Acid Nucleic Các kỹ thuật phân tích ADN pot

1
Acid Nucleic
Acid Nucleic
C
C
á
á
c k
c k
ỹ
ỹ
thu
thu
ậ
ậ
t phân t
t phân t
í
í
ch ADN
ch ADN
1.
1.
Kỹ
Kỹ
thu
thu
ậ
ậ
t ly t
t ly t

rí
rí
ch ADN
ch ADN
2.
2.
S
S
ự
ự
c
c
ắ
ắ
t n
t n
ố
ố
i ADN
i ADN
3.
3.
KT đi
KT đi
ệ
ệ
n di ADN
n di ADN
4. KT PCR
4. KT PCR

2
A
A
cide
cide
D
D
eoxyribo
eoxyribo
N
N
ucleic
ucleic
(ADN)
(ADN)
Đư
Đư
ờ
ờ
ng
ng
+ base
+ base
nitơ
nitơ
=
=
Nucleoside
Nucleoside
Nucleoside

Nucleoside
+ acide P =
+ acide P =
Nucleotide
Nucleotide
Base
Base
Purine (2 v
Purine (2 v
ò
ò
ng nhân):
ng nhân):
Adenine
Adenine
, Guanine
, Guanine
Base
Base
Pyrimidine (1 v
Pyrimidine (1 v
ò
ò
ng):
ng):
Thymine, Cytosine
Thymine, Cytosine
Tóm lược về sự sao chép ADN
Sao chép ADN trong TB (in vivo):
Mở xoắn mạch kép

Tạo con mồi (primer)
Kết nối các Nu. tự do
Hoàn chỉnh mạch và đóng xoắn
Sao chép ADN trong ống nghiệm (in vitro):
Mở xoắn mạch kép : nhiệt độ
Tạo con mồi (primer) : con mồi tổng hợp
Kết nối các Nu. tự do : Taq Polymerase
Đóng xoắn : nhiệt độ
 Kỹ thuật PCR (công nghệ gien)
3
Kỷ
Kỷ
thu
thu
ậ
ậ
t ly tr
t ly tr
í
í
ch ADN
ch ADN
Ly trích ADN – Phương pháp nào ?
Vi
Vi
ệ
ệ
c c
c c
họ

họ
n l
n l
ự
ự
a phương
a phương
phá
phá
p ly t
p ly t
rí
rí
ch t
ch t
ù
ù
y thu
y thu
ộ
ộ
c v
c v
à
à
o nhi
o nhi
ề
ề
u y

u y
ế
ế
u t
u t
ố
ố
:
:
–
–
Ngu
Ngu
ồ
ồ
n ADN:
n ADN:
t
t
ừ má
ừ má
u,
u,
niêm m
niêm m
ạ
ạ
c,
c,
VK, T

VK, T
V,
V,
ĐV
ĐV
–
–
Mụ
Mụ
c đ
c đ
í
í
ch s
ch s
ử dụ
ử dụ
ng c
ng c
ủ
ủ
a ADN đ
a ADN đ
ượ
ượ
c ly t
c ly t
rí
rí
ch: P

ch: P
CR,
CR,
c
c
ắ
ắ
t b
t b
ằ
ằ
ng
ng
Enz.
Enz.
c
c
ắ
ắ
t gi
t gi
ớ
ớ
i h
i h
ạ
ạ
n,
n,
Cloning

Cloning
–
–
Loạ
Loạ
i ADN:
i ADN:
DNA trong nhân
DNA trong nhân
(genomic
(genomic
DNA), ty
DNA), ty
th
th
ể
ể
, l
, l
ạ
ạ
p th
p th
ể
ể
–
–
S
S
ố

ố
l
l
ượ
ượ
ng ADN c
ng ADN c
ầ
ầ
n thu đ
n thu đ
ượ
ượ
c,
c,
s
s
ố
ố
m
m
ẫ
ẫ
u c
u c
ầ
ầ
n ly t
n ly t
rí

rí
ch
ch
4
Các bước cơ bản của qui trình ly trích ADN
1. Phá vở vách TB và màng nguyên sinh chất  phóng thích
các thành phần của TB.
2. Ức chế các Enz. phân hủy DNA và ARNm (DNases,
RNases).
3. Tách nucleic acid (ADN, ARN) ra khỏi các thành phần khác
của TB.
• PP Tách ly/kết tủa
• PP hấp phụ (Adsorption)
• PP ly tâm dựa trên sự khác nhau về tỉ trọng
4. Thu nhận ADN: hòa tan//kết tủa
5. Bảo quản ADN: hòa tan trong H
2
O hay TE
6. Kiểm tra số lượng và chất lượng ADN
V
V
ậ
ậ
t li
t li
ệ
ệ
u
u
-

