dạng, cánh,
số lượng khác nhau và có thể ra hoa kép.
Ngồi ra cịn có nhiều loại lá khác nhau bao gồm các tên gọi như hình cậu bé, cơ
gái, hình loang lổ (xanh lá cây và trắng), hình thìa, nhựa ruồi, hình răng cưa và hình
mũi mác.
Thân: Violet Châu Phi thuộc dòng thân bụi nhỏ, chiều cao trưởng thành khoảng
30-40cm.
Rễ: Hoa violet Châu Phi thuộc dòng rễ cọc.
Hoa: Đây là điểm nhấn đặc biệt của violet Châu Phi, những cánh hoa mềm mại,
đa dạng nhiều màu sắc từ tím mộng mơ, hồng ngây thơ, trắng ban mai. Sự nở hoa:

Những bông hoa này nở trong khoảng 10 tháng hoặc hơn một năm, với việc sử dụng
ánh sáng nhân tạo, nhiệt độ và điều kiện phù hợp. Về cơ bản, chúng có thể ra hoa
quanh năm nhưng: tùy thuộc vào mức độ chăm sóc.
1.5. Cơ sở khoa học của ni cấy mô tế bào thực vật
1.5.1. Sơ lược lịch sử nuôi cây mô tế bào thực vật
Năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức Schleiden và Schwan đã đề xướng
thuyết tế bào và nêu rõ: “Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ, các
tế bào hợp thành. Các tế bào phân hóa đều mang các thơng tin di truyền có trong các tế
bào đầu tiên, đó là trứng sau thụ tinh, và là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây
dựng lại toàn bộ cơ thể” (Nguyễn Đức Thành, 2000).
Năm 1902, Harberland là người đầu tiên đã quan niệm rằng bất kì một tế bào nào
của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể
hồn chỉnh. Ơng đã cho rằng “Bằng ni cấy mơ tế bào đã phân lập, người ta có thể
tạo ra các phôi nhân tạo từ các tế bào sinh dưỡng”. Ơng cũng đã tiến hành ni cấy
mẫu lá của một số cây lá mầm như: Erythronium, Tradescantia, tuy nhiên đã không
thành công (Vũ Văn Vụ và cs, 2009).

3


Chương 1. Tổng quan

Năm 1922, Kotte, học trò của Harberland và Robbins, người Mỹ, lặp lại thực
nghiệm của Haberland với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hoà thảo. Trong
mơi trường lỏng gồm có muối khống và glucose, đầu rễ sinh trưởng khá mạnh, tạo
nên một hệ rễ nhỏ mang cả rễ phụ. Tuy nhiên, sự sinh trưởng như vậy chỉ tồn tại trong
một thời gian sau đó chậm dần và dừng lại, mặc dù các tác giả đã chuyển sang môi
trường mới (Nguyễn Đức Thành, 2000).
Năm 1934, được xem là giai đoạn thứ hai của nuôi cấy mô và tế bào thực vật khi
White thành công trong việc duy trì mơ rễ cây cà chua trong mơi trường lỏng có chứa

muối khống, đường saccarozơ và dịch chiết nấm men. Qua thí nghiệm, ơng thấy rằng
có thể thay dịch chiết nấm men bằng các vitamin nhóm B (B1, B3, B6) (Dodd J. H.,
Roberts L. W, 1999).
Năm 1939, độc lập với Nobercourt, Gautheret cũng đã duy trì được sinh trưởng
của mô sẹo cà rốt trong một thời gian dài. Năm 1941, Van Overbeek và cộng sự đã
phát hiện thấy nước dừa có ảnh hưởng tích cực đến sự phát sinh phôi và tạo mô sẹo ở
cây họ cà (Dodd J. H., Roberts L. W, 1999). Cũng trong thời gian này, nhiều chất điều
hồ sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin như NAA, 2,4-D đã được tổng hợp. Nhiều
tác giả xác nhận cùng với nước dừa, 2,4-D và NAA đã giúp tạo mô sẹo thông qua phân
chia tế bào ở nhiều đối tượng thực vật mà trước đó rất khó nuôi cấy (Nguyễn Kim
Thanh, 2005).
Năm 1954, Skoog bổ sung chế phẩm ADN chiết từ tinh dịch cá bẹ vào môi
trường ni cấy mơ thân cây thuốc lá. Ơng nhận thấy chế phẩm này có tác dụng kích
thích sinh trưởng mơ nuôi cấy rõ rệt. Một năm sau, Skoog và cộng sự đã xác nhận chất
gây ra hiện tượng trên là 6-furfuryl amino purine và đặt tên là kinetin. Sau đó người ta
đã tìm ra và tổng hợp một số chất có tác dụng kích thích phân bào tương tự như kinetin
và cùng với kinetin gọi chung là nhóm cytokinin. Cytokinin được tách chiết từ thực
vật bậc cao đầu tiên là zeatin có trong mầm ngơ. Các hợp chất này có khả năng kích
thích sự phân chia tế bào của các mơ đã biệt hố cao như tế bào thịt lá hoặc nội nhũ
của hạt đã phơi khô (Dodd J. H., Roberts L. W, 1999).
Nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, Morel (1960) đã tạo ra được các protocorm (mô
sẹo) từ địa lan. Khi để trong các điều kiện nhất định, các protocorm có thể phát triển
thành cây lan con và hồn tồn sạch bệnh. Cùng năm đó, Cocking ở trường đại học
tổng hợp Nottingham đã thu được các tế bào trần (protoplast) dùng cho nuôi cấy từ mô
4


