Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống cây địa hoàng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào giai đoạn phòng thí nghiệm

1
TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG
KHOA NÔNG - LÂM - NGƢ

VŨ THỊ HUYỀN

NGHIÊN CỨU HỒN THIỆN QUY TRÌNH
NHÂN GIỐNG CÂY ĐỊA HỒNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP
NI CẤY MƠ TẾ BÀO GIAI ĐOẠN PHỊNG THÍ NGHIỆM

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành Khoa học Cây trồng

Phú Thọ, 2017


2
TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG
KHOA NÔNG - LÂM - NGƢ

VŨ THỊ HUYỀN

NGHIÊN CỨU HỒN THIỆN QUY TRÌNH
NHÂN GIỐNG CÂY ĐỊA HỒNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP
NI CẤY MƠ TẾ BÀO GIAI ĐOẠN PHỊNG THÍ NGHIỆM

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành Khoa học Cây trồng

NGƢỜI HƢỚNG DẪN: 1. TS. PHẠM THANH LOAN
2. THS HÀ THỊ TÂM TIẾN

Phú Thọ, 2017


i
LỜI CẢM ƠN
Đƣợc sự phân công của Khoa Nông - Lâm - Ngƣ, Trƣờng Đại học
Hùng Vƣơng tơi đã hồn thành khóa luận tốt nghiệp tại Trƣờng Đại học Hùng
Vƣơng. Để hồn thành khóa luận này, tơi xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn
tới các thầy, cơ giáo Khoa Nông - Lâm - Ngƣ, trƣờng Đại học Hùng Vƣơng
đã giúp đỡ, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tơi trong q trình
thực hiện khóa luận.
Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Phạm Thanh Loan, Trƣởng
khoa Nông - Lâm - Ngƣ, ThS Hà Thị Tâm Tiến, giảng viên khoa Nông - Lâm
- Ngƣ, ngƣời đã hƣớng dẫn đề tài khóa luận, tận tình chỉ bảo, động viên và
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập và viết khóa luận.
Cuối cùng, với tất cả lịng kính trọng và sự biết ơn, tơi xin gửi lời cảm ơn
sâu sắc đến gia đình, bạn bè và ngƣời thân đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ và
tạo động lực cho tơi để tơi có thể hồn thành báo cáo này một cách tốt nhất.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Phú Thọ, ngày

tháng năm 2017

Sinh viên

Vũ Thị Huyền


ii

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan tồn bộ Thí nghiệm, kết quả Thí nghiệm do chính tơi
trực tiếp thực hiện. Các số liệu và kết quả trong báo cáo khóa luận này là
trung thực và chƣa công bố trên bất kì cơng trình nghiên cứu nào khác.
Tơi xin cam đoan rằng các thơng tin, tài liệu đƣợc trích dẫn trong báo
cáo này đều đƣợc ghi nguồn gốc rõ ràng.
Phú Thọ, ngày

tháng năm 2017

Sinh viên

Vũ Thị Huyền


iii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. ii
MỤC LỤC ........................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................... v
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ vi
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ vii
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 3
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn....................................................................... 3
3.1. Ý nghĩa khoa học ........................................................................................ 3
3.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4

1.1. Tổng quan về cây Địa hoàng...................................................................... 4
1.1.1. Đặc điểm thực vật học............................................................................. 4
1.1.2. Điều kiện sinh thái ................................................................................... 4
1.2. Tổng quan về phƣơng pháp nhân giống nuôi cấy mô tế bào ..................... 8
1.2.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nhân giống nuôi cấy mô tế bào ........ 9
1.2.2. Môi trường nuôi cấy mô tế bào ............................................................. 11
1.2.3. Các giai đoạn nuôi cấy ......................................................................... 12
1.2.4. Các điều kiện nuôi cấy in vitro ............................................................... 14
1.2.5. Chất điều hòa sinh trưởng .................................................................... 16
1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nƣớc .............................................. 17
1.3.1. Tình hình nghiên cứu ngồi nước ......................................................... 17
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước.......................................................... 20
Chƣơng 2. Đ I TƢ NG, PHẠM VI, N I DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ................................................................................................ 22
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................... 22
2.2. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................. 22


iv
2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 22
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 22
2.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm ............................................................. 22
2.4.2. Phương pháp xử lý số liệu..................................................................... 26
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 27
3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của hóa chất khử trùng và thời gian khử
trùng đến mẫu cấy ........................................................................................... 27
3.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nền nuôi cấy đến sự nảy chồi của lát cắt củ Địa
hoàng................................................................................................................ 29
3.3. Ảnh hƣởng của Kinetin đến sự nhân chồi của Địa hoàng in vitro ........... 31
3.4. Ảnh hƣởng phối hợp của Kinetin và BAP đến sự nhân chồi của Địa

hoàng in vitro .................................................................................................. 35
3.5. Ảnh hƣởng của IAA đến sự tạo rễ cây Địa hoàng in vitro ...................... 39
3.5.1. Ảnh hưởng của IAA đến tỷ lệ cây ra rễ ................................................. 39
3.5.2. Ảnh hưởng của IAA đến số rễ trung bình/cây và chiều dài rễ .............. 40
3.6. Ảnh hƣởng phối hợp của IAA và NAA đến sự tạo rễ của cây Địa hoàng
in vitro ............................................................................................................. 42
3.6.1. Ảnh hưởng phối hợp của IAA và NAA đến tỷ lệ cây ra rễ .................... 42
3.6.2. Ảnh hưởng phối hợp của IAA và NAA đến số rễ trung bình/cây và chiều
dài rễ................................................................................................................ 44
KẾT LUẬN ..................................................................................................... 47
KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 48


v
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Nội dung

BAP

Benzylaminopurine

CT

Cơng thức

ĐC

Đối chứng

IAA

Indole-3-acetic acid

MS

Murashige and Skoog

NAA

Naphthalene Acetic Acid

TB

Trung bình

VW

Vaccin and Went


vi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của phƣơng pháp khử trùng đến sự tạo chồi Địa hoàng
in vitro sau 2 tuần nuôi cấy ............................................................................. 27
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng ni cấy đến sự nảy chồi của Địa hồng
in vitro ............................................................................................................. 30
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của Kinetin đến sự nhân chồi của Địa hoàng in vitro . 32
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng phối hợp của Kinetin và BAP đến sự nhân chồi của Địa

