nghiên cứu sự phát triển cơ quan lympho của cá tra pangasianodon hypophthalmus từ 1 đến 30 ngày tuổi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

ĐẶNG THANH PHONG

NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT TRIỂN CƠ QUAN LYMPHO
CỦA CÁ TRA Pangasianodon hypophthalmus
TỪ 1 ĐẾN 30 NGÀY TUỔI

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2009

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

ĐẶNG THANH PHONG

NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT TRIỂN CƠ QUAN LYMPHO
CỦA CÁ TRA Pangasianodon hypophthalmus
TỪ 1 ĐẾN 30 NGÀY TUỔI

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TỪ THANH DUNG

2009

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


LỜI CẢM TẠ
Tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cơ Từ Thanh Dung đã nhiệt tình giúp đỡ,
hướng dẫn và đóng góp nhiều kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian thực hiện đề
tài này.
Xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô khoa Thủy Sản trường Đại Học Cần Thơ đã tạo
môi trường tốt trong học tập, trao dồi đạo đức, truyền đạt kiến thức và nhiều kinh
nghiệm thực tế trong suốt quá trình rèn luyện ở nhà trường.
Tác giả xin chân thành cảm ơn gia đình Bác 2 Nắm (Hồng Mỹ) – Thị Trấn Hồng
Ngự, tỉnh Đồng Tháp đã giúp đỡ tôi chỗ ăn, ở, phương tiện và điều kiện nghiên cứu
thuận tiện trong suốt thời gian thu mẫu ở địa phương thuộc thị trấn Hồng Ngự.
Xin gởi lời cảm tạ đến anh Huỳnh Chí Thanh khuyến ngư huyện Hồng Ngự, tất cả
các bạn lớp Bệnh học thủy sản K.31 và cùng các anh em P2C12, ký túc xá trường
Đại Học Cần Thơ đã quan tâm, giúp đỡ và ủng hộ tơi trong q trình học tập và thực
hiện đề tài.

i

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


TĨM TẮT
Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là đối tượng ni quan trọng ở Đồng Bằng
Sông Cửu Long (ĐBSCL). Tuy nhiên các thơng tin khoa học về hệ miễn dịch chưa
có tác giả nào công bố để làm cơ sở cho việc phòng bệnh cho cá. Việc nghiên cứu đề

tài này nhằm mục tiêu là tìm hiểu sự phát triển cơ quan lympho của cá tra
Pangasianodon hypophthalmus từ 1 đến 30 ngày tuổi sau khi nở. Thu mẫu cá từ 1
đến 30 ngày tuổi trực tiếp ở ao ương, mỗi ngày tuổi thu từ 6 – 30 con cá. Bên cạnh
đó, cũng theo dõi quá trình hoạt động của cá, các chế độ quản lý và chăm sóc ao,
hàng tuần kiểm tra các yếu tố môi trường và nhiệt độ đo mỗi ngày. Nghiên cứu này
đã sử dụng phương pháp mô học (Haematoxylin & Eosin) trên cơ quan lympho
thận,tuyến ức và tỳ tạng. Kết quả nghiên cứu được tìm thấy thận xuất hiện đầu tiên ở
cá 6 ngày tuổi sau khi nở; tuyến ức được quan sát ở cá 9 ngày tuổi và cuối cùng là tỳ
tạng được tìm thấy ở cá 21 ngày tuổi. Trong suốt thời gian ương ni thì các yếu tố
môi trường đều nằm trong khoảng cho phép và thích hợp cá phát triển. Kết quả này
góp phần làm cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu hệ thống miễn dịch trên cá tra
nhằm tìm ra giải pháp phịng các bệnh truyền nhiễm một cách tích cực và có hiệu
quả hơn..

ii

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ ...................................................................................................... i
TÓM TẮT ........................................................................................................... ii
MỤC LỤC ......................................................................................................... iii
DANH SÁCH HÌNH ......................................................................................... iv
Chương I: GIỚI THIỆU .................................................................................. 1
Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2
Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 2
Chương II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ............................................................ 3
2.1 Sơ lược đặc điểm về cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) .................. 3
2.2 Lịch sử tiến hóa của các cơ quan lymphoid............................................... 3

2.3 Sự tiến hoá và phát triển của tế bào lympho .............................................. 4
2.4 Các cơ quan lymphoid ............................................................................... 5
2.4.1 Tỳ tạng (spleen).................................................................................... 5
2.4.2 Cơ quan thymus (tuyến ức) .................................................................. 6
2.4.3 Thận (kidney) ....................................................................................... 7
2.5 Sự hình thành cơ quan lymphoid ............................................................... 7
2.6 Một số thành tựu về phương pháp mô học ............................................. 10
Chương III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 13
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 13
3.2 Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 13
3.2.1 Dụng cụ .............................................................................................. 13
3.2.2 Hoá chất ............................................................................................. 13
3.3 Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 13
3.3.1 Đối tượng nghiên cứu ........................................................................ 13
3.3.2 Phương pháp cắt mẫu ......................................................................... 13
3.3.3 Phương pháp cố định mẫu .................................................................. 14
3.3.4 Phương pháp làm tiêu bản mô ........................................................... 14
3.4 Đọc kết quả .............................................................................................. 17
Chương IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 18
4.1 Thông tin chung về hộ nuôi ..................................................................... 18
4.2 Các chỉ tiêu môi trường trong ao ương .................................................... 19
4.3 Sự phát triển của các cơ quan Lympho .................................................... 20
iii

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


4.3.1 Thận.................................................................................................... 20
4.3.2 Tuyến ức (thymus) ............................................................................. 24
4.3.3 Tỳ tạng ............................................................................................... 26

Chương V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT........................................................ 28
5.1 Kết luận ................................................................................................. 28
5.2 Đề xuất .................................................................................................. 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 29
PHỤ LỤC I ....................................................................................................... 32
PHỤ LỤC II ...................................................................................................... 33
PHỤ LỤC III .................................................................................................... 34

iv

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


DANH SÁCH HÌNH
Hình 3.1 Khối paraffin trước khi cắt ............................................................... 16
Hình 3.2 Vị trí của tuyến ức ............................................................................. 18
Hình 4.1 Công tác cải tạo ao và các giai đoạn của cá hương ........................... 19
Hình 4.2 Thận của cá tra qua các giai đoạn ...................................................... 22
Hình 4.3 Cấu trúc của thận qua các giai đoạn của cá ....................................... 23
Hình 4.4 Tuyến ức cá của tra qua các giai đoạn ............................................... 25
Hình 4.5 Cấu trúc tỳ tạng cá 21 ngày tuổi ........................................................ 28

v

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


CHƯƠNG I
GIỚI THIỆU
Ngành nuôi trồng thuỷ sản (NTTS) Việt Nam (VN) nói chung và Đồng Bằng

