Giáo trình Công nghệ sinh học trong Bảo vệ thực vật (Nghề: Bảo vệ thực vật - Cao đẳng): Phần 2 - Trường Cao đẳng cộng đồng Đồng Tháp

Chương 3
THÀNH TỰU CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT
NN405-3
Mục tiêu: giúp sinh viên biết về các thành tựu của công nghệ sinh học trong BVTV
Trong hơn thập kỷ qua, nhờ thành tựu to lớn của công nghệ gen, người ta đã
chuyển thành công những gen phân lập từ sinh vật này vào những sinh vật khác để tạo
ra cơ thể biến đổi gen mang các đặc tính mong muốn. Sản phẩm biến đổi gen đang đem
lại những lợi nhuận kinh tế khổng lồ cho nhiều quốc gia. Ở Mỹ, hiện nay có tới 1.300
cơng ty Cơng nghệ sinh học với doanh thu hàng năm đạt khoảng 12,7 tỷ đô la. Trong số
các sản phẩm tạo ra (có liên quan đến biến đổi gen), sản phẩm y dược chiếm tới 75%,
trong khi sản phẩm nông nghiệp chỉ chiếm 3%. Tuy nhiên, sự đầu tư mở rộng quy mô
nghiên cứu và khai thác sản phẩm nông nghiệp biến đổi gen ngày càng tăng.
Năm 1996, toàn thế giới chỉ có 1,7 triệu ha trồng cây biến đổi gen, nhưng đến
năm 2004 diện tích cây trồng biến đổi gen tồn cầu tăng lên gần 48 lần, đạt tới 81 triệu
ha, trong đó hơn 1/3 diện tích này là ở các nước đang phát triển. Hiện nay, có khoảng
20 quốc gia sản xuất cây trồng biến đổi gen với diện tích từ 50.000 ha trở lên. Mỹ là
quốc gia hàng đầu trồng cây biến đổi gen với diện tích trong năm 2004 là 47,6 triệu ha
(chiếm 59%). Tiếp đến là Argentina: 16,2 triệu ha (20%), Canada: 5,4 triệu ha (6,7),
Brazil: 5 triệu ha (6%), Trung Quốc: 3,7 triệu ha (4,6%). Ở châu Á, cây trồng biến đổi
gen chủ yếu là bông, được trồng nhiều ở Trung Quốc, Ấn Độ, Philippines và Indonesia
(trích từ Trần Thị Lệ, 2006).
Có 4 loại cây trồng biến đổi gen được thương mại hóa mạnh nhất. Đó là: đậu
tương kháng thuốc diệt cỏ đạt đến diện tích 48,4 triệu ha (chiếm 60% tổng diện tích cây
trồng biến đổi gen năm 2004), ngô kháng thuốc diệt cỏ và kháng sâu đạt diện tích 19,3
triệu ha (chiếm 24%), bơng kháng thuốc diệt cỏ và kháng sâu đạt diện tích 9 triệu ha
(chiếm 11%) và cải dầu kháng thuốc diệt cỏ đạt diện tích 4,3 triệu ha (chiếm 5%). Nếu
so sánh diện tích trồng cây biến đổi gen với tổng diện tích cây trồng cùng loại ở quy mơ
tồn cầu thì đậu tương biến đổi gen chiếm 56%, bơng biến đổi gen chiếm 28%, cải dầu
biến đổi gen chiếm 19% và ngơ biến đổi gen chiếm 14%. Ngồi 4 loại cây trồng biến
đổi gen chính đã được thương mại hóa rộng rãi nói trên, cịn có hàng loạt các cây trồng
biến đổi gen khác như kháng nấm, kháng virus, chín chậm... cũng đã và đang được phổ

biến (trích từ Trần Thị Lệ, 2006).

29


Hình 3.1. Tỷ lệ (%) của các loại cây biến đổi gen được đưa vào sản xuất.
Thực vật biến đổi gen đã mang lại những đặc tính tốt cho cây trồng. Cho đến nay
gen được chuyển vào thực vật nhiều nhất là gen kháng thuốc diệt cỏ và kháng côn trùng.
Vì vậy, đã làm giảm một lượng đáng kể thuốc diệt cỏ và trừ sâu được sử dụng trong
nông nghiệp.
3.1. Cây trồng kháng thuốc diệt cỏ
Trong sản xuất nông nghiệp có tính chun mơn hóa cao thì việc sử dụng các loại
thuốc diệt cỏ dại là điều rất cần thiết nhằm đảm bảo năng suất cây trồng. Tuy nhiên, việc
lạm dụng một số thuốc diệt cỏ có độc tính cao đã và đang gây ra các hậu quả nghiêm
trọng đối với môi trường, hệ sinh thái và sức khỏe con người. Gần đây, người ta đã tổng
hợp được một số hợp chất chỉ tồn tại trong tự nhiên một thời gian ngắn, nhưng lại tiêu
diệt toàn bộ cây cối. Các hợp chất này được gọi là thuốc diệt cỏ không chọn lọc.
Bằng phương pháp sử dụng đột biến, người ta đã phân lập được một số gen tạo
cho cây trồng có khả năng kháng các loại thuốc diệt cỏ nói trên. Việc chuyển các gen
này vào cây đã nâng cao tính chọn lọc và hiệu quả kinh tế của thuốc diệt cỏ cũng như
làm giảm ảnh hưởng của thuốc đối với quần thể sinh vật trong đất. Thật vậy, khi chưa
có loại cây trồng biến đổi gen kháng thuốc khơng chọn lọc, người ta phải phun nhiều
lần trước khi gieo hạt nhằm loại bỏ hoàn toàn mầm mống cỏ dại. Nhưng khi người nông
dân gieo trồng loại cây biến đổi gen thì họ đợi cho cây trồng và cỏ dại cùng phát triển
đến một mức độ nhất định, sẽ tiến hành phun thuốc một lần là có thể đảm bảo loại bỏ sự
xâm lấn của cỏ dại. Đồng thời việc phun thuốc khi mà cây trồng đã phát triển sẽ làm
giảm thuốc diệt cỏ thấm vào đất, làm giảm nguy cơ gây hại đối với môi trường.
Kháng thuốc diệt cỏ nhân tạo là đặc điểm thường được sử dụng nhiều nhất cho
đến nay ở thực vật biến đổi gen.
Điều này có nhiều nguyên nhân:

- Thứ nhất là tạo ra thực vật biến đổi gen loại này tương đối đơn giản.
- Thứ hai, cỏ dại là một vấn đề lớn nhất trong nông nghiệp, làm giảm năng suất từ 1015%.
Về cơ bản phân biệt loại thuốc diệt cỏ chọn lọc với loại không chọn lọc. Ở liều
lượng nhất định loại kháng chọn lọc có tác dụng đối với thực vật có đặc điểm sinh lý và
hình thái nhất định. Ví dụ: thuộc nhóm này gồm có: atrazin, bromoxynil, 2,4-D. Tác
dụng của thuốc diệt cỏ chọn lọc:
Atrazin: Làm ngừng sự vận chuyển điện tử trong hệ thống quang hóa II ở lục
lạp (cần thiết đối với quang hợp của thực vật). Ngô khơng mẫn cảm với atrazin.
Bromoxynil: Đình chỉ sự vận chuyển điện tử trong hệ thống quang hóa II của
lạp thể, làm chết cây hai lá mầm.
Glyphosate (Round upR): Làm ngừng hoạt động enzyme EPSP-synthase và qua
đó kìm hãm sự tổng hợp các amino acid thơm.
Phosphinothricin (PPT) còn gọi là Basta: PPT là đồng phân dạng L của sản
phẩm tổng hợp glufosinate. PPT có cấu trúc tương tự glutamic acid, gắn khơng thuận
nghịch với enzyme glutamatsynthase, gây độc do tích lũy NH3.
2,4-D: Auxin tổng hợp này gây hại cho sự phát triển của cây hai lá mầm, phần
lớn cây một lá mầm không mẫn cảm.