hoàng in vitro .................................................................................................. 36
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của IAA đến sự tạo rễ cây Địa hoàng in vitro ............ 39
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng phối hợp của IAA và NAA đến sự tạo rễ cây Địa hoàng
in vitro ............................................................................................................. 42


vii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây Địa hồng ................................................................................... 4
Hình 1.2. Hoa Địa hồng ................................................................................... 4
Hình 1.3. Củ Địa hồng ..................................................................................... 4
Hình 3.2. Mẫu Địa hồng ................................................................................ 29
Hình 3.3. Sự nảy chồi của lát cắt Địa hồng sau 2 tuần ni cấy ................... 30
Hình 3.4. Biểu đồ sự nảy chồi của mẫu Địa hồng......................................... 31
Hình 3.5. Biểu đồ hệ số nhân chồi in vitro Địa hồng .................................... 33
Hình 3.6. Sự nhân chồi Địa hồng sau 4 tuần ni cấy .................................. 33
Hình 3.7. Biểu đồ chiều cao chồi Địa hoàng in vitro...................................... 34
Hình 3.8. Chiều cao chồi Địa hồng in vitro sau 4 tuần ni cấy .................. 34
Hình 3.9. Hệ số nhân chồi in vitro Địa hồng ................................................ 36
Hình 3.10. Sự nhân chồi của Địa hồng trong các mơi trƣờng ...................... 37
Hình 3.11. Biểu đồ chiều cao chồi Địa hoàng in vitro.................................... 37
Hình 3.12. Chiều cao chồi Địa hồng in vitro ................................................ 38
Hình 3.13. Biểu đồ tỷ lệ cây Địa hồng in vitro ra rễ ..................................... 40
Hình 3.14. Biểu đồ số rễ trung bình/cây Địa hồng in vitro ........................... 40
Hình 3.15. Biểu đồ chiều dài rễ cây Địa hoàng in vitro ................................. 41
Hình 3.16. Sự ra rễ Địa hồng sau 4 tuần ni cấy ........................................ 41
Hình 3.17. Biểu đồ tỷ lệ cây Địa hồng in vitro ra rễ ..................................... 43
Hình 3.18. Biểu đồ số rễ trung bình/cây Địa hồng in vitro ........................... 44
Hình 3.19. Biểu đồ chiều dài rễ cây Địa hồng in vitro ................................. 44

Hình 3.20. Sự ra rễ của Địa hồng in vitro ..................................................... 45
Hình 3.21. Sơ đồ quy trình nhân giống in vitro cây Địa hồng giai đoạn phịng
thí nghiệm........................................................................................................ 46


1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cây thuốc có vai trị quan trọng trong cơng tác chăm sóc và bảo vệ sức
khỏe cộng đồng. Theo các tài liệu cho thấy, có tới 80% dân số thế giới đang sử
dụng các loại cây thuốc để chăm sóc sức khỏe ban đầu và gần 70 - 80% dân số
ở các vùng nông thôn lấy cây thuốc làm nguồn chữa bệnh chủ yếu.
Việt Nam là nƣớc có khí hậu nhiệt đới, thời tiết quanh năm nóng ẩm từ
đó tạo nên nguồn tài nguyên dƣợc liệu vô cùng phong phú, đa dạng về thành
phần và chủng loại. Trong lịch sử phát triển, ngƣời Việt Nam luôn nêu cao
chân lý: “Thuốc nam chữa bệnh ngƣời nam”. Y tế phát triển, nhu cầu cây
thuốc tạo nguyên liệu cho sản xuất thuốc và xuất khẩu ngày càng cao. Thuốc
từ cây dƣợc liệu có nhiều triển vọng để phục vụ thị trƣờng hơn 90 triệu dân,
để xuất khẩu và sử dụng làm mỹ phẩm. Để đáp ứng nhu cầu đó, ngành dƣợc
liệu đã và đang tích cực nghiên cứu phát hiện dƣợc liệu mới, công dụng mới
giúp điều trị và nâng cao sức khỏe cho cộng đồng. Do vậy, phát triển công tác
nghiên cứu trồng cây thuốc là một yêu cầu cần thiết.
Theo quyết định số 1976/QĐ-TTg ngày 30/10/2013 của Thủ tƣớng
Chính phủ về việc phê duyệt Quy hoạch tổng thể phát triển dƣợc liệu đến năm
2020 và định hƣớng đến năm 2030, trong đó lồi dƣợc liệu Địa hồng đƣợc
ƣu tiên phát triển tại vùng trung du miền núi Bắc Bộ và vùng đồng bằng sơng
Hồng với diện tích 200 ha.
Căn cứ quyết định số 206/QĐ-BYT ngày 22/1/2015 của Bộ Y tế về việc
ban hành danh mục 54 cây dƣợc liệu ƣu tiên phát triển giai đoạn 2015-2020,
UBND tỉnh Phú Thọ đã ban bành quyết định số 621/QĐ-UBND, ngày

31/3/2015 về danh mục các loài cây dƣợc liệu ƣu tiên phát triển trên địa bàn
Phú Thọ giai đoạn 2015-2020, đã xác định loài dƣợc liệu Địa hoàng
(Rehmanmia glutinosa) là một trong 7 loài đƣợc ƣu tiên nghiên cứu và phát
triển tại tỉnh Phú Thọ.


