Nghiên cứu tạo cây đậu tương (Glycine max L.) biến đổi gen có khả năng tổng hợp astaxanthin chuyên biệt ở hạt.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CƠNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ
-

HỒNG VĂN DƢƠNG

NGHIÊN CỨU TẠO CÂY ĐẬU TƢƠNG (Glycine max L.)
BIẾN ĐỔI GEN CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP
ASTAXANTHIN CHUYÊN BIỆT Ở HẠT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH - 2022


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CƠNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ
-

HỒNG VĂN DƢƠNG

NGHIÊN CỨU TẠO CÂY ĐẬU TƢƠNG (Glycine max L.)
BIẾN ĐỔI GEN CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP

ASTAXANTHIN CHUYÊN BIỆT Ở HẠT

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 9 42 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. Nguyễn Hữu Hổ
2. TS. Phan Tƣờng Lộc

TP. HỒ CHÍ MINH - 2022


iii
LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn
khoa học của TS. Nguyễn Hữu Hổ và TS. Phan Tƣờng Lộc. Nội dung nghiên cứu
và các kết quả trong đề tài này hoàn toàn trung thực. Toàn bộ số liệu và kết quả
nghiên cứu chƣa từng đƣợc sử dụng để công bố trong các cơng trình nghiên cứu để
nhận học vị, các thơng tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc trích dẫn nguồn gốc
rõ ràng. Một phần trong kết quả nghiên cứu của đề tài này đã đƣợc công bố trên tạp
chí khoa học chun ngành trong nƣớc. Tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về sự
cam đoan này.

Hoàng Văn Dƣơng


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành Luận Án này, tơi đã nhận đƣợc rất nhiều sự động viên, giúp

đỡ từ Thầy Cơ, Gia Đình và Bạn Bè.
Xin bày tỏ và gửi lòng biết ơn chân thành, sâu sắc đến:
- Thầy - TS. Nguyễn Hữu Hổ đã tận tình hƣớng dẫn, động viên và tạo mọi điều
kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận án.
- TS. Phan Tƣờng Lộc - Anh vừa là ngƣời Thầy ln theo sát, tận tình chỉ bảo,
hƣớng dẫn, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận án.
- Thầy Lê Tấn Đức đã luôn bên cạnh ủng hộ, động viên, giúp đỡ tôi hồn thành
luận án.
- Các q Thầy Cơ ở Học Viện Khoa Học Công Nghệ đã truyền đạt kiến thức, giúp
đỡ tơi hồn thành luận án.
- Ban Lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo điều kiện thuận lợi để tơi thực hiện
đề tài này.
- Các bạn đồng nghiệp phịng Công Nghệ Gen và các bạn sinh viên đã giúp đỡ tôi
trong thời gian qua.
- Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Gia Đình đã ln sát cánh, ủng hộ,
giúp đỡ tôi trong những năm học vừa qua cũng nhƣ trên mỗi bƣớc đƣờng
trƣởng thành trong cuộc sống.

Hoàng Văn Dƣơng


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN........................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN................................................................................................................ ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT......................................................... vi
DANH MỤC CÁC BẢNG.......................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ..................................................................... viii
TĨM TẮT...................................................................................................................... 1
MỞ ĐẦU....................................................................................................................... 5
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................ 8

1.1. Chuyển hóa tạo carotenoid ở thực vật..................................................................... 8
1.1.1. Sinh tổng hợp và tích trữ carotenoid.................................................................... 8
1.1.2. Thay đổi chuyển hóa sinh tổng hợp carotenoid.................................................. 10
1.1.3. Tổng quan về astaxanthin................................................................................... 11
1.2. Biến đổi gen thực vật............................................................................................ 19
1.2.1. Chuyển gen vào thực vật sử dụng Agrobacterium tumefaciens..........................19
1.2.2. Sử dụng promoter trong công nghệ chuyển gen thực vật................................... 22
1.2.3. Sự di truyền của gen biến nạp trong cây chuyển gen......................................... 26
1.3. Nghiên cứu phát sinh hình thái và biến đổi gen đậu tƣơng................................... 27
1.3.1. Giới thiệu chung về cây đậu tƣơng.................................................................... 27
1.3.2. Nghiên cứu phát sinh hình thái ở đậu tƣơng...................................................... 29
1.3.3. Nghiên cứu biến đổi gen đậu tƣơng................................................................... 35
1.4. Cách tiếp cận của đề tài......................................................................................... 43
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP......................................................... 46
2.1. Vật liệu.................................................................................................................. 46
2.1.1. Giống đậu tƣơng................................................................................................ 46
2.1.2. Chủng vi khuẩn, plasmid.................................................................................... 46
2.1.3. Kim châm để tạo vết thƣơng cho mẫu chuyển gen............................................ 47
2.1.4. Mơi trƣờng ni cấy mơ.................................................................................... 47
2.1.5. Hóa chất trong các thí nghiệm khác................................................................... 48
2.1.6. Thiết bị sử dụng................................................................................................. 49
2.2. Nội dung và Phƣơng pháp.................................................................................... 50
Nội dung 1: Xây dựng hệ thống tạo cây con hoàn chỉnh in vitro từ đốt lá mầm và
một nửa hạt.......................................................................................................... 50
2.2.1. Tuyển chọn giống đậu tƣơng............................................................................. 50
2.2.2. Khử trùng hạt..................................................................................................... 50


2.2.3. Ảnh hƣởng của BA lên sự tái sinh chồi của đốt lá mầm và một nửa hạt............51
2.2.4. Ảnh hƣởng của IBA lên sự tạo rễ của chồi in vitro............................................ 52