30


Một số loại thuốc diệt cỏ chọn lọc tồn tại lâu trong đất, vì vậy nó làm nhiễm
nguồn nước.
Ngược lại, thuốc diệt cỏ không chọn lọc như glyphosate hoặc phosphinothricin
(PPT) độc đối với tất cả cây trồng.
Ưu điểm của hai loại thuốc diệt cỏ này là phân giải rất nhanh trong đất thành
những chất không hại.
Thời gian bán hủy của Basta trong đất chỉ 10 ngày và Round up từ 3 đến 60 ngày.
Thời gian bán hủy là khoảng thời gian mà 50% chất này bị biến đổi và phân giải.
Để sản xuất cây chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ, người ta cần những gen kháng

mã hóa cho protein, những protein này hoặc làm bất hoạt thuốc diệt cỏ, hoặc thay đổi vị
trí tác động của thuốc trong tế bào, làm thuốc khơng cịn gây hại. Cơ chế kháng thuốc
diệt cỏ khơng chọn lọc Basta và glyphosate được giải thích như sau:
Basta là thuốc diệt cỏ không chọn lọc được sử dụng trong hơn 50 quốc gia, nhưng
được sử dụng rất có giới hạn, vì nó gây độc ở cây trồng và cỏ dại như nhau. Gần đây,
rất nhiều loại cây trồng biến đổi gen được tạo nên và đã được thử nghiệm trong hơn 100
thí nghiệm đồng ruộng, trong đó nhiều loại đã được đưa ra thị trường. Những gen kháng
được phân lập từ vi sinh vật hoặc từ thực vật kháng trong tự nhiên. Từ cây linh lăng thảo
(Medicago sativa) một gen không mẫn cảm với Basta được phân lập và từ vi khuẩn đất
Streptomyces hygroscopius và S. viridochromogenes 2 gen bar và pat được phân lập,
những gen này mã hóa cho enzyme phosphinothricin-acetyltransferase. Enzyme này làm
mất độc tính của thuốc bằng acetyl hóa, gắn vào một gốc acetyl. Để sử dụng cho thực
vật, những gen từ vi khuẩn được biến đổi và được điều khiển bởi promoter CaMV 35S
nhằm đạt được sự biểu hiện gen thường xuyên trong tất cả các mô. Bằng cách này cây
linh lăng thảo, cà chua, ngô, lúa, lúa mỳ và đậu tương kháng thuốc diệt cỏ được tạo nên.
Thuốc diệt cỏ glyphosate đình chỉ đặc hiệu enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3phosphate-synthase (EPSP-synthase). Đây là enzyme cần thiết trong thực vật để tổng
hợp amino acid thơm (phenylalanin, tryptophan và tyrosin), một số vitamin và các hợp
chất có nguồn gốc thứ cấp. Enzyme này khơng có ở người và động vật, vì vậy glyphosate
khơng độc đối với người. Glyphosate được phân giải trong đất nhờ vi sinh vật và không
để lại sản phẩm độc hại nào.
Kháng glyphosate có thể do những cơ chế khác nhau:
- Thứ nhất trong cây có sự biểu hiện mạnh mẽ của enzyme của EPSP-synthase dưới sự
điều khiển của promoter CaMV-35S và đồng thời tạo nên một enzyme oxidoreductase
của vi khuẩn. Nhờ enzyme oxidoreductase mà thuốc bị bất hoạt và với một lượng lớn
EPSP-synthase được tạo nên thì lượng thuốc cịn lại khơng thể gây hại ở cây biến đổi
gen (Hình 3.2). Ở đây 2 gen cần thiết, trong đó gen oxidoreductase là khơng có trong
thực vật.

31

Hình 3.2. Hiệu quả kháng thuốc diệt cỏ sau 15 ngày phun thuốc.
Một khả năng thứ hai là sử dụng EPSP-synthase của vi khuẩn. Từ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens (loài CP4), EPSP-synthase vi khuẩn được phân lập và do sự
thay đổi trình tự amino acid nên enzyme này khơng cịn mẫn cảm với glyphosate và vì
vậy được sử dụng trong nhiều cây trồng thương mại.
Thứ ba là xuất hiện một dạng đột biến EPSP-synthase của cây trồng có khả năng
kháng glyphosate (Hình 3.3).
Tính kháng khơng chọn lọc được sử dụng đối với nhiều cây trồng biến đổi gen,
như cây bông, khoai tây, ngơ, đậu tương, thuốc lá và lúa mì.
Bằng việc sử dụng cây trồng kháng thuốc diệt cỏ, lượng thuốc diệt cỏ được sử
dụng giảm đi đáng kể, vì thuốc được dùng theo yêu cầu và trong phạm vi nhỏ hơn.

Hình 3.3. Đột biến xảy ra trong EPSP-synthase làm cho cây kháng thuốc diệt
cỏ glyphosate. Sự kết hợp của glyphosate vào enzyme EPSP-synthase ở loại hình bình
thường đã làm mất hoạt tính xúc tác và hạn chế sự di chuyển của enzyme này vào lục
lạp. Dạng EPSP*-synthase (mã hóa bởi ShkG*-dạng đột biến) có hoạt tính thấp với
glyphosate và vẫn thể hiện hoạt tính khi có mặt của thuốc diệt cỏ này.

32


Năm 1996 và 1997 ở Mỹ, khi sử dụng cây kháng thuốc diệt cỏ đã làm giảm lượng
thuốc dùng tương ứng là 26% và 22%. Rửa trôi đất giảm 90%, do đất không phải cày
sâu, đồng thời năng suất tăng lên 5%.
Một vấn đề khó khăn trong việc sử dụng cây biến đổi gen là sự lan truyền tính
kháng qua hạt phấn đến những cây họ hàng. Để giải quyết vấn đề này việc tạo cây biến
đổi gen là dựa vào sự thay đổi các gen trong lạp thể. Vì gen lạp thể ở phần lớn thực vật
di truyền theo tế bào chất, vì vậy tính kháng thuốc diệt cỏ không thể lan truyền được qua
hạt phấn.

EPSP-synthase hoạt động ở trong lạp thể. Nhưng gen mã hóa cho enzyme này lại
có mặt ở trong nhân. Protein được dịch mã ở ribosome trong tế bào chất và do có trình
tự đích của lạp thể nên được vận chuyển vào cơ quan tử này. Cây thuốc lá kháng
glyphosate đã được tạo nên bằng cách biến nạp gen mã hóa cho EPSP-synthase có nguồn
gốc từ cây dã yên thảo. Gen này được chèn vào DNA của lạp thể. Lạp thể cũng có
ribosome nên tổng hợp trực tiếp EPSP-synthese. Bằng cách này việc vận chuyển gen
qua hạt phấn ở phần lớn cây trồng đã không xảy ra.

33


3.2. Kháng côn trùng gây hại
Các tổn thất trước thu hoạch gây ra bởi các loại sâu phá hoại là một trong các
nguyên nhân chủ yếu làm giảm năng suất cây trồng, đặc biệt là ở các nước nhiệt đới có
nhiệt độ cao, ẩm độ lớn, thích hợp cho sự phát triển sâu bệnh như ở nước ta.
Côn trùng gây hại cây trồng ở hai khía cạnh:
- Thứ nhất là gián tiếp truyền các tác nhân gây bệnh khác như virus, vi khuẩn hoặc nấm.
- Thứ hai là trực tiếp ăn hại các cơ quan của cây trồng.
Biện pháp hữu hiệu được sử dụng rộng rãi hiện nay là phun thuốc trừ sâu hóa
học. Việc sử dụng thuốc trừ sâu làm ảnh hưởng đến môi trường sinh thái, do dư lượng
cịn lại tích lũy trong chuỗi thức ăn và mặt khác thuốc trừ sâu gây độc không đặc hiệu
đối với tất cả động vật. Vì vậy, sự phát triển những cây trồng chuyển gen kháng sâu có
ý nghĩa lớn.
Ở đây đề cập đến một loại toxin tự nhiên, được tạo ra trong vi khuẩn Bacillus
thuringensis và chỉ gây hại ở một số lồi cơn trùng nhất định, khơng hại đối với các
động vật khác và con người. Toxin này được gọi là Bt-toxin.
B. thuringensis là một vi khuẩn đất tạo bào tử. Ở quá trình tạo bào tử xuất hiện
những vỏ tinh thể chứa -endotoxin. Ở các loài B. thuringensis khác nhau người ta đã xác
định được hơn 100 loại toxin khác nhau, là những protein với khối lượng phân tử khoảng
130 kDa. Trong ruột côn trùng -endotoxin được biến đổi thành dạng độc tố hoạt động

và tích lũy trong tế bào thượng bì ruột. Việc tạo bào tử trong màng dẫn đến sự phân giải
thẩm thấu những tế bào này và làm cho côn trùng chết.
Trong nông nghiệp sinh thái vi khuẩn B. thuringensis được phun trực tiếp trên
đồng ruộng. Tuy nhiên, đối với một số cây trồng, việc phun thuốc trừ sâu Bt đơi khi ít
hiệu quả do đặc tính hình thái của cây trồng tại thời điểm cần phun thuốc. Ví dụ: đối với
cây ngơ loại cơn trùng phá hoại chính là sâu đục thân Ostrinia nubilalis. Để phòng trừ
loại sâu này, người ta phun thuốc vào thời điểm sâu bắt đầu nở. Nhưng do đặc tính khí
hậu ở một số vùng, thời điểm sâu bắt đầu nở rơi đúng vào lúc cây đã phát triển. Điều
này ngăn cản thuốc trừ sâu Bt đi tới các mô, các bộ phận mà sâu đục thân phá hoại. Mặt
khác, thuốc trừ sâu Bt rất dễ phân hủy trong môi trường tự nhiên, đặc biệt dưới ánh sáng
mặt trời chứa nhiều tia cực tím. Do vậy, ở những vùng thích hợp cho sự phát triển của
sâu đục thân, khiến cho thời kỳ sinh sản của sâu kéo dài, người nông dân phải phun
thuốc nhiều lần rất tốn kém.
Bắt nguồn từ các hạn chế của việc phun thuốc trừ sâu Bt, các nhà khoa học đã
chuyển gen Bt vào nhiều loại cây trồng. Lúc này, cây chuyển gen Bt có khả năng sinh
tổng hợp trực tiếp loại thuốc trừ sâu sinh học. Điều này giúp cho việc phòng trừ trở nên
hiệu quả hơn và giảm chi phí mua thuốc trừ sâu cho người nông dân.