2
Cây Địa hoàng là một dƣợc liệu quý, đƣợc nhập nội từ Trung Quốc và
trồng tại Việt Nam vào năm 1958; là lồi ƣa ánh sáng và nhiệt độ ơn hịa từ
15-25oC; ƣa đất tơi xốp, thốt nƣớc. Cây sinh trƣởng trong thời gian từ 150160 ngày. Bộ phận khai thác là củ. Củ lồi Địa hồng có chứa các hợp chất
nhóm: Iridoid glycosid, rehmainonosid, các axit amin… có tác dụng bổ âm,
thanh nhiệt, bổ huyết, bổ thận, làm đen râu tóc, hạ đƣờng huyết, tăng cƣờng
sức khỏe [1, 3]. Củ Địa hoàng là một loại thảo dƣợc cơ bản, đƣợc dùng để chế
biến Sinh địa và Thục địa, là vị thuốc bắc đƣợc sử dụng nhiều trong y học cổ
truyền. Nhu cầu của thị trƣờng đối với củ Địa hồng từ 1.000-1.200 tấn
khơ/năm, nhƣng hầu hết là nhập khẩu từ Trung Quốc; năm 2014, Việt Nam
mới tự sản xuất đƣợc khoảng 50 tấn (bằng 1/20 nhu cầu). Do vậy, nghiên cứu
phát triển trồng dƣợc liệu Địa hoàng để đáp ứng nhu cầu dƣợc liệu trong nƣớc
là cần thiết.
Hiện nay, Địa hoàng chủ yếu đƣợc trồng tại một số huyện (Việt Yên,
Yên Dũng) của tỉnh Bắc Giang, quy mô nhỏ, chỉ từ 5-10 ha/toàn tỉnh. Củ
giống hay bị nhiễm bệnh thối nhũn củ, dẫn tới năng suất và chất lƣợng củ Địa
hồng thƣơng phẩm thấp. Do đó, nhằm góp phần sản xuất giống cây Địa
hồng có chất lƣợng cao và tăng số lƣợng giống. Tạo ra cây giống có ƣu thế
về sinh trƣởng, phát triển, cho năng suất và chất lƣợng dƣợc liệu cao hơn cây
trồng bằng lát cắt rễ củ truyền thống chúng tôi tiến hành nghiên cứu: Nghiên
cứu hồn thiện quy trình nhân giống cây Địa hồng bằng phƣơng pháp
ni cấy mơ tế bào giai đoạn phịng thí nghiệm.

3
2. Mục tiêu nghiên cứu
Hồn thiện đƣợc quy trình nhân giống cây Địa hồng bằng phƣơng
pháp ni cấy mơ tế bào giai đoạn phịng thí nghiệm, góp phần duy trì và phát
triển nguồn giống Địa hồng sạch bệnh, có chất lƣợng cao.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới có giá trị về
khả năng nhân giống in vitro giống cây Địa hoàng các phƣơng pháp khử trùng
mẫu sạch, phƣơng pháp nhân nhanh và phƣơng pháp tạo rễ cho cây Địa hoàng.
Kết quả nghiên cứu cũng là tài liệu tham khảo cho việc nghiên cứu, học
tập về cây dƣợc liệu nói chung và cây Địa hồng nói riêng.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài có thể ứng dụng vào q trình nhân giống in vitro
giống cây Địa hồng tại Khoa Nơng - Lâm - Ngƣ, Trƣờng Đại học Hùng
Vƣơng, tỉnh Phú Thọ.
Tạo ra giống cây Địa hoàng in vitro đồng đều về chất lƣợng, năng suất
cao. Góp phần bảo tồn và phát triển nhân giống cây Địa hoàng trong thực tiễn.


4
Chƣơng 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cây Địa hoàng
1.1.1. Đặc điểm thực vật học
Địa hoàng (Rehmannia glutinosa Libosch) thuộc họ Hoa mõm sói
(Scrophulariaceae), chi Địa hồng (Rehmannia).
Địa hồng là cây thân thảo, sống hàng năm, toàn thân cây có lơng trắng
mềm. Cây cao từ 30-35 cm. Lá mọc vịng ở gốc, phiến lá hình trứng ngƣợc đến
bầu dục dài, đi lá tù, mép lá có răng cƣa khơng đều nhau, lá có nếp nhăn.

Hoa tự chùm ở ngọn, đài hình chng, bên trong nứt thành 5 cánh giống nhƣ
hình mơi, mặt ngồi màu tím đỏ, mặt trong màu vàng có vân tím. Cây trồng vụ
nào cũng có hoa, nhƣng khơng kết hạt. Địa hồng thuộc loại cây rễ củ, mỗi cây
có 5-7 củ, củ có cuống dài, vỏ củ màu đỏ nhạt. Mùa hoa tháng 5-6 [3].

Hình 1.1. Cây
Địa hồng

Hình 1.2. Hoa
Địa hồng

Hình 1.3. Củ
Địa hồng

1.1.2. Điều kiện sinh thái
Địa hoàng là cây thuốc nhập nội từ Trung Quốc. Từ năm 1958, cây Địa
hoàng đƣợc nhập vào Việt Nam và đã đƣợc trồng ở nhiều vùng thuộc trung
du, đồng bằng và miền núi.
Địa hoàng ƣa đất tơi xốp, nhiều mùn, cao ráo, thoát nƣớc, nếu đƣợc
trồng ở đất pha cát càng tốt. Địa hồng khơng chịu đƣợc úng, hạn, rét q
hoặc nóng q phát triển kém, thậm chí ngừng phát triển. Vì vậy, đối với các
tỉnh miền núi cao hay nơi lạnh nhiều, mỗi năm chỉ trồng đƣợc một vụ vào
cuối xuân (tháng 3-4). Nếu trồng vào mùa thu cây khơng phát triển đƣợc vào
mùa lạnh. Cịn đối với các tỉnh miền trung du và đồng bằng mỗi năm có thể
trồng 2 vụ, một vụ trồng vào tháng 1-2, một vụ trồng vào tháng 7-8 [1].