Nội dung 2: Khảo sát các điều kiện thích hợp để ứng dụng trong qui trình chuyển
gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng...................................................................... 53
2.2.5. Ảnh hƣởng của PPT lên khả năng tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt.......53
2.2.6. Ảnh hƣởng của PPT lên sự sinh trƣởng của chồi in vitro.................................. 53
2.2.7. Ảnh hƣởng của việc tạo vết thƣơng bằng kim châm lên khả năng tái sinh
của đốt lá mầm.................................................................................................... 53
2.2.8. Ảnh hƣởng của việc tạo vết thƣơng bằng dao mổ kết hợp sóng siêu âm lên
hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tƣơng............................................................. 54
2.2.9. Ảnh hƣởng của việc tạo vết thƣơng bằng dao mổ kết hợp thấm hút chân
không lên hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tƣơng........................................... 55
Nội dung 3: Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng gián tiếp thông qua vi
khuẩn A. tumefaciens và kiểm tra, đánh giá các dòng đậu tƣơng chuyển gen.....55
2.2.10. Tạo dòng Agrobacterium tumefaciens EHA 105 chứa plasmid pITB-AST......55
2.2.11. Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng..................................................... 57
2.2.12. Kiểm tra cây chuyển gen bằng PCR................................................................. 58
2.2.13. Kiểm tra cây chuyển gen bằng Southern blot................................................... 60
2.2.14. Phân tích hàm lƣợng astaxanthin trong hạt...................................................... 62
2.2.15. Đánh giá các giai đoạn sinh trƣởng cây chuyển gen trong điều kiện ex
vitro.................................................................................................................... 62
2.2.16. Xử lý thống kê.................................................................................................. 63
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................... 64
Nội dung 1: Xây dựng hệ thống tạo cây con hoàn chỉnh in vitro từ đốt lá mầm và
một nửa hạt.......................................................................................................... 64
3.1. Tuyển chọn các giống đậu tƣơng.......................................................................... 64
3.2. Hiệu quả của các phƣơng pháp khử trùng hạt đậu tƣơng..................................... 66
3.3. Ảnh hƣởng của BA lên sự tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt...................... 67
3.4. Ảnh hƣởng của IBA lên sự tạo rễ của chồi in vitro............................................... 73
Nội dung 2: Khảo sát các điều kiện thích hợp để ứng dụng trong qui trình chuyển
gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng...................................................................... 75
3.5. Ảnh hƣởng của PPT lên khả năng tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt..........75

3.6. Ảnh hƣởng của PPT lên sự sinh trƣởng của chồi in vitro..................................... 78
3.7. Ảnh hƣởng việc tạo vết thƣơng bằng kim châm lên khả năng tái sinh của đốt
lá mầm................................................................................................................. 79
3.8. Ảnh hƣởng của việc tạo vết thƣơng bằng dao mổ kết hợp sóng siêu âm lên


hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tƣơng (giống MTĐ 176)................................ 80
3.9. Ảnh hƣởng của việc tạo vết thƣơng bằng dao mổ kết hợp thấm hút chân không
lên hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tƣơng......................................................... 83
Nội dung 3: Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng gián tiếp thông qua vi
khuẩn A. tumefaciens và kiểm tra, đánh giá các dòng đậu tƣơng chuyển gen.....85
3.10. Tạo dòng Agrobacterium tumefaciens EHA 105 chứa plasmid pITB-AST.........85
3.11. Chuyển gen tạo cây đậu tƣơng có khả năng sản xuất astaxanthin chuyên biệt
ở hạt..................................................................................................................... 87
3.11.1. Chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng kim châm tạo vết thƣơng
mẫu...................................................................................................................... 87
3.11.2. Chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng dao mổ kết hợp sóng
siêu âm, thấm chân không tạo vết thƣơng mẫu................................................... 93
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................... 111
DANH MỤC CƠNG TRÌNH..................................................................................... 113
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 114
PHỤ LỤC...................................................................................................................... 1


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D

2,4-Dichlorophenoxyacetic

acid BA

Benzyl Adenine

CBFD

Carotenoid β-ring 4-

dehydrogenase GGPP Geranylgeranyl
Pyrophosphate
H

Hour

HBFD

Carotenoid 4-hydroxy-β-ring 4-dehydrogenase

HPLC

High-performance liquid chromatography

IAA

Indole-3-acetic acid

IBA

Indole-3-butyric acid

KT

Kinetin

NAA

α-naphthylacetic acid

NXS

Neoxanthin synthase

PCR

Polymerase Chain Reaction

PDS

Phytoene desaturase

PPT

Phosphinothricin

PSY

Phytoene synthase

QC1

Qui cách 1

QC2

Qui cách 2

S

Second

SAAT

Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation

TDZ

Thidiazuron

VDE

Violaxanthin deepoxidase

ZDS

Zeta-carotene desaturase

ZEP

Zeaxanthin epoxidase

β-LCY

β Lycopene cyclase

ε-LCY

ε Lycopene cyclase


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Nguồn gốc và một số đặc điểm của các giống đậu tƣơng đƣợc sử
dụng................................................................................................................ 46
Bảng 2.2. Thành phần các loại môi trƣờng nuôi cấy mô và chuyển gen.................47
Bảng 3.1. Kiểm tra thành phần β-carotene ở các giống đậu tƣơng..........................65
Bảng 3.2. Tỉ lệ nảy mầm ở các giống đậu tƣơng..................................................... 65
Bảng 3.3. Tỉ lệ hạt đậu tƣơng không nhiễm và nảy mầm khi khử trùng bằng dung
dịch Javel hoặc khí clo.................................................................................... 67
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của các nồng độ BA lên sự tái sinh của đốt lá mầm và một
nửa hạt giống MTĐ 176.................................................................................. 68
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của các nồng độ BA lên sự tái sinh của đốt lá mầm và một
nửa hạt giống HL 07-15.................................................................................. 70
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của các nồng độ BA lên sự tái sinh của đốt lá mầm và một
nửa hạt giống OMĐN 29................................................................................ 71
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi đậu tƣơng in vitro......75
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng PPT lên sự tái sinh chồi của đốt lá mầm..............................76
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của PPT lên khả năng sống của chồi in vitro........................78
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của việc sử dụng kim châm lên khả năng
tái sinh của đốt lá mầm................................................................................... 80
ảng 3 11 Tỉ lệ mẫu dƣơng tính GUS khi xử l sóng siêu âm ở các thời gian khác
nhau................................................................................................................. 82
ảng 3 12 Tỉ lệ đốt lá mầm dƣơng tính GUS khi xử l áp lực âm ở các thời gian

khác nhau........................................................................................................ 84
Bảng 3.13. Kết quả thu nhận hạt của các dòng chuyển gen D2 và D8 ở thế hệ T1103
Bảng 3.14. Kết quả định lƣợng astaxanthin trong hạt của các dòng chuyển gen...106
Bảng 3.15. So sánh một số đặc điểm của cây chuyển gen và đối chứng................109