34


Hình 3.4. Cây ngơ biến đổi gen, tạo ra Bt-endotoxin (phía trên) và cây ngơ
bình thường bị nhiễm sâu hại (phía dưới).
Gen mã hóa cho Bt-toxin được biến đổi cho phù hợp với thực vật, được đưa vào
các cây trồng khác nhau như bông, ngô, khoai tây và cà chua chuyển gen đang được sản
xuất thương mại biểu hiện độc tố của Βt để tạo ra tính kháng đối với các côn trùng loại
nhai-nghiền (chewing insects). Vi khuẩn B. thuringensis tổng hợp các protein endotoxin tinh thể được mã hóa bởi các gen Cry.
Người ta phân biệt 4 nhóm endotoxin (CryI đến CryIV), tùy thuộc nó độc với
lồi sâu nào, đối với Lepidoptere (bướm, CryI), Lepidoptere và Diptere (ruồi và muỗi,
CryII), Coledoptere (côn trùng cánh cứng, Cry III) và Diptere (Cry IV).

Sau nhiều thí nghiệm đồng ruộng các loại cây trồng chứa gen Bt đã có mặt trên
thị trường với kết quả tốt. Ví dụ: với việc sử dụng ngơ chứa gen Bt năm 1996 và 1997
đã làm giảm lượng thuốc trừ sâu cho cây ngô ở Mỹ 10%, năng suất tăng lên 9%, bông
chứa gen Bt năng suất tăng 7%. 60% nơng dân loại bỏ hồn tồn thuốc trừ sâu.
Một số ưu điểm của độc tố Bt như sau :
- Tính đặc hiệu, mỗi protein Cry chỉ hoạt động chống lại một hoặc một vài lồi cơn
trùng.
- Sự đa dạng, nhiều protein Cry khác nhau đã được nhận biết.
- Các ảnh hưởng không bất lợi hoặc bị giảm đã được xác nhận trên các cơn trùng khơng
phải đích hoặc các địch thủ tự nhiên của cơn trùng.
- Độc tính với động vật có vú là rất thấp.
- Có thể thoái biến dễ dàng.
Kết quả nghiên cứu cho thấy điểm mấu chốt là gen chịu trách nhiệm tổng hợp
protein tinh thể trừ sâu của vi khuẩn B. thuringensis chủng kurstaki, chưa đặc biệt biểu
hiện rõ ở cây trồng. Để nâng cao hiệu quả của độc tố, các nhà nghiên cứu đã cắt gọt bớt

35


gen chỉ để tổng hợp phần protein có hoạt tính chứa độc tố mà không cần các phần gen
phụ khác. Gen Cry được cắt bớt đã biểu hiện tổng hợp protein gấp 500 lần so với gen
nguyên thủy. Hiện nay, hơn 40 gen khác nhau mang tính kháng cơn trùng đã được hợp
nhất trong cây trồng chuyển gen với một vài giống đã được thương mại hóa ở các nước
như Mỹ, Úc…
Lợi ích của các độc tố Bt trong kiểm sốt cơn trùng đã buộc chúng ta phải có các
phương thức quản lý khác nhau để làm chậm sự phát triển của tính kháng của cơn trùng
đối với Βt, bao gồm :
- Bố trí các vùng bên cạnh trồng cây bông không chuyển gen Bt, làm nơi trú ẩn để giảm
áp lực chọn lọc hướng tới việc kháng côn trùng.
- Triển khai các gen kháng cơn trùng khác nhau (Ví dụ: protease inhibitors).

- Dùng các loại độc tố Bt cho các receptor đích khác nhau.
- Dùng các promoter khác nhau để điều chỉnh sự biểu hiện của các gen Bt.
- Dùng các promoter đặc trưng mô (tissue-specific promoter), như thế cơn trùng có thể
ăn mà khơng tổn hại đến kinh tế trên các bộ phận ít quan trọng của thực vật.
- Có các hướng khác để phát triển tính kháng côn trùng cho cây chuyển gen dựa trên cơ
sở: protease inhibitors, -amylase, lectins, chitinases, cholesterol oxidase, các virus của
côn trùng được tạo dòng, tryptophan decarboxylase, anti-chymotrypsin, bovine
pancreatic trypsin inhibitor và nhân tố ức chế lá lách.
Dĩ nhiên là Bt-toxin không độc cho tất cả mọi côn trùng và trong tự nhiên ln
có khả năng xuất hiện những lồi sâu kháng. Vì vậy, phải có chiến lược tiếp tục tạo ra
những loại cây trồng kháng.
Đặc biệt hứa hẹn là chất ức chế serin-protease, kìm hãm các enzyme tiêu hóa
quan trọng của côn trùng. Những cây trồng chứa một lượng lớn protein này có tác dụng
bảo vệ trước sự phá hoại của sâu hại.
Ngoài ra, nhiều phương pháp khác cũng được thử nghiệm. Về nguyên tắc các
phương pháp này dựa trên việc sử dụng những protein có trong tự nhiên đặc hiệu chỉ
gây hại cho cơn trùng. Điều này đặc biệt có ý nghĩa ở trong cây lương thực và thực phẩm
vì nó khơng chứa những chất độc gây hại cho người tiêu dùng.
3.3. Kháng virus gây bệnh
Tương tự như vi khuẩn, động vật và người; ở thực vật cũng tồn tại một số lượng
lớn virus. Ngồi ra, ở thực vật cịn có thể được gọi là viroide.
Virus chứa một vỏ protein và trong đó có cả màng lipid. Vật chất di truyền của
virus là DNA hoặc RNA. Viroide khơng có vỏ protein và màng mà chỉ có phân tử RNA
ở dạng vịng nhỏ. Sự tái sinh virus và viroide hồn tồn phụ thuộc vào trao đổi chất của
ký chủ. Theo quy ước quốc tế tên của virus được gọi theo tên thực vật đầu tiên mà loại
virus đó được tìm ra, sau đó đến triệu chứng đầu tiên và thêm từ virus (ví dụ: thuốc lákhảm-virus: tobacco-mosaic-virus). Virus thực vật cần sinh vật khác để truyền từ cây
này sang cây khác. Ở đây phần lớn là nhờ côn trùng, và khi chúng mang virus được gọi
là vector.
Virus thường được coi là tác nhân gây bệnh nguy hiểm. Tuy nhiên, quan niệm
này khơng hồn tồn chính xác, vì khi phân tích từng phần hệ gen thực vật cho thấy,

trong cây trồng và cây hoang dại tồn tại số lượng lớn các loại virus, trong chúng phần

36


lớn là khơng gây hại. Ngồi ra, virus ở thực vật không phải là virus ở người và động vật.
Chỉ có một số lồi virus gây thiệt hại lớn cho mùa màng. Ví dụ lồi virus tạo ra nhiều rễ
nhỏ ở củ cải đường trong một số vùng lớn ở Đức đã gây thiệt hại đến 75%.
Triệu chứng ở thực vật sau khi virus xâm nhiễm (thay đổi màu, dạng và chết) rất
đa dạng và phụ thuộc vào các yếu tố mơi trường. Ngược lại, virus thực vật có cấu tạo
đơn giản, vì chúng gồm một vỏ protein đơn giản và bên trong vỏ này chứa nucleic acid
mang những gen khác nhau.
Phần lớn virus chứa những gen mã hóa cho vỏ protein, cho sao chép thơng tin di
truyền của nó (từ DNA hoặc RNA) và một gen cho sự di chuyển bên trong thực vật từ
tế bào này đến tế bào khác.
Thường tồn tại những chủng virus họ hàng với mức độ gây bệnh khác nhau. Có
những chủng khơng gây triệu chứng, có độc tính thấp, trong khi đó có những chủng gây
triệu chứng hại rất nặng, được gọi là virus có độc tính cao. Đã lâu người ta biết rằng,
nếu tiêm chủng trước đó với lồi virus độc tính yếu thì ở trong cây xuất hiện tính miễn
dịch đối với lồi virus họ hàng độc tính mạnh hơn. Sự tái sinh của virus bị ngừng hoặc
là giảm rất mạnh, được gọi là bảo vệ chéo (cross protection) (Hình 3.5).
Người ta lợi dụng hiệu quả trên để tạo cây biến đổi gen kháng virus. Đầu tiên
những gen mã hóa cho protein vỏ của virus được đưa vào thực vật và biểu hiện dưới sự
điều khiển của promoter CaMV 35S. Thực tế cho thấy những cây này sau khi nhiễm
virus không xuất hiện triệu chứng. Theo cơ chế này những tính kháng cơ bản với nhiều
loại virus khác nhau được tạo nên.
Nhiều phương thức được sử dụng để kiểm soát sự xâm nhiễm virus bao gồm các
xử lý hóa học để giết các vector virus, chuyển vào cây trồng các gen kháng tự nhiên từ
các loài liên quan, sử dụng các phương pháp chẩn đoán hiện đại như PCR và đưa ra
những chỉ dẫn thích hợp để đảm bảo nhân giống các vật liệu khởi đầu sạch virus (ví dụ:

hạt, củ…).

