xác định ld50 của cá tra (pangasianodon hypophthalmus) bị nhiễm vi khuẩn edwardsiella ictaluri

T
R
Ư
Ờ
NG ĐẠIHỌCC
Ầ
N TH
Ơ
KHOA THỦY SẢN

2009
















LÊ THƯỢNG KHỞI

XÁC ĐỊNH LD
50
CỦA CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus)
BỊ NHIỄM VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri













LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN
T
R
Ư

Ờ
NG ĐẠIHỌCC
Ầ
N TH
Ơ
KHOA THỦY SẢN

2009















LÊ THƯỢNG KHỞI

XÁC ĐỊNH LD
50
CỦA CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus)
BỊ NHIỄM VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri









LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN









CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH

ĐẶNG THỤY MAI THY
NGUYỄN TRÚC PHƯƠNG




LỜI CẢM TẠ




Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Thủy Sản đặc biệt là các thầy cô
thuộc bộ môn Sinh học và Bệnh học Thủy sản đã truyền đạt những kiến thức,
những kinh nghiệm quý báo trong suốt quá trình em học tập và nghiên cứu tại
trường.

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc cô Đặng Thị Hoàng Oanh, cô Đặng Thụy Mai
Thy, chị Nguyễn Trúc Phương và các anh, chị trong bộ môn đã tận tình hướng
dẫn và giúp đỡ em rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp.

Đồng thời xin gởi lời cảm ơn đến cô cố vấn Bùi Thị Bích Hằng cùng các bạn
lớp Bệnh Học Thủy Sản K31 đã động viên và hỗ trợ em trong thời gian học tập
cũng như thực hiện đề tài tốt nghiệp.

i


TÓM TẮT




Đề tài “Xác định LD
50
của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị nhiễm
vi khuẩn Edwardsiella ictaluri” được thực hiện bằng phương pháp tiêm vi
khuẩn E. ictaluri trên cá tra giống. Nhằm so sánh độc lực của các chủng vi
khuẩn E. ictaluri với nhau và khảo sát sự biến đổi mô học của gan và thận cá
tra khi bị nhiễm vi khuẩn E. ictaluri. 4 chủng vi khuẩn E. ictaluri được phục
hồi từ trong tủ âm 80
0
C (A1, T8, CAF258 và KSL103). Sau đó tiến hành tiêm
cho cá gồm 6 nghiệm thức và 3 lần lặp lại với mật độ 10con/bể. Kết quả thu
được chủng A1 với tỉ lệ chết cao nhất ở tất cả các nghiệm thức đều chết 100%
không xác định được LD
50
, kế đến là chủng CAF258 ở nồng độ 0,8x10
7

CFU/ml chết cao nhất 100% và thấp nhất là nồng độ 0,8x10
2

CFU/ml tỉ lệ là
6% với giá trị LD
50
= 4,7x10
2
CFU/ml. Trong khi đó chủng T8 ở nồng độ cao
nhất 0,4x10
7
CFU/ml chết với tỉ lệ 83% và nồng độ thấp nhất 0,4x10
2
CFU/ml
tỉ lệ chết là 23% với giá trị LD
50
= 1,3x10
4
CFU/ml, còn chủng KSL103 ở
nồng độ 0,5x10
7
CFU/ml chết 93% và nồng độ 0,5x10
3
CFU/ml chết 6% với
giá trị LD
50
= 2,1x10
4
CFU/ml.

Quan sát mô gan của cá gây cảm nhiễm có sự biến đổi, liên kết cấu trúc tế bào
gan bị phá hủy, đảo tụy và tĩnh mạch gan xung huyết. Nhiều vùng tế bào có
hiện tượng xuất huyết, bị biến đổi cấu trúc và họai tử hạt. Cấu trúc ống thận bị

vỡ, nhiều vùng bị xuất huyết quản cầu thận bị mất cấu trúc.


























ii

1
PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
Nuôi trồng thủy sản đang ngày một phát triển và trở thành một ngành có đóng
góp đáng kể trong kim ngạch xuất khẩu. Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL)
có truyền thống nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) từ rất lâu đời, cá
tra được nuôi phổ biến trong ao đất và trong bè. Hiện nay cá tra đã được nuôi ở
hầu hết các tỉnh trong vùng. Những năm gần đây, việc nuôi cá tra phát triển
mạnh nhằm ph
ục vụ tiêu thụ nội địa và cung cấp nguyên liệu cho chế biến xuất
khẩu. Đặc biệt từ khi giống nhân tạo hoàn toàn được chủ động thì nghề nuôi
càng ổn định và có những bước phát triển vượt bậc (Dương Nhựt Long, 2003).
Từ 1996-2006, diện tích nuôi cá tra, basa tăng gấp 7 lần, sản lượng tăng 36,2
lần, từ 22.000 tấn năm 1997 đã tăng lên 800.000 tấn vào năm 2006 (Nguyễn
Trọng Bình, 2008). Sản ph
ẩm thủy sản không chỉ đáp ứng nhu cầu trong nước
mà còn xuất khẩu ra thế giới, năm 2004 cả nước xuất khẩu thủy sản thu về 240
triệu USD và năm 2006 là 661 triệu USD. Hiện nay cá tra đã được xuất khẩu
sang 80 quốc gia và vùng lãnh thổ (Bộ Thủy Sản, 2007). Để có sản lượng như
thế ngoài việc tăng diện tích nuôi thì người nuôi còn tăng mật độ làm xuất hiện
nhi
ều loại bệnh như bệnh mủ gan, bệnh đốm đỏ, bệnh nhiễm huyết, một số
bệnh nấm, kí sinh trùng.

