ảnh hưởng của antistress lên khả năng đề kháng edwardsiella ictaluri của cá tra (pangasianodon hypophthalmus)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN








TRẦN HOA CÚC






ẢNH HƯỞNG CỦA ANTISTRESS LÊN KHẢ NĂNG ĐỀ
KHÁNG Edwardsiella ictaluri CỦA CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus)






LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN






TRẦN HOA CÚC





ẢNH HƯỞNG CỦA ANTISTRESS LÊN KHẢ NĂNG ĐỀ
KHÁNG Edwardsiella ictaluri CỦA CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus)




LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TS. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH
KS. ĐẶNG THỤY MAI THY
KS. NGUYỄN THỊ THÚY LIỄU





2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
i
TÓM TẮT
Thí nghiệm được tiến hành nhằm tìm hiểu ảnh hưởng của Antistress lên khả năng
kháng Edwardsiella ictaluri của cá tra thông qua việc phân tích huyết học sau cho
ăn Antistress và theo dõi tỉ lệ chết sau cảm nhiễm. Cá tra giống khỏe cho ăn thức
ăn đối chứng có hàm lượng 0% Antistress trong 1 tuần. Sau đó, cá được bố trí
thành 4 nghiệm thức cho ăn thức ăn có hàm lượng 0%; 0,2%; 0,4%; 0,6%
Antistress trong 8 tuần. Cá còn lai sau thu mẫu huyết học được tiêm 0,1ml vi
khuần Edwardsiella ictaluri CAF255, nồng độ 1,2x10
6
tb/ml.
Kết quả thu được, số lượng hồng cầu tăng có ý nghĩa thống kê ở nghiệm thức bổ
sung 0,4%và 0,6% Antistress so với nghiệm thức đối chứng và trước cho ăn. Tổng
bạch cầu, tiểu cầu cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,2% Antistress. Trong khi đó,
nghiệm thức bổ sung 0,4% Antistress lại có số lượng bạch cầu trung tính cao nhất;
tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân lại cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,6%
Antistress. Tuy nhiên, tất cả sự chênh lệch về bạch cầu không có ý nghĩa thống kê
giữa các nghiệm thức.

Bạch cầu đơn nhân, đại thực bào tăng trong cùng nghiệm thức trước và sau khi
gây cảm nhiễm. Trong khi đó, hồng cầu, tổng bạch cầu, tế bào lympho, tiểu cầu lại
giảm. Giữa các nghiệm thức sau khi gây cảm nhiễm, số lượng hồng cầu, tổng bạch
cầu, tế bào lympho cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,6% Antistress. Bạch cầu đơn
nhân; đại thực bào cao nhất nghiệm thức bổ sung 0,4% Antistress. Bạch cầu trung
tính cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,2% Antistress.
Sau cảm nhiễm, thu được tỉ lệ cá chết thấp nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,2%
Antistress là 83%. Tỉ lệ cá chết cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,6% Antistress là
100%.







PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
ii
LỜI CẢM TẠ

Chân thành gửi lòng biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh cùng quý thầy
cô Bộ môn sinh học và bệnh Thủy Sản đã hết lòng hướng dẫn cũng như luôn tạo
mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian học tập, thực hiện và hoàn thành luận
văn tốt nghiệp.
Xin gửi lời biết ơn chân thành đến cô Đặng Thụy Mai Thy và chị Nguyễn Thị
Thúy Liễu đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tình, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu
trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp
Và cũng xin chân thành biết ơn sâu sắc gia đình và những người thân đã tạo mọi
điều kiện, sự động viên, tình yêu thương về vật chất cũng như tinh thần trong suốt
thời gian học và hoàn thành luận văn.

Gửi lời cảm tạ đến tập thể lớp BHTS - K31 đã hết lòng ủng hộ, quan tâm, giúp đõ
trong suốt thời gian qua.

Chân thành cảm tạ!
























PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
iii

MỤC LỤC
Trang

Tóm tắt i
Lời cảm tạ ii
Mục lục iii
Danh sách hính v
Danh sách bảng vi
Danh mục từ viết tắc vii

Chương 1: Giới thiệu 1
Chương 2: Lược khảo tài liệu 3
2.1 Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan trên cá tra 3
2.2 Bệnh lí và sự thay đổi các chỉ tiêu huyết học 3
2.3 Một số thí nghiệm gây cảm nhiễm gần đây 6
2.4 Sản phẩm Antitress và vai trò của vitamin, chất khoáng đối với sức khỏe của
cá. 7
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 9
3.1 Thời gian thực hiện đề tài 9
3.2 Địa điểm nghiên cứu 9
3.3 Vật liệu nghiên cứu 9
3.4 Phương pháp nghiên cứu 9
3.5 Phương pháp xử lý số liệu 13
Chương 4: Kết quả và thảo luận 14
4.1 Thí ngiệm 1 14
4.1.1 Về hồng cầu 14
4.1.2 Bạch cầu 15
4.2 Thí nghiệm 2 16

4.2.1 Hồng cầu 16
4.2.2 Các loại bạch cầu 17
4.2.3 Kết quả tỉ lệ chết sau cảm nhiễm 22
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
iv
4.2.4 Kết quả phân lập vi khuẩn 23
Chương 5: Kết luận và đề xuất 26
5.1 Kết luận 26
5.2 Đề xuất 26
Tài liệu tham khảo 27
Phụ lục 29