37


Hình 3.5. Thí nghiệm về bảo vệ chéo. Bên trái: Cây thuốc lá được xử lý với
TMV yếu, sau đó được lây nhiễm với TMV độc tính và kết quả là cây không gây bệnh.
Ở giữa: Cây thuốc lá không được xử lý với TMV yếu, xuất hiện triệu chứng bệnh sau
khi xử lý với TMV độc tính. Bên phải: Cây biến đổi gen, chứa các gen mã hóa cho
protein vỏ của TMV, kháng được sự lây nhiễm
Tuy nhiên, phương pháp chủ yếu để khắc phục tình trạng trên là khai thác tính
kháng xuất phát từ các tác nhân gây bệnh. Chẳng hạn, sử dụng các trình tự có nguồn gốc
từ virus được biểu hiện trong các cây chuyển gen để tạo ra tính kháng đối với các virus
thực vật. Hướng này dựa trên cơ sở các nghiên cứu về sự gây nhiễm (inoculation) hay
xâm nhiễm (infection) ở thực vật, được khởi đầu với các chủng virus nhẹ tạo ra khả năng
bảo vệ chống lại sự gây nhiễm tiếp theo với cùng chủng virus hoặc các virus có liên
quan gần gũi. Tính kháng bắt nguồn từ tác nhân gây bệnh như vậy cần sự biến nạp thực
vật với các trình tự có nguồn gốc từ virus. Tính kháng vật chủ xuất hiện từ hai cơ chế
khác nhau: (1) Sự bảo vệ được dàn xếp thông qua biểu hiện của các protein virus tự
nhiên hoặc đã được biến đổi (ví dụ: protein vỏ, replicase, và replicase khiếm khuyết).
(2) Sự bảo vệ được dàn xếp ở mức độ phiên mã (RNA-mediated resistance), địi hỏi sự
phiên mã của RNA hoặc từ các trình tự hồn chỉnh hoặc từng phần có nguồn gốc từ
virus đích (bao gồm các gen cho protein vỏ, replicase, replicase khiếm khuyết, protease,
protein vận động…).
Một đường hướng khác tạo ra cây trồng kháng là dựa trên việc sử dụng những
gen kháng (các gen R) tồn tại ở một số thực vật tự nhiên. Những gen kháng này đã xuất

38

hiện trong q trình tiến hóa của một số lồi thực vật và mỗi một tính kháng chống lại
một tác nhân đặc hiệu.
Người ta chuyển một gen R vào một cây trồng khác thì cây này sẽ kháng được
tác nhân đặc hiệu đó. Bằng cách này khơng những kháng virus có hiệu quả mà người ta
cịn biết các gen R kháng vi khuẩn, nấm và tuyến trùng. Trong tương lai có thể tạo nên
các gen R có tính đặc hiệu xác định.
Trong những năm 80, bệnh virus đốm vòng ở cây đu đủ đã xuất hiện ở vùng
Hawai. Năm 1994, gần một nửa diện tích đu đủ của quốc gia này bị bệnh. Một giống
kháng bệnh rất cần nhưng phương pháp lai tạo truyền thống đã không thành công. Các
nhà nghiên cứu ở Đại học Cornell và Đại học Hawai quyết định tìm một dạng kháng
bệnh này. Họ đã sử dụng cơng nghệ gen để chèn các gen mã hóa cho vỏ protein của
virus đốm vòng đu đủ được phân lập từ virus này vào DNA của cây đu đủ. Sự có mặt
của protein vỏ virus trong cây đã ngăn cản sự lây nhiễm virus vì các gen virus cần để
gây nhiễm khơng có mặt. Như vậy, đã tạo ra một loại miễn dịch thực vật. Sau khi kiểm
tra sự an toàn cần thiết người ta đã sử dụng loại cây đu đủ biến đổi gen để sản xuất.
3.4. Kháng vi khuẩn và nấm
Vi khuẩn là những sinh vật tiền nhân. Cũng như virus, phần lớn vi khuẩn là tác
nhân gây bệnh nguy hiểm, mặc dù thực tế cũng chỉ một số lượng nhỏ. Gần đây, được
biết có 200 lồi gây bệnh ở thực vật trong tổng số khoảng hơn một triệu loài. Đối với
bệnh vi khuẩn, hướng nghiên cứu tạo giống mới bằng công nghệ gen chỉ mới bắt đầu.
Về cơ bản có ba hướng: (1) Dùng gen mã hóa enzyme làm thối hóa thành tế bào vi
khuẩn, chẳng hạn gen sản xuất lysozyme từ các nguồn tế bào động vật hoặc từ
bacteriophage T4 đưa vào cây thuốc lá và khoai tây. Các gen này biểu hiện hoạt tính
lysozyme mạnh và các tế bào có khả năng phịng trừ vi khuẩn Erwina carotovora rất
tốt. (2) Gen mã hóa -thionin-cystein được chuyển vào cây thuốc lá cũng phòng ngừa
được vi khuẩn Pseudomonas syringae. (3) Chuyển nạp gen sản xuất protein làm giảm
độc tố của vi khuẩn là hướng có nhiều hứa hẹn. Gen này chủ yếu sản xuất các loại
enzyme phân hủy độc tố của vi khuẩn, do vậy đã ngăn cản tác hại của chúng.
Nấm thuộc vào sinh vật nhân chuẩn (eukaryote), có khoảng 8.000 trong 100.000
lồi nấm đã biết gây hại nặng ở thực vật.

Một sự kiện nổi bật là sự phá hủy vụ khoai tây ở Ailen vào năm 1845 và những
năm sau đó do nấm Phytophtora infestants. Sự kiện này đã dẫn đến nạn đói lớn nhất và
sự di cư của hàng triệu người từ nước này đến Mỹ. Cho đến nay dân số nước này vẫn
chưa đạt đến con số trước năm 1845.
Mất mùa do vi khuẩn và nấm vẫn luôn là vấn đề lớn, vì vậy bắt buộc sử dụng
thuốc trừ nấm trong nơng nghiệp.
Một vấn đề nữa là sự nhiễm thực phẩm do mycotoxin mà nấm thải ra, thường
gặp khi thực phẩm thực vật không được xử lý bằng thuốc trừ nấm. Mycotoxin về cấu
tạo hóa học rất đa dạng, có thể gây bệnh nặng ở người và động vật và có thể gây ung
thư nếu sự tiếp nhận thực phẩm này trong thời gian dài. Khả năng gây hại chính xác của
nó cho đến nay vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ.
Vì phương thức tạo ra cây biến đổi gen kháng vi khuẩn và nấm có phần tương tự
nhau, nên được đề cập chung ở đây.

39


Việc sử dụng các gen kháng trong cây biến đổi gen đã được nêu rõ ở phần trên.
Những gen kháng cụ thể có ý nghĩa và đã được thử nghiệm trong cây biến đổi gen.
Gen kháng mã hóa cho các chất nhận, chúng kích thích nhiều phản ứng bằng
chuỗi vận chuyển tín hiệu, ví dụ tạo nên kháng thể. Những gen này là sự quan tâm lớn
của các nhà sản xuất.
Sản xuất những chất chống lại vi sinh vật trong cây biến đổi gen đã được thử
nghiệm từ nhiều năm nay, nhưng kết quả thu được chưa thống nhất. Ví dụ: người ta đã
thử nghiệm chitinase trong cây biến đổi gen, vì thành tế bào của nhiều lồi nấm chứa
chitin. Thực tế đã cho kết quả tốt ở một số thực vật do nấm gây bệnh.
Cải tạo các giống cây trồng kháng nấm hại dựa trên nguyên lý đưa gen mã hóa
một loại enzyme nào đó có tác dụng ức chế trực tiếp hoặc gián tiếp đến sự phát triển của
nấm hại. Các enzyme làm thối hóa các thành phần chính của vỏ tế bào nấm chitin và
β-1,3 glucan là loại đang được chú ý. Khi có gen chitinase chuyển vào, cây thuốc lá