Năm 2007 ở khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long tần suất xuất hiện bệnh đốm
trắng 52,80%, xuất huyết 42,50%, phù đầu, phù mắt 20,70% và vàng da
21,60%. Trong đó bệnh đốm trắng xuất hiện trên nội tạng cá tra gây thiệt hại
nghiêm trọng nhất cho ng
ười nuôi, bệnh này thường xuất hiện ở các tỉnh như :
An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ gây hậu quả rất nghiêm trọng. Khi cá nhiễm
bệnh, tỷ lệ chết tăng cao từ 10-90% có thể lên tới 100% tùy thuộc vào cách
quản lý và cỡ cá nuôi (Nguyễn Quốc Thịnh và ctv, 2003). Hiện nay đã có nhiều
công trình nghiên cứu về đặc điểm sinh lý, sinh hóa, khả năng gây bệnh, độc
lực của vi khuẩn E. ictaluri c
ũng như sự biến đổi mô học do vi khuẩn này gây
ra đã được nhiều tác giả công bố. Tuy nhiên thông tin về độc lực của vi khuẩn
E. ictaluri ở cá tra còn hạn chế vì vậy đề tài:“Xác định LD
50
của cá tra
(Pangasianodon hypophthalmus) bị nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri”
được thực hiện.
Mục tiêu của đề tài nhằm: Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn E.
ictaluri có nguồn gốc khác nhau nhằm góp phần cung cấp thông tin cho những
nghiên cứu về huyết học, mô bệnh học của cá tra. Mặt khác đề tài cũng góp
phần vào việc chuẩn hóa phương pháp nghiên cứu bệnh do vi khuẩn E. ictaluri
gây ra trên cá tra.

2
Nội dung nghiên cứu:
1. Thực hiện thí nghiệm cảm nhiễm xác định LD
50
của các nhóm vi khuẩn
E. ictaluri có nguồn gốc phân lập khác nhau.
2. Biến đổi về cấu trúc mô học ở gan và thận của cá tra gây cảm nhiễm vi

khuẩn E. ictaluri.



3
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tình hình bệnh trên cá tra
Cá tra Pangasianodon hypophthalmus là loài cá da trơn nước ngọt được nuôi
phổ biến ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, đặc biệt ở các tỉnh An Giang, Đồng
Tháp và Cần Thơ. Theo thống kê của Sở tài nguyên và môi trường An Giang
toàn tỉnh có 750ha đất phát sinh nuôi thủy sản năm 2007. Năm 2008, diện tích
nuôi cá tra tỉnh Đồng Tháp là 1.348ha và Đồng Tháp đề ra năm 2010 diện tích
vùng nuôi cá tra trong toàn tỉnh là 2.309ha, còn Cần Thơ dự kiến năm 2010 đạt
di
ện tích 1.300ha (www.fistnet.gov.vn).
Với tốc độ phát triển nghề nuôi cá tra nhanh chóng dẫn đến chất lượng nước
ngày càng xấu, môi trường luôn tồn tại mầm bệnh và bốc phát bệnh khi đủ số
lượng và điều kiện thuận lợi. Theo Lê Phú Khởi (2006) tại An Giang đã ghi
nhận được một số bệnh xuất hiện trên cá tra với tần suất khác nhau từ năm
2004 trở lại đây là: bệnh đốm
đỏ, bệnh mủ gan, ký sinh trùng, thối đuôi, vàng
da, đường ruột, nổ mắt, tuột nhớt, bỏ ăn, sưng thận, nấm, thối mang. Trong 3
bệnh đó bệnh mủ gan, đốm đỏ và kí sinh trùng xảy ra với tần suất cao nhất.
Còn theo Từ Thanh Dung (2005) thì tần xuất hiện bệnh trên động vật thủy sản
với vi khuẩn (50,9%), virut (24,6%), kí sinh trùng (21,1%), nấm (3,4%).
Năm 2002 tỉ lệ sống của cá tra trong ao khoảng 90% năm 2004 giảm còn 85%.
Nguyên nhân làm giảm tỉ lệ sống là do nguồn nước bị ô nhiễm, có nhiều bùn bã
hữu cơ, nền đáy không nạo vét và nước quá bẩn dẫn đến dịch bệnh xãy ra.
Bệnh xãy ra trên cá tra chủ yếu là bệnh phù đầu, xuất huyết, đỏ mỏ đỏ kỳ, mủ
gan và vàng da trong đó gây thiệt hại nhiều nhất cho nghề nuôi là bệnh đốm đỏ,

đỏ mỏ đỏ kỳ, xuất huyết và bệnh mủ
gan. Đặc biệt là bệnh mủ gan xuất hiện
quanh năm và xuất hiện nhiều vào mùa lũ. Tỉ lệ hao hút của bệnh này cũng rất
cao (Nguyễn Thanh Phương và ctv, 2004).
2.2 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ở cá tra.

2.1.1 Nguyên nhân gây bệnh
Bệnh mủ gan (bệnh đốm trắng trên gan, thận) xuất hiện lần đầu tiên trên cá tra
nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long vào cuối năm 1998 do vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri gây ra và có tên là BNP (bacillary necrosis of Pangasius)
(Ferguson et al., 2001). Vi khuẩn
E. ictaluri thuộc họ Enterbacteriaceae là vi
khuẩn gram âm, hình que mảnh, kích thước 1x2-3µm, không sinh bào tử, là vi
khuẩn yếm khí tùy tiện, phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, không