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
v

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Tế bào hồng cầu 3
Hình 2.2 Tế bào lympho 4
Hình 2.3 Tiểu cầu 4
Hình 2.4 Bạch cầu đơn nhân 5
Hình 2.5 Bạch cầu trung tính 5
Hình 3.1 Thao tác lấy mẫu máu và trải mẫu 12
Hình 3.2 Buồng đếm hồng cầu 12
Hình 4.1 Biểu đồ so sánh số lượng hồng cầu giữa các nghiệm thức sau cho ăn
Antistress 14
Hình 4.2 Biểu đồ thể hiện sự biến động số lượng hồng cầu giữa các nghiệm thức
trước và sau cảm nhiễm 16
Hình 4.3 Các loại tế bào máu 21
Hình 4.4 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ chết giữa các nghiệm thức sau cảm nhiễm E.ictaluri
22
Hình 4.5 Kết quả phân lập vi khuẩn 24
Hinh 4.6 Kết quả nhuộm Gram 24
Hình 4.7 Kết quả test sinh hóa (OF, H
2
S, nitrate, indole) 24
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
vi
DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 4.1 Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu TTN và các NT sau cho ăn .15
Bảng 4.2A Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu của nghiệm thức I trước và sau
cảm nhiễm 17
Bảng 4.2B Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu của nghiệm thức II trước và sau
cảm nhiễm 18
Bảng 4.2C Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu của nghiệm thức III trước và
sau cảm nhiễm 18
Bảng 4.3D Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu của nghiệm thức IV trước và
sau cảm nhiễm 19
Bảng 4.3 Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu giữa các nghiệm thức sau cảm
nhiễm 20


PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
vii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT


Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri)
Trước cảm nhiễm (TCN)
Sau cảm nhiễm (SCN)
Trước thí nghiệm (TTN)
Đối chứng (ĐC)
Nghiệm thức (NT)
Tổng bạch cầu (TBC)
Hồng cầu (HC)
Tiểu cầu (T)
Tế bào lympho (L)
Tế bào mono (M)
Neutrophil (N)

Đại thực bào (ĐTB)


PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
1
CHƯƠNG I
GIỚI THIỆU
Cá tra được xem là loài cá kinh tế được nuôi phổ biến ở các tỉnh Đồng Bằng
Sông Cửu Long. Cá thịt không chỉ được tiêu thụ nội địa mà còn là mặt hàng
xuất khẩu lớn sang các nước Châu Âu và Mỹ. Hệ quả của việc nuôi cá tra phát
triển nhanh không theo quy hoạch dẫn đến hiện trạng bệnh trên cá nuôi hiện
nay xảy ra ngày càng nhiều, diễn biến ngày càng phức tạp hơn. Các bệnh
thường gặp trên cá tra như: bệnh do ký sinh trùng, vi khuẩn, bệnh do môi
trường, dinh dưỡng…trong đó bệnh mủ gan hay còn gọi là gan thận mủ do vi
khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra đang rất phổ biến, ảnh hưởng lớn đến giai
đoạn cá hương, cá giống và cả cá nuôi thương phẩm với tỉ lệ chết cao (10-
90%), gây thiệt hại lớn cho người nuôi (Từ Thanh Dung và ctv, 2004).
Theo tập quán sản xuất của người nuôi cá khi có bệnh là nghĩ ngay đến việc
dùng thuốc kháng sinh để điều trị và khi sử dụng lại không chú ý nhiều đến
hướng dẫn, công dụng, liều lượng và thời gian sử dụng. Việc sử dụng thuốc
kháng sinh trong một thời gian dài dẫn đến hiện tượng kháng thuốc, khi cá
phát bệnh sẽ mạnh hơn và việc điều trị khó khăn tốn kém hơn nhiều. Theo
điều tra của Nguyễn Tấn Duy Phong, (2008) trên cá tra nuôi ao thâm canh ở
hai tỉnh Cần Thơ và An Giang thì chi phí cho thuốc thú y thủy sản là rất lớn
(chiếm hơn 7% tổng chi phí sản xuất). Việc lạm dụng kháng sinh và thuốc thú
y thủy sản không chỉ tốn kém mà còn làm cho sản phẩm cá tra, basa của Việt
Nam gặp nhiều bất lợi khi xuất khẩu sang các thị trường trên thế giới. Để đảm
bảo sức khỏe của người tiêu dùng nói chung cũng như đáp ứng tốt các yêu cầu
và đòi hỏi ngày càng khắc khe của các thị trường thì việc hạn chế sử dụng
kháng sinh, lựa chọn những phương pháp phòng bệnh bằng các giải pháp tích

cực làm tăng cường sức đề kháng của cá nuôi đang được nhiều nhà khoa học
quan tâm. Do đó, việc cung cấp thức ăn đầy đủ dinh dưỡng cũng như lựa chọn
các sản phẩm bổ sung với thành phần chính là các vitamin và chất khoáng để
kích thích hệ thống miễn dịch của cá, đặc biệt là hệ thống miễn dịch không
đặc hiệu là một hướng đi tích cực trong việc phòng trị bệnh cá ngày nay.
Antistress là một hỗn hợp bao gồm vitamin C, β-glucan và khoáng selenium
hữu cơ được bổ sung vào thức ăn nhằm tăng cường sức kháng bệnh của cá tra.
Vấn đề được đặt ra cho nhà sản xuất là cần có sự đánh giá chính xác về hiệu
quả sử dụng cũng như liều lượng Antistress hợp lí cần bổ sung vào thức ăn.
Xuất phát từ những thực tế trên đề tài “Ảnh hưởng của Antistress lên khả năng
đề kháng Edwardsiella ictaluri của cá tra” được thực hiện.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
2
Với mục tiêu: tìm hiểu ảnh hưởng của Antistress lên khả năng đề kháng
Edwardsiella ictaluri của cá tra.
Nội dung đề tài:
1. Ảnh hưởng của Antistress lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra.
2. Hiệu quả sử dụng Antistress qua cảm nhiễm với vi khuẩn Edwardsiella
ictaluri.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
3
CHƯƠNG II
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan trên cá tra
E. ictaluri là vi khuẩn hình que, gram âm, không di động, lên men, không oxy
hóa, oxidase âm tính, cho phản ứng catalase dương. Các chỉ tiêu sinh hóa của
E. ictaluri đều âm tính, riêng lysine và glucose cho phản ứng dương tính
Cá tra bị bệnh thường không có biểu hiện bất thường bên ngoài. Ở giai đoạn
sớm cá vẫn còn bắt mồi. Tuy nhiên khi bệnh nặng, cá gầy, bơi lờ đờ, da nhợt
nhạt, có hiện tượng xuất huyết trên da và hậu môn. Bên trong nội quan (gan,