Chương 1. Tổng quan

thực vật được xử lý với enzym xenlulaza. Năm 1966, Guha và cộng sự đã tạo được cây

đơn bội từ nuôi cấy túi phấn của cây cà độc dược (Datura inoxia). Việc tạo cây đơn bội
thành công ở nhiều lồi thực vật thơng qua ni cấy bao phấn và hạt phấn đã đóng góp
rất lớn cho các nghiên cứu di truyền và lai tạo giống (Vũ Văn Vụ và cs, 2009).
Từ những năm 1970 trở đi, các nhà khoa học đã chú ý vào triển vọng của kỹ
thuật nuôi cấy protoplast, khi hai tác giả người Nhật Bản là Nagata và Takebe đã thành
công trong việc làm cho protoplast thuốc lá tái tạo được xenlulozo. Năm 1978,
Melchers và cộng sự đã lai tạo thành công protoplast của cà chua với protoplast của
khoai tây, mở ra một triển vọng mới trong lai xa ở thực vật (Vũ Văn Vụ và cs, 2009).
1.5.2. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là q trình ni cấy in vitro các ngun liệu như
đoạn thân, đoạn rễ, vảy củ hay mẫu mô, cánh hoa có kích thước phù hợp được ni
cấy trong ống nghiệm với điều kiện vơ trùng và mơi trường thích hợp để tạo thành mơ
hay cây hồn chỉnh (Vũ Văn Vụ và cs,2009).
Ưu điểm của phương pháp này là: Cho hệ số nhân giống cao nên có thể tạo ra số
lượng cây lớn trong thời gian ngắn; Thực hiện quanh năm không phụ thuộc vào điều
kiện tự nhiên; Tạo ra cá thể mới giữ được đặc tính của cây ban đầu (Nguyễn Ngọc
Dung, 1998), (Ngô Ứng Long, 1985).
1.5.3. Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vậy
Trong nhiều thập kỷ qua, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã phát triển mạnh mẽ ở
nhiều quốc gia trên thế giới. Có thể nói đây là cơng cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực
nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của nghành sinh học
Nhờ áp dụng các kĩ thuật nuôi cấy mô như: nuôi cấy mô phân sinh, callus, nuôi
cấy phôi, nuôi cấy rễ tơ, nuôi cấy tế bào trần... con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản
nhanh hơn, gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên. Điều này sẽ góp phần tạo ra
hàng loạt các cá thể mới giữ nguyên các tính trạng di truyền của cơ thể mẹ và rút ngắn
thời gian để đưa một giống mới vào sản xuất với quy mô lớn (Nguyễn Hoàng Lộc,
2006;), (Vũ Văn Vụ và cs, 2008).
Ngoài ra, dựa vào kỹ thuật ni cấy, có thể duy trì và bảo quản được nhiều giống
cây trồng quý hiếm, hoặc loại bỏ các mầm bệnh của những loài sinh vật sinh dưỡng.
Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần có thể tạo ra những con lai về mặt

di truyền mà phương pháp nhân giống cổ điện không thực hiện được. Bên cạnh đó, các
5


Chương 1. Tổng quan

nhà nghiên cứu đã thu nhận các chất trao đổi thứ cấp từ tế bào nuôi cấy, dẫn đến sự ổn
định và độc lập hơn, ít lệ thuộc vào sản xuất thực vật ở ngoài tự nhiên “Mở ra triển
vọng sử dụng kỹ thuật này để nuôi cấy sinh khối lớn có khả năng tổng hợp những chất
sinh học để thu nhận các hợp chấp trên quy mô công nghiệp” (Quách Thị Liên, 2004).
Ưu điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong điều kiện in vitro dễ sản xuất các
hợp chất thứ cấp:
Các tế bào thực vật có thể được ni cấy trong điều kiện nhân tạo mà không phụ
thuộc vào thời tiết và địa lý. Không cẩn thiết để vận chuyển và bảo quản một số lượng
lớn các ngun liệu thơ.
Có thể kiểm sốt chất lượng và hiệu quả sản phẩm bằng cách loại bỏ những trở
ngại trong quá trình sản xuất thực vật, như là chất lượng của nguyên liệu thô, sự đồng
nhất giữa các lô sản xuất và sự hư hỏng trong quá trình vận chuyển và bảo quản.
Một số sản phẩm trao đổi chất được sản xuất được từ nuôi cấy mơ dịch huyền
phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006).
Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung các kỹ thuật nhân giống vô tính cổ
điển như dâm cành, dâm chồi, chiết, ghép, tách dòng... một kỹ thuật tiến bộ với những
ưu thế như tính khả thi rộng, tốc độ nhân giống cực kỳ cao và có tiềm năng cơng
nghiệp hóa (Lê Trần Bình, 1997).
Một ý nghĩa không kém phần quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật là mở
ra những hướng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật như: cơ chế tổng
hợp các chất, sinh lý phân tử, di truyền - đột biến, sinh lý sinh dưỡng ở các tế bào
thực vật và nhiều đề sinh học khác…(Vũ Văn Vụ và cs, 2008)
1.6. Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.6.1. Ảnh hưởng của các thành phần trong môi trường nuôi cấy

Trong ni cấy in vitro, cả ́u tố hóa học và ́u tố vật lý của cây trong các bình
ni đều phải được cung cấp đầy đủ. Môi trường dinh dưỡng phải cung cấp tất cả các
ion khoáng cần thiết, nguồn chất hữu cơ bổ sung như amino acid và vitamin, nguồn
cacbon cố định, và một thành phần cần cho sự sống cũng phải được cung cấp đó là
nước. Các nhân tố vật lý như nhiệt độ, pH, môi trường khí, ánh sáng và áp lực thẩm
thấu, cũng phải được duy trì trong giới hạn chấp nhận.
Hiện nay trên thế giới có rất nhiều mơi trường được sử dụng như môi trường
Murashige và Skoog (1962), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974),
6