4
oxy hóa, lên men trong môi trường O/F glucose. Thường gặp hai loài là E.
ictaluri và E. tarda (Bùi Quang Tề và ctv, 2004).
E. ictaluri tăng trưởng chậm trên môi trường nuôi cấy, cần từ 36-48 giờ ở 28-
30
0
C để phát triển thành khuẩn lạc nhỏ trên thạch BHI (Brain heart infusion
Agar) vi khuẩn tăng trưởng chậm hoặc không tăng trưởng khi ủ ở 37
0
C (Plumb,
1999). Vi khuẩn có thể phân lập từ mẫu cá bệnh (gan, thận, tỳ tạng) trên môi
trường Trytone Soya Agar (TSA) hoặc Eosine Methylene blue lactase Agar
(EMB) sau 48 giờ ở 28
0
C tạo thành khuẩn lạc nhỏ màu trắng, không có nhân,

rìa có dạng không đồng nhất (Từ Thanh Dung và ctv, 2004).
2.1.2 Đường lây lan
Bệnh thường xảy ra nhiều vào mùa mưa lũ kéo dài đến mùa khô. Thời điểm
phát triển bệnh và mức độ thiệt hại khác nhau theo từng năm (Nguyễn Quốc
Thịnh và ctv, 2003).
E. ictaluri có thể nhiễm cho cá bằng 2 đường khác nhau. Vi khuẩn trong nước
có thể qua đường mũi của cá xâm nhập vào cơ quan khứu giác và di chuy
ển
vào dây thần kinh khứu giác, sau đó vào não. Bệnh lan rộng từ màng não đến
sọ và da E. ictaluri cũng có thể xâm nhiễm qua đường tiêu hóa qua niêm mạc
ruột vào máu gây nhiễm trùng máu. Bằng đường này thì vi khuẩn vào mao
mạch trong biểu bì gây hoại tử và mất sắc tố của da. Cá da trơn còn nhiễm E.
ictaluri qua đường miệng gây nhiễm khuẩn ruột. Bệnh tiến triển gây viêm ruột,
viêm gan và viêm cầu thận trong vòng 2 tuần sau khi nhiễm bệnh (Shotts et al.,
1986). Vi khuẩn E.ictaluri
có thể tồn tại trong môi trường nước một tuần và
trong bùn đáy khoảng một tháng (Francis-Floyd, 1996).
2.1.3 Dấu hiêu bệnh lý
Cá mới bị bệnh thường không có những dấu hiệu bất thường bên ngoài, ở giai
đoạn đầu vài con tách đàn bơi lờ đờ sau đó dạt vào bờ bỏ ăn. Khi bị bệnh nặng
cá có biểu hiện gầy, da nhợt nhạt, có nhiều bệch lớn nhỏ trên da. Bên trong nội
quan (gan, thậ
n, tỳ tạng) xuất hiện những đốm trắng đường kính 1-3mm các cơ
quan sưng to và có hiện tượng nhũn ở thận. Bệnh thường xuất hiện vào mùa lũ,
xuất hiện nhiều nhất vào tháng 7 và 8. Tuy nhiên, trong những năm gần đây
bệnh xuất hiện trên cá tra hầu như quanh năm và xuất hiện ở tất cả các giai
đoạn phát triển của cá tra. Khi cá nhiễm bệnh, tỷ lệ chết t
ăng cao 10-90% tùy
thuộc vào cách quản lý và cỡ cá nuôi (Từ Thanh Dung và ctv, 2004).

5
2.3 Lịch sử bệnh mủ gan trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)
Bệnh mủ gan xuất hiện lần đầu tiên ở đồng bằng sông Cửu Long vào cuối năm
1998 trên cá tra nuôi và có tên la Bacillary necrosis of Pangasius – BNB với
dấu hiệu bệnh có nhiều nốt trắng trên gan (Ferguson et al., 2001). Trong 10
năm gần đây đã trở thành một bệnh phổ biến, gây thiệt hại lớn về kinh tế ở các
vùng nuôi cá tra thâm canh.
Theo nghiên cứu trước đây cho rằng bệnh mủ gan không tìm th
ấy trên đối
tượng cá basa mà chỉ xuất hiện trên cá tra, theo Ferguson et al., (2001) giải
thích nguyên nhân có thể là kết quả của sự khác biệt về tính nhạy cảm của loài
(trích dẫn bởi Phan Thị Mỹ Hạnh, 2004; Lê Thị Bé Năm, 2002). Nhưng kết quả
nghiên cứu gần đây cho rằng bệnh mủ gan, thỉnh thoảng xuất hiện trên cá basa
bệnh xuất hiện tất cả các giai đoạn của cá tra (Từ Thanh Dung, 2005). Tỉ l
ệ hao
hụt lớn ở cá tra giống nhưng gây thiệt hại kinh tế lớn nhất ở giai đoạn cá đạt
trọng lượng khoảng 300-500g.
Hiện nay bệnh mủ gan thường lây lan theo chiều ngang trực tiếp từ cá bệnh
sang cá khỏe, qua phân và qua môi trường nước. Vi khuẩn E. ictaluri sống
trong môi trường nước ao từ 1-2 tuần, trong bùn đáy ao và cây cỏ thủy sinh, vi
khuẩn có thể tồn tại 90 ngày ở nhiệt độ 25
0
C. Vì thế bệnh mủ gan có thể kéo
dài, chi phí điều trị tốn kém và lưu giữ mầm bệnh trong bùn đến vụ sau, nếu
không cải tạo ao đúng các bệnh sẽ dễ dàng tái phát trở lại khi gặp điều kiện
thuận lợi (Từ Thanh Dung, 2005).
Hiện nay phương pháp xác định vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh trên cá tra phổ
biến là phương pháp truyền thống, sử dụng bộ kit API 20E, phương pháp PCR.
Trong đó phương pháp truy
ền thống đã được ứng dụng từ rất lâu có thể kiểm