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Sơ đồ con đƣờng sinh tổng hợp carotenoid [19]........................................ 9
Hình 1.2. Bột astaxanthin [36]................................................................................. 11
Hình 1.3. So sánh khả năng chống gốc oxy tự do có hại cho cơ thể của một số
chất chống oxy hóa [43].................................................................................. 12
Hình 1.4. Vị trí của phân tử astaxanthin trong màng tế bào [40].............................13
Hình 1.5. Qui mơ thị trƣờng astaxanthin đến năm 2022 [4].................................... 13
Hình 1.6. Con đƣờng chuyển hố tạo astaxanthin ở Adonis aestivalis [6]..............15
Hình 1.7. Con đƣờng tổng hợp astaxanthin ở một số loài khác nhau [6][57]..........16
Hình. 1.8. Sơ đồ chuyển hóa tạo astaxanthin trên đậu tƣơng khi đƣợc biến nạp
các gen mã hóa phytoene synthase và ketolase [63]........................................ 18
Hình 1.9. Vi khuẩn A. tumefaciens bám trên bề mặt tế bào thực vật [71]................20
Hình 1.10. Vi khuẩn A. tumefaciens gây khối u trên thực vật [72].........................20
Hình 1.11. Sự ức chế của phosphinothricin lên hoạt động của enzyme...................21
Hình 1.12. Phản ứng của X-Gluc với β-glucuronidase [77].................................... 22
Hình 1.13. Mơ hình cơ bản về cấu trúc và điều hịa phiên mã của gen mã hóa
protein [79]..................................................................................................... 23
Hình 1.14. Cây đậu tƣơng.......................................................................................27
Hình 1.15. Sản lƣợng của 6 nƣớc sản xuất đậu tƣơng lớn nhất [94]......................28
Hình 1.16. Cấu trúc plasmid pITB-AST.................................................................. 45
Hình 2.1. Sơ đồ các bƣớc chuẩn bị mẫu đốt lá mầm............................................... 51
Hình 2.2. Sơ đồ các bƣớc chuẩn bị mẫu một nửa hạt.............................................. 52
Hình 2.3. Minh họa kích thƣớc theo chiều dài, rộng, dày của hạt đậu tƣơng..........63
Hình 3.1. Hạt đậu tƣơng nảy mầm sau 5 ngày........................................................ 65

Hình 3.2. Hạt đậu tƣơng (HL 07-15) nảy mầm 5 ngày sau khi khử trùng...............67
Hình 3.3. Sự hình thành chồi của đốt lá mầm giống MTĐ 176 ở các nồng độ BA
khác nhau sau 3 tuần ni cấy......................................................................... 69
Hình 3.4. Sự đáp ứng của đốt lá mầm và một nửa hạt của giống MTĐ 176 ở các
nồng độ BA khác nhau sau 3 tuần ni cấy..................................................... 69
Hình 3.5. Sự hình thành chồi của mẫu một nửa hạt giống MTĐ 176 ở các nồng
độ BA khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy.............................................................. 70


Hình 3.6. Sự hình thành chồi của đốt lá mầm giống HL 07-15 ở các nồng độ BA
khác nhau sau 3 tuần ni cấy......................................................................... 71
Hình 3.7. Sự hình thành chồi của đốt lá mầm giống OMĐN 29 ở các nồng độ
BA khác nhau sau 3 tuần ni cấy................................................................... 72
Hình 3.8. Sự tạo rễ của chồi in vitro của các giống MTĐ 176, HL 07-15 và
OMĐN 29 ở các nồng độ IBA khác nhau sau 3 tuần ni cấy........................74
Hình 3.9. Sự tái sinh của đốt lá mầm giống MTĐ 176 trên mơi trƣờng có PPT......77
Hình 3.10. Sự sinh trƣởng đoạn thân giống MTĐ 176 trên mơi trƣờng có PPT.....79
Hình 3.11. Ảnh hƣởng của số lần châm đến khả năng tái sinh của đốt lá mầm
giống MTĐ 176.............................................................................................. 80
nh 3 12. Mẫu dƣơng tính GUS khi xử l sóng siêu âm ở các thời gian khác
nhau.
.....................................................................................................................
82
nh 3 13 Mẫu dƣơng tính GUS khi xử l áp lực âm ở các thời gian khác nhau.
............................................................................................................................. 83
Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid ly trích từ E. coli........................85
Hình 3.15. Các khuẩn lạc vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens biến nạp sau khi
ủ qua đêm trên mơi trƣờng có kháng sinh...................................................... 86
Hình 3.16. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen hbfd1 từ plasmid của vi khuẩn E.
coli và A. tumefaciens..................................................................................... 86

Hình 3.17. Vật liệu chuyển gen và các giai đoạn phát triển cây chuyển gen...........88
Hình 3.18. Kiểm tra sự hiện diện của gen bar ở các cây kháng PPT bằng PCR.....89
Hình 3.19. Kiểm tra sự hiện diện của gen hbfd1 ở các cây kháng PPT bằng PCR...90
Hình 3.20. Kết quả phân tích DNA cây đậu tƣơng chuyển gen bằng Southern
blot.................................................................................................................. 91
Hình 3.22. Kiểm tra sự hiện diện của gen bar ở các cây kháng PPT bằng PCR.....95
Hình 3.23. Kiểm tra sự hiện diện của gen cbfd2 ở các cây kháng PPT bằng PCR 96
Hình 3.24. Kiểm tra sự hiện diện của gen hbfd1 ở các cây kháng PPT bằng PCR...97
Hình 3.25. Kiểm tra sự hiện diện của gen Zm-psy ở các cây kháng PPT bằng
PCR................................................................................................................. 97
Hình 3.26. Kết quả phân tích DNA cây đậu tƣơng chuyển gen bằng Southern
blot.................................................................................................................. 99
Hình 3.27. Lá cây đối chứng và chuyển gen sau 7 ngày quét dung dịch Basta....100
Hình 3.28. Dịng chuyển gen D2 (a) và D8 (b) phát triển ngồi vƣờn ƣơm..........101
Hình 3.29. Hạt màu đỏ của dịng D2 và D8........................................................... 101
Hình 3.30. Các giai đoạn phát triển của cây chuyển gen trồng từ hạt....................102


Hình 3.31. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen biến nạp ở các dịng T1...............102
Hình 3.32. Thử nghiệm qt Basta trên lá cây chuyển gen và đối chứng..............103
Hình 3.33. Các hạt chuyển gen biểu hiện màu đỏ không đồng đều.......................104
Hình 3.34. Hạt của các dịng chuyển gen T2......................................................... 105
Hình 3.35. Phổ ESI-MS của chuẩn astaxanthin..................................................... 107
108
Hình 3.36. Phổ ESI-MS của mẫu ly trích từ hạt dịng D2-1..................................108
Hình 3.37. Phổ ESI-MS của mẫu ly trích từ hạt dịng D8-1..................................108
Hình 3.38. So sánh kiểu hình cây chuyển gen và cây đối chứng...........................110