Chương 1. Tổng quan

mơi trường Anderson, Went, Knudson, Lindemann…Trong đó môi trường MS được
đánh giá là phù hợp rộng rãi nhất với nhiều loại cây trồng, bao gồm cả cây hai lá mầm
và cây một lá mầm. Thông thường trong một môi trường nuôi cấy phải đảm bảo các
thành phần hóa học sau:


Các ngun tố khống
Tùy theo nồng độ sử dụng, các ngun tố khống được chia vào hai nhóm là

nguyên tố đa lượng và nguyên tố vi lượng.
• Nguyên tố đa lượng: Các nguyên tố này thường chiếm 0,1 % khối lượng khô
của thực vật. Nitơ, phốt pho, kali, magiê, canxi, và lưu huỳnh là các muối vô cơ.
Chúng có mặt trong các hợp chất quan trọng (diệp lục. protein, acid nucleic, acid
amin…), tham gia vào các quá trình như điều chỉnh áp suất thẩm thấu tế bào, vận
chuyển năng lượng trong hô hấp, quang hợp, thực hiện vai trị tín hiệu tế bào,…
• Ngun tố vi lượng: Được cung cấp với lượng rất thấp cho thực vật sinh
trưởng, phát triển và có nhiều vai trị khác nhau. Mangan, iốt, đồng, coban, Bo, Mo,

sắt và kẽm là các nguyên tố vi lượng, ngồi ra niken và nhơm cũng được tìm thấy
trong một số cơng thức. Ngun tố vi lượng thường có mặt trong thành phần của một
số coenzyme, vitamin; tham gia vào các phản ứng trao đổi điện tử, sinh tổng hợp diệp
lục,…


Các loại vitamin

• Các vitamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzyme và cofactor
trong nhiều phản ứng sinh hóa (Vũ Văn Vụ, 2006). Các loại vitamin B1, B6, PP và
myoinositol là cần thiết cho nuôi cấy tế bào thực vật in vitro. Tuy nhiên, vì lý do lịch
sử các loại vitamin khác nhau cũng được thêm vào để ni cấy.
• Các amino acid có vai trị quan trọng trong việc phát sinh hình thái, amino acid,
aLanine, glutamic acid, glutamine và proline cũng được sử dụng nhưng trong nhiều
trường hợp là không cần thiết.


Nguồn cacbon

Các mơ và tế bào thực vật ni cấy nói chung, không thể tự quang hợp hoặc
quang hợp yếu do thiếu chlorophil và các điều kiện khác…do đó phải bổ sung thêm
cacbon. Saccharose thường được sử dụng làm nguồn cacbon do đó những đặc tính như
rẻ, dễ kiếm, đồng hóa triệt để và tương đối ổn định. Ngoài ra, các loại đường khác như
glucose, maltose, galactose và sorbitol cũng có thể được sử dụng trong những trường
7


Chương 1. Tổng quan

hợp đặc biệt. Đường vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu ni cấy, đồng thời cịn

tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của môi trường.
Đường đóng góp khoảng 50-70 % vào khả năng thẩm thấu của môi trường
(Trigiano and Gray, 2000). Thông thường đường saccharose được sử dụng ở nồng độ
0,2-0,3 %, nhưng nồng độ này có sự thay đổi ở từng đối tượng khác nhau và mục đích
ni cấy khác nhau, có khi xuống tới 0,2 % (tạo dịng), có khi tăng lên đến 12 % (gây
cảm ứng stress nước).
Sự hình thành rễ địi hỏi một lượng đường được cung cấp từ quang hợp hoặc
ngoại sinh. Theo George (1993) hầu hết các loại thực vật khi ra rễ thích hợp với lượng
đường 20-30 g/lít. Tuy nhiên, cũng có lồi u cầu nguồn carbohydrate ngoại sinh cao
hơn. Ví dụ theo Sharma (1993) cây Gentiana kurroo chỉ có thể ra rễ tốt khi bổ sung 60
g/lít saccharose trong mơi trường cung cấp tốt hơn đường saccharose.
Thí nghiệm áp dụng phương pháp quang tự dưỡng cho thấy các cây in vitro đã
phát triển tốt trên môi trường khơng có đường và vitamin, độ thống khí cao. Tỷ lệ
nhiễm nấm giảm đáng kể. Cây có diện tích lá lớn hơn và sự đóng mở của lá theo quy
luật tự nhiên ngay khi gặp điều kiện thay đổi của mơi trường.
Trong khi đó cây ni cấy theo điều kiện truyền thống (có đường và vitamin) có
diện tích lá nhỏ, khí khổng ln ln ở trạng thái mở trong nhiều giờ khi chuyển từ
điều kiện in vitro ra vườn ươm. Tỷ lệ sống 95-100 % sau một tháng ở vườn ươm đối
với cây ni cấy trên mơi trường khơng có đường, trái lại chỉ từ 70-80 % theo phương
pháp truyền thống (Nguyễn Thị Quỳnh và cộng sự, 2005).
• Tác nhân làm đặc môi trường
Tùy thuộc vào loại sinh trưởng, môi trường nuôi cấy cần được sử dụng ở dạng
lỏng hoặc đặc, nhiều loại mơi trường ni cấy địi hỏi tế bào hoặc mô thực vật phải
sinh trưởng trên bề mặt, agar là tác nhân làm đặc môi trường được sử dụng phổ biến
nhất. Agar được sản xuất từ tảo biển, loại tinh khiết hay agarose có thể cũng được sử
dụng, nhưng có thể khác nhau về độ đặc.
1.6.2. Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý
Các yếu tố vật lý chính là ánh sáng, nhiệt độ, độ pH, trạng thái môi trường,…