tra đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn nhưng cần thời gian khá lâu để đọc
kết quả. Trong khi đó bộ kit API 20E lại cho kết quả nhanh chóng và dễ thực
hiện nhưng nhược điểm là chỉ định danh được vi khuẩn gram âm, hình que (Từ
Thanh Dung và ctv, 2004). Ứng dụng PCR để định danh vi khuẩn E. ictaluri là
một trong những ph
ương pháp hiện đại giúp phát hiện nhanh ADN của vi
khuẩn nhưng không phát hiện sự tạp nhiễm trong mẫu phân tích. Đặng Thị
Hoàng Oanh và ctv (2008) đã ứng dụng thành công phương pháp PCR phát
hiện vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh trên cá tra cho kết quả dương tính ở 407 bp.
2.4 Một số thí nghiệm gây cảm nhiễm Edwardsiella ictaluri
Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri đã được nhiều tác giả nghiên cứu
cũng như công bố không chỉ trên cá tra mà còn trên nhiều
đối tượng khác. Có
nhiều phương pháp gây cảm nhiễm như: tiêm, tắm, ngâm.

6
Baxa et al. (1990) cho rằng vi khuẩn E. ictaluri gây chết ở các loài cá khác
nhau thì tỉ lệ chết khác nhau: cá nheo là 32%, cá hồi trắng 75% và 5% đối với
cá vược sọc khi tiến hành ngâm cá với mật độ 1x10
8
CFU/ml thời gian theo dõi
là 14 ngày.
Francis – Floyed (1996) thì cho rằng vi khuẩn E. ictaluri nhiễm trên cá nheo
Mỹ gây chết cao nhất ở 25
0
C và thấp nhất ở 23
0
C và 28
0
C, đặc biệt không gây

chết ở 17
0
C, 21
0
C và 32
0
C. Bên cạnh đó Wise et al. (1993) kết luận khi cá nheo
bị sốc do nuôi trong bể trước khi tiếp xúc E. ictaluri, tỉ lệ chết là 97% ở lô cá bị
sốc và 77% ở lô cá không có sốc.
Theo Lương Trần Thục Đoan (2006) khi gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri
trên cá tra ở nhiệt độ khoảng 26-28
0
C kết luận mật độ vi khuẩn 1x10
6
CFU/ml
và 1x10
5
CFU/ml có động lực đủ mạnh để gây chết cá. Ngoài ra, Plumb (1999)
cho rằng E. ictaluri chỉ thích hợp với điều kiện nhiệt độ khoảng 18-28
0
C. Do
đó bệnh do vi khuẩn này xảy ra trên cá da trơn thường rơi vào mùa có nhiệt độ
thấp.
Thí nghiệm của Phan Thị Mỹ Hạnh (2004) khi tiến hành ngâm vi khuẩn E.
ictaluri ở mật độ 1,5x10
2
và 1,5x10
3
CFU/ml thì tỉ lệ cá chết dao động từ
56,6% đến 96,7%. Bên cạnh đó Tiết Ngọc Trân (2007) cũng ngâm với 2 dòng

vi khuẩn là 18764 và 223 mật độ 0,9x10
8
CFU/ml, sau 1h tỉ lệ xâm nhập của 2
dòng tương đối cao khoảng 10
4
-10
5
CFU/ml sau đó giảm dần, trong các cơ quan
phân tích thì ruột là cơ quan cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn E. ictaluri cao
nhất, kế đến là thận, tỳ tạng, gan.
Năm 2007, Lê Minh Đương cũng tiến hành thí nghiệm trên cá tra bằng phương
pháp ngâm với 2 dòng vi khuẩn EH02 & E223 kết quả cho thấy tỉ lệ nhiễm của
dòng vi khuẩn EHO2 cao nhất là ở tỳ tạng (92,5%), thấp nhất là não (27,5%).
Trong khi đó, lô E223 thì tỉ lệ cảm nhiễm cao nh
ất là lớp nhớt trên da (80%) và
thấp nhất là mang (2,5%). Nghiên cứu này cũng xác định được tỉ lệ cá chết dao
động từ 2,5-92,5% với mật độ vi khuẩn là 10
8
CFU/ml.
Trần Lê Triệu Tú (2007) khi tiêm vi khuẩn E. ictaluri với mật độ 10
5
-10
8

CFU/ml thì kết quả cá chết vào ngày thứ 3 với LD
50
= 3,17x10
6
CFU/ml. Ngoài
ra Lương Trần Thục Đoan (2006) cũng tiêm vi khuẩn ở mật độ 10

5
-10
6

CFU/ml thì cá chết vào ngày thứ 2 và tỉ lệ chết dao động từ 66,7-100%.
Gần đây Viện nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II đã kết hợp với công ty thuốc
thú y TW (Navetco) thực hiện đề tài cấp nhà nước nghiên cứu vaccine phòng
bệnh nhiễm khuẩn cho cá tra, cá basa, cá mú, cá giò, cá hồng mỹ nuôi công

7
nghiệp, kết quả cho thấy ở các tỉnh như Vĩnh Long, An Giang, Đồng Tháp, đều
có cá tra bi bệnh mủ gan đồng thời cũng xác định được liều gây chết 50% cá
thí nghiệm (LD
50
) là 2,5x 10
4
tế bào/0,2ml/cá có trọng lượng trung bình khoảng
30gram (Bộ Thủy Sản, 2007). Trong khi đó Huỳnh Chí Thanh (2007) lại cho
kết quả LD
50
là 3,16x10
6
cfu/ml khi tiến hành phân lập vi khuẩn ngoài tự nhiên
(cá tra bệnh mủ gan ở An Giang) sau đó gây cảm nhiễm trở lại với 4 mật độ
10
5
, 10
6
, 10
7