13

TĨM TẮT
Hiện nay, ứng dụng cơng nghệ gen để cải tạo giống cây trồng, tạo giống đã
và đang đạt đƣợc nhiều thành tựu với ngày càng nhiều giống cây mới đƣợc tạo ra,
đƣa vào sản xuất. Một trong những ƣu điểm nổi bật của công nghệ này là trong thời
gian ngắn so với lai tạo giống truyền thống, giúp tạo đƣợc giống mới với nhiều đặc
tính vƣợt trội, có thể gồm những đặc tính từ các sinh vật khác lồi. Trong nghiên
cứu này, chúng tôi hƣớng tới tạo giống đậu tƣơng mang các gen ngoại lai từ cây
hoa Adonis aestivalis nhằm tạo đƣợc astaxanthin, một hợp chất có giá trị kinh tế và
ứng dụng cao, chuyên biệt ở hạt. Phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens đƣợc sử dụng để chuyển vào đậu tƣơng cấu trúc gen gồm: gen cbfd,
hbfd đóng vai trị chuyển hóa β-carotene thành astaxanthin; gen zm-psy từ ngô giúp
tăng cƣờng con đƣờng tổng hợp β-carotene, gen chọn lọc bar, với chất chọn lọc là
phosphinothricin (PPT). Nhiều yếu tố đƣợc khảo sát nhằm tối ƣu con đƣờng nuôi
cấy mô, chọn lọc thể chuyển gen, và nâng cao hiệu quả chuyển gen. Các khảo sát cụ
thể gồm: khảo sát các phƣơng pháp khử trùng hạt bằng khí clo và nƣớc Javel; tìm
nồng độ BA thích hợp để cảm ứng tạo chồi cho mẫu đốt lá mầm, một nửa hạt; nồng
độ IBA thích hợp để cảm ứng tạo rễ cho chồi in vitro; nồng độ PPT tối ƣu cho giai
đoạn chọn lọc chồi và duy trì áp lực chọn lọc ở giai đoạn tạo rễ, phát triển cây;
phƣơng pháp tạo vết thƣơng mẫu thích hợp sử dụng dao mổ, kim châm nhiều mũi,
sóng siêu âm, thấm hút chân khơng. Sau đó, kết quả tối ƣu từ các thí nghiệm này
đƣợc áp dụng cho giai đoạn chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng. Thể chuyển
gen trong nghiên cứu đƣợc xác định bƣớc đầu bằng phƣơng pháp PCR, tiếp theo
khẳng định sự gắn chèn bền vững của gen bằng phƣơng pháp Southern blot. Các
dòng chuyển gen phát triển trong vƣờn ƣơm sẽ đƣợc thử nghiệm tính kháng thuốc
diệt cỏ Basta, nhằm kiểm tra biểu hiện của gen bar trong cây chuyển gen. Sự di
truyền của gen biến nạp qua các thế hệ đƣợc kiểm tra bằng PCR và thử nghiệm với
Basta. Hàm lƣợng astaxanthin trong hạt đậu tƣơng đƣợc ghi nhận bằng phƣơng
pháp HPLC-MS. Ngoài ra, cây chuyển gen ở thế hệ T0, T1 và cây đối chứng không
chuyển gen cũng đƣợc so sánh các chỉ tiêu kiểu hình và năng suất hạt. Những kết
quả chính đạt đƣợc nhƣ sau. Thu thập đƣợc 7 giống đậu tƣơng, các giống này

đƣợc kiểm tra và xác nhận có sự hiện diện của β-carotene trong hạt bằng HPLC,
đây là cơ


chất ban đầu, điều kiện cần thiết để tổng hợp astaxanthin. Các giống đậu tƣơng
MTĐ 176, HL 07-15 và OMĐN 29 đƣợc ghi nhận có khả năng nảy mầm cao, sức
sống tốt, lá mầm không bị nứt, vỡ nên đƣợc chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
Khảo sát khử trùng hạt đậu tƣơng bằng khí clo trong 16 h cho thấy hiệu quả khử
trùng tốt nhất. Mẫu đốt lá mầm và một nửa hạt đƣợc cảm ứng tạo chồi tốt nhất với
môi trƣờng bổ sung 2 mg/l BA, chồi tạo rễ tốt nhất khi bổ sung IBA 1 mg/l với
giống MTĐ 176; HL 07-15 và 1,5 mg/l với giống OMĐN 29, chất chọn lọc PPT ở
nồng độ 6 mg/l phù hợp để chọn lọc thể chuyển gen với giống MTĐ 176 và 5 mg/l
cho giống HL 07-15; OMĐN 29. Các kết quả khảo sát tạo vết thƣơng mẫu cho thấy
sử dụng phƣơng pháp tạo vết thƣơng mẫu thích hợp giúp tăng đáng kể hiệu quả
chuyển gen, cụ thể với khả năng biến nạp cấu trúc gen tạo astaxanthin vào giống
đậu tƣơng MTĐ 176: dùng kim châm đâm nhẹ 3 lần để thay thế dao mổ tạo vết
thƣơng cho vùng đốt lá mầm đã tăng hiệu quả chuyển gen từ 0,33% lên 1%; kết
hợp sử dụng sóng siêu âm 30s; thấm chân không 60s ở áp lực -20 in Hg trong quá
trình tạo vết thƣơng mẫu đốt lá mầm cũng giúp tăng hiệu quả chuyển gen từ 0,67 %
lên 2%. Nghiên cứu đã tạo đƣợc nhiều dòng đậu tƣơng chuyển gen, trong đó hai
dịng có khả năng sản xuất astaxanthin chun biệt ở hạt và di truyền gen chuyển
cho các thế hệ tiếp theo. Hàm lƣợng astaxanthin trong hạt thế hệ T1 của hai dòng
đậu tƣơng chuyển gen lần lƣợt là 0,31 µg/g (D2) và 0,77 µg/g (D8). Trong các giai
đoạn sinh trƣởng, phát triển cũng nhƣ năng suất hạt cho thấy cây chuyển gen và đối
chứng khơng có nhiều khác biệt. Nhƣ vậy, đề tài đã tạo đƣợc các dòng đậu tƣơng
có khả năng sản xuất astaxanthin ở hạt, làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo để
ứng dụng tạo các sản phẩm có giá trị ứng dụng thực tế.
ABSTRACT
Currently, application of gene technology to improve plant varieties has been
achieving many achievements with more and more new plant varieties being created