Ánh sáng

Trong môi trường nuôi cấy, quang tổng hợp khơng phải là một hoạt động cần
thiết do sự có mặt của đường trong môi trường, nhưng ánh sáng cần thiết để điều hòa
8


Chương 1. Tổng quan

một số quá trình liên quan tới phát sinh hình thái của cây. Tùy từng loại ni cấy, yêu
cầu cường độ cũng như thời gian chiếu sáng khác nhau, ví dụ như khi ni cấy mơ
sẹo, thường khơng cần ánh sáng. Ánh sáng cịn ảnh hưởng tới sinh trưởng của mô nuôi
cấy thông qua tác động nên trạng thái và cấu trúc của các chất điều hòa sinh trưởng
cũng như dinh dưỡng khống. Thơng thường trong phịng nuôi cấy người ta sử dụng
ánh sáng huỳnh quang chiếu sáng 14-15 giờ/ ngày với cường độ 2000 lx.


Nhiệt độ

Nhiệt độ trong phịng ni cấy mơ thường được điều chỉnh ổn định từ 220C đến
250C. Tuy nhiên tùy từng loại ni cấy và đối tượng ni cấy mà có sự điều chỉnh
nhiệt độ phù hợp. Theo nhiều nghiên cứu trong ni cấy mơ sẹo, huyền phù tế bào với
mục đích sản xuất các hợp chất thứ sinh thì sự điều chỉnh nhiệt độ rất có ý nghĩa, cảm
ứng cho tế bào sinh trưởng, phân chia và tiết các hợp chất thứ sinh. Nhiệt độ cịn ảnh
hưởng tới ni cấy thơng qua tác động tới cấu trúc của các chất điều hịa sinh trưởng
như IAA, GA3,…


pH mơi trường
pH của mơi trường cũng là một yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng tới trạng thái

lý hóa của các chất trong mơi trường, do đó ảnh hưởng tới khả năng điện ly của các
muối, sự thủy phân hóa các chất… Thơng thường pH được điều chỉnh ở mức 5,5 - 5,8.
• Trạng thái mơi trường
Sự phát triển của mơ có thể bị thay đổi hồn tồn nếu chúng ni cấy trên một
mơi trường đặc, lỏng hoặc nửa lỏng. Các mô nuôi cấy thường sinh trưởng tốt hơn 20
trong môi trường lỏng, tuy nhiên mơi trường lỏng cũng gây ra hiện tượng thủy tinh
hóa, các mơ ni cấy bị mọng nước gây khó khăn cho cấy chuyển và ra cây.
1.7. Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng.
1.7.1. Auxin
Went (1926, 1928) đã khám phá ra auxin và phát hiện sau đó là IAA vào năm
1934 (Went, Thimann, 1937; Haagen-Smit, 1951). Từ đó, IAA đã mở đường cho
những thành công ban đầu trong nuôi cấy mơ (Gautheret, 1983, 1985).
Auxin gồm có hai loại là auxin có nguồn gốc nội sinh được tổng hợp bởi thực vật
và auxin tổng hợp do con người tạo ra. Các loại auxin thông dụng thường dùng là:
IAA, IBA, NAA và 2,4-D.

9


Chương 1. Tổng quan

Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nó tùy thuộc vào
nồng độ và sự kết hợp của chúng với các chất điều hòa sinh trưởng khác. Auxin tác
động lên sự kéo dài tế bào. Hệ quả này tạo sự tiếp nối cho sự gia tăng tính đàn hồi của
thành tế bào và sự xâm nhập của nước vào trong tế bào; sự đề kháng của thành tế bào
giảm đi và tế bào được kéo dài ra. Auxin cịn làm thay đổi tính thẩm thấu của màng tế
bào, sự thay đổi này thể hiện bằng sự phóng thích ion H+. Ion này gây ra một hoạt tính
có tác dụng làm giảm tính đề kháng của thành tế bào bởi sự hấp thu K+. Ngồi ra,
auxin cịn kích thích sự phân chia tế bào một cách đặc biệt trong q trình hình thành