Sơng Cửu Long (ĐBSCL) nói riêng đã và đang phát triển mạnh mẽ. Trong đó,
đối tượng nuôi nước ngọt được nuôi nhiều nhất là cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus), không chỉ cung cấp thực phẩm trong nước mà còn là mặt
hàng xuất khẩu ra nhiều nước trên thế giới. Theo Bộ Nông nghiệp và Phát
triển nông thôn (NN&PTNT), năm 2008 lượng cá tra xuất khẩu của VN đạt
657.000 tấn, đạt kim ngạch 1,48 tỉ USD, chiếm đến 32,1% tổng kim ngạch
xuất khẩu thủy sản của cả nước. Cá tra, ba sa là điểm sáng của bức tranh xuất
khẩu thủy sản Việt Nam (htt://antg.cand.com.vn). Nhưng trong quá trình mở
rộng diện tích ni do thiếu sự quy hoạch và không đồng bộ đã kéo theo nhiều
vấn đề xảy ra đặc biệt là tình hình dịch bệnh. Ở cá ni, nhiều loại bệnh truyền
nhiễm xuất hiện và gây thiệt hại nghiêm trọng cho nghề ni cá tra. Điển hình,
bệnh mủ gan do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra đã làm thiệt hại lớn cho
người nuôi ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, tỷ lệ cá chết khi bị bệnh này
có thể lên đến 90% (). Theo nghiên cứu của
Ferguson et al., 2001 và Dung et al., 2004 cho rằng đây là loài vi khuẩn đặc
thù gây bệnh chủ yếu trên cá da trơn ni cơng nghiệp, cịn theo Mitchell
(1997) xác định E. ictaluri là tác nhân gây bệnh nhiễm trùng máu (Enteric
septicaemia of catfish: ESC) ở cá nheo mỹ (Ictalurus punctatus), gây hao hụt
trên 60% và hằng năm thiệt hại trên 50 triệu USD.
Việc dùng kháng sinh trị bệnh mang lại hiệu quả khi dùng thuốc đúng liều và
chẩn đoán đúng tác nhân gây bệnh, nhưng trong thực tế do người nuôi sử dụng
bừa bãi, không đúng liều lượng cũng như loại kháng sinh nên gây ra hiện trạng
kháng thuốc và tình hình dịch bệnh trở nên trầm trọng hơn (Dung và ctv,
2008). Do đó, việc phịng bệnh như quản lý tốt môi trường nuôi, giống tốt, chế
độ dinh dưỡng hợp lý…, và đặc biệt hơn là việc nghiên cứu hệ miễn dịch. Đây
cũng là biện pháp phòng bệnh hữu hiệu nhất. Việc nghiên cứu có hiệu quả hay
khơng phụ thuộc vào sự sản xuất các tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch và độ
tuổi của cá. Ở cá xương, các tế bào lympho (tế bào B, T) tạo ra các kháng thể
(IgM, IgH,…) tham gia vào hệ thống đáp ứng miễn dịch được sản xuất ra từ
những cơ quan lympho như thymus, tỳ tạng, thận trước (Nadia et al., 2002;

Magnadottir et al ., 2005). Theo Merete et al., 1998, cho rằng các cơ quan
lympho ở cá phát triển hồn chỉnh sau khi cá hồn thành q trình biến thái.
Các cơ quan lymphoid như thận trước, thymus và tỳ tạng phát triển trong suốt
1

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


ở giai đoạn ấu trùng (Padros et al., 1996) và sự hình thành cơ quan lympho
của các lồi cá nước ngọt sớm hơn so với các loài cá nước mặn (Doggett et al.,
1987; Chantanachookhin et al., 1991). Mãi đến năm 2001, Lora et al ., đã
nghiên cứu sự hình thành cơ quan lymphoid của cá nheo Mỹ cho thấy các tế
bào có chức năng miễn dịch ở cơ quan tạo máu thuộc thận và thymus xuất
hiện lúc nở, còn tỳ tạng là 3 ngày sau khi nở. Gần đây, Sonal et al., 2008
nghiên cứu sự hình thành cơ quan lympho ở cá bơn Đại Dương (Hippoglossus
hippoglossus L.) cũng cho kết quả là thận xuất hiện ở cá 1 ngày tuổi, nhưng cơ
quan thymus là 33 ngày tuổi và tỳ tạng là 49 ngày tuổi. Cho đến nay, vẫn chưa
có tác giả nào công bố những nghiên cứu về sự phát triển cơ quan lymphoid ở
cá tra. Vì thế, đề tài “Nghiên cứu sự phát triển cơ quan lymphoid ở giai
đoạn giống của cá tra Pangasianodon hypophthalmus” được thực hiện
nhằm mục tiêu:
Tìm hiểu sự phát triển cơ quan lympho của cá tra từ 1 đến 30 ngày tuổi từ
đó làm cơ sở khoa học để nghiên cứu sự hình thành hệ miễn dịch góp phần
vào việc sử dụng hệ miễn dịch có hiệu quả hơn trong phịng bệnh cho cá.
Nội dung nghiên cứu
-

Theo dõi, thu mẫu và ghi nhận sự phát triển và thay đổi về hình thái của
cá tra từ 1 đến 30 ngày tuổi ở Thị Trấn Hồng Ngự, tỉnh Đồng Tháp.

-

Xác định sự phát triển cơ quan lympho của cá tra bằng phương pháp
nhuộm mô học (Haematoxylin & Eosin)

2

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


CHƯƠNG II

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược đặc điểm về cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)
Cá tra phân bố nhiều ở lưu vực sông Mê Kông ở cả 4 nước Lào, Campuchia,
Việt Nam và Thái Lan. Ở nước ta những năm trước đây khi chưa có cá sinh
sản nhân tạo, cá bột được vớt trên sông Tiền và sông Hậu. Khảo sát chu kỳ di
cư của cá tra ở địa phận Campuchia cho thấy cá ngược dòng từ tháng 10 đến
tháng 5 và di cư vào hạ lưu tháng 5 đến tháng 9 hàng năm (Phạm Văn Khánh,
2006). Cá tra sống chủ yếu trong nước ngọt, có thể sống được ở vùng nước
nhạt lợ (nồng độ muối từ 0,7 đến 1%), có thể chịu đựng được nước phèn có
pH >5, dễ chết ở nhiệt độ 150C nhưng chịu nóng tới 390C (Phạm Văn Khánh,
1996).
Cá tra khi hết nỗn hồng thích ăn mồi tươi sống, chúng có thể ăn lẫn nhau.
Dạ dày to và ngắn là đặc điểm của cá có tập tính ăn tạp nhưng thiêng về động
vật. Khi cá lớn, trong điều kiện thiếu thức ăn cá bắt buộc ăn thức ăn khác như
mùn bã hữu cơ, thức ăn có nguồn gốc động vật. Cá tra có tốc độ tăng trưởng
tương đối nhanh, cá còn nhỏ tăng nhanh về chiều dài. Cá ương trong ao sau 2
tháng đã đạt chiều dài từ 10-12 cm (trọng lượng 14-15 g). Cá khi lớn đạt cỡ
2,5 kg trở lên, mức tăng trọng lượng nhanh hơn so với chiều dài cơ thể. Cá tra