5
Giá trị làm thuốc
Thành phần hóa học

* Rễ của Địa hoàng chứa:
- Iridoidglycosides: catalpol, ajugol, geniposide, 8-epiloganic acid,
jioglutoside A, B, melittoside, rehmanniaoside A, B, C, D.
- Iridoid aglycons: rehmanglutine A, B, C, D.
- Terpenoids: 3-jononglucoside, rehmaionoside A, B, C, rehmapicroside.
- Phenolic esterglycosides: verbascoside, acetylverbascoside, cistanoside,
isoverbascoside, jionoside A1, B1, B2, C, D, E, leucosceptoside, martynoside,
purpureaside C.
- Carbohydrates: stachyose, D-fructose, D-galactose, manninotriose,
raffinose, saccharose, verbascose, D-mannitol.
- Các hợp chất khác: campesterol, β-sitosterol, stigmasterol, cerebroside.
* Lá chứa các flavan chrysoeriol [3].
Công dụng:
- Theo y học cổ truyền:
+ Địa hồng có vị ngọt đắng, tính hàn, quy vào 4 kinh: Tâm, can, thận,
tiểu trƣờng. Có tác dụng bổ âm, thanh nhiệt, sinh huyết, làm mát máu và
cầm máu.
+ Thục địa có vị ngọt, mùi thơm, tính hơi ấm, quy vào 3 kinh: Tâm, can,
thận. Có tác dụng dƣỡng huyết, bổ thận, làm đen râu tóc.
+ Địa hồng chữa âm hƣ, phát nóng về chiều, khát nƣớc nhiều, đái tháo
đƣờng, thiếu máu, suy nhƣợc cơ thể, tạng chảy máu, thổ huyết, băng huyết,
chảy máu cam, kinh nguyệt không đều, động thai, ban chẩn, viêm họng, tân
dịch khô, tâm thần không yên, phiền não mất ngủ. Ngày dùng 8-16 g, dạng
thuốc sắc.
+ Thục địa dùng chữa âm hƣ, huyết suy, chứng nóng âm ỉ, cơ thể yếu
mệt, ho khí suyễn, bệnh tiêu khát, kinh nguyệt khơng đều, làm sáng mắt, điều
kinh, bổ huyết, sinh tinh, cơ thể tráng kiện, làm đen râu tóc.


6

+ Trong y học cổ truyền Trung Quốc: Địa hoàng tƣơi dùng trị âm suy, với
nhiệt trong, sốt có lƣỡi đỏ và tiêu khát, khạc máu, chảy máu cam, đau họng; thục
địa chữa âm suy ở gan thận, đau nhức và yếu thắt lƣng, đầu gối, ra mồ hôi ban
đêm, di tinh, mộng tinh, đái tháo đƣờng, thiếu máu, đánh trống ngực, rối loạn
kinh nguyệt, chảy máu tử cung, chóng mặt, ù tai, bạc râu tóc sớm [3].
- Theo y học hiện đại, tác dụng dƣợc lý:
+ Trên hệ miễn dịch: Nƣớc sắc Địa hồng làm tăng hoạt tính tạo phân
bào của phorbol myristat acetat và phytohemaglutimin trên tế bào lách của
chuột cống trắng. Nhƣng khơng có biểu hiện khi có các chất tạo phân bào
trên. Điều đó chứng tỏ Địa hồng có tác dụng kích thích và điều hịa miễn
dịch. Địa hồng thể hiện hoạt tính chặn miễn dịch trên invivo của các hoạt
chất 2-phenyllethyl glycosid, các jionosid A1 và B1. Khi thử nghiệm kết hợp
sử dụng Địa hoàng và glucocorticoid ở trên Thỏ, thấy Địa hồng khơng làm
mất tác dụng của corticoid, nhƣng hạn chế tác dụng không mong muốn của
corticoid trên tuyến yên và thƣợng thận của Thỏ [3].
+ Địa hoàng tác dụng hạ đƣờng huyết trên động vật đái tháo đƣờng với
các thành phần hoạt chất là các iridoid glycozid A, B, C. Tiêm màng bụng
phân đoạn các polysarcarid có cấu trúc tƣơng tự pectin chiết xuất từ Địa
hoàng cho chuột nhắt trắng đã gây đái tháo đƣờng bằng steptozotocin nhận
thấy: làm tăng hoạt tính glucokinase, G6DP (glucose - 6 - dehydrogenase
phosphatase) và giảm hoạt tính của G6P (glucose - 6 - phosphatese),
phosphofructokinase; làm tăng tiết insulin, giảm glycogen trong gan [3].
+ Địa hồng có tác dụng an thần và lợi tiểu trên động vật thí nghiệm và
thể hiện hoạt tính chống oxy hóa trên in vitro.
+ Trên chuột nhắt cái thiến, thử tác dụng của bài thuốc bổ tinh (thực địa,
khởi tử), thấy gây động dục.
+ Áp dụng tiêm thuốc đƣợc bào chế từ Địa hoàng và Đan sâm cho 23
bệnh nhân đái tháo đƣờng có biến chứng thần kinh ngoại biên, các triệu
chứng và dấu hiệu của bệnh giảm rõ rệt.

7
+ Bệnh nhân chảy máu dạ dày, ruột đƣợc điều trị bằng bột Địa hoàng và
Bạch cập hay thuốc sắc của Địa hoàng, Hoàng liên, Hoàng kỳ cho thấy giảm và
ngừng hẳn chảy máu sau 4-5 ngày điều trị.
+ Địa hồng có tác dụng hỗ trợ trong điều trị viêm thối hóa hồng điểm
+ Địa hồng cịn có tác dụng tăng cƣờng sức khỏe, tăng cƣờng khả năng
hoạt động tình dục, chất lƣợng sinh tinh của các bệnh nhân nam bị suy giảm
chức năng sinh dục với bài bổ thận. Đồng thời cũng có tác dụng an thai với
các phụ nữ mang thai hay bị sẩy thai với bài an thai [3].
* Một số bài thuốc dùng Sinh địa và Thục địa
- Chế biến Địa hoàng thành Sinh địa và Thục địa
+ Chế biến Địa hoàng thành sinh địa:
Sinh địa chế: Rễ củ khi đào, không bị sây xƣớc, rửa nhanh qua nƣớc
(có nơi khơng rửa). Phân loại theo độ to nhỏ. Cho vào lò sấy, lúc đầu sấy nhẹ
ở nhiệt độ 35 - 40 C (khoảng 24 giờ). Sau giữ nhiệt độ ở 50 - 60 C, hàng
ngày đảo cho đều. Làm nhƣ vậy trong khoảng 6 - 7 ngày cho đến khi củ mềm
dẻo, phần thịt đã chuyển sang màu đen. Cho ra khỏi lò sấy, rải ra sàn (khơ
ráo, thống sạch) phơi tự nhiên trong khoảng 6 - 7 ngày. Xếp củ dồn lại, dùng
bao tải phủ lên và để 2 - 3 ngày khi thấy vỏ củ ngồi ngả màu xám, có mốc
trắng, nếu bẻ củ thấy trong có tiết ra một chất dịch màu đen dính, chất củ
mềm là đƣợc. Tiếp tục đƣa củ vào sấy ở nhiệt độ 40 - 50ºC đến khi thấy vỏ
ngồi củ khơ là đƣợc. u cầu: Sinh địa có vỏ khơ, màu xám đen, thịt đen,
phần giữa củ cịn hơi vàng. Bảo quản trong thùng kín. Nếu để chế thành Thục
địa thì khơng cần bảo quản.
 Sinh địa thán: Sinh địa thái lát, cho vào nồi rang nóng, sao đều tay cho
đến khi bề mặt phiến có màu đen có những nốt nhỏ phổng lên. Phun ít nƣớc lã
vào, để nguội.
+ Chế biến sinh địa thành thục địa: củ Địa hồng rửa sạch, xếp vào thùng
nhơm hoặc thép khơng gỉ. Xếp củ to ở dƣới, củ nhỏ ở trên, thêm rƣợu 40%