mơ sẹo và sự hình thành rễ bất định; ức chế sự phát triển của chồi nách và sự hình
thành phơi soma trong môi trường nuôi cấy mô sẹo.
Tất cả các cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo từng giai đoạn phát triển của
chúng. Auxin được tổng hợp ở các lá non, trong các chồi đang hoạt động, ở phát hoa
và ở trên các quả còn non. Tác động thúc đẩy hay ức chế sự nở hoa của auxin lên cây
thuốc lá phụ thuộc vào nồng độ. Nồng độ vừa phải của IAA (3,0 – 10,3 M) làm giảm tỉ
lệ chồi sinh dưỡng, trong khi đó ở các nồng độ cao ức chế tồn bộ sự hình thành chồi
(Wardell và Skoog, 1969).
1.7.2. Cytokinin
Cytokinin là hợp chất của adenine được thay thế, chất này được biết đến qua hai
nhóm nội sinh là: Zeatin và IPA. Miller tìm thấy KIN (6-furfuryl amino purin) trong
DNA của tinh trùng cá trích thanh trùng được lưu trữ lạnh trong thời gian dài và định
danh. Được gọi là KIN bởi nó có khả năng kích thích sự phân chia tế bào hay sự phân
bào trong mô thuốc lá. Cytokinin đầu tiên được phân lập từ hạt bắp non, được gọi là
zeatin (6-(4- hydroxy-3-methyl-trans-2-butenyl-amino purine). Cytokinin được tìm
thấy ở hầu hết thực vật bậc cao, rêu, nấm ký sinh và khơng ký sinh. Có hai loại
cytokinin được sử dụng nhiều nhất cho môi trường nuôi cấy Lan là KIN và BA (Lê
Văn Hoàng, 2008). Ngoài ra, TDZ cũng là một chất điều hòa sinh trưởng mạnh được
xếp vào nhóm cytokinin, nhưng nó có thể thay thế đồng thời cả cytokinin và auxin để
kích thích q trình phát sinh hình thái trong ni cấy mơ.
Vai trị chính của cytokinin trong cây là giúp phân chia tế bào, bởi cytokinin có
khả năng kích thích sự tổng hợp enzyme RuBisCo (Ribulozo-1,5-biphotphate 22
cacboxylase/oxygenase), làm tăng hoạt tính ARN - polymarase và thiết lập các

10


Chương 1. Tổng quan

polyribosome nên làm tăng quá trình chuyển hóa acid nucleic và protein (Vũ Văn Vụ

et al., 2001).
Cytokinin giúp cho sự nảy mầm, mở rộng tế bào và cơ quan, kích thích sự mở
rộng tế bào ở trục hạ diệp được cắt từ cây củ cải, bí đỏ, cây lanh và nhiều cây song tử
diệp khác. Sự mở rộng của tế bào là do sự hấp thu nước gây ra, làm giảm thế năng
thẩm thấu của tế bào được kích thích bởi sự biến đổi trở lại của lipid dự trữ trong trục
hạ diệp thành đường khử (glucose và fructose).
Cytokinin có thể kích thích hoặc ức chế sự khởi đầu và phát triển của rễ tùy theo
nồng độ và thời gian xử lý. KIN có thể kích thích sự tăng trọng lượng khô và sự vươn
dài của rễ cây đậu lupin con, trái lại hai yếu tố trên bị ức chế ở nồng độ KIN cao. Khi
KIN được xử lý lên rễ ở nồng độ thấp nó kích thích quang hợp và sinh trưởng. Tuy
nhiên, nếu rễ tiếp xúc với KIN ở nồng độ cao trong hai ngày thì sự sinh trưởng và phát
triển của rễ sẽ giảm rõ rệt.
Cytokinin có khả năng kích thích chồi bên và đặc biệt vượt qua ảnh hưởng của
ưu thế ngọn. Ưu thế ngọn được điều khiển bởi sự cân bằng giữa mức độ cytokinin và
auxin nội sinh. Cytokinin có thể giúp làm giảm q trình lão hóa khi tách lá ra khỏi
thân cây và hoạt động như là chất thay thế cho sự cần thiết của rễ để làm giảm lão hóa.
Cytokinin cũng có khả năng thay thế ảnh hưởng của ánh sáng và làm giảm sự lão hóa
bằng cách duy trì nguyên vẹn màng tonoplast (màng bán thấm bao quanh khơng bào).
KIN có khả năng kích thích sự vận chuyển của các chất hữu cơ trong lá đã cắt và giữ
trong tối. Khả năng của cytokinin kích thích sự vận chuyển dinh dưỡng và tạo ra sức
chứa đã được biết trên nhiều lồi.
Ngồi ra, cytokinin cịn có chức năng làm tăng diện tích phiến lá, làm tăng sự mở
của khí khổng ở một số loài, tạo chồi bất định ở nồng độ cao (Nguyễn Đức Lượng, Lê
Thị Thủy Tiên, 2003).
1.7.3. Giberellin
Giberellin là nhóm phytohormone thứ hai được phát hiện vào năm 1955—1956.
Khi nghiên cứu cơ chế gây nên bệnh lúa von (cây lúa sinh trưởng chiều cao quá mức
gây nên bệnh lí), các nhà khoa học đã chiết tách được chất gây nên sinh trưởng mạnh
của cây lúa bị bệnh. Đó chính là axit Gibberillic (GA3). Giberelin cũng được xem là
một phytohormone quan trọng của thế giới thực vật.