trong tự nhiên có thể sống trên 20 năm (trích dẫn từ Trần Thanh Xuân, 1994).
2.2 Lịch sử tiến hóa của cơ quan lymphoid
Vài ngàn năm trở về trước đây cơ quan lymphoid đã được các nhà giải phẩu
học khám phá. Bước ngoặc khám phá đầu tiên là tỳ tạng tìm thấy trong Edwin
Smith Papyrus, từ khoa y ở nước Ai Cập; thymus được mô tả đầu tiên bởi the
Italian Jacopo Berengario da Carpi vào thế kỷ 15; và hệ bạch huyết được phát
hiện bởi Dane Thomas Bartholin và the Swede Olaus Rudbeck vào thế kỷ 17.
Nhưng giải thích chức năng của các cơ quan lymphoid trong hệ thống miễn
dịch chỉ mới nghiên cứu gần đây và thymus được công nhận là cơ quan quan
trọng trong hệ miễn dịch cho đến nay (trích dẫn từ George Iwama, 1996).
Ở lớp chim, tế bào B được sinh ra ở cơ quan lymphoid sơ cấp là túi Fabricius
(là nơi tạo ra các tế bào biểu mơ của ruột sau); sự hình thành tế bào B cũng có
liên quan đến tổ chức lymphoid sơ cấp ở ruột của động vật có vú và đặc biệt là
ở nhóm động vật nhai lại (như cừu, thỏ và bị). Ngược lại, những cơ quan thứ
cấp (và tam cấp) hoặc những cơ quan lymphoid ngoại biên như hạch lympho,
3

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


cơ bản là không cần thiết trong miễn dịch. Trong khi đó, ở nhóm cá xương nói
chung cơ quan lymphoid sơ cấp gồm có tuỷ xương và thymus (tuyến ức), cơ
quan lymphoid thứ cấp gồm có tỳ tạng và một tổ chức lymphoid có liên quan
đến ruột và hệ thống màng nhầy. Bên cạnh đó thì ở động vật hữu nhũ, cơ quan
thymus là nơi tế bào T phát triển, trong khi đó tế bào B được sinh ra ở tuỷ
xương. Những cơ quan Lymphoid chẳng hạn như thymus, tỳ tạng và những
bạch huyết ở đốt mắt là trung tâm cấu thành hệ thống miễn dịch ở động vật
hữu nhũ (George Iwama, 1996).
Cơ quan lymphoid nguyên thuỷ (cũng được gọi là cơ quan lymphoid trung
tâm), như thymus và tuỷ xương ở hầu hết các động vật hữu nhũ, phụ thuộc vào

sự phát triển và sinh sôi của những tế bào lympho sơ cấp. Vì vậy nó giữ 1
chức năng khá quan trọng trong hệ miễn dịch. Cơ quan Lymphoid quan trọng
trong điều chỉnh của sự phát triển tế bào lympho và những đáp ứng miễn dịch.
Trong suốt quá trình tiến hóa của động vật có xương sống, những cơ quan
lymphoid sơ cấp xuất hiện sớm hơn những cơ quan lymphoid thứ cấp (George
Iwama, 1996).
Từ vài điểm tiến hoá trên cho thấy, những cơ quan lymphoid sơ cấp có tầm
quan trọng đặc biệt vì nó có liên quan đến việc tạo ra các thụ thể của kháng
nguyên thông qua các tế bào lympho.
2.3 Sự tiến hoá và phát triển của tế bào lympho
Ở tất cả các động vật có xương sống, các thụ thể kháng nguyên được sản xuất
từ các tế bào lympho. Tất cả các tế bào tạo máu, tế bào lympho bắt nguồn từ
chính cơ quan tạo máu của tế bào tuỷ xương. Ở chuột, tế bào B bắt đầu phát
triển trong bào thai sống (xuyên suốt sự phát sinh phôi) hoặc ở tuỷ xương (thời
kỳ sau khi sinh) và thành thục trong tỳ tạng. Trái lại, tế bào T chỉ phát triển ở
thymus. Hầu hết những sinh vật đại diện tổ tiên thuộc động vật có xương sống
có thể nhận biết rõ ràng tế bào T và tế bào B ở cá sụn như cá mập và cá đuối.
Ở cá, tế bào B phát triển đầu tiên ở gan, sau đó đến thận và cuối cùng là tỳ
tạng. Ở cá xương như cá chép và cá ngựa, thận trước là vị trí chiếm lĩnh của tế
bào B. Ở động vật lưỡng thê và bò sát, tế bào B phát triển đầu tiên ở gan và tỳ
tạng, sau đó thì gián đoạn ở gan nhưng ở tỳ tạng vẫn được duy trì và cuối cùng
nó xuất hiện ở tuỷ xương. Ở chim, tế bào B phát triển trong túi của Fabricius
(là nơi tạo ra các tế bào biểu mô của ruột sau). Và ở động vật hữu nhũ, tế bào
B phát triển chủ yếu ở tuỷ xương. Tuy nhiên, ở 1 vài loài động vật hữu nhũ,
như thỏ và bò, tổ chức lymphoid ở ruột là nơi quan trọng để tạo ra các tế bào
B nguyên thuỷ. Vì vậy, có thể cho rằng tế bào B có thể được sinh ra ở nhiều vị

4

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

trí khác nhau của động vật xương sống có hàm. Trái ngược lại, tế bào T chỉ
phát triển ở một số vị trí nhất định (Trích dẫn từ Thomas et al., 2007).
2.4 Các cơ quan lymphoid
2.4.1 Tỳ tạng (Spleen)
Tỳ tạng của cá da trơn là một cơ quan lymphoid thuộc vùng ruột được bao
quanh bằng màng treo ruột. Nó có màu đỏ thẩm, hình thoi dài hoặc hình trứng
có bề mặt phẳng. Nó được bao bọc bởi 1 lớp biểu bì và lớp mơ liên kết. Nhiều
tế bào nằm ở dưới mơ liên kết. Thành phần chính của tỳ tạng gồm dạng thể
bầu dục, phần tủy trắng, phần tủy đỏ và trung tâm đại thực bào. Thận của cá
chưa trưởng thành khơng có phần cơ mở rộng đến nhu mơ như ở trường hợp
của cá trưởng thành. Mặc dù ở tỳ tạng của cá trưởng thành có phần cơ mở
rộng đến nhu mô nhưng không rõ ràng như ở động vật hữu nhủ. Tủy trắng và
tủy đỏ của cá bột không tách ra riêng biệt như ở cá trưởng thành. Phần tủy đỏ
bao gồm nhiều tế bào máu hình sine với những hồng cầu trưởng thành, một số
nguyên hồng cầu, đại thực bào, những tế bào lưới và trung tâm đại thực bào
sắc tố (melanin). Những sợi mạng lưới được tìm thấy ở vách dạng đường sine,
được sắp xếp ở dạng vòng bao quanh vi thể tỳ tạng. Phần tủy trắng có nhiều tế
bào bạch cầu kiềm tính hơn phần tủy đỏ, ngồi ra ở tủy trắng cịn có tế bào
lympho, ít tế bào hồng cầu, đại thực bào và một số trung tâm đại thực bào.
Những tế bào hồng cầu chưa trưởng thành hoặc trưởng thành, đại thực bào,
với một số ít tế bào hồng cầu trong tế bào chất đã được tìm thấy ở tỳ tạng, bắt
màu đậm với dung dịch Wright và Giemsa. Nhìn chung ở tỳ tạng có nhiều đại
thực bào hơn ở tiền thận, đều này cho thấy tỳ tạng là cơ quan chính loại bỏ
những tế bào hồng cầu già và tạo ra nhiều tế bào mới (Trích dẫn từ Supranee
et al., 1991).
Theo Nguyễn Quốc Thịnh, 2002 ở cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) tỳ
tạng có màu đỏ thẩm, dạng dẹp, vị trí của tỳ tạng nằm ở màng treo ruột. Chức
năng của tỳ tạng là tiêu hủy những tế bào hồng cầu già, tái hấp thu sắt,