chuyển gen đã tăng hoạt tính kháng nấm gây hại. Sự biểu hiện đồng thời của cả hai gen
chitinase và glucanase trong thuốc lá làm cho cây có tính kháng nấm gây hại cao hơn
cây có một gen độc lập. Cũng tương tự, cà chua có tính kháng nấm Fusarium cao hơn
hẳn, sau khi được chuyển cả hai gen nói trên. Protein ức chế ribosome (ribosomal
inhibition protein-RIP) cũng biểu hiện tính kháng nấm khả quan. Cây thuốc lá cho tính
kháng nấm rất tốt, khi cây được chuyển đồng thời gen RIP và chitinase.
Nhiều thực vật biến đổi gen khác nhau tạo ra protein kháng vi sinh vật khác nhau.
Ở đây người ta thu được những kết quả trái ngược nhau, ví dụ -thionin có nguồn gốc từ
yến mạch được biến nạp vào cây thuốc lá kháng vi khuẩn Pseudomonas syringae và một
thionin nhân tạo nội sinh biểu hiện mạnh kháng Fusarium oxyporum.
Nhiều tác nhân gây bệnh tạo ra trong cây các chất độc. Ngược lại cây trồng cũng
tạo ra chất độc để tự bảo vệ chúng.
CÂU HỎI ÔN TẬP
1. Thành tựu của công nghệ sinh học trong diệt cỏ?
2. Thành tựu của công nghệ sinh học trong diệt côn trùng?
3. Thành tựu của công nghệ sinh học trong phòng trừ bệnh cây do nấm?
4. Thành tựu của cơng nghệ sinh học trong phịng trừ bệnh cây do virus?
5. Thành tựu của cơng nghệ sinh học trong phịng trừ bệnh cây do vi khuẩn?
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002. Sinh học phân tử. NXB Giáo dục.
Trần Thị Lệ, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Quốc Dung, 2006. Giáo trình cơng nghệ
gen trong Nơng Nghiệp. ĐH Huế.
Phạm Thị Thùy, 2004. Công nghệ sinh học trong bảo vệ thực vật. NXB Đại học
quốc gia Hà Nội
Trần Thị Thanh, 2003. Công nghệ vi sinh. NXB Giáo dục

40


Chương 4

CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN
NN405-4
Mục tiêu:giúp sinh viên biết khái quát về chuyển gen và một số phương pháp
được sử dụng trong chuyển gen.
4.1. Chuyển gen là gì
Chuyển gen (transgenesis) là đưa một đoạn DNA ngoại lai vào genome của một
cơ thể đa bào, sau đó đoạn DNA ngoại lai này sẽ có mặt ở hầu hết các tế bào và được
truyền lại cho thế hệ sau. Vì vậy khái niệm chuyển gen chỉ được sử dụng cho thực vật
và động vật. Nấm men, vi khuẩn và tế bào nuôi cấy mang một đoạn DNA ngoại lai được
gọi là các tế bào tái tổ hợp (recombinant cell) hoặc tế bào biến nạp (transformed cell).
Chuyển gen khác với liệu pháp gen (gene therapy). Có trường hợp các tế bào
mầm khơng mang DNA ngoại lai. Thuật ngữ liệu pháp gen mầm (germinal gene therapy)
cũng được sử dụng. Liệu pháp gen mầm hãy còn chưa được thử nghiệm ở người. Các tế
bào mầm này mang DNA ngoại lai và được truyền lại cho thế hệ sau.
Về mặt lịch sử, thuật ngữ GMO (genetically modified organism)-sinh vật biến
đổi gen, được sử dụng chủ yếu để chỉ các thực vật chuyển gen được gieo trồng để cung
cấp lương thực, thực phẩm cho con người và động vật. Logic hơn và chính xác hơn,
GMO đề cập tới tất cả các cơ thể sống biến đổi di truyền, bao gồm cả vi sinh vật. Thuật
ngữ GMP (genetically modified plant)-thực vật biến đổi gen và GMA (genetically
modified animal)- động vật biến đổi gen cũng được sử dụng.
Trong thực tế, các đoạn DNA ngoại lai được sử dụng để tạo sinh vật chuyển gen
hầu hết là các gen luôn có sẵn một trình tự phù hợp với một promoter làm cho nó biểu
hiện thành RNA, nói tổng quát là protein.
Sản phẩm phiên mã của gen có thể là một RNA không được dịch mã thành
protein. Ðây là trường hợp đối với RNA ngược hướng (antisense RNA), rybozyme và
các gen được phiên mã bởi RNA polymerase I và III.
Không nhất thiết là DNA ngoại lai luôn luôn được hợp nhất vào genome của
sinh vật chuyển gen. DNA ngoại lai không thể tồn tại trong cơ thể mà không hợp nhất
vào trong genome của nó. Một đoạn DNA tự do nhanh chóng bị loại trừ trong chu trình
tế bào vì vậy nó sẽ khơng có khả năng tái bản và truyền lại cho các tế bào con. Tuy nhiên

về lý thuyết thì có thể duy trì một đoạn DNA ngoại lai như một nhiễm sắc thể nhỏ
(minichromosome) có khả năng tự tái bản và có mặt trong các tế bào con. Một số genome
virus có đặc tính này, ví dụ như virus herpes. Một vài đoạn nhiễm sắc thể thường được
tìm thấy ở các tế bào khối u, là các nhiễm sắc thể tồn tại trong một thời gian ngắn, mang
các yếu tố tái bản và truyền cho các tế bào con.

41


4.2. Nguyên lý của kỹ thuật chuyển gen
4.2.1. Nguyên lý
Nguyên lý cơ bản trong việc tạo động vật (thực vật) chuyển gen là đưa một hoặc
vài gen ngoại lai vào động vật (thực vật) (do con người chủ động tạo ra). Các gen ngoại
lai này phải được truyền thông qua dịng mầm vì vậy mọi tế bào kể các tế bào mầm sinh
sản của động vật (thực vật) đều chứa vật chất di truyền đã được sửa đổi như nhau.
4.2.2. Cơ chế hợp nhất của DNA ngoại lai vào genome
Trong tất cả các trường hợp, sự hợp nhất của đoạn DNA ngoại lai vào genome
được thực hiện với sự tham gia của các cơ chế sửa sai DNA của tế bào. Các protein liên
quan với các cơ chế này nhận ra các cấu trúc DNA khơng bình thường, có thể là sự ghép
đôi không tương ứng của hai sợi đơn DNA, các vùng sợi đơn hoặc các vị trí mà DNA
ngoại lai liên kết với DNA chủ.
Khi DNA ngoại lai khơng có trình tự chung với genome chủ, sự nhận biết giữa
hai DNA chỉ bao gồm các trình tự DNA ngắn tương đồng ít hoặc nhiều. Sự nhận biết
này là cần thiết cho các cơ chế sửa sai hoạt động. Sau đó DNA ngoại lai hợp nhất vào
genome nhờ quá trình tái tổ hợp khơng tương đồng (Hình 1). Sự kiện này là khá hiếm
và xảy ra ở các vị trí khác nhau trong genome.
Khi DNA ngoại lai đóng góp một trình tự dài tương đồng với genome chủ thì
trình tự này sẽ được nhận biết một cách chính xác. Các cơ chế sửa sai gây ra tái tổ hợp
tương đồng nghiêm ngặt làm thay thế gen nội sinh đích bằng DNA ngoại lai. Nếu gen
sau bị đột biến thì gen nội sinh được thay thế bằng một gen đột biến (Hình 2). Trong

điều kiện tốt nhất, tái tổ hợp tương đồng ít xảy hơn 100 lần so với tái tổ hợp không tương
đồng. Sở dĩ như vậy là do số vị trí đối với sự nhận biết khơng chính thức là lớn hơn
nhiều so với sự nhận biết tương đồng. Thông thường sự nhận biết tương đồng là duy
nhất trong mỗi genome đơn bội.
DNA ngoại lai phải đến nhân tế bào để hợp nhất vào genome của nó. Số phận
của DNA ngoại lai không giống nhau và phụ thuộc vào việc nó đã xâm nhập vào tế bào
chất hoặc vào nhân một cách trực tiếp.
DNA biến nạp vào tế bào ni cấy nói chung là dạng plasmid vịng. Plasmid vòng
bị phân cắt bởi DNAse của tế bào chất tại các vị trí ngẫu nhiên. Phần lớn DNA bị phân
hủy trong tế bào chất. Một phần nhỏ đi đến nhân và có thể được phiên mã. Ở dạng này,
DNA ngoại lai khơng ổn định và nó sẽ bị loại trừ khi tế bào phân chia. Một tỉ lệ nhỏ
DNA ngoại lai hợp nhất vào genome. Trong quá trình di chuyển từ tế bào chất đến nhân,
các đoạn DNA ngoại lai liên kết với nhau để tạo ra dạng polymer gọi là đoạn trùng lặp
(concatemer). Trong tế bào chất, các liên kết đồng hóa trị xảy ra một cách ngẫu nhiên
giữa các đoạn DNA ngoại lai làm cho các gen sắp xếp lại ở dạng nối tiếp.
Khi DNA được xâm nhập vào nhân một cách trực tiếp, các đoạn DNA này cũng
tạo thành các đoạn trùng lặp nhưng thông qua quá trình tái tổ hợp tương đồng. DNA
ngoại lai bị phân cắt một cách ngẫu nhiên, tạo ra các đoạn trùm gối lên nhau và tái kết
hợp tạo ra một đoạn trùng lặp mà ở đó các gen được xây dựng lại rất tốt. Sau đó các bản
sao khác nhau của các đoạn DNA ngoại lai được cấu tạo chủ yếu ở dạng nối tiếp.
Khi các đoạn DNA khác nhau được xâm nhập đồng thời vào một tế bào, chúng
tạo thành các đoạn trùng lặp chứa một vài bản sao của mỗi đoạn. Các đoạn trùng lặp lai