11


Chương 1. Tổng quan

Ngày nay, người ta đã phát hiện ra trên 60 loại giberellin trong cây kí hiệu là
GA1; GA2, GA3,… GA60..; trong đó GA3 có hoạt tính sinh lí mạnh nhất và là dạng
GA được sản xuất và sử dụng hiện nay trong sản xuất. GA;, được sản xuất bằng con
đường lên men và chiết xuất sản phẩm từ dịch nuôi cấy nấm...
Giberellin được tổng hợp chủ yếu trong lá non, một số cơ quan non đang sinh
trưởng như phôi hạt đang nảy mầm, quả non, rễ non... Sự vận chuyển của nó trong cây
theo hệ thống mạch dẫn và không phân cực như auxin. GA trong cây cũng có thể ở
dạng tự do và dạng liên kết với các hợp chất khác.
Hiệu quả rõ rệt nhất của GA là kích thích mạnh mẽ sự sinh trưởng về chiều cao
của thân, chiều dài của cành, rễ, sự kéo dài của lóng cây hồ thảo. Hiệu quả này có
được là do ảnh hưởng kích thích đặc trưng của GA lên sự dãn theo chiều dọc của tê
bào.
Trong tự nhiên, tồn tại các đột biến lùn. Các đột biến này có chiều cao thấp hơn
nhiều so với các cây bình thường. Đây là các đột biến gen đơn giản, do thiếu một gen
nào đó trong q trình tổng hợp giberellin. Với các đột biến này, việc xử lí GA sẽ rất
hiệu quả.
Trong sản xuất, nếu muốn tăng chiều cao, tăng sinh khối, người ta có thể xử lí
GA.
GA kích thích sự nảy mầm của hạt, củ, nên nó có tác dụng đặc trưng trong việc
phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của chúng. GA có tác dụng hoạt hố sự hình thành các
enzim thuỷ phân trong hạt như a-amylaza. Enzim này sẽ xúc tác phản ứng biến đổi
tinh bột thành đường, tạo điều kiện cho sự nảy mầm.
Trong sản xuất, muốn phá trạng thái ngủ nghỉ, tăng tỉ lệ nảy mầm của các hạt,
củ... thì có thể xử lí GA3 cho chúng.

Trong nhiều trường hợp, GA có hiệu quả kích thích sự ra hoa. Theo học thuyết ra
hoa của Trailakhian thì GA là một trong hai thành viên của hoocmon ra hoa (florigen)
là GA và antesin. GA cần cho sự hình thành và phát triển của trụ dưới hoa (cuống
hoa), còn antesin cần cho sự phát triển của hoa.
Xử lý GA có thể làm cho cây dài ngày ra hoa trong điều kiện ngày ngắn hoặc làm
cho bắp cải, su hào ra hoa trong điều kiện của Việt Nam

12


Chương 1. Tổng quan

GA có hiệu quả trong việc phân hố giới tính đực. Nó ức chế sự hình thành hoa
cái và kích thích hình thành hoa đực. Có thể sử dụng GA để tăng tỉ lệ hoa đực cho cây
có hoa đực, hoa cái riêng biệt như bầu bí...
GA có ảnh hưởng kích thích lên sự hình thành quả và tạo quả không hạt. Hiệu
quả này cũng tương tự như của auxin, nhưng một số cây trồng có phản ứng đặc hiệu
với GA như nho, anh đào... Trong việc sản xuất nho, biện pháp xử lí GA có ý nghĩa
quan trọng trong việc tăng tỉ lệ đậu quả và quả khơng hoặc ít hạt, tăng năng suất quả
nho. Ngồi ra, GA có ảnh hưởng điều chỉnh lên một số q trình trao đổi chất và hoạt
động sinh lí của cây. GA là một trong những chất có ứng dụng khá hiệu quả trong sản
xuất.

13


Chương 2. Vật liệu và phương pháp

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu

2.1.1. Nguồn mẫu thực vật
Nguồn mẫu cho thí nghiệm nhân nhanh chồi
Sử dụng nguồn mẫu là các cụm phơi Violet Châu Phi có sẵn tại phịng thí nghiệm
Cơng nghệ sinh học thực vật Đại học Yersin Đà Lạt làm vật liệu cho thí nghiệm nhân
nhanh chồi.
Nguồn mẫu cho thí nghiệm ra rễ in vitro
Các chồi thu được sau giai đoạn nhân nhanh có kích thước ≥ 5mm, có 4-5 lá
được sử dụng làm vật liệu ni cấy cho thí nghiệm ra rễ in vitro.
2.1.2. Hóa chất:
Mơi trường MS cơ bản
Saccharose
Các chất kích thích sinh trưởng: Kinetin, Giberellin, Auxin
2.1.3. Trang thiết bị, dụng cụ:
Tủ cấy, cân phân tích, máy đo pH
Dụng cụ: Dao cấy, đĩa cấy, pank cấy, kéo, túi nuôi cấy nylon 120 x 250 mm
không thống khí, cốc đong 20 mL và 50 mL,...
2.2. Phương pháp
2.2.1. Khảo sát nồng độ khoáng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của
cây Violet Châu Phi (Saintpaulia) trong điều kiện ni cấy mơ.
- Mục đích thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành nhằm khảo sát ảnh hưởng của
các nồng độ chất khoáng lên khả năng nhân nhanh chồi của cây Violet Châu Phi
(Saintpaulia) nuôi cấy in vitro
- Tiến hành thí nghiệm: Sử dụng các cụm phơi cây Violet Châu Phi (Saintpaulia)
chưa hình thành cây hồn chỉnh cấy vào các túi ni cấy nylon có chứa các mơi trng
khoỏng khỏc nhau (MS, ắ MS, ẵ MS, ẳ MS), 7g agar và 30g sucrose, pH = 6. Đã
được vô trùng ở 121oC trong thời gian 30 phút. Mật độ nuôi cấy 5 cụm phôi/ túi
- Chỉ tiêu theo dõi: số chồi hoàn chỉnh, chiều cao chồi (mm), số lá/chồi. Thu kết
quả sau 6 tuần nuôi cấy