Hemoglobin và các thành phần cấu tạo hồng cầu khác để sản xuất hồng cầu
mới. Ngoài ra tỳ tạng cịn có nhiệm vụ sản xuất ra các loại tế bào limpho giúp
cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh.

5

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


2.4.2 Cơ quan thymus (tuyến ức)
Thymus là 1 đôi cơ quan được tìm thấy giữa lớp biểu bì và vỏ ở rìa trên của
nắp mang thuộc hốc mang cá . Nó là 1 cơ quan nhỏ. Thymus được bao quanh
bởi những sợi mơ liên kết. Nó khơng được tách biệt trong 1 vùng để nhận biết
giữa vỏ và lỗi, vì vậy có sự khác nhau với thymus của động vật hữu nhũ.
Thymus có thể thay đổi hình dạng và phát triển tốt ở cá hương và cá giống.
Nó nằm gần thận trước ở cá hương và cá giống nhưng vị trí đó lại khác so với
cá trưởng thành bởi vì là cơ quan rất nhỏ và kích thước tương tự như thymus
ở cá giống. Các tế bào thymus bắt màu xanh đen với thuốc nhuộm
haematoxylin & eosin đó là loại tế bào chiếm ưu thế được tìm thấy trong
Thymus. Thymus là cơ quan quan trọng của cá con và có một nhận định nó là
cơ quan nội tiết nhưng chức năng quan trọng phổ biến được nhận biết là nó
giữ vai trị trong tạo miễn dịch (Trích dẫn từ Supranee et al., 1991).
Ở cá nheo mỹ (channel catfish), thymus nằm ở phía trong mặt lưng của hốc
mang. Nó thường được bao bọc bằng lớp biểu bì mỏng.. Ở một số loài, lớp võ
của thymus chủ yếu là các tế bào thymus và phần lõi là các tế bào biểu mô
chiếm đa số. Các tế bào biểu mô giống với các huyết cầu của 1 số cá có vú. Ở
một vài lồi cá, thymus có thể được phát hiện ở 1 vài ngày đầu sau khi nở,
ngược lại ở 1 vài lồi cá bơn sao, dường như chỉ tìm thấy ở cá sau giai đoạn
biến thái của ấu trùng. Sự thành thục của thymus ở tất cả các lồi cá khơng
phát sinh giống như ở động vật hữu nhủ. Thymus có khả năng thay đổi về kích

thước với sự thay đổi của mùa hoặc theo chu kỳ của hormone được nhận dạng
nhờ phương pháp mô học. Chức năng thymus của cá cũng giống như ở động
vật hữu nhũ, tạo ra các tế bào lympho trong miễn dịch qua trung gian tế bào,
trước khi di dời ra cơ quan lymphoid ngoại biên. Ở cá nhỏ, khi vi khuẩn tiếp
xúc với hốc mang, phủ lên thymus gây hoại tử biểu bì là phổ biến, sau đó xâm
nhập và phá huỷ nhu mơ của thymus. Sự thay đổi về hình dạng ngồi của
thymus đặc biệt là sự xuất huyết của thymus ở một số lồi cá được cho là có
liên quan đến điều kiện gây sốc của mơi trường (Trích dẫn từ Grizzle et al.,
1976).

6

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


2.4.3 Thận (Kidney)
Thận của cá (nheo Mỹ) thì trải dài và đối xứng hai bên nhưng được chia ra
thành từng phần riêng biệt, đó là phần thận trước và phần thận sau. Tiền thận
và thân thận của cá trưởng thành và tiền trưởng thành trên 4 cm chiều dài tổng
không được liên kết bởi một số biểu mô thận hoặc ống thận. Tĩnh mạch chính
của phần thận trước kéo dài từ phần thân thận đến tiền thận. Tiền thận nằm ở
phía trước bong bóng hơi của cá gồm tuyến nội tiết, biểu mô và cơ quan tạo
máu. Quản cầu thận Malpighi và ống cuộn có ở tiền thận của những cá nhỏ
hơn 4 cm chiều dài tổng. Nhưng cấu tạo và những ống này thì kéo dài từ phần
tiền thận đã tiêu biến ra phía sau của thận (Trích dẫn từ Grizzle et al., 1976).
Ở cá tra thận có màu nâu đỏ nằm dọc theo cột sống. Chức năng chính của thận
là bài tiết các sản phẩm của quá trình biến dưỡng như NH3, Ure, các muối hóa
trị 2; ổn định mơi trường pH; điều hịa áp suất thẩm thấu,… Đồng thời thận
cịn có chức năng tạo máu và tham gia vào hệ thống miễn dịch bằng mơ kẽ.
Ngồi ra, thận còn tham gia vào hệ thống nội tiết (tiết kích thích tố và điều hịa

q trình sinh lý của cơ thể bằng hormone Adrenalin và Noradrenalin) (Bùi
Châu Trúc Đan, 2003).
2.5 Sự hình thành cơ quan lympho
Ở người hệ miễn dịch bao gồm nhiều cơ quan như tuyến ức (thymus), các
hoạch bạch huyết, tuỷ xương, tuỵ tạng và ruột thừa. Tất cả các tế bào miễn
dịch xuất phát từ các ngun bào trong phơi, sau đó di chuyển đến các mô và
cơ quan chuyên biệt, tại đây chúng sản sinh ra các hồng cầu và bạch cầu.
Những tế bào bạch cầu nhất là các đại thực bào, tế bào B, T, NK và tế bào
mast giữ vai trò quan trọng trong đáp ứng niễm dịch. Có 2 hệ thống đáp ứng
miễn dịch là miễn dịch qua thể dịch và miễn dịch qua trung gian tế bào. Cả 2
hệ thống này hoạt động chung để phá huỷ các kháng nguyên. Hệ thống miễn
dịch thể dịch bảo vệ cơ thể chống lại các kháng nguyên thông qua sự tiết các
prôtêin chuyên biệt là kháng thể, làm bất hoạt hoặc phá huỷ kháng nguyên trên
bề mặt của vi khuẩn, nấm, virus nằm bên ngoài tế bào cũng như các chất độc
tự do trong máu và huyết tương. Còn hệ miễn dịch qua trung gian tế bào trực
tiếp phá huỷ các vi khuẩn qua việc sản xuất những tế bào chuyên biệt tấn công
vào các chất xâm nhập (Bùi Tấn Anh và ctv, 2004).
Theo Breuil.G, et al., 1997 nghiên cứu sự phát sinh kháng thể IgM trong tế
bào và sự thay đổi trong miễn dịch golobulin (IgM) xuyên suốt ở giai đoạn ấu
trùng của cá chẽm bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (FITC) và phép phân