, 10
8
và ở nghiệm thức 10
8
CFU/ml cá xuất hiện bệnh sớm nhất
vào ngày thứ 2 và thứ 3 với tỉ lệ chết 91,66%.
Theo Ngô Minh Dung (2007) khi tiêm E. ictaluri với 4 mật độ khác nhau, kết
quả thu được ở nồng độ 10
5
CFU/ml thì thời gian xuất hiện bệnh và tỉ lệ chết
lần lượt là 86 giờ và 25%; tương tự ở 10
6
là 72,5 giờ và 33,33%; ở 10
7
là 61 giờ
và 66,67% và ở 10
8
là 37 giờ và 91,67%. Với giá trị LD
50
= 10
6,5
CFU/ml.
2.5 Biến đổi mô học ở cá bệnh do vi khuẩn E. ictaluri
Khi cá tra bị bệnh mủ gan có nhiều biến đổi về cấu trúc mô học, gan, thận và tỳ
tạng có hiện tượng xung huyết, xuất huyết và nhiều vùng hoại tử trầm trọng. Vi
khuẩn cũng được tìm thấy trên mẫu mô của các cơ quan này, những vi khuẩn
này tạo thành bó ở rìa các vết hoại tử (Nguyễn Quốc Thịnh và ctv, 2003).
Vi khu
ẩn E. ictaluri đã được Hawke et al. (1981) phân lập từ cơ quan thận sau
và tỳ tạng của cá nheo Mỹ có dấu hiệu nhiễm bệnh nhiễm trùng máu cấp tính

(ESC). Cá nheo Mỹ bị bệnh này thường có vết loét trên đầu, bị sưng viêm và
xuất huyết trong da ở phần mõm. Bên cạnh dó còn xuất hiện dấu hiệu hoại tử
tạo thành những đốm hình cầu màu trắng và hiện tượng xuất huyết trên gan.
Ngoài ra, Ferguson et al. (2001) c
ũng cho thấy có sự tổn thương trên gan, thận,
tỳ tạng và một vài vùng trên cơ của cá tra P. hypophthalmus. Tỳ tạng có nhiều
vùng hoại tử lan rộng ở nhu mô.

8
PHẦN 3:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm
- Thời gian: tháng 01/2009 đến 06/2009.
- Địa điểm: Phòng cảm nhiễm, phòng thí nghiệm của Bộ môn sinh học và
Bệnh Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, trường Đại Học Cần Thơ.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
Dụng cụ thí nghiệm
Que cấy, đèn cồn, hộp quẹt, ống nghiệm, đĩa petri th
ủy tinh, micropipet 1ml,
5ml, hộp đầu col 1ml, 5ml, chai 100ml, 250ml, 500ml, lame, lamen, viết lông
dầu, viết chì, bình xịt cồn, sổ ghi chép…
Hóa chất thí nghiệm
Cồn tuyệt đối, NaCl, H
2
O
2
, vaselin, nước cất, hóa chất nhuộm gram, HCl,
KOH, amyl alcohol, ethanol, axit sulphanilic, axit acetic, dầu paraffin, oxidase.
Môi trường
Tryptic soy agar (TSA), Nutrient agar (NA), Nutrient broth (NB).
Thiết bị

Bể Composite (2m
3
), bể thí nghiệm (35L), máy bơm nước (cấp nước cho hệ
thống thí nghiệm), máy sục khí, ống sục khí, đá bọt, tủ ấm, nồi thanh trùng,
máy ly tâm, máy so màu quang phổ, máy trộn mẫu (vortex). Các dụng cụ và
thiết bị cần thiết cho nghiên cứu…
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Chuẩn bị hệ thống bể
Bể Composite được vệ sinh kỹ bằng xà phòng và chlorin 200ppm, phơi khô.
Sau đó cấp nước vào:
- Đối vớ
i bể 2m
3
để trữ cá thì cấp nước khoảng 2/3 bể, sục khí 1-2 ngày
trước khi thí nghiệm. Bể được đặt ngoài trời có mái che (tránh mưa).
- Đối với bể thí nghiệm 35L thì cấp khoảng nước, sục khí. Bể được đặt
trong phòng kín nhiệt độ phòng 26-28
0
C.

9
- Nguồn nước sử dụng là nguồn nước máy.
- Các dụng cụ thí nghiệm như: xô, dợt, ống sục khí, đá bọt…cũng được vệ
sinh kỹ.
3.3.2 Cá thí nghiệm
Cá tra giống có trọng lượng khoảng 15-30g/con, da sáng và phản ứng linh hoạt
với tiếng động. Cá mua về được trữ trong bể composite, có sục khí, cho ăn thức
ăn công nghiệp, cho ăn theo nhu cầu của cá. Thuần cá khoảng 1-2 tuần trướ
c
khi tiến hành thí nghiệm.

3.3.3 Vi khuẩn
Sử dụng nguồn vi khuẩn trữ trong tủ - 80
0
C của Bộ môn Sinh học và Bệnh
Thủy sản, Khoa thủy sản, Trường Đại học Cần thơ (Bảng 3.1).
Bảng 3.1: Các chủng vi khuẩn sử dụng gây cảm nhiễm

STT Chủng vi khuẩn Năm thu mẫu Nguồn gốc
2 A1 2008 Phụng Hiệp - Hậu Giang
3 T8 2008 Thốt Nốt - Cần Thơ
4 CAF258 2006 Châu Phú - An Giang
6 KSL103 2008 Kế Sách - Sóc Trăng

Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn
Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường NA/TSA ở 28
0
C. Sau 24-48 giờ quan
sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nhuộm gram kiểm tra tính thuần của vi
khuẩn.
Chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm
Nuôi tăng sinh vi khuẩn: sau khi có được đĩa vi khuẩn thuần, dùng que cấy tiệt
trùng lấy khoảng 2 đến 3 khuẩn lạc cho vào chai chứa khoảng 30ml NB đã tiệt
trùng, đặt lên máy lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ.
Sau 24 giờ chuyển vi khuẩn sang ống falcol 50ml tiệt trùng, đem ly tâm 4000
vòng/phút ở 4
0
C trong 15 phút. Sau khi ly tâm loại bỏ dung dịch phía trên và
dùng nước muối sinh lý tiệt trùng để rửa vi khuẩn (lặp lại 2-3 lần).