(1lít cho 9 - 10kg củ Địa hồng). Thêm nƣớc đủ ngập. Đun đến sôi, hạ lửa,


8
duy trì sơi nhẹ từ 6 - 8 giờ. Trong thời gian đun, thƣờng sau 1 giờ lại múc
nƣớc dƣới nồi rƣới đều lớp củ phía trên. Có thể đun liên tục trong 72 giờ, tiếp
nƣớc sôi liên tục khi đun, chú ý không để bị cháy. Đun tới cạn. Đổ ra phơi
nắng tới độ ẩm 20% hoặc có thể sấy. Sau đó, đem nấu tiếp với nƣớc Sinh
khƣơng (dùng 200g gừng tƣơi rửa sạch, giã nhỏ, vắt lấy nƣớc cho vào Địa
hoàng đã phơi ở trên) tiếp tục đun trong 6 giờ. Phơi và sấy đến khi thu đƣợc
Thục địa đen nhánh, sờ khơng dính tay.
Một số bài thuốc dùng Sinh địa và Thục địa:
- Chữa suy nhƣợc cơ thể, suy nhƣợc thần kinh, ỉa chảy mãn tính ở ngƣời
cao tuổi - “Thận khí hồn”: Thục địa 16g, Sơn thù, Hồi sơn mỗi vị 12 g,
Trạch tả, Đan bì, Phục linh, Phụ tử chế mỗi vị 8g, Nhục quế 4g; sắc uống.
- Chữa hen phế quản - “Hữu quy ẩm”: Thục địa 16g, Kỷ tử, Phụ tử chế
mỗi vị 12g, Sơn thù, Hoài sơn, Phục linh mỗi vị 8g, Cam thảo, Nhục quế mỗi
vị 6g: sắc uống.
- Chữa tăng huyết áp: Thục địa 16g, Hoài sơn 12g, Sơn thù, Phục linh,
Trạch tả, Đan bì, Đƣơng quy, Bạch thƣợc mỗi vị 8g: sắc uống.
- Chữa đái tháo đƣờng: Sinh địa, Thạch cao mỗi vị 40g, Thổ hoàng liên
16g: sắc uống.
- Chữa động thai ra máu nhỏ giọt - “Bảm âm tiễn”: Sinh địa, Thục địa,
Hoài sơn, Tục đoạn mỗi vị 12g, Bạch thƣợc, Hoàng cầm, Hoàng bá mỗi vị 8g,
Cam thảo 6g: sắc uống [3].
1.2. Tổng quan về phƣơng pháp nhân giống nuôi cấy mô tế bào
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho các loại
nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trƣờng dinh
dƣỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng.
Đây là phƣơng pháp nhân giống hiện đại đƣợc thực hiện trong phịng thí

nghiệm nên cịn gọi là phƣơng pháp nhân giống trong ống nghiệm (in vitro) để
phân biệt với các q trình ni cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ống nghiệm.
Khác với các phƣơng pháp nhân giống truyền thống nhƣ giâm, chiết cành
hoặc ghép mắt, phƣơng pháp nhân giống in vitro trong một thời gian ngắn có


9
thể tạo ra một số lƣợng cây lớn, đồng đều về chất lƣợng mà các phƣơng pháp
nhân giống khác không thể làm đƣợc. Ngồi ra phƣơng pháp này cịn khơng
phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên nên có thể tiến hành quanh năm.
1.2.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nhân giống nuôi cấy mô tế bào
Kỹ thuật nhân giống nuôi cấy mô tế bào đã đƣợc phát triển trên những
cơ sở lý thuyết về tế bào học và cơ sở sinh lý thực vật.
* Tính tồn năng của tế bào
Cuối thế kỉ XIX đầu thế kỉ XX, nhà sinh lí thực vật ngƣời Đức Haberlandt
(1902) đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều
có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh.
Theo quan niệm sinh học hiện đại thì: “Mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa
đều mang tồn bộ lƣợng thơng tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh
vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành
một cá thể hồn chỉnh”. Đó chính là tính tồn năng của tế bào.
Tính tồn năng của tế bào mà Haberlandt đã nêu ra chính là cơ sở lý luận
của phƣơng pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật.
Cho đến nay, con ngƣời đã hoàn toàn chứng minh đƣợc khả năng tái sinh
của một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ.
* Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
Cơ thể thực vật trƣởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều
cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau thực
hiện các chức năng cụ thể khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều
bắt nguồn từ tế bào phơi sinh.

“Sự phân hố tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào
của mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể”. Tuy
nhiên, khi tế bào đã phân hố thành mơ chức năng chúng khơng hồn tồn
mất khả năng phân chia của mình. Trong trƣờng hợp cần thiết, điều kiện thích
hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phơi sinh và lại phân chia mạnh mẽ.
Q trình đó gọi là sự phản phân hoá tế bào, ngƣợc lại với sự phân hoá tế bào.