7

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


tích FACS để phát hiện những tế bào dương tính với IgM bằng mẫu dò kháng
kháng thể. Còn sự phát triển của cơ quan lympho được nghiên cứu bằng
phương pháp mô học. Kết quả nghiên cứu cho thấy, một lượng nhỏ IgM được
phát hiện bằng phương pháp ELISA ở trứng cá, nhưng giảm dần cho đến ngày

thứ 5 sau khi nở, từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 15 không tìm thấy IgM trong tế
bào. Sau đó IgM được phát hiện lại từ ngày 15 đến ngày thứ 30. Xuyên suốt
giai đoạn này cơ quan thymus và thận trước được hình thành. Từ ngày 30 đến
ngày 95, mật độ IgM tăng lên tương quan với trọng lượng cơ thể của ấu trùng.
Kết quả này cho thấy rằng IgM được phát hiện từ ngày thứ 0 đến ngày thứ 5
xuất phát từ cá mẹ, trong khi đó IgM được phát hiện từ ngày 15 là các IgM
mới được tổng hợp. Hơn thế nửa, tế bào B thành thục và sự tổng hơp IgM
tương đối hoàn chỉnh ở ấu trùng cá chẽm 50 ngày tuổi khi cơ quan lympho
phát triển đầy đủ.
Trong khi đó, Merete et al., 1998 nghiên cứu về sự hình thành cơ lympho và
sự sản xuất miễn dịch globulin ở cá tuyết đại dương (Gadus morhua L.), thuộc
loài cá nước mặn. Kết quả cho thấy, ở cá tuyết (Gadus morhua L) thận trước
và lá lách là cơ quan lympho xuất hiện trước tiên trong khoảng thời gian lúc
nở, còn thymus được quan sát ở ấu trùng có kích thước 9 mm. Tế bào IgH
mRNA được phát hiện trong lát cắt paraffin của ấu trùng cá, còn cá ở giai
đoạn tiền trưởng thành dùng phương pháp lai phân tử. Những tế bào dương
tính khơng phát hiện được ở cá nhỏ hơn 33 mm (58 ngày sau khi nở). IgH
mRNA có sự giống nhau với các động vật khác và sự xuất hiện đầu tiên của
các tế bào miễn dịch globulin dương tính được tìm thấy bằng phương pháp
hố mơ miễn dịch.
Tiếp theo đó, vào năm 2001, Lora et al., nghiên cứu sự hình thành cơ quan
lympho của cá nheo mỹ, để đánh giá sự thay đổi có liên quan đến sự phát triển
về chức năng đáp ứng miễn dịch dịch thể, nghiên cứu đánh giá về thời gian và
không gian phân bố của tế bào miễn dịch phát triển ở cá da trơn. Kết quả cho
thấy những tế bào có chức năng trong miễn dịch khơng đặc hiệu nó hiện diện
ở cơ quan tạo máu thuộc thận và thymus lúc nở và ở tỳ tạng là 3 ngày tuổi. Tế
bào lympho dương tính với IgM được phát hiện đầu tiên ở ngày thứ 7, 10 và
thứ 14 tương ứng với các cơ quan tạo máu thuộc thận, thymus và tỳ tạng. Sự
thành thục của cơ quan thymus được phát hiện đầu tiên ở cá 10 ngày tuổi. Cơ
quan thymus xuất hiện rõ ràng và tổ chức lympho thuộc tỳ tạng không quan

sát được cho đến ngày thứ 21 sau khi nở. Nghiên cứu còn cho thấy, tổ chức
lympho thứ cấp nghèo nàn là do kháng thể được sản xuất ra ít cho đến khi ấu
trùng cá được 21 ngày tuổi.

8

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


Một năm sau, Nadia et al., 2002 đã nghiên cứu sự phát triển của tế bào B trong
tỳ tạng của cá ngựa. Ở cá ngựa trước đây được cho rằng tế bào T có thể phân
biệt được ở thymus của cá 4 ngày tuổi nhưng tế bào B chỉ phân biệt được ở cá
3 tuần tuổi. Nhưng ở cá 4 ngày tuổi, phát hiện gen thụ thể của tế bào B trong
ADN ly trích từ tồn bộ con cá. Cũng thời gian 4 ngày, bản sao Rag-1 được
thấy ở tỳ tạng (là cơ quan trước đây cho rằng không liên quan đến tổ chức
lymphoid của cá ngựa); ở cá 10 ngày tuổi, bản sao Ig cũng được phát hiện ở tỳ
tạng. Vì vậy, ở cá ngựa tỳ tạng cũng được thừa nhận là cơ quan có chức năng
quan trọng trong hệ thống miễn dịch. Và cũng năm này, Lora et al., 2002,
nghiên cứu hệ thống đáp ứng miễn dịch thể dịch của cá nheo mỹ (Ictalurus
punctatus) ở giai đoạn cá bột và cá giống khi tiếp xúc với vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri. Nghiên cứu thực hiện với cá khơng có mầm bệnh được
thuần hố phù hơp với điều kiện mơi trường. Cá ở tuổi 1, 2, 3 và 4 tuần và 2,
3, 4, 5, và 6 tháng sau khi nở, Cá được tiêm liều sơ cấp với vi khuẩn E. ictaluri
(ở liều 6,4×104 cfu/ ml cho 1 bể) và sau đó 4 tuần tiêm tiếp liều thứ 2. cịn
nhóm đối chứng thì được tiếp xúc với mơi trường ni cấy đã tiệt trùng. Kết
quả cho thấy kháng thể đặc hiệu được phát hiện đầu tiên ở cá 4 tuần tuổi sau
khi nở có trọng lượng trung bình 85 mg. Đáp ứng thứ cấp được chứng minh ở
cá hương 4 tuần tuổi khi nhúng liều sơ cấp và 8 tuần tuổi khi nhúng liều thứ
cấp. Tuy nhiên, hiệu quả tăng khả năng đáp ứng là đúng được chứng minh ở
cá 2 tháng tuổi nhận liều sơ cấp. Cá nhận liều sơ cấp ở trước 4 tuần tuổi và 1