thận, tỳ tạng) xuất hiện những đốm trắng đường kính 1-3 mm, các cơ quan này
sưng to và có hiện tượng nhũng ở thận.
Bệnh thường xuất hiện vào mùa lũ cao điểm tháng 7 và tháng 8, gây thiệt hại
lớn cho nghề nuôi cá tra công nghiệp ở An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ.
Bệnh gây tỉ lệ hao hụt cao ở cá hương, cá giống (10-90%), (Từ Thanh Dung
và ctv, 2004).
Bệnh lí và sự thay đổi các chỉ tiêu huyết học
Máu là thành phần quan trọng trong hệ tuần hoàn của tất cả các cơ thể sống.
Thành phần các tế bào máu của hệ tuần hoàn cá trơn bao gồm hồng cầu, tế bào
lympho, tiểu cầu, tế bào mono và các loại bạch cầu trung tính có hạt.
Hồng cầu (Erythrocyte)
Hồng cầu trưởng thành ở cá có hình tròn hoặc hình oval với nhân bắt màu đậm
và kích thước từ 10x11µm-12x13µm, đường kính nhân 4-5µm. Hồng cầu chưa
trửơng thành ít được tìm thấy trong vòng tuần hoàn máu, kích thước giống
hồng cầu trưởng thành nhưng nhân lớn hơn. Tế bào chất bắt màu xanh nhạt
hoặc xám bởi thuốc nhuộm Wright và Giemsa (Chinabut et al, 1991).

Hình 2.1 Tế bào hồng cầu của cá trê trắng (Chinabut et al, 1991)
E: hồng cầu thành thục
R: hồng cầu chưa thành thục
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
4
Tế bào lympho (lymphocyte)
Tế bào lympho ở cá da trơn nhỏ hơn hồng cầu, kích thước biến động 6-11µm.
Tế bào có hình tròn, nhân chiếm toàn bộ tế bào bắt màu tím đậm khi nhuộm
với Giemsa, tế bào chất nhỏ không rõ ràng và thường bắt màu xanh nhạt.


Hình 2.2 Tế bào lympho của cá trê trắng (Chinabut et al, 1991)
Tiểu cầu (thrombocyte)

Hình dạng thay đổi, có thể là hơi tròn, dài hoặc hình thoi. Có vành mỏng của
tế bào chất bao quanh nhân. Tế bào chất có màu xanh nhạt khi nhuộm với
dung dịch Wright and Giemsa. Tiểu cầu tham gia vào quá trình đông máu
trong trường hợp bị tổn thương (Chinabut et al, 1991).


Hình 2.3 Tiểu cầu của cá trê trắng (Chinabut et al, 1991)
Bạch cầu đơn nhân (monocyte)
Bạch cầu đơn nhân là tế bào lớn nhất trong các dạng tế bào máu với đường
kính 10-14µm, hình dạng không đều, chúng có tâm lệch, trong tế bào chất tồn
tại những không bào có nhiều kích thước khác nhau. Nhân bắt màu xanh, tế
bào chất bắt màu xanh nhạt (Chinabut et al, 1991).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
5

Hình 2.4 Bạch cầu đơn nhân của cá trê trắng (Chinabut et al, 1991)
Bạch cầu trung tính (neutrophil)
Tế bào lớn và tròn đường kính nhân 9-13µm với số lượng lớn của những hạt
nhỏ trong tế bào chất màu xanh nhẹ hoặc hơi hồng. Nhân bắt màu xanh đậm,
chia hai thuỳ ở tế bào thành thục và dạng tròn lệch tâm ở dạng chưa trưởng
thành (Chinabut et al, 1991)

Hình 2.5 Bạch cầu trung tính của cá trê trắng (Chinabut et al, 1991)
Không có bạch cầu ái toan hay bạch cầu ái kiềm được ghi nhận ở tế bào máu
ngoại vi của cá trê, nhưng Williams and Waner (1976) đã tìm được 2 loại bạch
cầu này trong máu cá nheo (Chinabut et al, 1991).
Trần Hồng Ửng (2003) đã xác định sự thay đổi số lượng tế bào bạch cầu và
mô tỳ tạng trên cá tra (P. hypophthalmus) bệnh trắng gan. Kết quả nghiên cứu
cho thấy tỉ lệ tế bào lympho của cá bệnh giảm so với cá khỏe nhưng tỉ lệ bạch
cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính thì tăng cao hơn. Điều này chứng tỏ khi