42


(hybrid concatemers) này được hợp nhất vào genome. Vì thế đến bốn gen khác nhau có
thể được chuyển đồng thời vào một tế bào.
Nói chung, DNA ngoại lai được hợp nhất dưới dạng đoạn trùng lặp có kích thước
khoảng 100kb, thường chứa từ một đến mười bản sao của đoạn DNA gốc. Ðiều thú vị

là khi các đoạn DNA lớn được chuyển vào, đoạn trùng lặp hợp nhất vào thường chứa số
bản sao ít hơn mặc dù kích thước tối ưu để hợp nhất vào genome là vào khoảng 100kb.

Hình 4.1: Các cơ chế hợp nhất ở một vị trí ngẫu nhiên của DNA ngoại lai tiêm vào
nhân tế bào
DNA tiêm vào được cắt ra một cách ngẫu nhiên. Các đoạn DNA này lệ thuộc vào
quá trình tái tổ hợp tương đồng tạo ra các polymer (các đoạn trùng lặp) của gen tiêm vào
xếp nối tiếp nhau. Các đầu của đoạn trùng lặp bị phân hủy bởi DNAse, tạo ra các vùng
sợi đơn ngắn nhận biết các vị trí bổ sung trong genome. Trong quá trình tái bản DNA,
các cơ chế sửa sai hợp nhất DNA ngoại lai.

43


Hình 4.2: Cơ chế thay thế gen bằng tái tổ hợp tương đồng
DNA nhận biết các trình tự tương đồng trong genome một cách chính xác. Cơ
chế sửa sai của tế bào gây ra sự thay thế đặc hiệu vùng genome đích bằng các đoạn DNA
ngoại lai. Trình tự định vị giữa hai vùng tương đồng được hợp nhất trong khi trình tự
nằm bên ngồi các vùng tương đồng lại bị loại ra.
DNA vi tiêm vào nhân hay tế bào chất là ở dạng thẳng bằng cách cắt plasmid ở
vị trí chọn trước. Ðiều này làm giảm cơ hội cắt plasmid tại các vị trí ngẫu nhiên dẫn đến
tạo thành các đoạn trùng lặp chứa các gen bị cắt xén bớt.
Các đoạn DNA sử dụng cho chuyển gen được làm thẳng còn do các lý do khác.
Cách này làm cho có thể loại bỏ các trình tự plasmid (giàu GC) mà có thể phá hủy các
gen chuyển (transgenes). Mặt khác, DNA vòng tiêm vào nhân được hợp nhất với tần số
thấp hơn nhiều so với DNA thẳng.
Vì vậy nguy cơ của DNA ngoại lai cơ bản là giống nhau khi chúng được chuyển
vào tế bào chất bằng vi tiêm (microinjection), chuyển nhiễm (transfection) với các tác
nhân hóa học hoặc biến nạp bằng xung điện (electroporation). Tiêm DNA vào nhân là
khó hơn nhưng kết quả là tần số hợp nhất cao hơn nhiều và tình trạng nguyên vẹn của

DNA ngoại lai được duy trì tốt hơn. Tiêm DNA vào nhân của phơi khơng phải ln ln
có thể thực hiện, đặc biệt là đối với các lồi khơng phải là thú.
Tất cả những phân tích ở trên cho thấy:
-

Một gen ngoại lai có thể được tách chiết và sửa đổi bằng kỹ thuật di truyền.

Gen ngoại lai có mặt trong tế bào cơ thể bao gồm cả tế bào mầm sinh sản có thể
truyền lại cho thế hệ sau.

44


4.3. Các phương pháp chuyển nạp gen
4.3.1. Chuyển gene bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium có khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật bằng cách chuyển một
đoạn DNA của nó vào tế bào thực vật. Khi DNA vi khuẩn được hợp nhất với nhiễm sắc
thể thực vật, nó sẽ tấn công vào hệ thống tổ chức của tế bào một cách có hiệu quả và sử
dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sôi của quần thể vi khuẩn. Thật không may mắn cho
các nhà trồng cây ăn quả khi gặp phải lồi vi khuẩn này. Bởi vì nó chính là thủ phạm
gây ra bệnh khối u hình chóp và bệnh lơng rễ ở nhiều lồi cây cảnh và cây ăn quả.
Mặc dù hệ thống chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium là có hiệu quả đối với
một số lồi nhưng khơng phải tất cả thực vật có thể được biến nạp bằng con đường này.
Ðặc biệt, lớp một lá mầm bao gồm các cây ngũ cốc chính trên thế giới như lúa, lúa mì
và ngơ là khơng được biến nạp dễ dàng nhờ A. tumefaciens.
Ðể khai thác và sử dụng A. tumefaciens như là một vector chuyển gen các nhà
khoa học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hoá opine của T - DNA và thay thế
vào đó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ trái của TDNA và các gen vir. Gen chuyển được xen vào giữa các vùng bờ của T-DNA. Nó sẽ
được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế bào thực vật
Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium đã được kiểm tra đối với

sự xâm nhập bền vững, sự biểu hiện và sự di truyền của các gen chuyển đặc biệt. Tuy
nhiên, một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp là loại mô được biến nạp, giai
đoạn phát triển của mô, mức độ khởi đầu của vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng, môi
trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp, marker được sử dụng để chọn lọc thể biến nạp,
loại vector sử dụng và kiểu gen của thực vật.

45


Tạo thực vật chuyển gen bằng phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium
Phương pháp này dựa trên cơ chế gây u vết thương của A.tumefaciens. Khi cây
bị thương, vi khuẩn này đã nhập vào chỗ bị thương và gây u. Tiến hành phân tích thành
phần các chất trong khối u thì thấy có nhiều hợp chất lạ. Phân tích hố sinh các hợp chất
lạ thì phát hiện ra đó là các phức hợp axit amin arginin-xetoaxit, những hợp chất đó
khơng có ở thực vật, vi khuẩn đã sử dụng những hợp chất đó trong q trình đồng hố.
Như vậy vi khuẩn đã chuyển vào trong tế bào thực vật tác nhân gây u và những tác nhân
đó tổng hợp lên những hợp chất mới. Nhờ những thành tựu của kỹ thuật ADN tái tổ hợp,
những phương pháp nghiên cứu mới về ADN, người ta đã làm sang tỏ cơ chế gây bệnh
của vi sinh vật đất.

46


Hiện nay có rất nhiều kỹ thuật chuyển gen khác nhau vào tế bào song kỹ thuật
chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumerfacien vẫn được ứng dụng rộng rãi là
nhờ những ưu điểm sau:
1. Khơng địi hỏi dụng cụ đặc biệt
2. Số lượng bản copy thấp và ổn định ở thế hệ con cháu
3. Dễ thao tác invitro, dễ làm
4. Đây là kỹ thuật đơn giản, chi phí thấp