and put into production. One of outstanding advantages of this technology is that in
a short time compared to conventional crossbreeding, it helps to create new
varieties with many superb characteristics, which may include those from other
organisms. In this study, we aimed to produce soybean lines carrying foreign genes


from the red flowered-Adonis aestivalis to produce seed-specific astaxanthin, a
compound with high economic and application value.
Method of Agrobacterium-mediated genetic transformation was used to transfer into
soybean the genetic structure including: cbfd, hbfd gene, play the role of converting
β-carotene into astaxanthin; zm-psy gene from corn, enhances the synthesis of βcarotene; bar-selective gene, with the selective agent phosphinothricin (PPT). Many
factors were investigated to optimize tissue culture pathways, selection of
transgenics, and transformation efficiency. Specific surveys include: methods of
sterilizing seeds with chlorine gas and Javel detergent; appropriate concentrations of
BA to induce shoot regeneration for cotyledonary node, half seed explant; suitable
concentrations of IBA to induce rooting of in vitro shoots; optimal concentrations of
PPT for transgenic shoot selection and maintenance of selective pressure at rooting
and plant development stages; appropriate method of wounding explants using
scalpel, multi-needle, ultrasound, vacuum infiltration. The optimal results from
these experiments were then applied to generate transgenic soybean lines producing
astaxanthin. Transformants in this study were initially determined by PCR, followed
by the confirmation of stable insertion of the transgenes by Southern blot method.
Transgenic lines grown in greenhouse will be tested for resistance to Basta
herbicide, to check the expression of bar gene in transgenic plants. Inheritance of
transgenes across generations was checked by PCR and herbicide leaf painting
assay. Astaxanthin content in soybean seeds was analyzed by HPLC-MS method. In
addition, the transgenic plants in the T0, T1 generation and the non-transgenic
control plants were also compared for phenotypic parameters and seed yield. The
main results obtained are as follows. Collected 7 soybean varieties, these varieties
were tested and confirmed for the presence of β-carotene in seeds by HPLC, which

is the initial substrate, necessary condition for astaxanthin synthesis. Soybean
varieties MTD 176, HL 07-15 and OMDN 29 were recorded with high germination
ability, good vigor, and cotyledons were not cracked or broken, so they were
selected for further studies. Sterilizing of soybean seeds with chlorine gas for 16 h
showed the best sterilization effect. Cotyledonary node and half seed explants were
best induced to produce shoots in the medium supplemented with 2 mg/l BA;


The best rooting efficiency was achieved in 1 mg/l IBA with the MTD 176; HL 0715 varieties and 1.5 mg/l for OMDN 29 variety; PPT selective agent at a
concentration of 6 mg/l is suitable for selecting transformants with variety MTD
176 and 5 mg/l for HL 07-15; OMDN 29. The results of the appropriate wounding
survey showed that using proper explant wounding method significantly increased
efficiency

of

gene

transfer,

specifically,

in

transferring

astaxanthin

biosynthesis genes into MTD 176 soybean variety: puncturing 3 times with multineedle to replace scalpel for wounding MTD 176 cotyledonary node has increased
the transformation efficiency from 0.33% to 1%; combined use of 30s ultrasound;

60s vacuum infiltration at -20 in Hg during wounding of cotyledonary nodes also
increased efficiency of gene transfer from 0.67% to 2%. This study generated many
transgenic soybean, in which, two lines have ability to produce seed-specific
astaxanthin and pass astaxanthin biosynthesis genes to next generations.
Astaxanthin content in the T1 generation seeds of two transgenic soybean lines was
0.31 µg/g (D2) and 0.77 µg/g (D8), respectively. In stages of growth, development
as well as seed yield, there was not much differences between transgenic and
control plants. Thus, this research has gernerated value-added soybean lines capable
of producing astaxanthin in seeds, serving as a basis for further studies to create
products with practical applications.


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Astaxanthin (C40H52O4) là một loại carotenoid màu đỏ, trong tự nhiên đƣợc
tìm thấy ở động vật, thực vật và vi sinh vật. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh
astaxanthin có tác dụng vƣợt trội trong lĩnh vực chăm sóc, bảo vệ sức khỏe nhƣ
chống oxy hóa, bảo vệ DNA, tăng cƣờng miễn dịch, hỗ trợ điều trị tiểu đƣờng, tim
mạch, thần kinh...[1][2]. Hiện nay, sản phẩm bổ sung astaxanthin đã lƣu hành phổ
biến trên thị trƣờng gồm viên nang, bột, kem bảo vệ da, gel... Ngồi ra, ngành chăn
ni, thủy sản cũng tiêu thụ khối lƣợng lớn astaxanthin để tạo màu đỏ tự nhiên cho
sản phẩm thịt, cá, tôm bằng cách bổ sung vào nguồn thức ăn. Do đƣợc sử dụng phổ
biến, hiệu quả trên nhiều lĩnh vực nên nhu cầu astaxanthin trên thị trƣờng rất lớn và
ngày càng tăng. Điều này làm cho giá astaxanthin rất cao, với astaxanthin tự nhiên
là 2500-7000 USD/kg, astaxanthin tổng hợp khoảng 1000 USD/kg, tổng nhu cầu
trên thế giới đạt khoảng 280 tấn, trị giá 447 triệu USD năm 2014, ƣớc tính đến năm
2020 đạt mức 1,1 tỉ USD [3][4][5].
Hai nguồn cung chính của astaxanthin gồm sản phẩm tổng hợp hoặc ly trích
từ sinh vật, với nguồn tổng hợp chỉ giới hạn sử dụng để tạo màu tự nhiên cho thực
phẩm, còn astaxanthin tự nhiên đƣợc dùng trong chăm sóc, bảo vệ sức khỏe. Loại