cá bị nhiễm vi khuẩn gây bệnh thì trước hết hệ miễn dịch không đặc hiệu sẽ
hoạt động do thành phần chính của hệ miễn dịch không đặc hiệu là bạch cầu
đơn nhân và bạch cầu trung tính. Bạch cầu toan tính và bạch cầu kiềm tính có
xuất hiện ở cá bệnh nhưng không có ở cá khỏe.
Nghiên cứu cấu trúc mô và sự biến động số lượng tế bào hồng cầu trên cá tra
(P. hypophthalmus) bị bệnh vàng da của Phan Thị Hừng (2004). Nghiên cứu
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
6
cho thấy số lượng hồng cầu ở cá bệnh giảm hơn 50% so với cá khỏe, hồng cầu
ở cá bệnh bị thoái hóa, khó phân biệt tế bào chất và nhân hoặc có những tế bào
chỉ còn nhân, không còn tế bào chất.
Theo Benli and Yildiz (2004) nghiên cứu về sự thay đổi các chỉ tiêu huyết học
trên cá rô phi ảnh hưởng bởi Edwardsiella tarda. Kết quả ghi nhận ở cá bệnh
tổng bạch cầu tăng từ 12.00 ± 0,82 (x10
3
µl
-1
) ở cá khỏe và cá bệnh là 21.75 ±
2.82 (x10
3
µl
-1
) và có sự giảm số lượng hồng cầu ở cá bệnh so với cá khỏe và
sự thay đổi này là có ý nghĩa thống kê.
Phạm Thanh Hương (2006) xác định một số yếu tố huyết học trên cá tra bệnh
vàng da ở Cần Thơ. Nghiên cứu cũng cho thấy sự giảm trong số lượng hồng
cầu, tế bào lympho và tiểu cầu. Trong khi đó tổng bạch cầu, bạch cầu đơn
nhân và bạch cầu trung tính lại tăng. Tuy nhiên, sự thay đổi số lượng tổng
bạch cầu, tế bào lympho và tiểu cầu lại không có ý nghĩa thống kê.
Theo Nguyễn Thị Thuý Liễu (2008) cũng có sự thay đổi rõ rệt về số lượng các

tế bào máu giữa cá tra khỏe và cá tra bị mủ gan. Sự thay đổi này biểu thị cho
phản ứng bảo vệ không đặc hiệu của cá khi bị mầm bệnh tấn công. Số lượng
hồng cầu trên cá khỏe là 2,05x10
6
tế bào/mm
3
, còn trên cá bệnh là 0,75x10
6
tế
bào/mm
3
, giảm 63,4% so với cá khỏe. Đồng thời có sự xuất hiện hồng cầu
nhiều nhân và hồng cầu không nhân ở cá bệnh. Số lượng bạch cầu trung tính
và bạch cầu đơn nhân trên cá bệnh tăng cao nhưng chỉ có sự tăng của bạch cầu
trung tính là có ý nghĩa thống kê.
Một số thí nghiệm gây cảm nhiễm gần đây
Williams & Lawrence (2005) đã sử dụng vi khuẩn E. ictaluri R4383 WT và
R4383 HM với nồng độ lần lượt là 7,0x10
7
CFU/ml và 7,2x10
7
CFU/ml ngâm
trên cá nheo Mỹ trong thời gian 30 phút, tỉ lệ chết là 90% và 85%. Đồng thời,
tác giả cũng sử dụng phương pháp tiêm vi khuẩn E. ictaluri để so sánh với
phương pháp ngâm với mật độ vi khuẩn tăng dần. Đối với vi khuẩn E. ictaluri
R4383 WT tiêm với mật độ 5,2x10
3
CFU/ml, 5,2x10
4
CFU/ml, 5,2x10

5
CFU/ml thì tỉ lệ chết lần lượt là 67,2%, 100%, 100%. Trong khi đó, tiêm E.
ictaluri R4383 HM với mật độ vi khuẩn là 5,2x10
3
CFU/ml, 5,2x10
4
CFU/ml,
5,2x10
5
CFU/ml và 5,2x10
6
CFU/ml gây chết 63,5%, 98,7%, 100%, 100%.
Qua kết quả thí nghiệm, họ kết luận rằng không có sự khác nhau giữa hai
phương pháp ngâm và tiêm.
Lương Trần Thục Đoan (2006) đã chứng minh ngâm cá tra với mật độ vi
khuẩn E. ictaluri từ 1x10
5
CFU/ml đến 1x10
7
CFU/ml trong một giờ, thời gian
theo dõi 10 ngày thì tỉ lệ chết cao nhất ở 1x10
7
CFU/ml là 75% cá thí nghiệm.
Trong khi đó ở phương pháp tiêm thì ở mật độ vi khuẩn 1x10
5
CFU/ml đã đủ
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
7
mạnh để giết chết 100% cá thí nghiệm trong vòng 5 ngày và kết luận rằng
phương pháp tiêm vi khuẩn chết nhanh hơn phương pháp ngâm vi khuẩn trong