* Hoạt động của Agrobacterium tumefaciens
Bản chất tự nhiên của vi khuẩn A.tumefaciens là xâm nhập vào những vị trí
tổn thương trên cây hai lá mầm và gây ra khối u tại những vị trí tổn thương đó.
Những chất được tổng hợp và bài tiết ra từ tế bào khối u, được vi khuẩn sử dụng
làm nguồn cácbon và nitơ duy trì sự tồn tại và phát triển của chúng. Bệnh khối u
do vi khuẩn A.tumefaciens gây ra được phát hiện cách đây khoảng một thế kỷ và
suốt thời gian dài, nhiều nghiên cứu tập trung khám phá nhằm tìm ra cơ chế gây
“ung thư” của chúng với mục đích dựa vào đó có thể tìm ra những phương sách
chữa bệnh ung thư ở người cũng như ở động vật. Những ý tưởng đó đã bất
thành và một loạt các nghiên cứu cũng bị dừng lại khi cơ chế gây khối u ở thực
vật được khám phá chính là kết quả của quá trình chuyển gen từ vi khuẩn vào
thực vật. Tuy nhiên, sự khám phá và hiểu biết về cơ chế gây khối u đó đã mở ra
một hướng chuyển gen mới mà ở đó con người đã lợi dụng vi khuẩn để chuyển
những gen mong muốn vào thực vật.
Vi khuẩn xâm nhiễm vào chỗ vết thương, kích thích hình thành các chất độc
có bản chất phenolic (Acetosyringon, Hydroxyl acetosyringon). Chất này có tác
dụng làm lành vết thương, vừa là kết hợp chất dẫn dụ vi khuẩn xâm nhập , lại có
vai trị như một chất kích hoạt vùng gen vir thuộc Ti-plasmid kích thích cho sự
cắt đoạn T-ADN (tại vùng bờ trái và bờ phải) để gắn vào genom thực vật.
Trong T-ADN có chứa 3 vùng gen quan trọng quy định sự hình thành khối u.
Đó chính là vùng gen iaam và iaah kích thích cho sự hình thành IAA và vùng
gen ipt kích thích cho sự hình thành xytokinin. Tỷ lệ auxin/xytokinin kích thích
sự hình thành callus tạo lên các khối u.
4.3.2. Chuyển gene bằng phương pháp vật lý (súng bắn gen)
Súng bắn gen (Gene gun) là một thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền vào
tế bào, được thiết kế đầu tiên cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thực vật và được
phát triển vào đầu thập niên 1980 do các nhà thực vật học ở Ðại học Corrnell cùng với
các nhà nghiên cứu ở Corrnell Nanofabrication Facility, Newyork, USA. Súng bắn gen
được bán trên thị trường vào năm 1990. Ðạn sử dụng cho loại súng này là các hạt kim
loại nặng cơ bản được bao bọc DNA. Tên chính xác và đầy đủ của súng bắn gen là hệ

thống phân phối hạt biolistics (biolistic particle delivery system) và kỹ thuật này thường
được gọi một cách đơn giản là biolistics (sự kết hợp giữa hai thuật ngữ biology (sinh
học) và ballistics (sự bắn tung)). Mặc dù có nhiều thiết kế kỹ thuật khác nhau nhưng
nguyên lý chung của phương pháp này là sử dụng áp lực xung của khí helium để gai tốc
các hạt.

47


Ứng dụng của kỹ thuật xung điện trong liệu pháp gen
Súng bắn gen bao gồm hai buồng bằng thép không gỉ, kích thước 6“x7“x10“ nối
với hai bơm chân khơng. DNA ngoại lai được gắn vào các hạt tungsten có đường kính
rất nhỏ, khoảng 1μm (các kim loại năng khác như vàng và bạc cũng được sử dụng nhưng
không thường xuyên do giá cả đắt). Các hạt này được đặt trên một cái đĩa ở mặt bên
trong của súng. Sự bùng nổ khí helium ở 1000psi làm cho cái đĩa bắn về phía trước với
tốc độ 1300 food/s, tương đương với tốc độ khi một viên đạn rời khỏi nòng súng. Một
tấm chắn làm dừng đĩa lại và các hạt vàng hay tungsten được phóng về phía các tế bào
đích. Chúng xun qua vách tế bào và phóng thích các phân tử DNA (Hình 2.21). Súng
bắn gen sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp để hợp nhất sự biểu hiện các gen đã phân phối.
Các tế bào biến đổi di truyền có thể được sử dụng để tạo thực vật bao gồm cả sự sửa đổi
di truyền mong muốn ở trong tất cả các tế bào của chúng (Voiland, 1999).

Sơ đồ nguyên lý hoạt động của súng bắn gen
Mục tiêu của súng bắn gen thường là callus của các tế bào thực vật giống nhau
sinh trưởng trong môi trường gel trên đĩa petri. Sau khi các hạt tungsten đã va chạm vào
đĩa, gel và callus bị phá vỡ nhiều. Tuy nhiên một số tế bào không bị phá vỡ khi va chạm

48

mạnh và đã tiếp nhận các hạt tungsten được bao bọc DNA và cuối cùng các phân tử
DNA ngoại lai đã xâm nhập và hợp nhất vào nhiễm sắc thể thực vật. Các tế bào từ đĩa
petri được tập hợp lại và chọn lọc các tế bào đã hợp nhất thành công và biểu hiện DNA
ngoại lai bằng các kỹ thuật hóa sinh hiện đại như sử dụng gen chọn lọc nối tiếp và
Northern blots.
Các tế bào đơn đã chọn lọc từ callus có thể được xử lý với một số hormone thực
vật như auxin, gibberelin và mỗi một tế bào có thể phân chia, biệt hóa thành các tế bào
mơ, cơ quan, tế bào chun hóa của tồn bộ cây. Cây mới có nguồn gốc từ một tế bào
nảy mầm thành cơng có thể mang các đặc tính di truyền mới

Chuyển gen bằng súng bắn gen
Phương pháp này có ưu điểm là thao tác dễ dàng, có thể chuyển gen vào nhiều
loại tế bào và mô, các tế bào được biến nạp có tỉ lệ sống sót cao, cho phép đưa các gen
vào tế bào ở vị trí mong muốn....Do vậy nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực.
Các ứng dụng của kỹ thuật bắn gen bao gồm
- Tạo thực vật chuyển gen: đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay
trong lĩnh vực tạo ngũ cốc chuyển gen. Bacillus thuringiensis là loài vi khuẩn tổng hợp
ra protein crystal (crys1Ab và crys1Ac) có khả năng giết một cách chọn lọc các nhóm
cơn
trùng
nhất
định.
Gen
mã
hố
protein
crystal
được
gọi là gen Bt. Gen Bt đã được bắn vào mô sẹo của cây ngũ cốc (Rassmussen,
1994). Trong khi các tế bào này sửa chữa tổn thương, DNA ngoại lai xâm nhập vào

genome tế bào chủ. Vì vậy cho phép tế bào chủ phiên mã và giải mã gen Bt. Sau mỗi
lần quá trình biến nạp được hồn thành người ta cũng tiến hành sàng lọc theo phương
pháp truyền thống là dựa trên cơ sở các marker chọn lọc được xen vào DNA cấu trúc
(Brettschneider, 1997). Các marker chọn lọc mang tính kháng (kháng thuốc kháng sinh
hay kháng thuốc diệt cỏ) như kanamycin là một là một trong những marker phổ biến
nhất được sử dụng.
- Tiêm chủng vaccine di truyền: các gen được đưa vào cơ thể bằng súng bắn gen với
mục đích gây ra phản ứng miễn dịch với protein biểu hiện bởi gen chuyển. Phương pháp
tiêm chủng vaccine này an toàn hơn các phương pháp khác bởi vì chỉ DNA ngoại lai
được đưa vào và khơng có các protein ngoại lai (Lin, 2000).
- Liệu pháp gen tự sát (Suicide gene therapy): phương pháp bắn gen đã được sử dụng
trong điều trị bệnh ung thư. Một gen biểu hiện protein gây độc có promoter đặc hiệu
khối u được đưa vào các tế bào khối u. Khi protein này được biểu hiện thì tế bào khối u
chết. Protein này chỉ gây độc đối với các tế bào khối u bởi vì promoter đặc hiệu cần cho
sự biểu hiện chỉ được tạo ra trong các tế bào khối u (Lin, 2000).

49


- Sự điều biến miễn dịch (Immunomodulation): phương pháp này còn được sử dụng để
chống lại ung thư. Sử dụng súng bắn gen, một protein chỉ biểu hiện trong tế bào khối u
nhưng làm cho phản ứng miễn dịch tăng lên được đưa vào tế bào. Phản ứng miễn dịch
tăng lên nhắm vào các tế bào khối u và hiển nhiên gây ra hiệu quả mong muốn
(Lin,2000).
- Dược lý di truyền: súng bắn gen có thể được sử dụng để đưa các gen tổng hợp protein
hữu ích hay protein liệu pháp vào cơ thể. Ví dụ như các yếu tố đông máu ở các cơ thể
rối loạn sự đông máu hoặc tăng sự tổng hợp hồng cầu trong các cơ thể thiếu máu. Sự
biểu hiện kéo dài của các gen đưa vào là một vấn đề, trong nhiều trường hợp thường đòi
hỏi sự phân phối gen phức tạp (Lin, 2000).
- Súng bắn gen là một công cụ nghiên cứu: súng bắn gen có thể được sử dụng để xen

các promoter mà sẽ dẫn đến sự biểu hiện của các gen nhất định. Hiệu quả khuyếch đại
các protein nhất định là một phương pháp có giá trị lớn đối với các nhà khoa học để
nghiên cứu chức năng của các protein này (Lin, 2000).
4.3.3 Chuyển gene bằng phương pháp xung điện
Kỹ thuật xung điện (electroporation) là một phương pháp cơ học được sử dụng
để đưa các phân tử phân cực vào trong tế bào chủ qua màng tế bào. Trong phương pháp
này, một xung điện cao thế trong khoảnh khắc (vài phần nghìn giây) có khả năng làm
rối loạn cấu trúc màng kép phospholipid, tạo ra các lỗ thủng tạm thời cho phép các phân
tử DNA ngoại lai từ môi trường xâm nhập vào bên trong tế bào.
Nhiều kỹ thuật nghiên cứu trong sinh học phân tử yêu cầu đưa gen hoặc protein
ngoại lai vào trong tế bào chủ. Vì lớp phospholipid kép của màng sinh chất có một đầu
ưa nước phía ngồi và một đầu ưa nước phía trong , nên bất kỳ phân tử phân cực nào,
bao gồm cả DNA và protein, đều khơng có khả năng đi qua màng một cách tự do
(Farabee, 2001).