10

Lần ly tâm cuối, loại bỏ phần dung dịch phía trên và cho vào khoảng 25ml
dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng, sau đó trộn đều mẫu bằng máy vortex.
Tiến hành xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ với bước
sóng 610nm và điều chỉnh OD tương ứng để xác định mật độ vi khuẩn.
OD=1±0.1 tương ướng mật độ vi khuẩn là 10
9
cfu/ml.

Hình 3.1: Sơ đồ chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm


11
3.3.4 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri ở cá tra.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức và nghiệm
thức đối chứng không tiêm và tiêm nước muối sinh lý, mỗi nghiệm thức lặp lại
3 lần với mật độ 10 con/bể.
1. Nghiệm thức không tiêm.
2. Nghiệm thức đối chứng: Tiêm nước muối sinh lý.
3. Nghiệm thức 1: cá được tiêm vi khuẩn (mậ
t độ 10
7
CFU/ml).
4. Nghiệm thức 2: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 10
6
CFU/ml).
5. Nghiệm thức 3: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 10
5
CFU/ml).
6. Nghiệm thức 4: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 10

4
CFU/ml).
7. Nghiệm thức 5: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 10
3
CFU/ml).
8. Nghiệm thức 6: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 10
2
CFU/ml).
Thí nghiệm xác định LD
50
được tiêm với 6 mật độ từ 10
3
- 10
8
CFU/ml đối với
chủng A1. 3 chủng còn lại tiêm từ 10
2
- 10
7
CFU/ml (Bảng 3.2).

Bảng 3.2: Mật độ vi khuẩn E. ictaluri (CFU/ml) gây cảm nhiễm

Chủng NT 6 NT 5 NT 4 NT 3 NT 2 NT 1
A1 2,7x10
3
2,7x10
4
2,7x10
5

2,7x10
6
2,7x10
7
2,7x10
8

T8 0,4x10
2
0,4x10
3
0,4x10
4
0,4x10
5
0,4x10
6
0,4x10
7

CAF258 0,8x10
2
0,8x10
3
0,8x10
4
0,8x10
5
0,8x10
6

0,8x10
7

KSL103 0,5x10
2
0,5x10
3
0,5x10
4
0,5x10
5
0,5x10
6
0,5x10
7

Ghi chú: NT: nghiệm thức

- Cá mua về được thuần hóa 1 tuần thì tiến hành tiêm vi khuẩn cho cá ở các mật
độ vi khuẩn và tiêm ở gốc vi ngực của cá.
- Cá được kiểm tra kí sinh trùng và vi sinh trước khi tiến hành thí nghiệm.
- Tiêm 0,1ml cho mỗi con và không cho ăn trong suốt quá trình thí nghiệm.
- Thời gian theo dõi sau khi gây cảm nhiễm là 12 ngày.

12
3.3.4.1 Xác định LD
50
theo phương pháp của Reed và Muench (1938)

Xác định LD

50
để biết được khả năng gây bệnh của vi khuẩn và so sánh độc lực
giữa các chủng vi khuẩn.
Log LD
50
= Log A + x Log 10

Trong đó: Log A: nồng độ nhỏ và cận 50%
Log 10: độ pha loãng
%d: % số cá chết nhỏ và cận 50%
%t: % số cá chết lớn và cận 50%

3.3.4.2 Tái phân lập và tái định danh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bằng
phương pháp truyền thống.
- Tiến hành thu mẫu cá lờ đờ hay vừa mới chết, ghi lại thời gian dấu hiệu bên
ngoài và bên trong cơ thể.
- Phân lập vi khuẩn ở 3 cơ quan: gan, thận và tỳ tạng
- Sau 24-48 gi
ờ ủ ở 28-30
0
C quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc
trên môi trường TSA/NA, nhuộm gram, xác định hình dạng vi khuẩn, khả năng
di động của vi khuẩn.
Các chỉ tiêu sinh lý
Kiểm tra phản ứng oxidase, catalase
Các chỉ tiêu sinh hóa
Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose (O/F), khả năng tạo acid từ các
loại đường: mannose, glucose, sucrose, galactose, mannitol, maltose, sorbitol,
xylose, glycerol, rhamnose, Inositol, khả năng sinh H
2

S, indole, khả năng sử
dụng citrate, sử dụng urea, khả năng thủy phân gelatine, thủy phân starch, thủy
phân Tween 80. Phản ứng tạo nitrite từ nitrate, phản ứng VP, MR, khả năng kết
hợp crystal violet và khả năng phát triển ở các nồng độ muối khác nhau.
50% - %d
%t - %d