vòng một giờ.
Ngô Minh Dung (2007) với mã vi khuẩn E. ictaluri: Tỷ-PTK 207 bằng
phương pháp tiêm đã xác định được chủng vi khuẩn gây cảm nhiễm có giá trị
LD50=10
6,5
CFU/ml và cá có thời gian biểu hiện bệnh lí sớm nhất ở nghiệm
thức 10
8
cfu/ml sau 37 giờ.
Sản phẩm Antistress và vai trò của vitamin, chất khoáng đối với sức
khỏe của cá.
Thành phần trong 6kg của Antistress
- Selenium hữu cơ: 1kg
- Stay C (vitamin C): 1kg
- B. Glucan: 2kg
- FC 20: 2kg
Selenium
Selenium là một dạng khoáng hữu cơ tăng khả năng đề kháng bệnh và hoạt
động của một số emzym. Là một trong những yếu tố khoáng vi lượng chiếm tỉ
lệ rất thấp trong cơ thể cá nhưng lại rất cần thiết cho hoạt động sống của cá.
Vitamin C
Vitamin C có dạng tinh thể màu trắng, dễ tan trong nước, dễ hấp thụ qua niêm
mạc ruột, không tích lũy trong cơ thể, thải trừ nhanh. Nhưng vitamin C dễ bị
phân hủy, mất tác dụng dưới tác dụng của nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm và sự oxy
hóa. Có 4 loại vitamin C thường được dùng trong nuôi trồng thủy sản là: L
Ascorbyl-2 Monophosphate, L Ascorbyl-2 Diphosphate, L Ascorbyl -2
Triphosphate, L Ascorbyl-2 Sulphate (Trần Thị Thanh Hiền, 2004)
Theo Dabrowki (1990) Vitamin C được xác định là rất quan trọng cho động
vật thủy sản bởi vì trong khi hầu hết các động vật khác có khả năng tổng hợp
vitamin C từ glucuronic acid thì cá và giáp xác lại thiếu enzim gulonolactone

oxidase cần thiết cho bước cuối cùng của quá trình tổng hợp. Chính vì vậy
vitamin C của động vật thủy sản chủ yếu hấp thu từ thức ăn (trích dẫn bởi
Trần Thị Thanh Hiền, 2004)
Việc cung cấp thức ăn thiếu vitamin C hay do tình trạng cơ thể bị stress vì
điều kiện môi truờng hay cơ thể bị mắc bệnh hậu quả dẫn đến tình trạng cơ thể
bị suy giảm hệ thống miễn dịch, làm cho cơ thể cá dễ bị nhiễm bệnh và không
có khả năng hồi phục lại chức năng bình thường của cơ thể. Vitamin C được
ghi nhận là có vai trò quan trọng trong trao đổi chất, nó tham gia vào quá trình
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
8
sinh trưởng và phát triển của sinh vật bởi việc tạo thành collagen, tăng cường
các phản ứng miễn dịch và sức đề kháng bệnh của tôm cá. (Phạm Khắc Hiếu
(1997) trích dẫn bởi Nguyễn Kim Kha, 2006).
Theo Lương Thanh Trúc (2000) có sự sai khác có ý nghĩa giữa tỉ lệ cảm nhiễm
kí sinh trùng và tỉ lệ chết giữa nghiệm thức bổ sung 2000, 4000mg vitamin
C/kg thức ăn so với nghiệm thức đối chứng.
Beta glucan
Beta glucan là một polysaccharide được ly trích từ hạt ngũ cốc hay từ men
bánh mì. Beta glucan làm tăng khả năng thực bào của tế bào bạch cầu. Do khả
năng tăng cường miễn dịch không đặc hiệu, beta glucan từ lâu đã được chế
biến và sử dụng trong dược phẩm cho người và ngành chăn nuôi.
Kumari and Sahoo (2006) nghiên cứu về khả năng miễn dịch bẩm sinh và
kháng bệnh ở cá trê có chế độ ăn β- 1,3 glucan. Tác giả ghi nhận rằng với mức
glucan 0,1% trong thức ăn có sự khác biệt về sự nâng cao MPO, lysozyme, O
-

và khả năng bảo vệ của huyết thanh chống lại Aeromonas hydrophila. Ở chế
độ cho ăn glucan 0,1% trên 1 tuần có khả năng nâng cao khả năng miễn dịch
không đặc hiệu và kháng bệnh của cá trơn một cách hiệu quả. Theo Saurabh
and Sahoo (2008) lysozyme là phần tử bảo vệ quan trọng trong hệ thống miễn

dịch không đặc hiệu của cá được tìm thấy trong dịch nhày, tế bào lympho,
plasma và dịch lỏng ở cá.
Theo Welker et al (2007) cá cho ăn thức ăn bổ sung thành phần men phụ có sự
pha trộn β-glucan có tỉ lệ sống sau khi nhiễm E. ictaluri là 5-17% cao hơn cá
ở nghiệm thức đối chứng và có sự giảm stress ở cá có cho ăn thức ăn bổ sung
thành phần men phụ có sự pha trộn β-glucan.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
9
CHƯƠNG 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian thực hiện đề tài
Đề tài được thực hiện từ tháng 11/2008 đến tháng 05/2009.
3.2 Địa điểm nghiên cứu
- Thí nghiệm cho cá ăn với các hàm lượng Antistress khác nhau được bố
trí tại trại thực nghiệm khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ.
- Thí nghiệm gây cảm nhiễm tại phòng gây cảm nhiễm Khoa Thủy Sản,
Đại Học Cần thơ.
- Phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học và bệnh thủy sản,
khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ.
3.3 Vật liệu nghiên cứu
3.3.1 Đối tượng nghiên cứu
- Cá tra giống có khối lượng trung bình 12g/con.
- Nguồn vi khuẩn: chủng Edwardsiella ictaluri CAF255 từ bộ sưu tập vi
khuẩn trong tủ -80
o
, khoa Thủy Sản, trường Đại Học Cần Thơ.
3.3.2 Dụng cụ và thiết bị
Kính hiển vi, nồi Autolaves, cân điện tử (hai số lẻ), bếp khuấy gia nhiệt, tủ cấy
vô trùng, lọ nhuộm tiêu bản, lame và lamen, pipet, micro pipet, đầu col 1mL
và 0,1mL, buồng đếm hồng cầu, bể composite, máy sục khí. Đĩa Petri, ống