14

Chương 2. Vật liệu và phương pháp

2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của Kinetin lên sự sinh trưởng và phát triển của cây
Violet Châu Phi (Saintpaulia) trong điều kiện nuôi cấy mơ.
- Mục đích thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành nhằm khảo sát ảnh hưởng của
Kinetin lên khả năng sinh trưởng và phát triển chồi của cây Violet Châu Phi
(Saintpaulia) ni cấy in vitro.
- Tiến hành thí nghiệm: Sử dụng các cụm phơi cây Violet Châu Phi (Saintpaulia)
chưa hình thành chồi hồn chỉnh cấy sang mơi trường MS bổ sung Kinetin ở nồng độ
khác nhau (0; 0,3; 0,5; 0,7; 1; 1,5; 2)mg/l, 7g agar và 30g sucrose, pH được điều chỉnh
về 5.8, sau đó đem đi vơ trùng ở 121oC trong thời gian 30 phút. Mật độ nuôi cấy 5 cụm
phơi/ túi
- Chỉ tiêu theo dõi: số chồi hồn chỉnh, chiều cao chồi (mm), số lá/chồi. Thu kết
quả sau 6 tuần nuôi cấy
2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng Gibberillic lên sự sinh trưởng và phát triển của cây
Violet Châu Phi (Saintpaulia) trong điều kiện ni cấy mơ.
- Mục đích thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành nhằm khảo sát ảnh hưởng của
Gibberillic lên khả năng sinh trưởng và phát triển của chồi cây Violet Châu Phi
(Saintpaulia)
- Tiến hành thí nghiệm: Sử dụng các cụm phơi cây Violet Châu Phi (Saintpaulia)
chưa hình thành cây hồn chỉnh cấy sang mơi trường MS bổ sung Gibberillic ở các
nồng độ khác nhau (0; 0,3; 0,5; 0,7; 1; 1,5; 2) mg/l, 7g/l agar và 30g sucrose, pH được
điều chỉnh về 5.8 sau đó được vơ trùng ở 121oC trong thời gian 30 phút. Mật độ nuôi
cấy 5 cụm phôi/ túi
- Chỉ tiêu theo dõi: số chồi hoàn chỉnh, chiều cao chồi (mm), số lá/chồi. Thu kết
quả sau 6 tuần nuôi cấy
2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của Auxin đến khả năng ra rễ của cây Violet Châu Phi
(Saintpaulia) trong điều kiện ni cấy mơ.

- Mục đích thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành nhằm khảo sát ảnh hưởng của
Auxin NAA đến khả năng ra rễ của cây Violet Châu Phi (Saintpaulia).
- Tiến hành thí nghiệm: Cây hồn chỉnh có 3 - 4 lá được sử dụng làm nguồn mẫu
cho thí nghiệm ra rễ. Cây được cấy sang mơi trường MS có bổ sung NAA ở các nồng
độ (0; 0,3;0,5; 0,7; 1; 1,5; 2)mg/l, 7g agar và 30g sucrose, pH được điều chỉnh về 5.8
sau đó được vơ trùng ở 121oC trong thời gian 30 phút. Mật độ nuôi cấy 12 cây/ túi.
15


Chương 2. Vật liệu và phương pháp

- Chỉ tiêu theo dõi: số lá, số rễ, chiều dài rễ (mm), chiều dài mẫu (mm). Thu kết
quả sau 1 tháng nuôi cấy.
2.2.5. Thu thập xử lý số liệu.
Tất cả các thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên và lặp lại 3 lần, mỗi lần 5
túi, mỗi túi 5 mẫu. Trong thí nghiệm ra rễ mỗi lần 5 túi, mỗi túi 12 cây. Số liệu thu
nhận được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2016 và phần mềm SPSS 22.0 với
phép thử Duncan (mức ý nghĩa p = 0,05).

16


Chương 3. Kết quả và biện luận

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Kết quả khảo sát nồng độ khoáng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát
triển của cây violet (Saintpaulia) trong điều kiện nuôi cấy mô.
Bảng 3.1. Khảo sát nồng độ khoáng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của
cây Violet Châu Phi (Saintpaulia) trong điều kiện ni cấy mơ.
Nghiệm

thức

Mơi trường

Trung bình

Trung bình chiều

Trung bình số

số chi

cao chi (mm)

lỏ/chi

A1

MS

9,6a

6,6a

6,8a

A2

ắ MS

10,4a

7,8a

7,6a

A3

ẵ MS

4,8c

1c

4,16b

A4

ẳ MS

8,6b

2,6b

3,4b

Ghi chỳ: Cỏc ký t a, b, c, d… trên cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê, khác
biệt có ý nghĩa ở mức  = 0,05.

Sau 6 tuần ni cấy trên các mơi trường có nồng độ khoáng khác nhau, sự sinh

trưởng và phát triển của chồi cây Violet Châu Phi (Saintpaulia) cho thấy có sự khác
biệt rõ rệt về các chỉ tiêu theo dõi. Ở nghiệm thức A2 mơi trường ¾ MS cho kết quả
các chỉ tiêu theo dõi là tốt nhất, với số chồi TB đạt 10,4 chồi/ cụm; chiều cao chồi
trung bình đạt 7,8 mm/ chồi; số lá TB đạt 7,6 lá/chồi. Có sự khác biệt rõ so với nghiệm
thức A3 với số chồi TB (4,8 chồi/ cụm); chiều cao chồi TB (1mm/ cụm); số lá TB
(4,16 lá/ chồi). Các chồi được nuôi cấy trên nghiệm thức A2 cho thấy sự khác biệt về
hình thái chồi tương đối rõ rệt, thể hiện ở số chồi thật được hình thành, chiều cao chồi,
số lá cao hơn so với các nghiệm thức còn lại (Bảng 3.1; Hình 3.1). Hơn nữa qua quan
sát sự sinh trưởng và phát triển thể hiện rõ ở hình thái chồi với thân to, khỏe, phát triển
đều; lá xanh đậm, to hơn hẳn, ở các nghiệm thức cịn lại mẫu có số mẫu rnhiều, tuy
nhiên hình thái mẫu nhỏ, chưa hồn chỉnh, lá cũng nhiều và nhỏ màu sắc xanh nhạt,
chất lượng chồi kém (Hình 3.1). Kết quả thu được đã chỉ ra nghiệm thức A2 tương ứng
với mơi trường ¾ MS là môi trường tốt nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của chồi
cây violet (Saintpaulia). Vậytrong nghiên cứu này, mơi trường ¾ MS có bổ sung 30
g/l đường; 7 g/l agar là môi trường tốt nhất cho sự sinh trưởng và phát triển chồi của
cây Violet Châu Phi (Saintpaulia).