13
3.3.5 Mô học
Cố định mẫu: Mẫu gan và thận được cố định trong dung dịch formol trung
tính 10% trong 24
h
, tiến hành rửa dưới vòi nước 2
h
. Sau đó chuyển sang cồn
70% để bảo quản và xử lý mẫu.
Cắt tỉa và định hướng: Mẫu trước khi đưa vào qui trình xử lý mẫu phải cắt tỉa
và định hướng cho mẫu đạt kích cỡ phù hợp, cắt mẫu với độ dày từ 5-7mm.
Đưa mẫu vào catsset và tiến hành xử lý.
Qui trình xử lý mẫu: Qui trình xử lý mẫu được thực hiện trên máy Tisue
processing (phụ lục 4)
Loại nước
: Mục đích của lọai nước nhằm đảm bảo loại hết nước trong mẫu mô
mà không làm tế bào bị biến dạng hoặc không làm vị trí thành phần cấu tạo tế
bào trong mẫu mô không bị thay đổi. Qúa trình loại nước được thực hiện bằng
cách cho mẫu qua nhiều dung dịch cồn với nồng độ gia tăng từ 70% đến 100%.
Thời gian khử nước phụ thuộc vào độ dày của m
ẫu mô.
Làm trong mẫu: Vì cồn không thể hòa lẫn với paraffin nên sau khi khử nước
thì cồn cũng được loại ra khỏi mẫu. Nếu không loại bỏ hết cồn, phần mô đó sẽ

bị co rút lại, khối mẫu đúc trong paraffin sẽ không đồng nhất, tạo nên những lổ
hỗng trên lát cắt. Do đó làm ngấm vào trong mẫu mô dung môi trung gian
(xylen) có thể hòa tan được cồn và paraffin.
Tẩm paraffin: Paraffin là chất nền để bảo đả
m cho tế bào giữ nguyên được
hình dạng khi cắt. Sau khi làm trong, mẫu mô sẽ được ngấm paraffin nóng chảy
(57- 60
0
C).
Đúc khối: Mục đích của việc đúc khuôn là làm cho mẫu mô nằm trong khối
rắn để cắt lát mỏng. Chất nền để đúc khuôn là paraffin: sáp ong nóng chảy với
tỉ lệ 7:3. Sau khi mẫu mô đã vùi vững chắc vào paraffin làm rắn paraffin lại
bằng cách đặt khuôn trong tủ lạnh, sau đó tách khối paraffin ra khỏi khuôn.
Cắt mẫu: Sử dụng máy microtome để cắt mẫu, lát cắt có độ dày là 2 µm. Mẫu
được cắt thành b
ăng dài và cho vào chậu nước nóng 45-50
0
C để paraffin căng
ra, dùng kim mũi giáo nhẹ nhàng tách riêng từng đoạn mẫu đạt yêu cầu.
Dán mẫu lên lame: Dung dịch keo để dán mẫu là Mayer's albumin. Thoa dung
dịch keo lên lame, đặt một đầu lame vào chậu nước ấm nghiêng một góc 45
0
và
nâng từ từ lên, lát cắt sẽ được dán chặt vào phiến kính. Sau khi dán, làm khô
phiến kính bằng cách sấy khô ở nhiệt độ 45
0
C-50
0
C.

14
Nhuộm mẫu (Harris's Haematoxylin & Eosin): mẫu được nhuộm theo qui
trình trình bày trong phụ lục 4.
Dán lamelle vào lame: Để đảm bảo mẫu được giữ lâu và tăng tính chiết quang
của mẫu, dùng keo Enterlan phủ lên mẫu và dán lamelle lên mẫu. Nhỏ một giọt
keo lên mẫu, đặt lamelle nghiêng 45
o
và tiếp xúc với giọt keo, hạ lame xuống
từ từ để tránh bọt khí.
Đọc kết quả: Tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 10x để quan
sát tổng quát tiêu bản nếu tiêu bản đẹp đạt yêu cầu có nhân bắt màu tím xanh
của Hematoxylin, phần còn lại bắt màu hồng Eosin. Các tiêu bản đẹp sẽ được
quan sát lần lượt ở độ phóng đại 40x,100x (nhỏ giọt dầu) và chụp hình tiêu bản
đặc tr
ưng.
3.3.6 Xử lý số liệu
Các số liệu được thu thập và xử lý bằng phần mềm Excel.

15
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Sau khi thực hiện thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri trên những
chủng khác nhau thì thời gian xuất hiện bệnh khác nhau. Ở những nồng độ
khác nhau thì tỉ lệ chết cũng khác nhau.
4.1 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri.
4.1.1 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri chủng A1
Sau khi gây cảm nhiễm, ở tất cả các nghiệm thức đều có cá chết với t
ỉ lệ rất cao
và đều có dấu hiệu bệnh lý rất rõ. Ở các nồng độ vi khuẩn khác nhau thì thời
điểm xuất hiện bệnh cũng khác nhau (Đồ thị 4.1.1).

Đồ thị 4.1.1: Tỉ lệ cá chết (%) theo ngày cảm nhiễm của chủng A1


Qua đồ thị 4.1.1 cho thấy vào ngày thứ 2 ở tất cả các nghiệm thức đều có cá
chết ngoại trừ bể đối chứng tiêm nước muối sinh lý. Sau 12 ngày thí nghiệm tất
cả các nghiệm thức đều chết (100%), bể đối chứng tiêm nước muối sinh lý chết
(39%) riêng bể đối chứng không tiêm thì không có cá chết. Do chủng A1 tỉ lệ

chết cao nồng độ thấp 2,7x10
3
CFU/ml tỉ lệ chết đã là 100%. Vì vậy chủng A1
không xác định được giá trị LD
50
.

16
4.1.2 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri chủng T8
Do chủng A1 không xác đinh được LD
50
lý do ở nồng độ thấp tỉ lệ chết đã trên
50%. Vì vậy từ chủng T8 trở về sau được bố trí với nồng độ thấp hơn từ 10
2

đến 10
7
CFU/ml.