nghiệm, que cấy, bao tay, đèn cồn, bình xịt cồn, khay nhựa, viết lông dầu, chai
thủy tinh, bình tam giác, kim tiêm 1ml, ống nghiệm nhựa 5ml và giá ống
nghiệm
3.3.3 Hóa chất
NaCl, Na
2
SO
4
, Na
2
HPO
4
.2.H
2
O, NaH
2
PO
4
.2H
2
O, KH
2
PO
4
, formaline (37%),
Chlorin , methyl violet, nước cất, methanol, glycerol, bột Wright, bột Giemsa,
acid citric, môi trường tripticase soy agar (TSA), nutrient broth (NB), cồn 96°,
cồn 70°, dung dịch nhuộm gram, giấy test oxidase, H
2
0

2

3.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Thí nghiệm cho ăn thức ăn bổ sung Antistress
Bố trí thí nghiệm
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
10
Thí nghiệm được bố trí với 4 nghiệm thức thức ăn có cùng mức protein, acid
amin và năng lượng. Mỗi nghiệm thức được lập lại 3 lần
Nghiệm thức 1: Thức ăn có 0% Antistress
Nghiệm thức 2: Thức ăn có 0,2% Antistress
Nghiệm thức 3: Thức ăn có 0,4% Antistress
Nghiệm thức 4: Thức ăn có 0,6% Antistress
Cá được cho ăn 2 lần/ngày.
Thời gian thí nghiệm trong 8 tuần
Thí nghiệm được thực hiện trên hệ thống bể composite (500L/bể), nước chảy
tràn có sục khí. Mật độ cá thí nghiệm 50 con /bể.
Các chỉ tiêu thu thập
Kết thúc 8 tuần cho ăn thức ăn, thu mẫu huyết học ngẫu nhiên 3con/bể để so
sánh số lượng hồng cầu, bạch cầu, đại thực bào giữa các nghiệm thức.
3.4.2 Thí nghiệm gây cảm nhiễm với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
Chuẩn bị thí nghiệm
Bể thí nghiệm
- Nước cung cấp cho thí nghiệm được xử lí bằng Chlorin 30 ppm và sục
khí mạnh trong vòng 3-4 ngày.
- Bể, lưới che, vợt dùng trong thí nghiệm được xử lí bằng Chlorin 10%
và làm sạch bằng xà phòng và nước trước khi sử dụng.
Vi khuẩn cảm nhiễm
Vi khuẩn E. ictaluri CAF 255 được phục hồi trên môi trường TSA và giữ
trong tủ ấm 48 giờ ở 28

0
C. Kiểm tra tính thuần thông qua các đặc điểm hình
thái của khuẩn lạc, hình dạng và kích thước của vi khuẩn, tính gram của vi
khuẩn cũng như việc kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản (phản ứng oxidase, catalase,
tính di động, phản ứng decarboxylase, khả năng lên men và oxi hóa đường
glucose (Fermentation /Oxidation: O/F).
Khi vi khuẩn đã thuần thì chọn hai khuẩn lạc đồng nhất để nuôi tăng sinh
trong 30ml môi trường NB ở 28
0
C trong 48 giờ. Sau đó, vi khuẩn sẽ được
chuyển qua ống Falcon đã tiệt trùng. Li tâm ở 4.000rpm với nhiệt độ là 4
0
C
trong 5 phút. Rửa qua nước muối sinh lí 2-3 lần. Lần cuối vortex hòa tan nước
muối và vi khuẩn. Đo mật độ vi khuẩn ở bước sóng 610nm (OD =1) tương
đương mật độ 10
9
cfu/mL. Pha loãng mật độ vi khuẩn về 10
6
cfu/mL.


PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
11
Kiểm tra lại mật số vi khuẩn trên môi trường đĩa TSA
Nồng độ vi khuẩn đã sử dụng 1,2x10
6
cfu/mL.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí với 5 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức được lập lại 3 lần

1. Nghiệm thức 1: gây cảm nhiễm, cá đã sử dụng thức ăn có 0%
Antistress.
2. Nghiệm thức 2: gây cảm nhiễm, cá đã sử dụng thức ăn có 0,2%
Antistress.
3. Nghiệm thức 3: gây cảm nhiễm, cá đã sử dụng thức ăn có 0,4%
Antistress.
4. Nghiệm thức 4: gây cảm nhiễm, cá đã sử dụng thức ăn có 0,6%
Antistress
5. Nghiệm thức đối chứng: tiêm nước muối sinh lí, cá đã sử dụng thức ăn
có 0% Antistress.
Cá được tiêm 0,1 ml dung dịch vi khuẩn ở các nghiệm thức gây cảm nhiễm và
0,1 ml nước muối sinh lí ở nghiệm thức đối chứng. Cá được cho ăn theo nhu
cầu. Mật độ cá bố trí thí nghiệm là 10 con/bể
Các chỉ tiêu thu thập
Thu mẫu huyết học cá mới chết khoảng 3con/bể để so sánh số lượng hồng cầu,
bạch cầu, đại thực bào giữa các nghiệm thức.
Theo dõi và ghi nhận tỉ lệ chết sau cảm nhiễm ở các nghiệm thức.
Phân lập vi khuẩn từ gan, thận của cá mới chết sau cảm nhiễm.
3.4.3 Phương pháp lấy mẫu máu
Dùng ống tiêm tiệt trùng 1ml lấy máu ở động mạch đuôi của cá (lượng máu tối
thiểu là 0,3ml). Nhỏ máu xuống lam, dùng pipet cho 10µl máu vào ống
nghiệm nhựa có chứa 1990µl dung dịch Natt & Herrick và đếm hồng cầu bằng
buồng đếm. Tiếp tục nhỏ một giọt máu lên một góc lame khác (lập lại 3 lần)
cho thao tác trãi mẫu để đếm bạch cầu.
Trãi mẫu máu: cho lamelle chạm vào giọt máu, đẩy lamelle ngược về phía
trước (Hình 3.1). Mẫu máu sau khi khô được cố định bằng cách ngâm trong
methanol 1-2 phút (Rowley, 1990 trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thúy Liễu, 2008).
Để mẫu khô tự nhiên và trữ lạnh.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