10
Về bản chất, sự phân hóa và phản phân hóa là một q trình hoạt hóa, ức
chế các gen: Tại một thời điểm nào đó trong q trình phát triển của cá thể, có
một số gen đƣợc hoạt hóa (mà vốn trƣớc đó nó bị ức chế) để cho tính trạng
mới, cịn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này đã đƣợc mã hóa
trong bộ gen của từng loài thực vật. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối
mô của cơ thể thƣờng bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng
từng tế bào hoặc giảm kích thƣớc của khối mơ sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho
sự hoạt hóa các gen của tế bào.
Q trình phát sinh hình thái trong ni cấy mô – tế bào thực vật thực
chất là kết quả của q trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Kĩ thuật nuôi
cấy mô - tế bào xét cho đến cùng là kĩ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái
của tế bào thực vật (khi ni cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo, vô trùng)
một cách định hƣớng dựa và sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ
sở tính tồn năng của tế bào thực vật.
Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, ngƣời ta thƣờng
bổ sung vào trong mơi trƣờng ni cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trƣởng
thực vật đó là Auxin và Cytokinin. Tỷ lệ hai nhóm chất này trong mơi trƣờng
sẽ kéo theo sự phát sinh hình thái khác nhau của thực vật [4].
* Sự trẻ hóa
Vào thế kỉ XVII, XVIII ngƣời ta cho rằng các dịng vơ tính bị thối hóa
đi theo tuổi và chỉ có thể trẻ hóa thơng qua sinh sản bằng hạt. Song thực tế

cho thấy rằng đời sống một dịng vơ tính là vơ hạn nếu nó sống trong một mơi
trƣờng thích hợp và liên tục đổi mới bằng sinh trƣởng sinh dƣỡng.
Ngun nhân thối hóa chủ yếu là do tác hại của virus.
Trong nuôi cấy mô tế bào, khả năng ra chồi, rễ ở các thành phần khác
nhau là rất khác nhau. Vì vậy để chọn mẫu cấy phù hợp phải căn cứ vào trạng
thái sinh lý hay tuổi mẫu: các mẫu non trẻ có sự phản ứng với các điều kiện
và môi trƣờng nuôi cấy nhanh, dễ tái sinh, đặc biệt trong ni cấy mơ sẹo,
phơi. Ngồi ra mơ non trẻ mới đƣợc hình thành, sinh trƣởng mạnh, mức độ
nhiễm mầm bệnh ít hơn. Vì vậy việc trẻ hoá là một biện pháp quan trọng nhất
trong nhân giống sinh dƣỡng [4].


11
1.2.2. Mơi trường ni cấy mơ tế bào
*Thành phần hóa học của môi trường
Thành phần môi trƣờng nuôi cấy mô tế bào thay đổi tuỳ theo loài thực
vật, loại tế bào, mô và cơ quan nuôi cấy. Đối với cùng một loại mơ, cơ quan
nhƣng mục đích ni cấy khác nhau thì mơi trƣờng ni cấy khác nhau cũng
khá cơ bản. Mơi trƣờng ni cấy cịn thay đổi theo giai đoạn sinh trƣởng và
phát triển của mẫu cấy.
Mặc dù có sự đa dạng về thành phần các chất nhƣng môi trƣờng nuôi
cấy đều gồm các thành phần sau:
- Thành phần vơ cơ: Bao gồm các muối khống (đa lƣợng và vi lƣợng)
đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy.
- Thành phần hữu cơ:Vitamin, aminoaxit, amit, myo-inositol, thành phần
hữu cơ phức hợp, dịch chiết hoa quả, củ, nƣớc ép cà chua, nƣớc ép cam, nƣớc
ép chuối xanh, nƣớc dừa.
- Các chất điều hoà sinh trƣởng: Các chất điều hoà sinh trƣởng là thành
phần không thể thiếu đƣợc trong môi trƣờng nuôi cấy, có vai trị quan trọng
trong phát sinh hình thái thực vật in vitro. Hiệu quả tác động của chất điều

hoà sinh trƣởng phụ thuộc vào loại và nồng độ chất điều hồ sinh trƣởng sử
dụng trong ni cấy.
- Nguồn cacbon: Các mẫu ni cấy thực vật nói chung khơng thể quang
hợp hoặc quang hợp nhƣng ở cƣờng độ rất thấp. Vì vậy phải đƣa thêm những
hợp chất hydratcacbon vào thành phần môi trƣờng nuôi cấy. Loại
hydratcacbon đƣợc sử dụng phổ biến là đƣờng saccarozơ với hàm lƣợng từ 2 6% (w/v). Những loại đƣờng khác nhƣ fructose, glucose, maltose, sorbitol...
rất ít dùng. Hàm lƣợng đƣờng thấp đƣợc sử dụng cho nuôi cấy tế bào trần,
ngƣợc lại hàm lƣợng đƣờng cao cần cho nuôi cấy hạt phấn và phôi.
- Các thành phần khác:
+ Tác nhân tạo gel: quyết định trạng thái vật lý của môi trƣờng nuôi cấy.
Chất tạo gel đƣợc sử dụng phổ biến là agar (thạch). Hàm lƣợng agar sử dụng
từ 0,5-10% (w/v) tuỳ theo chất lƣợng của chúng và môi trƣờng sử dụng. Khi


12
môi trƣờng nuôi cấy là môi trƣờng lỏng hoặc bán lỏng thì khơng hoặc bổ sung
rất ít agar.
+ Than hoạt tính: đƣợc dùng để hấp thụ các chất màu, các hợp chất
phenol, các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp... Trong trƣờng hợp những chất đó
có tác dụng gây ức chế sinh trƣởng của mẫu nghiên cứu. Mặt khác, khi bổ
sung vào mơi trƣờng, than hoạt tính làm thay đổi mơi trƣờng ánh sáng do mơi
trƣờng trở nên sẫm vì vậy có thể kích thích q trình tạo rễ, một số trƣờng
hợp cịn có tác dụng thúc đẩy phát sinh phơi vơ tính. Nhƣng than hoạt tính lại
làm giảm hiệu quả của các chất điều hoà sinh trƣởng. Nồng độ than hoạt tính
thƣờng sử dụng từ 0,2 - 0,3% (w/v) [4].
*pH của môi trường
pH của đa số các môi trƣờng nuôi cấy đƣợc điều chỉnh trong phạm vi
5,5-6,0. pH dƣới 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel, cịn pH lớn hơn
6,0 agar có thể rất cứng. Nếu trong mơi trƣờng có GA3 thì phải điều chỉnh giá
trị pH trong phạm vi nói trên vì ở pH kiềm hoặc q axit thì GA3 sẽ chuyển