Đồ thị 4.1.2: Biểu hiện tỉ lệ cá chết (%) theo ngày cảm nhiễm của chủng T8

Kết quả Đồ thị 4.1.2 cho thấy cá bắt đầu chết vào ngày thứ 3 ở nghiệm thức
0,4x10
7
CFU/ml với tỉ lệ 13% và 0,4x10
2
CFU/ml là 3%. Vào ngày thứ 4 tất cả
các nghiệm thức đều có cá chết ngoại trừ bể đối chứng. Sau 12 ngày thí nghiệm
ở nghiệm thức 0,4x10
7
CFU/ml cá chết với tỉ lệ cao nhất 83%. Tỉ lệ thấp nhất
23% ở mật độ 0,4x10
2
CFU/ml. Trong khi đó, ở các nghiệm thức còn lại
0,4x10
3
CFU/ml; 0,4x10
4
CFU/ml; 0,4x10
5
CFU/ml và 0,4x10
6
CFU/ml cá
chết với tỉ lệ lần lượt là 67%; 57%; 43% và 37%. Riêng bể tiêm nước muối
sinh lý cũng có cá chết nhưng tỉ lệ không cao 17%, bể không tiêm thì không có
cá chết.
Từ kết quả thí nghiệm, LD
50
của chủng T8 thu được trong thí nghiệm gây cảm
nhiễm có giá trị LD

50
= 1,3x10
4
CFU/ml.
4.1.3 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri chủng CAF258
Sau khi gây cảm nhiễm chủng CAF258 cho kết quả rất tốt giữa các nghiệm
thức khác nhau thì tỉ lệ chết khác nhau (Đồ thị 4.1.3).

17

Đồ thị 4.1.3: Tỉ lệ cá chết (%) theo ngày cảm nhiễm của chủng CAF258


Ở nghiệm thức 0,8x10
7
; 0,8x10
6
; 0,8x10
5
CFU/ml cá tập trung chết vào ngày
thứ 4 còn 0,8x10
4
CFU/ml chết vào ngày thứ 5. Trong khi đó ở nghiệm thức
0,8x10
3
và 0,8x10
2
CFU/ml cá chết lần lượt vào ngày 5 và ngày 6. Sau 12 ngày
thí nghiệm nghiệm thức 0,8x10
7

CFU/ml chết với tỉ lệ cao nhất 100% và thấp
nhất là 0,8x10
2
CFU/ml với tỉ lệ 7%, còn ở nghiệm thức 0,8x10
5
và 0,8x10
6

CFU/ml chết với tỉ lệ 93% hai nghiệm thức còn lại 0,8x10
2
và 0,8x10
3
CFU/ml
tỉ lệ chết lần lượt là 63% và 73%. Bể đối chứng tiêm nước muối và bể không
tiêm đều không có cá chết trong suốt qua trình thí nghiệm.
Cũng như chủng T8 sau khi gây cảm nhiễm chủng CAF258 cho kết quả xác
định được giá trị LD
50
= 4,7x10
2
CFU/ml. Kết quả này cho thấy chủng CAF258
có động lực khá mạnh.
4.1.4 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri chủng KSL103
Cũng giống như chủng CAF258 chủng KSL103 sau khi gây cảm nhiễm ở các
nghiệm thức khác nhau tỉ lệ chết khác nhau (Đồ thị 4.1.4). Đồ thị trên cho thấy
sau 12 ngày gây cảm nhiễm nghiệm thức 0,5x10
7
CFU/ml chết với tỉ lệ 93% ở
0,5x10
6

CFU/ml là 80% và 0,5x10
5
CFU/ml là 60%, còn 0,5x10
4
CFU/ml là
33%. Trong khi đó nghiệm thức 0,5x10
3
CFU/ml chết với tỉ lệ 7% và 0,5x10
2

CFU/ml là 20%, tuy nghiệm thức 0,5x10
2
CFU/ml có tỉ lệ chết cao hơn 0,5x10
3

CFU/ml nhưng sự chênh lệch cũng không lớn có thể chấp nhận được. Sau khi

18
gây cảm nhiễm cá chết tập trung vào ngày 3 và 4 riêng bể đối chúng tiêm nước
muối và không tiêm thì không có cá chết.
Kết quả cũng cho ta xác định được LD
50
với giá trị LD
50
= 2,1x10
4
CFU/ml.
Độc lực của chủng này cũng tương đối mạnh.

Đồ thị 4.1.4: Tỉ lệ cá chết (%) theo ngày cảm nhiễm của chủng KSL103


4.2 Thảo luận chung
Sau khi gây cảm nhiễm các chủng vi khuẩn E. ictaluri kết quả thu được ở
những chủng vi khuẩn E. ictaluri khác nhau thì thời gian xuất hiện bệnh khác
nhau và ở các nồng độ khác nhau tỉ lệ chết cũng khác nhau.
E. ictaluri chủng A1 vào ngày thứ 2 ở tất cả các nồng độ vi khuẩn đều có cá
chết. Trong khi đó ch
ủng T8 cá bắt chết vào ngày thứ 3 ở nồng độ 0,4x10
7

CFU/ml và ngày thứ 4 ở các nồng độ 0,4x10
6
, 0,4x10
5
, 0,4x10
4
và 0,4x10
3

CFU/ml, còn chủng CAF258 cá bắt đầu chết vào ngày thứ 3 ở nồng độ 0,8x10
6

và 0,8x10
7
CFU/ml, chủng KSL103 thì cá chết vào ngày thứ 3 và thứ 4. Trong
thí nghiệm gây cảm nhiễm tiêm vi khuẩn này trên cá tra giống của Lương Trần
Thục Đoan (2006) ở mật độ 10
6

CFU/ml cá bắt đầu chết vào ngày thứ 2 và 10
5

CFU/ml là ngày thứ 3. Trong khi đó Ngô Minh Dung (2007) cũng sử dụng E.
ictaluri tiêm cho cá tra thì cho kết quả cá bắt đầu chết vào ngày thứ 2 ở 10
8

CFU/ml và vào ngày thứ 3 ở mật độ 10
7
và 10
6
CFU/ml. Bên cạnh đó,