12

Hình 3.1 Thao tác lấy mẫu máu và trải mẫu (Đoàn Nhật Phương, 2007)
3.4.3 Phương pháp đếm hồng cầu
Lắc nhẹ cho đều ống nghiệm. Mật độ hồng cầu sẽ được xác định bằng buồng
đếm hồng cầu thông qua sự quan sát dưới kính hiển vi quang học (40X). Đầu
tiên xem ở vật kính 10X, định vị 5 vùng đếm (vùng ký hiệu chữ C), đưa vào
giữa thị trường, chuyển sang vật kính 40X. Đếm 2 lần lặp lại.

Hình 3.2 Buồng đếm hồng cầu (Đoàn Nhật Phương, 2007)
Cách tính mật độ hồng cầu: HC = C x 10 x 5 x 200 (tb/mm
3
)
Trong đó C là tổng số hồng cầu trên 5 vùng đếm.
3.4.4 Định lượng và định loại các tế bào bạch cầu
v Nhuộm mẫu
Mẫu máu đã được cố định trên lame sẽ nhuộm bằng dung dịch nhuộm Wright
& Giemsa (Chinabut et al, 1991). Cách chuẩn bị dung dịch thuốc nhuộm được
trình bày ở phụ lục 1.
- Nhuộm với dung dịch Wright trong 3-5 phút.
- Ngâm trong dung dịch pH 6,2 – 6,8 trong 5 -6 phút.
- Nhuộm với dung dịch Giemsa trong 20 – 30 phút.
- Ngâm trong dung dịch pH 6,2 trong 15 – 30 phút.
Lamelle

Lame

10X
40X

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
13
- Rửa sạch lại bằng nước cất, để mẫu khô tự nhiên và đọc mẫu.
Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính X100. Định loại các tế bào máu theo mô
tả các tế bào máu trên cá trê trắng của Chinabut et al (1991).
v Đọc kết quả
Đọc mẫu theo hình Z-Z
Tổng bạch cầu (TBC) (Đoàn Nhật Phương, 2007)
Đếm tổng số hồng cầu và bạch cầu trên 1.500 tế bào trên mẫu nhuộm.
TBC (tb/mm
3
) = (số bạch cầu x mật độ hồng cầu trên buồng đếm)/số hồng cầu
trên mẫu
Từng loại bạch cầu (Đoàn Nhật Phương, 2007)
Đếm tổng số bạch cầu bằng 200 tế bào.
Mật độ từng loại bạch cầu (tb/mm
3
) = (số lượng mỗi loại BC x mật độ
TBC)/200
3.4.5 Phân lập và tái định danh vi khuẩn
Vi khuẩn được định danh qua các thao tác: nhuộm gram, phản ứng oxidase,
phản ứng catalase, kiểm tra tính di động, khả năng lên men và oxi hóa đường
glucose (Fermentation /Oxidation: O/F), khả năng sinh indole, khả năng sinh
H
2
S, phản ứng VP (voges-proskauer), phản ứng nitrate và kết quả PCR.
3.5 Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả các số liệu về huyết học được xử lý bằng phần mềm excel 2003 với
phép xử lý thống kê t-test ở mức ý nghĩa 0,05%.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

14

CHƯƠNG IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Thí nghiệm cho ăn thức ăn bổ sung Antistress
Sau 8 tuần cho ăn thức ăn, cá tra giống ngẫu nhiên thu 3 con/bể để xác định và
so sánh số lượng hồng cầu và các loại bạch cầu giữa các nghiệm thức cho ăn
khác nhau.
4.1.1 Về hồng cầu
Kết quả định lượng cho thấy số lượng hồng cầu ở các nghiệm thức tăng dần
theo hàm lượng Antistress được bổ sung vào thức ăn và cao hơn so với trước
thí nghiêm cho ăn (Hình 4.1).
Số liệu hồng cầu sau khi cho ăn Antistress
2100000
2200000
2300000
2400000
2500000
2600000
2700000
2800000
TTNIIIIIIIV
Nghiệm thức
tế bào/ml

Hình 4.1 Biểu đồ so sánh số lượng hồng cầu giữa các nghiệm thức sau cho ăn
Antistress
TTN: trước thí nghiệm; I: thức ăn bổ sung 0% Antistress; II: bổ sung 0,2% Antistress
III: bổ sung 0,4% Antistress; IV: bổ sung 0,6% Antistress
Số lượng hồng cầu tăng có ý nghĩa thống kê ở nghiệm thức bổ sung 0,4% và