liều thứ cấp nhẹ kết quả đáp ứng kháng thể có ý nghĩa, thậm chí chúng đồng
tuổi nhau ở liều tiếp xúc thứ 2 việc tạo ra đáp ứng kháng thể tốt được kéo dài
nhờ vào liều tiếp xúc ban đầu. Từ kết quả trên người ta cho rằng cá nheo
khơng có khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch thể dịch trước 4 tuần tuổi.
Tiếp tục, nghiên cứu mô học về cơ quan lympho của cá đĩa Xiphophorus
maculatus L. ở giai đoạn ấu trùng cho thấy thymus là cơ quan lớn và chứa đầy
các tế bào lympho. Trong khi tổ chức lympho có ở lá lách và ống thận phát
triển chậm hơn (Leknes, 2003).
Cho đến hai năm sau, Zapata et al, 2005, nghiên cứu sự phát sinh hệ miễn dịch
ở một số loài cá có giá trị từ cách nguồn báo cáo đã có trước đây. Kết quả cho
thấy rằng ở một vài loài cá xương (chẳng hạn như cá angelfish) tế bào máu
đầu tiên được hình thành từ khối nỗn hồng. Ở vài lồi cá khác như cá ngựa,
vị trí cơ quan tạo máu đầu tiên là ở trong phôi, đa số là các tế bào trung gian
(ICM), trong khi đó ở cả cá mùi và cá hồi các tế bào máu đầu tiên chỉ xuất
hiện 1 thời gian ngắn ở noãn hồng nhưng sau đó ICM phát triển chủ yếu ở cơ
quan tạo máu. Hồng cầu và các đại thực bào là những tế bào máu đầu tiên

9

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


được nhận định ở phôi của cá ngựa. Những tế bào này sinh ra từ tế bào ICM,
ống Cuvier và những tế bào ngoại biên. Trong khoảng 24 - 30 giờ sau khi thụ
tinh ở nhiệt độ 28°C một ít nguyên bào tuỷ và tế bào tuỷ xuất hiện giữa khối
nỗn hồng và vách cơ thể, ở vùng bụng gần phần đuôi ở cá ngựa 1 - 2 ngày
tuổi cũng có các tế bào máu phát triển. Cơ quan thymus, thận và lá lách là
những cơ quan lympho thiết yếu của lớp cá xương. Thymus là cơ quan lympho
được hình thành đầu tiên, mặc dù thận trước có thể xuất hiện trước nhưng
chưa xuất hiện các tế bào lympho. Ở cá nước ngọt, lá lách của cá xương là cơ

quan lympho phát triển sau cùng. Bên cạnh đó, sự xuất hiện sớm của Rag-1 ở
Thymus của cá ngựa có mối tương quan với hình thái của tế bào lympho.
Chức năng và hình dạng của tế bào lympho rõ ràng hơn khi cá có được hệ
miễn dịch hồn chỉnh.
Gần đây, Sonal et al., 2008 nghiên cứu sự hình thành cơ quan lympho và phát
triển của tế bào sinh kháng thể IgM ở cá bơn Đại Dương (Hippoglossus
hippoglossus L.). Kết quả mô học cho thấy thận xuất hiện ở cá 1 ngày tuổi sau
khi nở, cơ quan thymus xuất hiện ở cá 33 ngày sau khi nở, trong khi đó lá lách
là cơ quan sau cùng xuất hiện ở 49 ngày tuổi sau khi nở. Tất cả các cơ quan
lympho này có hình thái tương đối hồn chỉnh sau giai đoạn biến thái. Với
phương pháp RT - PCR cho thấy IgM mRCT xuất hiện ở cá 66 ngày tuổi sau
khi nở và có thể chậm hơn, tương ứng với thời gian này ở kỹ thuật lai phân tử
cũng cho thấy có 1 ít tế bào dương tính với IgM có thể được phát hiện ở giai
đoạn đầu của thận và lá lách. Cịn phương pháp hố mơ miễn dịch dùng kháng
thể đơn dòng phát hiện được IgM ở thận trước và lá lách của cá 94 ngày tuổi,
nhưng IgM mRCT được phát hiện chậm hơn. Nhiều tế bào xuất hiện rõ ràng
cả IgM mRCT và prơtein có thể được phát hiện ở tỳ tạng, thận trước, và
thymus cũng có xuất hiện nhưng ở giai đoạn cá bơn lớn.
2.6 Một số thành tựu về phương pháp mô học
Nghiên cứu mô học bắt đầu từ cuối thế kỉ 17 nhưng mãi đến cuối thế kỉ 19 mô
học mới được coi là ngành khoa học (trích dẫn bởi Nguyễn Quốc Thịnh,
2002). Mơ học bắt đầu từ khi kính hiển vi đầu tiên được chế tạo bởi Antoni
Van Leuwenhoek (1632-1723) người Hà Lan, đến cuối thế kỉ 18 Robert
Hooke (1635-1703) nhà khoa học người Anh đã xác định tế bào là đơn vị cấu
tạo cơ thể sinh vật. Quan sát miếng nút chai dưới kính hiển vi đã đưa ra kết
luận “miếng nút chai được tạo thành từ những túi nhỏ hay tế bào độc lập với
nhau và chứa đầy khơng khí” (R.Hooke, 1665, trích dẫn bởi Nguyễn Quốc
Thịnh, 2002).

10

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


Sau khi thuyết tế bào ra đời (1893), đặc biệt là lĩnh vực mơ học mơ tả ra đời
thì những thành phần cấu tạo khác nhau của cơ quan và các mô được nghiên
cứu cẩn thận, tỉ mỉ hơn. Thành tựu lớn nhất của giai đoạn này là chế tạo ra
máy cắt lát mỏng (microtom) cho phép nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc hiển vi
thể của tế bào và mơ (Phạm Phan Địch, 1998), từ đó đến nay mơ học ngày
càng được chú ý phát triển mạnh mẽ và chuyên sâu hơn.
Robert (1989) đã hệ thống lại tất cả các yếu tố mơi trường ảnh hưởng đến q
trình sinh trưởng và phát triển của cá, các giống lồi kí sinh trùng, vi khuẩn,
virut gây bệnh trên cá, dấu hiệu bệnh lý đặc trưng của cá đối với từng tác nhân
gây bệnh khác nhau. Ơng cũng đã mơ tả về phản ứng sinh lý của cá, quá trình
biến đổi chung của cơ quan trong cơ thể cá khi bị tác nhân xâm nhập và gây
bệnh. Bên cạnh đó, ơng cũng trình bày cơ bản về những đáp ứng miễn dịch
chung của cá trước tác động của các yếu tố vô sinh và hữu sinh.
Suprance et al., (1991) nghiên cứu về mô học trên cá trê trắng. Tác giả không
nghiên cứu trên cá bệnh mà chỉ nghiên cứu trên cá khỏe và khảo sát 1 số cơ
quan như hệ bài tiết, hệ tuần hồn,… nhằm so sánh khi nghiên cứu mơ và
cung cấp sự hiểu biết về mô học. Grizzle et al., (1976) giải phẩu và nghiên cứu
mô học trên cá nheo. Tác giả đã mô tả đặc điểm về mô trên một số cơ quan
của cá nheo như hệ thần kinh, hệ cơ, hệ tiêu hoá...nhằm nhận dạng đặc điểm
của các cơ quan để nghiên cứu sau này.
Groman (1982) nghiên cứu mô học trên cá chẽm. Tác giả đã quan sát cấu trúc
mô khỏe ở nhiều giai đoạn của cá từ giống đến trưởng thành ở một số cơ quan:
hệ hơ hấp, hệ thần kinh, hệ tuần hồn, hệ tiêu hố, hệ sinh dục, hệ bài
tiết…Tiếp đó, Herrera (1996) nghiên cứu trên cá rô phi (Oreochromis
niloticus). Tác giả dùng phương pháp mô học để nghiên cứu trên một số cơ
quan như da, cơ, xương, hệ tiêu hóa, hệ hơ hấp, hệ tuần hoàn, hệ bài tiết, hệ