sang dạng khơng có hoạt tính.
1.2.3. Các giai đoạn ni cấy
Giai đoạn 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Mục đích chủ yếu của giai đoạn này là phải chuẩn bị đƣợc nguồn nguyên
liệu thực vật cho q trình ni cấy. Khâu đầu tiên của giai đoạn này có thể
coi nhƣ một bƣớc thuần hố vật liệu nuôi cấy. Cây mẹ (là cây cho nguồn mẫu
nuôi cấy) đƣợc đƣa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với mơi
trƣờng mới, đồng thời giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy và
chủ động nguồn mẫu trong công tác nhân giống. Cây mẹ phải sạch bệnh, đặc
biệt là bệnh virut và ở giai đoạn sinh trƣởng mạnh. Thông thƣờng, cây mẹ là
cây có những tính trạng tốt, đạt tiêu chuẩn của các nhà chọn giống hoặc là
những đối tƣợng đang có nguy cơ tuyệt chủng. Trong trƣờng hợp cần thiết có
thể làm trẻ hoá vật liệu giống.


13
Giai đoạn 2: Nuôi cấy khởi động
Là giai đoạn khử trùng và đƣa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Khi đã có
nguồn ngun liệu ni cấy, tiến hành lấy mẫu và xử lý mẫu cấy trong những
điều kiện vô trùng. Khi lấy mẫu cần chọn loại mẫu cấy phù hợp: đúng loại
mô, đúng giai đoạn phát triển: ngƣời ta thƣờng lấy chồi đỉnh hay chồi nách để
nuôi cấy in vitro. Ngồi ra cũng có thể sử dụng đoạn thân, mảnh lá... để tiến
hành nuôi cấy. Ngƣời ta thƣờng sử dụng một số loại hoá chất nhƣ: HgCl2
0,1%, cồn 70º, H2O2, Ca(OCl)2... để khử trùng mẫu cấy. Để tăng tính linh
động của hóa chất diệt khuẩn, ngƣời ta thƣờng sử dụng thêm các chất làm
giảm sức căng bề mặt nhƣ tween 20, tween 80, teepol... Mẫu sau khi đƣợc
khử trùng đƣợc cấy vào môi trƣờng nuôi cấy khởi động.
Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm bệnh thấp, tỷ lệ
sống cao, mô tồn tại và sinh trƣởng tốt.
Giai đoạn 3: Nhân nhanh

Một trong những ƣu thế lớn nhất của phƣơng pháp nhân giống in vitro so
với các phƣơng pháp nhân giống truyền thống là có hệ số nhân cao. Vì vậy giai
đoạn nhân nhanh đƣợc coi là giai đoạn then chốt của tồn bộ q trình nhân
giống. Giai đoạn này sẽ kích thích mơ ni cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh
số lƣợng thơng qua các con đƣờng: Hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo
phơi vơ tính. Phải xác định đƣợc mơi trƣờng dinh dƣỡng và môi trƣờng vật lý
phù hợp để đạt hiệu quả cao nhất. Vai trò của các chất điều hòa sinh trƣởng, chất
phụ gia (nƣớc dừa, khoai tây...) là đặc biệt quan trọng. Tăng cƣờng chiếu sáng
(16 giờ/ngày, cƣờng độ ánh sáng tối thiểu 1000 lux, ánh sáng tím) là yếu tố quan
trọng kích thích mơ phân hố mạnh. Bảo đảm chế độ nhiệt 20 - 30ºC. Yêu cầu
cần đạt đƣợc trong giai đoạn này là tạo đƣợc hệ số nhân cao.
Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh
Đây là giai đoạn các chồi đã đạt kích thƣớc nhất định và đƣợc chuyển từ
môi trƣờng ở công đoạn 3 sang mơi trƣờng ni cấy tạo rễ để hình thành cây
hồn chỉnh. Ở giai đoạn này môi trƣờng cần giảm lƣợng cytokinin và tăng
lƣợng auxin để rễ phát triển. Các chất α - NAA, IBA, IAA thƣờng đƣợc sử


14
dụng ở nồng độ 1 - 5 mg/l để tạo rễ cho hầu hết các loài cây trồng. Từ những
chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Lúc này cây con
rất nhạy cảm với ẩm độ và bệnh tật do hoạt động của lá và rễ mới sinh rất yếu,
cây chƣa chuyển sang giai đoạn tự dƣỡng. Yêu cầu cần đạt đƣợc trong giai
đoạn này: Cây con tạo ra đủ tiêu chuẩn (chiều cao, số lá, số rễ).
Giai đoạn 5: Đưa cây mô ra ngoài vườn ươm
Đây là giai đoạn chuyển dần cây con từ ống nghiệm ra nhà kính rồi ra
ngồi trời để tạo điều kiện cho cây con tự dƣỡng hoàn toàn và thích nghi dần
với mơi trƣờng tự nhiên. Khi cây đủ tiêu chuẩn cứng cáp thì mang trồng. Để
đƣa cây từ ống nghiệm ra mơi trƣờng bên ngồi đạt tỷ lệ sống cao cần đảm
bảo một số yêu cầu: Cây trong ống nghiệm đạt những tiêu chuẩn về hình thái