0,6%Antistress (2,69x10
6
tb/mL và 2,68.10
6
tb/mL) so với nghiệm thức đối
chứng (2,31.10
6
tb/mL) và trước cho ăn (2,39.10
6
tb/mL). Giữa các nghiệm
thức sau khi cho ăn Antistress, các nghiệm thức có bổ sung Antistress có hồng
cầu cao hơn nghiệm thức đối chứng nhưng chỉ nghiệm thức bổ sung 0,4% và
0,6%Antistress là khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
15
Nhìn chung, các số liệu này đều cao hơn so với báo cáo của Nguyễn Thị Thúy
Liễu (2008) và Dương Thành Long (2008) trên cá tra khỏe là 2,05x10
6
tế
bào/mL và 1,86x10
6
tế bào/mL.
4.1.2 Bạch cầu
Tổng bạch cầu, tế bào lympho, tiểu cầu cũng tăng sau 8 tuần ở các nghiệm
thức cho ăn khác nhau. Nhưng sự tăng của các tế bào này chỉ có ý nghĩa thống
kê ở nghiệm thức bổ sung 0,2% Antistress. Riêng bạch cầu trung tính ở các
nghiệm thức lại giảm thấp so với trước cho ăn (Bảng 4.1).
Bảng 4.1 Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu TTN và các NT sau cho ăn

Loại tế bào

(x10
3
/mm
3
)

TTN
NT I NT II NT III
NT IV
TBC
T
L
N
M

107,9 ± 31
a
35,7 ±

11,3
a
68,1

± 24,1
a
3

±

1,7
a
1,1

±

1
a


121,3 ± 44
ab
46,9 ±

16,3
ab
72,5

± 29,8
ab
0,7

±

0,8
b
1

±

1,1
a

149,3± 46
b
52,7 ±

19,1
b
94,9

± 29,3
b
0,7

±

0,8
b
1,1

±0,7
a

111,3± 53
ab
34,9 ±

16,8
ab

74,6

± 41,5
ab
1,2

±

1,9
b
0,6

±0,7
a

148,9

± 76
ab
54,2

± 36,2
ab
92,2

± 43,2
ab
0,7

± 0,9

b
1,8

± 1,6
a

TNN: Trước thí nghiệm; NT: Nghiệm thức
NT I: Thức ăn bổ sung 0% Antistress
NT II: Thức ăn bổ sung 0,2% Antistress
NT III: Thức ăn bổ sung 0,4% Antistress
NT IV: Thức ăn bổ sung 0,6% Antistress
TBC : Tổng bạch cầu; T: tiểu cầu; L: lympho bào; N: neutrophil; M: mono bào
Giá trị thể hiện trên Bảng là giá trị trung bình và độ lệch chuẩn
Các giá trị trong cùng 1 hàng có các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê
(p<0,05).
Tuy nhiên, xét về mặt số lượng thì tổng bạch cầu, tiểu cầu vẫn cao nhất ở
nghiệm thức bổ sung 0,2% Antistress là 149x10
3
tb/ml và 42,7x10
3
tb/ml; bạch
cầu trung tính cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,4% Antistress là
1,2x10
3
tb/ml; tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân lại cao nhất ở nghiệm thức bổ
sung 0,6% Antistress là 92 x10
3
tb/ml và 1,8 x10
3
tb/ml.

Về tổng bạch cầu, tế bào lympho, tiểu cầu, bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn
nhân tuy có sự chênh lệch nhưng khác biệt này không có ý nghĩa giữa các
nghiệm thức (Bảng 4.1).
Tương tự như báo cáo của Liu (1989) khi thí nghiệm trên cá nheo bổ sung
vitamin C lần lượt theo nồng độ 0, 100, 500, 1000 và 4000 mg/kg thức ăn
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
16
trong 9 tuần nhận xét không có sự khác biệt ý nghĩa về tăng trọng cũng như
huyết cầu giữa các nghiệm thức cho ăn khác nhau.
4.2 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
4.2.1 Hồng cầu
Có sự giảm đáng kể số lượng hồng cầu trong cùng nghiệm thức trước và sau
khi gây cảm nhiễm (Hình 4.2). Số lượng hồng cầu ở các nghiệm thức giảm chỉ
bằng 45,7-61,6% so với trước cảm nhiễm. Giữa các nghiệm thức có gây cảm
nhiễm, hồng cầu cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,6% Antistress là
1,47x10
6
tb/ml và thấp nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,2% Antistress là
1,2 x10
6
tb/ml. Số lượng hồng cầu ở các nghiệm thức gây cảm nhiễm với vi
khuẩn thấp hơn nhiều so với đối chứng (-) tiêm nước muối sinh lí. Tuy nhiên,
sự khác biệt về hồng cầu ở các nghiệm thức sau cảm nhiễm đều không có ý
nghĩa thống kê.
Biến động số lượng hồng cầu trước và sau cảm nhiễm
0
500000
1000000
1500000
2000000

2500000
3000000
TTNIIIIIIIVDC(-)
Tên nghiêm thức
tế bào/ml
TCN
SCN

Hình 4.2 Biểu đồ thể hiện sự biến động số lượng hồng cầu giữa các nghiệm
thức trước và sau cảm nhiễm
TCN: trước cảm nhiễm
SCN: sau cảm nhiễm
NT I: Thức ăn bổ sung 0% Antistress
NT II: Thức ăn bổ sung 0,2% Antistress
NT III: Thức ăn bổ sung 0,4% Antistress
NT IV: Thức ăn bổ sung 0,6% Antistress
DC(-): Đối chứng tiêm nước muối sinh lí
Kết quả này cũng tương tự như báo cáo Trần Hồng Ửng (2003), Phan Thị
Hừng (2004) và Nguyễn Thị Thúy Liễu (2008) là có sự giảm đáng kể số lượng
hồng cầu dưới tác dụng của vi khuẩn gây bệnh. Song, không có sự khác biệt ý
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version