Sơ đồ màng phospholipid kép
Sơ đồ này cho thấy các thành phần hóa học của màng sinh chất. Các đầu ưa nước
phân cực hướng về phía ngồi trong khi các đi kỵ nước hướng về phía trong và tương
tác với đi kỵ nước khác để cùng bám giữ màng. Các phân tử phân cực không thể đi
qua màng này nếu như khơng có sự hỗ trợ bên ngoài.
Nhiều phương pháp đã được phát triển để vượt qua rào cản này, cho phép đưa
DNA và các phân tử khác vào trong tế bào đã được nghiên cứu. Một trong những phương
pháp này là kỹ thuật xung điện.

50


Kỹ thuật xung điện dựa trên trạng thái tương đối yếu của các tương tác kỵ nước
của phospholipid kép và khả năng tập hợp lại một cách tự động của nó sau khi bị rối
loạn (Purves, 2001). Vì vậy, một xung điện chớp nhống có thể gây ra rối loạn ở các vị

trí của màng một cách nhất thời, làm cho các phân tử phân cực có thể đi qua, nhưng sau
đó màng có thế đóng kín lại nhanh chóng và tế bào khơng bị ảnh hưởng gì cả.
Các tế bào chủ và DNA ngoại lai được tạo thành dịch huyền phù và cho vào trong
một cuvette nhựa có điện cực (Hình dưới).

Hình 4.2: Cuvette nhựa có điện cực
Ðể tạo ra xung điện cao thế trong một thời gian ngắn người ta sử dụng một thiết
bị gọi là máy xung gen (gene pulser) (Hình 2.16). Quá trình cơ bản diễn ra bên trong
máy này có thể được trình bày bằng sơ đồ hình2.17.

Máy xung gen (Gene pulser) (Hãng Biorad)

51


Sơ đồ bố trí mạch cơ bản của máy xung điện
Sơ đồ này cho thấy mạch điện cơ bản cung cấp điện cho kỹ thuật xung điện
Khi công tắc thứ nhất đóng, tụ điện nạp điện vào và tích một điện áp cao. Khi
cơng tắc thứ hai đóng, điện áp này phóng qua dịch huyền phù tế bào. Một xung điện cần
thiết cho kỹ thuật này thường là khoảng 10.000-100.000 v/cm (thay đổi tùy theo kích
thước của tế bào) trong vài phần triệu giây đến một phần ngàn giây. Xung điện này làm
rối loạn phospholipid kép của màng tế bào và tạo ra các lỗ tạm thời. Khả năng điện qua
màng tế bào cùng lúc tăng lên 0,5-1,0 v vì vậy các phân tử đã được nạp điện này đi qua
màng tế bào thông qua các lỗ bằng cách thức tương tự như điện di (Hình dưới).

Sơ đồ plasmid chứa DNA ngoại lai đi qua các lỗ tạm thời trên màng bào chất
Lối DNA đi vào tế bào không thể quan sát thấy dưới kính hiển vi, nhưng hình vẽ
này cho thấy khái niệm cơ bản của sự tạo thành các lỗ trên màng mà DNA có thể đi qua.
Khi các ion đã nạp điện và các phân tử đi qua các lỗ, màng tế bào phóng điện và
các lỗ này đóng lại một cách nhanh chóng và phospolipid kép phục hồi lại cấu trúc cũ

(Weaver, 1995). Lúc này các phân tử mong muốn đã ở trong tế bào và chúng được sử
dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Phương pháp này có thể sử dụng đối với gần như tất cả các loại tế bào của các
loài. Lúc đầu phương pháp này được sử dụng để chuyển gen vào các tế bào động vật có

52


vú, về sau cho cả tế bào thực vật ở dạng protoplast... Với một số cây một lá mầm quan
trọng (lồi lúa phụ Japonica, ngơ, lúa mì) mà khơng thể thể thực hiện được bằng phương
pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium thì người ta đã thành cơng với phương
pháp này. Hiệu quả biến nạp cao. Trong một nghiên cứu ở E.coli, 80% số tế bào nhận
được DNA ngoại lai (Miller và Nickoloff, 1995). Lượng DNA ngoại lai cần thiết là ít
hơn so với các phương pháp khác (Withers, 1995). Phương pháp này có thể thực hiện
với các mơ in vivo còn nguyên vẹn (Weaver, 1995). Ðoạn DNA ngoại lai được biến nạp
có kích thước lớn. Tuy nhiên nếu các xung điện có cường độ và chiều dài khơng đúng
thì một số lỗ của tế bào sẽ trở nên quá lớn hoặc bị hỏng khơng thể đóng lại sau khi tế
bào phóng điện, làm cho tế bào bị tổn thương hoặc bị thủng (Weaver, 1995). Một hạn
chế nữa là sự vận chuyển DNA ngoại lai vào và ra khỏi tế bào trong suốt thời gian điện
biến nạp là tương đối không đặc hiệu. Ðiều này dẫn đến kết quả là khơng cân bằng ion
mà sau đó sẽ làm rối loạn chức năng của tế bào và tế bào chết (Weaver, 1995).
Kỹ thuật xung điện được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau của
sinh học phân tử và y học. Các ứng dụng của kỹ thuật xung điện bao gồm:
- Biến nạp DNA: các gen đặc hiệu có thể được tạo dịng trong plamid và sau đó plasmid
này được đưa vào tế bào chủ để nghiên cứu cấu trúc và chức năng của gen và protein.
- Chuyển plasmid trực tiếp giữa các tế bào: tế bào vi khuẩn đã chứa plasmid có thể được
ủ với một dịng khác khơng mang plasmid nhưng lại có đặc tính mong muốn khác. Ðiện
áp của xung điện sẽ tạo ra các lỗ, cho phép một số plasmid đi ra khỏi tế bào và lại đi vào
tế bào khác. Sau đó các tế bào mong muốn sẽ được chọn lọc bằng tính kháng thuốc
kháng sinh hoặc bằng phương pháp tương tự khác (Withers, 1995). Kiểu chuyển gen

này cũng có thể được thực hiện giữa các lồi khác nhau. Vì vậy, một lượng lớn plasmid
sinh trưởng trong các khuẩn lạc vi khuẩn được nhân lên một cách nhanh chóng và sau
đó được chuyển vào các tế bào nấm men bằng kỹ thuật xung điện để nghiên cứu (Gunn,
1995).
- Dung hợp tế bào đã kích thích: sự tạo thành các lỗ thủng trên màng xảy ra do xung
điện chớp nhoáng tạo ra cho thấy đã kích thích sự dung hợp tế bào (Weber và Berrg,
1995).
- Phân phối thuốc qua da: Chỉ khi xung điện gây ra các lỗ tạm thời trên màng sinh chất,
các lỗ tương tự đã tạo ra ở màng lipid kép của lớp da chết ở phía ngồi cùng. Các lỗ này
cho phép thuốc đi qua da đến các mơ đích. Các bệnh nhân thích phương pháp này hơn
phương pháp tiêm (khơng cần kim tiêm) và có thể tránh được các vấn đề phân hủy hoặc
hấp thu không đúng của liệu pháp uống thuốc (oral medication) trong hệ tiêu hóa
(Praustmitz, 1993).
- Liệu pháp hóa điện khối u ung thư (cancer tumor electrochemotherapy): các nhà khoa
học đang nghiên cứu tiềm năng của kỹ thuật xung điện để tăng tính hiệu quả của liệu
pháp hóa học. Khi sử dụng kỹ thuật xung điện để biến nạp DNA, xung điện này sẽ phá
vỡ màng tế bào ung thư và làm tăng lượng thuốc đi đến các vị trí. Một số nghiên cứu
cho rằng đã làm giảm sự phát triển khối u khi áp dụng phương pháp này cho các tế bào
ung thư ở hệ thống mơ hình động vật (Maeda, 1998).
- Liệu pháp gen: kỹ thuật xung điện cho phép các vector mang các gen quan tâm được
biến nạp qua da đến các mơ đích. Khi đã hợp nhất vào các tế bào của cơ thể, các protein
được tổng hợp từ các gen này có thể thay thế gen sai hỏng và vì vậy đã điều trị các rối
loạn di truyền (Hình dưới)(Inovio, 2002).

53