có nguồn gốc tự nhiên chủ yếu đến từ ly trích tảo Haematococcus pluvialis, nấm
men Xanthophyllomyces dendrorhous, hoặc vỏ tôm, cua... Trên thực vật, astaxanthin
chỉ có ở một số cây có hoa thuộc chi Adonis nhƣ Adonis aestivalis [6]. Cánh hoa
màu đỏ của các lồi thuộc chi Adonis có sản lƣợng thấp nên khó khai thác để cung
cấp astaxanthin. Nghiên cứu chuyển gen tạo astaxanthin vào các cây thực phẩm mà
các sản phẩm của nó đã đƣợc sử dụng phổ biến trong thực tế là một hƣớng nghiên
cứu nhiều tiềm năng. Điều này hứa hẹn cung cấp các sản phẩm có giá trị kinh tế và
sử dụng cao. Nhiều nghiên cứu chuyển gen tạo astaxanthin, có nguồn gốc từ vi
khuẩn, tảo..., vào các loại cây trồng khác nhau nhƣ ngô, gạo, táo đã đƣợc thực hiện
[7][8]. Đậu tƣơng vốn là cây trồng quan trọng với nhiều ƣu điểm nổi bật ở giá trị
dinh dƣỡng của hạt đậu, khả năng thích nghi ở nhiều vùng trồng, giúp cải tạo đất,
đồng thời các sản phẩm từ đậu tƣơng rất đa dạng và phổ biến trong đời sống hàng


ngày nhƣ đậu hũ, chao, sữa, bột, dầu ăn... nên tiềm năng ứng dụng với giống đậu
tƣơng mới rất lớn. Tuy nhiên, nghiên cứu chuyển gen tạo astaxanthin trên đậu
tƣơng còn hạn chế. Ở Việt Nam, chƣa ghi nhận đƣợc nghiên cứu chuyển gen tạo
astaxanthin vào đậu tƣơng. Do đó, nghiên cứu này đã đƣợc thực hiện nhằm chuyển
các gen từ cây hoa Adonis aestivalis vào đậu tƣơng giúp cây có khả năng sản xuất
astaxanthin chuyên biệt ở hạt, từ đó tạo các sản phẩm có thể đƣợc ứng dụng.
2. Mục tiêu của đề tài
Tạo đƣợc dòng đậu tƣơng biến đổi gen có khả năng tổng hợp astaxanthin ở
hạt thơng qua phƣơng pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam chuyển gen tạo astaxanthin vào thực
vật nói chung và cây đậu tƣơng nói riêng. Giống đậu tƣơng dùng để chuyển gen là
các giống lai đã đƣợc thuần hóa và trồng phổ biến. Ngoài ra, trên thực vật, khả năng
tạo astaxanthin chỉ có ở một số lồi thuộc chi Adonis. Các gen đóng vai trị chính

trong q trình chuyển hóa tạo astaxanthin đã đƣợc xác định gồm gen cbfd (mã hóa
enzyme carotenoid β-ring 4-dehydrogenase) và gen hbfd (mã hóa enzyme
carotenoid 4-hydroxy-β-ring 4-dehydrogenase). Các gen này lần đầu tiên đƣợc sử
dụng để chuyển vào một lồi thực vật khác, có khả năng hoạt động hiệu quả giúp
cây chuyển gen sản xuất astaxanthin, điều này làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng
dụng tiếp theo.
Nghiên cứu cũng cho thấy ảnh hƣởng đáng kể của các phƣơng pháp tạo vết
thƣơng mẫu khác nhau đến hiệu quả chuyển gen vào giống đậu tƣơng MTĐ 176
thơng qua vi khuẩn A. tumefaciens. Trong đó, các phƣơng pháp tối ƣu dùng kim
châm, dao mổ kết hợp sóng siêu âm, thấm hút chân khơng đã đƣợc xác định, có thể
đƣợc áp dụng để nâng cao hiệu quả chuyển gen vào các giống đậu tƣơng khác.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Cây đậu tƣơng biến đổi gen có khả năng sản xuất astaxanthin chuyên biệt ở
hạt có thể đƣợc sử dụng để sản xuất các sản phẩm từ hạt đậu có chứa astaxanthin


nhƣ thức ăn chăn nuôi, thủy sản hoặc bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm cho
ngƣời nhƣ bột ngũ cốc...
4. Đối tƣợng, phạm vi và nội dung nghiên cứu của đề tài
Nghiên cứu sử dụng một số giống đậu tƣơng đƣợc trồng phổ biến ở Việt
Nam. Các giống này đƣợc dùng để chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
giúp tạo đƣợc cây đậu tƣơng có khả năng sản xuất astaxanthin. Cây đậu tƣơng
chuyển gen đƣợc phân tích sự hiện hiện gen biến nạp bằng PCR và Souhern blot,
đồng thời đánh giá so sánh kiểu hình và khả năng sinh sản với cây đối chứng. Hạt
đậu chuyển gen đƣợc phân tích xác định hàm lƣợng astaxanthin ở thế hệ T1.
Nội dung nghiên cứu chính của đề tài:
Nội dung 1: Xây dựng hệ thống tạo cây con hoàn chỉnh in vitro từ đốt lá
mầm và một nửa hạt.
Nội dung 2: Khảo sát các điều kiện thích hợp để ứng dụng trong qui trình
chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng.

Nội dung 3: Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng gián tiếp thông qua vi
khuẩn A. tumefaciens và kiểm tra, đánh giá các dịng đậu tƣơng chuyển gen.
5. Những đóng góp mới của luận án
Các gen cbfd2 (mã hóa enzyme enzyme carotenoid β-ring 4-dehydrogenase)
và gen hbfd1 (mã hóa enzyme carotenoid 4-hydroxy-β-ring 4-dehydrogenase) có
nguồn gốc từ cây hoa Adonis aestivalis kết hợp với gen Zm-psy (mã hóa enzyme
phytoen sythetase) có nguồn gốc từ ngô khi đƣợc chuyển vào đậu tƣơng đã giúp
tạo đƣợc cây phát triển bình thƣờng, có khả năng sản suất astaxanthin.
Xây dựng đƣợc qui trình giúp nâng cao hiệu quả chuyển gen trên giống đậu
tƣơng MTĐ 176, qui trình này có thể đƣợc áp dụng để nâng cao hiệu quả chuyển
gen trên các giống khác. Cụ thể cải tiến trong phƣơng pháp tạo vết thƣơng mẫu
gồm: sử dụng kim châm đâm nhẹ 3 lần hoặc dùng dao mổ cắt nhẹ lên vùng đốt lá
mầm 5 lần kết hợp xử lý sóng siêu âm 30 giây hoặc thấm hút chân khơng 60 giây.