nhất định: chiều cao cây, số lá, số rễ. Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích
hợp: giá thể tơi xốp, thoát nƣớc, sạch bệnh. Phải giữ ẩm cho cây khi mới đƣa
cây từ ống nghiệm ra, cần duy trì độ ẩm trên 50% để cây con không mất nƣớc
đặc biệt trong 2 - 3 tuần đầu, tránh ánh sáng quá mạnh gây cháy lá, tránh
nhiễm khuẩn và nấm gây hiện tƣợng thối nhũn. Điều kiện môi trƣờng trong
giai đoạn này là rất quan trọng, cần tạo điều kiện cho bộ rễ phát triển, cứng
cáp và phòng bệnh cho cây. Đây đƣợc xem là công đoạn quyết định khả năng
ứng dụng quy trình này trong thực tiễn sản xuất [4].
1.2.4. Các điều kiện nuôi cấy in vitro
* Điều kiện vô trùng
Đây là điều kiện tiên quyết đối với thành công của q trình ni cấy mơ
tế bào. Nếu khơng mẫu bị nhiễm nấm, khuẩn sẽ thối và chết.
- Vô trùng dụng cụ và môi trƣờng: Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật,
các thao tác mẫu cấy đƣợc tiến hành trong tủ cấy vô trùng. Để vô trùng dụng
cụ và mơi trƣờng ni cấy, có thể sử dụng một trong các phƣơng pháp sau:
+ Khử trùng khô: phƣơng pháp này chỉ dùng cho các dụng cụ bằng kim
loại, thuỷ tinh, các dụng cụ có tính chịu nhiệt. Thiết bị dùng khử trùng khơ là
lị sấy.


15
+ Khử trùng ƣớt: là phƣơng pháp áp dụng hiệu quả và phổ biến trong vô
trùng môi trƣờng và các dụng cụ nuôi cấy.
Thiết bị sử dụng là nồi hấp vô trùng, nhiệt độ thƣờng dùng ở 121ºC.
+ Màng lọc: dùng để loại bỏ các tác nhân gây nhiễm khỏi mơi trƣờng
ni cấy có kích thƣớc 0,025 - 10µm. Đây là phƣơng pháp phù hợp với các
môi trƣờng mà thành phần của nó bị phân huỷ ở nhiệt độ cao.
- Vô trùng mẫu cấy:
Với các loại mẫu cấy khác nhau hoặc cùng loại mẫu cấy nhƣng ở các vị
trí khác nhau... thì phƣơng pháp khử trùng mẫu cấy là khác nhau. Phƣơng

pháp phổ biến trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hố chất có khả
năng tiêu diệt vi sinh vật.
Hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào loại, nồng độ, thời gian xử lý hoá
chất khử trùng. Một hố chất đƣợc lựa chọn để vơ trùng phải đảm bảo 2 thuộc
tính: có khả năng diệt vi sinh vật tốt và khơng hoặc ít độc đối với mẫu thực
vật. Các hố chất hay đƣợc sử dụng đó là: hypoclorit canxi (nồng độ 5-15%
w/v), hypoclorit natri (nồng độ 10-20% w/v), oxy già (nồng độ 10-12% w/v),
thuỷ ngân clorua (nồng độ 0,1-1% w/v), chất kháng sinh (50-100 mg/l)... Để
tăng tính linh động của hoá chất diệt khuẩn,ngƣời ta thƣờng sử dụng thêm các
chất làm tăng sức căng bề mặt nhƣ Tween 20, Tween 80, fotoflo, teepol…
hoặc có thể phối hợp xử lý với cồn 70º.
Một số trƣờng hợp rất khó vơ trùng mẫu cấy do đó xử lý vơ trùng bề mặt
sẽ khơng đạt hiệu quả hồn tồn. Trong trƣờng hợp này các nhà nghiên cứu
đã thêm các chất diệt khuẩn, nấm vào môi trƣờng nuôi cấy.
*Ánh sáng và nhiệt độ.
Các mẫu ni cấy thƣờng đƣợc đặt trong những phịng ni ổn định về
ánh sáng và nhiệt độ. Tất cả các trƣờng hợp ni cấy đều cần có ánh sáng trừ
một số trƣờng hợp nuôi cấy tạo mô sẹo, nhƣng quá trình nhân giống của
chúng cũng cần có ánh sáng. Nhiệt độ của các phịng ni cây thƣờng đƣợc
duy trì từ 25 - 28ºC nhờ các máy điều hoà nhiệt độ [4].


16
1.2.5. Chất điều hịa sinh trưởng
1.2.5.1. Auxin
Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trƣởng thực vật đƣợc sử dụng thƣờng
xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các
thành phần khác của môi trƣờng dinh dƣỡng để kích thích sự tăng trƣởng của
mơ sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt khi nó
đƣợc phối hợp sử dụng với các cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ auxin

trong môi trƣờng nuôi cấy phụ thuộc vào:
+ Kiểu tăng trƣởng và phát triển cần nghiên cứu.
+ Hàm lƣợng auxin nội sinh của mẫu cấy
+ Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy.
+ Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh.
+ Đặc tính của auxin: kích thích sự tăng trƣởng và kéo dài tế bào.
Đối với nuôi cấy mô, auxin đã đƣợc sử dụng cho sự phân chia tế bào và phân
hóa rễ. Những auxin dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA (3-indolebutiric
axit), IAA (3 - indolaxetic axit), NAA (Napthaleneaxetic axit), 2,4-D (2,4-DDichlorophenoxyaxetic axit) và 2,4,5-T (trichlorophenoxyaxetic axit). Trong số
các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trƣờng ra rễ và phối hợp với
cytokinin sử dụng cho môi trƣờng ra chồi. 2,4-D và 2,4,5-T rất hiệu quả đối với
mơi trƣờng tạo và phát triển callus. Auxin thƣờng hịa tan trong etanol hoặc
NaOH [4].
1.2.5.2. Cytokinin
Tính chất đặc trƣng của cytokinin là kích thích sự phân chia tế bào mạnh
mẽ. Vì vậy ngƣời ta xem chúng nhƣ là các chất hoạt hóa sự phân chia tế bào,
nguyên nhân là do cytokinin hoạt hóa mạnh mẽ q trình tổng hợp axit
nucleic và protein dẫn đến kích sự phân chia tế bào.
Cytokinin ảnh hƣởng rõ rệt lên sự hình thành và phân hóa cơ quan của
thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi. Ngƣời ta đã chứng minh rằng sự cân
bằng giữa tỷ lệ auxin (phân hóa rễ) và cytokinin (phân hóa chồi) có ý nghĩa
rất quyết định trong q trình phát sinh hình thái của mơ ni cấy in vitro