17


Chương 3. Kết quả và biện luận

Hình 3.1. Khảo sát mơi trường khống thích hợp cho cây Violet Châu Phi sinh trưởng
và phát triển.
Ghi chú: A1: môi trường MS; A2: mụi trng ắ ms; A3: mụi trng ẵ MS; A4: Mơi trường ¼ MS .

3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng Kinetin lên sự sinh trưởng và phát triển
của cây Violet Châu Phi (Saintpaulia) trong điều kiện nuôi cấy mô.
Kinetin là thành phần của nhóm hợp chất được gọi là cytokinin, đây là một lớp
nhân tố điều hòa sinh trưởng ở thực vật. Ở các loài thực vật, Kinetin thúc đẩy phân

chia tế bào và hoạt động trong các quy trình sinh trưởng và biệt hóa tế bào. Chức năng
của nó cũng như một chất kháng ơ xi hóa, ngăn chặn tổn thương o xi hóa gây ra bởi
các gốc tự do. Kinetin thường được sử dụng trong nuôi cấy mơ tế bào thực vật để kích
ứng sự hình thành của mô sẹo và để tái tạo chồi từ mô sẹo. Trong thí nghiệm này,
Kinetin được bổ sung ở các nồng độ khác nhau và kết quả sự ảnh hưởng của hàm
Kinetin lên sự sinh trưởng và phát triển của cây Violet Châu Phi (Saintpaulia) được
trình bày ở (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của Kinetin lên sự sinh trưởng và phát triển của
cây Violet Châu Phi (Saintpaulia) trong điều kiện ni cấy mơ.
Nghiệm

Nồng

độ Trung

thức

Kinetin

số chồi

chồi (mm)

lá/chồi

C1

ĐC

9,6b

6,6a

6,8a

C2

0,3

13a

1,24b

3,5b

C3

0,5

7,6c

1,3b

3,26bc

C4

0,7

3,2d

1,24b

3,08bcd

C5

1

2,8de

1,18b

2,8cde

C6

1,5

2,5de

0,8b

2,5de

C7

2

1,5e

0,76b

2,34e

bình Trung bình chiều cao Trung bình số

Ghi chú: Các ký tự a, b, c, d… trên cùng một cộ thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê, khác
biệt có ý nghĩa ở mức  = 0,05.

18


Chương 3. Kết quả và biện luận

Sau 6 tuần nuôi cấy trên mơi trường MS có bổ sung Kinetin ở các nồng độ (0;
0,3; 0,5; 0,7; 1; 1,5; 2)mg/l, sự sinh trưởng và phát triển của chồi cây Violet Châu Phi
(Saintpaulia), cho thấy có sự khác biệt rõ rệt. Các chỉ tiêu theo dõi trên nghiệm thức
bổ sung 0,3 mg/l Kinetin cho kết quả các chỉ tiêu theo dõi là tốt nhất với số chồi được
hình thành hồn chỉnh TB 13 chồi/ cụm, chiều cao chồi TB 1,24 mm, số lá TB 3,5
lá/chồi có hình thái chồi rõ ràng, xanh tốt. Các nghiệm thức còn lại khi tiếp tục tăng
nồng độ Kinetin thì tỷ lệ chồi giảm dần tương ứng ở nghiệm thức C3 với số chồi TB
7,6 chồi/ cụm, nghiệm thức C4 với số chồi TB 3,2 chồi/cụm, nghiệm thức C5 với số
chồi TB 2,8 chồi/cụm, nghiệm thức C6 với số chồi TB 2,5 chồi/cụm, nghiệm thức C7
với số chồi TB 1,5 chồi/cụm. (Bảng 3.2). Hình thái các mẫu được ni cấy trên mơi
trường có bổ sung Kinetin thường xuất hiện các chồi hồn chỉnh, lá to có màu xanh
đậm. Tuy nhiên nồng độ Kinetin càng tăng hình thái chồi càng kém hơn, chồi nhỏ hơn,
lá yếu hơn, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây Violet Châu Phi (Hình
3.2). Như vậy, trong nghiên cứu này ở nghiệm thức môi trường MS bổ sung Kinetin
nồng độ 0,3 mg/l, 30g/l đường, 7 g/l agar là môi trường tốt nhất cho sự sinh trưởng và

phát triển chồi của cây Violet Châu Phi (Saintpaulia).

Hình 3.2. Kết quả khảo sát Kinetin lên sự sinh trưởng và phát triển của cây violet
(Saintpaulia) trong điều kiện nuôi cấy mô.
Ghi chú: C1: đối chứng; C2: bổ sung 0,3 mg/l-Kinetin; C3: bổ sung 0,5 mg/l-Kinetin; C4: bổ sung 0,7
mg/l-Kinetin; C5: bổ sung 1 mg/l-Kinetin; C6: bổ sung 1,5 mg/l-Kinetin; C7: bổ sung 2 mg/l-Kinetin

19