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Chuyển hóa tạo carotenoid ở thực vật
Carotenoid là một loại sắc tố hữu cơ tự nhiên có nhiều trong thực vật, đóng
vai trị quan trọng giúp bảo vệ, tăng cƣờng sức khỏe nhƣ chống oxy hóa, ung thƣ,
tăng cƣờng sức khỏe tim mạch, là tiền chất của vitamin...[9][10]. Tuy nhiên, con
ngƣời không thể tự tổng hợp carotenoid mà hấp thu qua thực phẩm. Nhiều nghiên
cứu đã đƣợc thực hiện nhằm thay đổi chu trình chuyển hóa carotenoid ở thực vật để
tăng cƣờng các sản phẩm mong muốn, trong đó nổi bật là β-carotene [11][12][13].
Bên cạnh đó, astaxanthin, một carotenoid, nằm ở cuối chuỗi chuyển hóa của một số
lồi thực vật thuộc chi Adonis cũng đang thu hút nhiều quan tâm nghiên cứu do có
giá trị thị trƣờng rất cao, với công dụng vƣợt trội trong bảo vệ, tăng cƣờng sức
khỏe [14][15][16][17][18]. Sau đây là chu trình chuyển hóa tổng hợp carotenoid ở
thực vật và một số cải biến chính đã đƣợc thực hiện.
1.1.1. Sinh tổng hợp và tích trữ carotenoid
Carotenoid đƣợc tổng hợp từ những tiền chất tạo bởi con đƣờng chuyển hóa

MEP (methylerythritol 4-phosphate pathway) diễn ra trong lạp thể. Glyceraldehyde3-phosphate và pyruvate là những cơ chất ban đầu để tổng hợp geranylgeranyl
pyrophosphate (GGPP), tiền chất chung để tổng hợp các carotenoid và những hợp
chất terpenoid khác (hình 1.1).
Bƣớc đầu tiên trong con đƣờng tổng hợp carotenoid là sự kết hợp hai phân
tử GGPP tạo thành 15-cis-phytoene đƣợc xúc tác bởi enzyme phytoene synthase
(PSY). Phytoene đƣợc chuyển thành lycopene bởi hai phản ứng khử bão hòa xúc
tác bởi phytoene desaturase (PDS) và zeta-carotene desaturase (ZDS).
Lycopene là điểm phân nhánh của con đƣờng tổng hợp do là cơ chất của hai
enzyme cyclase cạnh tranh nhau, β lycopene cyclase (β-LCY) và ε

lycopene

cyclase (ε-LCY). α-carotene đƣợc tạo ra khi β-LCY và ε-LCY hoạt động kết hợp
với nhau ở hai đầu của phân tử lycopene, trong khi β-carotene đƣợc tạo thành khi
chỉ β-LCY hoạt động. α-carotene và β-carotene đƣợc hydroxyl hóa bởi ε-ring
carotene hydroxylase và β-ring carotene hydroxylase để tạo lutein và zeaxanthin.


Lutein là sản phẩm cuối cùng của nhánh β, ε cịn zeaxanthin đƣợc oxy hóa
bởi zeaxanthin epoxidase (ZEP) trong hai bƣớc để tạo violaxanthin thông qua
antheraxanthin. Những phản ứng này có thể đảo ngƣợc bởi violaxanthin
deepoxidase (VDE), tạo thành vịng xanthophyll giúp thực vật thích nghi với stress
ánh sánh cƣờng độ cao. Violaxanthin đƣợc chuyển thành neoxanthin bởi
neoxanthin synthase (NXS), carotenoid cuối cùng của nhánh β,β [19][20][21].

Hình 1.1. Sơ đồ con đƣờng sinh tổng hợp carotenoid [19]
Tích trữ carotenoid: Carotenoid thƣờng đƣợc tổng hợp trong hầu nhƣ tất cả
các loại lạp thể của lá, rễ, hoa, trái, hạt bao gồm lục lạp, sắc lạp, bột lạp, dầu lạp…
nhƣng đƣợc tích lũy với lƣợng lớn trong lục lạp và sắc lạp. Trong lục lạp, hầu hết

các carotenoid đƣợc tích lũy ở dạng phức protein-chlorophill-chlorophyll trong các
màng thylakoid. Carotenoid của hạt đƣợc giữ trong các ngăn elaioplasts (các lạp thể
dự trữ lipid, vơ sắc lạp), có cấu trúc đặc biệt để dự trữ số lƣợng lớn các carotenoid.
Trong sắc lạp phần lớn các carotenoid có thể đƣợc dự trữ trong các màng, thể dầu
hoặc dạng tinh thể trong stroma [22][23][24].
1.1.2. Thay đổi chuyển hóa sinh tổng hợp carotenoid
Những thay đổi đƣợc thực hiện trên một số gen mã hóa các enzyme quan
trọng trong con đƣờng sinh tổng hợp carotenoid, giúp tăng cƣờng sự tích lũy hoặc
thay đổi tỉ lệ các loại carotenoid đƣợc tạo thành. Sau đây là một số gen mã hóa các
enzyme đã đƣợc sử dụng.
Phytoene synthase: Phytoene synthase (PSY) là enzyme xúc tác bƣớc đầu
tiên đóng vai trị quan trọng, quyết định đến quá trình sinh tổng hợp carotenoid, là
phản ứng kết hợp hai phân tử GGPP tạo thành phytoene. Do đó sự biểu hiện của
gen psy là yếu tố điều hòa quan trọng trong q trình tích lũy carotenoid ở thực vật.
Nhiều nghiên cứu cho thấy khi psy đƣợc tăng biểu hiện, có thể kết hợp với sự tăng
biểu hiện của gen ở các bƣớc sau nhƣ pds, β-lcy, đã giúp tăng đáng kể hàm lƣợng
carotenoid trong các loại cây trồng nhƣ cà chua [25], cà rốt [26], canola [27], gạo
Golden Rice [28], khoai tây vàng [29], khoai tây và ngô [30]. Carotenoid tổng của
các loại cây trồng biến đổi gen có thể tăng 2 - 50 lần ở các loài khác nhau, với từ 1,6
- 3600 lần ở mức độ β-carotene và dẫn đến màu sắc thay đổi sang vàng hoặc cam.
Các nghiên cứu chuyển gen ghi nhận gen psy có nguồn gốc khác nhau (ngô,
lúa gạo, arabidopsis, hoa thủy tiên,...) sẽ giúp tăng cƣờng con đƣờng tổng hợp
carotenoid ở mức độ rất khác nhau. Paine và cộng sự (2005) nhận thấy gen psy có
nguồn gốc từ ngơ giúp tăng cƣờng tổng hợp, tích lũy carotenoid cao hơn đáng kể so
với psy từ các cây khác nhƣ Arabidopsis, cà chua, cà rốt, ớt, lúa [28]. Nhằm nâng
cao hơn khả năng tích lũy carotenoid của gạo Golden Rice thế hệ đầu tiên, nhóm tác
giả đã thay psy có nguồn gốc từ cây hoa thủy tiên bằng psy từ ngô, kết quả đã giúp
tăng hàm lƣợng carotenoid ở gạo Golden Rice thế hệ 2 gấp 23 lần, tối đa đạt đƣợc
là 37 µg/g, so với Golden Rice thế hệ đầu, ngoài ra thành phần β-carotene cũng

chiếm chủ yếu với 84% trong carotenoid tổng. Các nghiên cứu tổng hợp astaxanthin
trên lúa gạo và ngô cũng cho thấy gen psy từ ngơ có khả năng giúp tăng cƣờng
con