sinh dục, hệ thần kinh…
Ở nước ta ngày nay, mô học đã được nghiên cứu nhiều trong lĩnh vực thủy sản
như: Nguyễn Quốc Thịnh (2002) bước đầu nghiên cứu về mô bệnh đốm trắng
trong nội tạng cá tra. Tác giả đã đưa ra sự so sánh về những biến đổi cấu trúc
của mô cá bệnh như hiện tượng xuất huyết, hoại tử, xung huyết so với cá khỏe.
Đến năm 2003, Bùi Châu Trúc Đan nghiên cứu đặc điểm mô bệnh học bệnh
phù mắt trên cá tra, quan sát trên các cơ quan như gan, nội tạng… nhằm so
sánh những cấu trúc vi thể của cá và tiếp theo là Phan Thị Hừng, 2004 nghiên
cứu cấu trúc mô và sự biến động số lượng hồng cầu trên cá tra bị bệnh vàng
da. Tác giả cũng quan sát cơ quan gan, thận và tỳ tạng trong cấu trúc của mô
11

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


cá bệnh để so sánh với cá khỏe. Gần đây, Võ Quốc Hào (2008), nghiên cứu
cấu trúc mô của một số hệ cơ quan trên cá tra. Tác giả đã xác định được đặc
điểm, cấu trúc mô của cá khỏe từ đó làm cơ sở cho việc chẩn đốn.
Ở nước ta, nghiên cứu về mô học trên cá được thực hiện khá phổ biến nhưng
chủ yếu thiêng về chẩn đoán và xác định mầm bệnh. Hiện nay, vaccine là biện
pháp phịng bệnh hữu hiệu cho cá tra ni nhưng việc sử dụng vaccine chưa
đem lại hiệu quả do chưa nghiên cứu. Việc sử dụng vaccine có hiệu quả hay
khơng là phụ thuộc vào khả năng đáp ứng miễn dịch của cá. Do đó, nghiên
cứu về sự hình thành cơ quan lymphoid trên cá tra là điều cần thiết.

12

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

CHƯƠNG III

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Thời gian thực hiện: Từ 29/12/2008 – 19/05/2009
Địa điểm thu mẫu: Mẫu thu ở trại ương cá tra Thị Trấn Hồng Ngự - tỉnh
Đồng Tháp
Địa điểm phân tích mẫu: Phịng mơ của Bộ mơn Sinh học và Bệnh thuỷ sản Khoa Thuỷ Sản - Đại Học Cần Thơ.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Dụng cụ:
Bộ tiểu phẩu, ống universal, khay nhựa, lọ thuỷ tinh, cốc đốt 500ml, máy cắt
lát mỏng (microtom), máy xử lý mô, khuôn đúc mẫu, máy ảnh, kính hiển vi,
lame, lamelle…
3.2.2 Hố chất:
Formol thương mại (37%), ethanol, xylene, paraffin, sáp ong, thuốc nhuộm
Hematoxylin và Eosin, keo dán enterllan.
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Đối tượng nghiên cứu
Thu mẫu cá ở ao ương, thu cá từ 1 đến 30 ngày tuổi sau khi nở, mỗi ngày tuổi
thu 6 - 30 con.
3.3.2 Phương pháp cắt mẫu
Mẫu xác định ở 3 cơ quan chính là thận, tỳ tạng và tuyến ức được tiến hành
cắt mẫu thăm dò ở các ngày tuổi như 1, 8, 15, 22,… và sau đó xác định các cơ
quan này bằng cách cắt mẫu ở các độ tuổi ngắn lại và xem sự hình thành các
chức năng của nó.

13

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

3.3.3 Phương pháp cố định mẫu
Mẫu thu được cố định trong dung dịch formalin 10% chứa trong ống
universal.
3.3.4 Phương pháp làm tiêu bản mô
Rửa mẫu sau khi cố định
Mẫu mô sau khi cố định trong dung dịch formol 10%, khoảng 24-48h tiến
hành rửa dưới vịi nước 2h. Sau đó chuyển sang cồn 70% để bảo quản và xử lý
mẫu.
Cắt tỉa và định hướng
Mẫu trước khi đưa vào qui trình xử lý mẫu phải cắt tỉa và định hướng cho mẫu
đạt kích cỡ phù hợp, cắt mẫu với độ dày từ 3-5µm. Đưa mẫu vào catsset và
tiến hành xử lý.
Quy trình xử lý mẫu
Loại nước
Việc loại nước phải đảm bảo nguyên tắc là phải loại hết nước trong mẫu mô
mà không làm tế bào bị biến dạng hoặc không làm vị trí thành phần cấu tạo tế
bào trong mẫu mơ khơng bị thay đổi. Quá trình loại nước được thực hiện bằng
cách nhúng mẫu qua nhiều dung dịch cồn với nồng độ gia tăng từ 80-100%.
Thời gian thử nước phụ thuộc vào độ dày của mẫu mô
Phương pháp làm trong mẫu (tẩm dung mơi trung gian)
Vì cồn khơng thể hịa lẫn với paraffin nên sau khi hồn thành q trình khử
nước, cồn cần phải loại khỏi mẫu mơ để tránh tình trạng mơ có thể bi co rút
khi tẩm paraffin. Dung mơi trung gian vừa hịa tan được cồn và paraffin
thường dùng là xylen, xylen ít độc và có tính thấm nhanh. Phương pháp này
được thực hiện bằng cách ngâm mẫu mô trong xylen qua hai lọ.Thời gian
ngâm mẫu mô trong mỗi lọ dao động từ 2h-2h30’. Ngoài ra để tăng khả năng
nhấm paraffin và để loại hoàn toàn cồn ra khỏi mẫu mô, trước khi chuyển sang
bước ngấm paraffin, mẫu mơ được ngâm trong lọ paraffin hịa tan trong xylen.

14

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


Tẩm paraffin
Paraffin là chất nền để đảm bảo chất tế bào giữ nguyên hình dạng khi cắt vì
thế sau khi làm trong mẫu, mẫu mô sẽ được chuyển sang bước ngấm paraffin.
Ngâm mẫu qua 2 lọ paraffin, thời gian mỗi lọ khoảng 1h ở nhiệt độ 560C ±1.
- Lọ 1: Paraffin: Sáp ong với tỉ lệ 1:1
- Lọ 2: Paraffin: Sáp ong với tỉ lệ 7:3
Xử lý mẫu theo máy tự động Sproceeding tissue (MICROM, STP 120-2)
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

Hóa chất sử dụng
Cồn 80%
Cồn 90%
Cồn 95%

Cồn 100%
Cồn 100%
Cồn 100%
Xylen
Xylen
Xylen
Paraffin + sáp ong + xylen (3:2:5)
Paraffin + sáp ong (7:3)
Paraffin + sáp ong (1:1)

Thời gian
1h
1h
1h
1h
1h
1h
2h
2h
2h
2h
2h
2h

Đúc khuôn: (máy đúc khối: MICROM EC 350-1)
Chuyển cassette chứa mẫu đã được xử lý vào khoang chứa paraffin nóng chảy
trên máy đúc khối, để cassette trong paraffin khoảng 30 phút, tiến hành đúc
khối. Mẫu mô sẽ được đặt trong một khung cố định bằng inox và tiến hành
đúc khối bằng paraffin nóng chảy ở 650C.
Đỗ một ít paraffin vào khn inox, gắp mẫu bỏ vào khn sau đó đặt mẫu

ngay ngắn và ấn sát mẫu vào đáy khuôn và đặt khuôn inox lên chỗ làm lạnh
trên máy đúc khối để cố định sơ bộ mẫu trên khn
Đặt cassette có ký hiệu mẫu lên trên, tiếp tục đỗ paraffin vào đầy khuôn inox.
Tiếp theo đặt khuôn inox qua ngăn làm lạnh nhanh để paraffin rắn lại, sau đó
tách khối paraffin ra khỏi khuôn và chuẩn bị cắt mẫu.
Cắt mẫu (máy cắt: Yamato-PR-50)

15

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


Trước khi mẫu đưa vào máy cắt, dung lưỡi dao cắt tỉa khối paraffin sao cho
khối paraffin có hình tháp (hình 3.1). Mục đích của cách làm này là để dễ cắt
mẫu và khi cắt ra, mẫu sẽ đẹp.
a
b

Hình 3.1: Khối paraffin trước khi cắt: (a) khối paraffin có chứa mẫu
mô; (b) cassette dung để giữ khối paraffin
+ Chuẩn bị máy cắt
Đặt lưỡi dao vào máy cắt, vặn ốc thật chặt. Độ lệch của lưỡi dao so với mặt cắt
của khối mẫu tạo thành một góc khoảng 15-30o. Khối mẫu sẽ được cắt thành
các lát cắt khi tay quay của máy xoay trịn, sau mỗi vịng xoay sẽ có một lát
cắt được hình thành.
+ Tiến hành cắt
Đặt khối mẫu vào máy cắt lát mỏng, chỉnh cho khối mẫu ngang và thẳng đứng,
điều chỉnh độ dày lát cắt, có thể bắt đầu bằng những lát cắt 10-12µm. Sau khi
cắt bằng mặt khối mẫu và đạt đến vị trí mong muốn, điều chỉnh độ dày về
vạch 4-6 µm và cắt mẫu

Dán mẫu lên lame
Mẫu cắt tạo thành dãy băng dài, cho dãy băng vào nước ấm ở nhiệt độ 4550oC cho dãy paraffin giản ra, dùng kim mũi giáo tách riêng từng đoạn đạt yêu
cầu, dùng lame để vớt mẫu lên. Cầm một đầu của lame, đầu kia cho vào cốc
nước thủy tinh phía dưới mẫu, sau đó từ từ nâng lên và điều chỉnh cho mẫu
ngay ngắn trên lame.
Để lame khô tự nhiên khoảng 15 phút sau đó chuyển lame lên máy Slide
warmer ủ ở nhiệt độ 45o sau 4 giờ để cố định mẫu lên lame. Sau khi dán mẫu
và cố định mẫu trên lame xong tiến hành nhuộm mẫu.
Nhuộm mẫu
Phương pháp nhuộm màu bằng Hematoxylin và Eosin (H&E) theo qui trình
được cài đặt trong máy nhuộm mẫu mơ tự động.

16

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


Sau khi cài đặt, cho phiến kính có chứa mẫu vào trong giá và cho vào máy
nhuộm với chương trình cài đặt sẵn.
Quy trình nhuộm mẫu (máy nhuộm mẫu tự động)
Xylen I
5 phút

Haematocylin
1 phút

Nước máy
5 phút

Cồn 100%

5 phút

Xylen
5 phút

Xylen II
5 phút

Cồn 100%
5 phút

Cồn70%
2 phút

Rửa nước
5 phút
1% acid acohol
10 giây

Cồn100%
5 phút

Xylen
5 phút

Cồn 100%
5 phút

Xylen III
5 phút

Cồn 95%
5 phút

Nước máy
1 phút

Eosin
2 phút

Dán keo
Enterllan

Dán Lamelle vào lame
Để đảm bảo mẫu được giữ lâu và tăng tính triết quang của mẫu, dùng keo dán
Enterlan phủ lên mẫu và dán lamelle lên mẫu. Nhỏ một giọt keo lên mẫu, đặt
lamelle nghiêng 450 và tiếp xúc với giọt keo, hạ lame xuống từ từ để tránh bọt
khí. Để lame khơ 24 giờ sau đó đọc kết quả. Thao tác này cần làm nhanh để
tránh sự xâm nhập của hơi nước trong khơng khí vào miếng mơ.
3.4 Đọc kết quả
Kết quả được đọc theo tài liệu của Ferguson (2006).
Tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 10x để quan sát tổng quát
tiêu bản nếu tiêu bản đẹp đạt yêu cầu có nhân bắt màu tím xanh của
Hematoxylin, phần cịn lại bắt màu hồng Eosin. Các tiêu bản đẹp sẽ được quan
sát lần lượt ở độ phóng đại 40X, 100X (nhỏ giọt dầu) và chụp hình tiêu bản
đặc trưng.

17

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

CHƯƠNG IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Thông tin chung về hộ ương nuôi
Trước khi ương hộ nuôi thường vệ sinh các bờ ao, diệt tạp, cải tạo ao,… hóa
chất thường dùng nhất trong cải tạo ao là vơi. Diện tích ao là 3000m 2 , mật độ
thả ương là 1000con/ m2. Con giống trực tiếp ở cơ sở sản xuất giống, giống
khỏe và có chất lượng. Thành phần thức ăn chủ yếu trong ương nuôi như bột
cá, hột vịt, bột sữa,…Ngồi ra cũng có lượng thức ăn trực tiếp ở trong ao.
Ngày cho ăn 4 lần, mỗi lần được chia đều mà hộ ni tính theo mật độ ương.
Nhìn chung hộ này ni theo kinh nghiệm bản thân là chính.

B

A

C

D

Hình 4.1: Công tác cải tạo ao và các giai đoạn của cá hương (A: cải tạo ao; B: bơm
nước vào ao chuẩn bị ương; C: cá 18 ngày tuổi; D: cá 16 ngày tuổi)

18

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version