đƣờng tổng hợp carotenoid, từ đó giúp tăng sự tổng hợp astaxanthin [31] [8]. Nhƣ
vậy, nhiều nghiên cứu đã cho thấy gen psy từ ngơ có thể đƣợc sử dụng giúp tăng
đáng kể khả năng tổng hợp carotenoid trong cây chuyển gen nên sẽ đƣợc sử dụng
trong nghiên cứu này nhằm nâng cao con đƣờng tổng hợp carotenoid trên cây đậu
tƣơng, qua đó giúp tăng cƣờng sự tổng hợp astaxanthin.
Phytoene desaturase và isomerase: Sự tăng cƣờng biểu hiện các gen liên
quan đến bƣớc chuyển hóa phytoene thành lycopene nhƣ PDS (phytoene
desaturase, ZDS (ζ-carotene desaturase), CRTISO (carotenoid isomerase), Z-ISO
(15-cis-ζ- carotene isomerase) cũng giúp nâng cao khả năng tổng hợp carotenoid ở
thực vật [32][33].
Lycopene cyclase: Sự cạnh tranh hoạt động của β-LCY và ε-LCY xác định tỉ
lệ lycopene đƣợc định hƣớng vào hai nhánh của con đƣờng carotenoid để tổng hợp
β-carotene hoặc α-carotene [34]. Lá của cây Arabidopsis đột biến bất hoạt gen mã
hóa ε-LCY dẫn đến thiếu hụt lutein và tăng cƣờng tổng hợp β-carotene, khoai tây
bất hoạt gen ε-LCY ở thân cũng tăng hàm lƣợng β-carotene gấp 14 lần [35].
1.1.3. Tổng quan về astaxanthin
1.1.3.1. Đặc điểm hóa học
Danh pháp: 3,3′-dihydroxy-β, β-carotene-4,4′-dione
Công thức phân tử: C40H52O4
Trọng lƣợng phân tử: 596,84 g/mol.
Cấu tạo phân tử:

Hình 1.2. Bột astaxanthin [36]

Astaxanthin là một carotenoid, màu đỏ (hình 1.2), cấu tạo bởi 40 phân tử
cacbon, đƣợc liên kết bằng các nối đôi và đơn xen kẽ. Cấu tạo phân tử khác biệt của
astaxanthin so với các loại ketocarotenoid khác là cấu trúc vịng ở hai đầu, ngồi
nhóm keto (CO), cịn có nhóm hydroxyl (OH). Điều này giúp tăng khả năng chống
chống oxy hóa, tính phân cực, khả năng ester hóa và tính ổn định cho phân tử
astaxanthin [37]. Astaxanthin có ba dạng đồng phân, phụ thuộc vào hƣớng khơng
gian của nhóm OH ở vị trí cacbon số 3 và 3’: (3R, 3′R), (3R , 3′S), (3S, 3′S) [38].
1.1.3.2. Công dụng và giá trị của astaxanthin
Astaxanthin có tính chống oxy hóa, mạnh hơn cả vitamin C, E, các
carotenoid khác nhƣ β carotene, lycopene, zeaxanthin… (hình 1.3) nên đƣợc dùng
làm chất chống các gốc tự do có hại cho cơ thể [39]. Hơn nữa, phân tử astaxanthin
có cả 2 đặc tính tan và khơng tan trong lipid, do đó có thể kết nối với màng tế bào
cả bên trong và bên ngoài, giúp tăng hiệu quả chống oxy hóa so với các chất chỉ có
một đặc tính (hình 1.4) [40][41][42].

Hình 1.3. So sánh khả năng chống gốc oxy tự do có hại cho cơ thể của một số chất
chống oxy hóa [43]
Nhiều nghiên cứu cho thấy astaxanthin cịn có tác dụng bảo vệ DNA, tăng
cƣờng hệ miễn dịch, giảm sự phát triển của khối u ung thƣ trên mơ hình động vật,
hiệu quả trong hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đƣờng, stress oxy hóa, viêm, tim mạch, một
số vấn đề về các chức năng thần kinh… [1][2][44][45]. Với nhiều công dụng nhƣ
trên, hiện nay, các dạng sản phẩm khác nhau của astaxanthin đã đƣợc bán trên thị
trƣờng nhƣ: thuốc viên, syro, dầu, gel, kem, sinh khối, bột… [40].


Hình 1.4. Vị trí của phân tử astaxanthin trong màng tế bào [40]
Ngoài ra, từ năm 2009, cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA)
và Ủy ban Châu Âu đã cho phép sử dụng astaxanthin làm chất tạo màu tự nhiên cho
thực phẩm. Đến nay, astaxanthin đã đƣợc sử dụng phổ biến để tạo màu đỏ tự nhiên
cho sản phẩm trong ngành chăn nuôi gia cầm, thủy sản [38][46].

iệ
u
Eu
ro

Hình 1.5. Qui mơ thị trƣờng astaxanthin đến năm 2022 [4]
Astaxanthin có nhiều cơng dụng trong bảo vệ sức khỏe, đồng thời cũng đƣợc
dùng phổ biến làm chất tạo màu nên nhu cầu astaxanthin rất lớn và ngày càng tăng
(hình 1.5) [4][47][48]. Năm 2014, thị trƣờng thế giới tiêu thụ khoảng 280 tấn, đạt
giá trị 447 triệu USD, đến năm 2019 qui mô thị trƣờng astaxanthin đã đạt mức 1 tỉ
USD, với mức tăng ƣớc tính khoảng 16,2%/năm đến năm 2027 [3][4][49]. Hiện
nay, giá astaxanthin trên thị trƣờng rất cao, với astaxanthin tự nhiên là 2.500-7.000
USD/kg, astaxanthin tổng hợp khoảng 1.000 USD/kg [4], khoảng 95% astaxanthin