-
hó
hó
a ch
a ch
ấ
ấ
t s
t s
ử dụ
ử dụ
ng
ng
Phá
Phá
v
v
ở
ở
c
c
ấ
ấ
u t
u t
rú
rú
c TB:
c TB:
+ C

+ C
ố
ố
i/ch
i/ch
à
à
y,
y,
má
má
y xay
y xay


phương
phương
phá
phá
p v
p v
ậ
ậ
t l
t l
ý
ý
+ N
+ N
itơ

itơ
lỏ
lỏ
ng
ng
+ C
+ C
á
á
c enzymes (
c enzymes (
Pectinase, Cellulas
Pectinase, Cellulas
e,
e,
Protease)
Protease)
+ N
+ N
aOH + n
aOH + n
hi
hi
ệ
ệ
t đ
t đ
ộ
ộ
Loạ

Loạ
i b
i b
ỏ cá
ỏ cá
c m
c m
ả
ả
nh v
nh v
ở
ở
, c
, c
á
á
c t
c t
hà
hà
nh ph
nh ph
ầ
ầ
n k
n k
há
há
c trong TB:

c trong TB:
+ Dishwashing detergent
+ Dishwashing detergent
+ Phenol/Chloroform
+ Phenol/Chloroform
Thu nh
Thu nh
ậ
ậ
n ADN qua k
n ADN qua k
ế
ế
t t
t t
ủ
ủ
a
a
+ Isopropyl alcohol
+ Isopropyl alcohol
+ Ethanol 100%
+ Ethanol 100%
5
Phá vở cấu trúc TB bằng cơ học
Yêu cầu: - Thao tác nhanh
- Không quá ‘thô bạo’
- Có sự hiện diện của buffer ly trích (chất ức chế Dnase)

-
-
Th
Th
ự
ự
c hi
c hi
ệ
ệ
n trong đi
n trong đi
ề
ề
u ki
u ki
ệ
ệ
n l
n l
ạ
ạ
nh
nh
(
(
Ứ
Ứ
c ch
c ch

ế hoạ
ế hoạ
t đ
t đ
ộ
ộ
ng c
ng c
ủ
ủ
a Enz.)
a Enz.)
Nước tNy (ra bát) có tác
dng gì ?
• Mi TB ưc bao bc bi
màng TB (phospholipid)
• ADN nm trong nhân, và
cũng ưc bao bc bi
màng nhân
 Phi phá v màng TB  phóng thích ADN
6
 N ưc tNy có tác dng phá v màng TB vì tn công vào lipid
(cht béo) và protein trong cu to màng
N ưc tNy (ra bát) có tác dng gì ?
Không ch có màng TB và màng nhân b phá v, mà
màng ca tt c các bào quan (ty th, lp th) cũng b
phá v.
Vy, thành phn nào còn li ?
• Protein
• Carbohydrate (ưng)

• DN A
7
PP Tách ly/Kt ta
N guyên t
N guyên t


c:
c:
d
d


a v
a v
à
à
o m
o m


c 
c 
 hò
 hò
a tan k
a tan k
há
há
c nhau c

c nhau c


a
a
cá
cá
c phân t
c phân t
 
 
phân t
phân t
á
á
ch
ch
Hn hp dch
trích sau khi phá
v màng TB, bao
gm acid nucleic
và các thành phn
khác ca TB
Mix thoroughly with
an equal volume of
organic solvent
e.g. phenol, chloroform,
or phenol:chloroform
Centrifuge
Phần ddịch nước chưa các phân t hòa

tan trong nưc bao gm c acid nucleic.
Phần dung môi hữu cơ cha protein,
lipid. N hng thành phn không hòa tan
(các mãnh v TB) s nm  phần solid (
gia 2 phn ddch)
Perform additional extractions for increased purity
Collect aqueous phase
Bưc 3: Tách ly bng dung môi hu cơ
Organic
Aqueous
Interphase
PP Tách ly/Kt ta
8
• Pellet down nucleic acids.
• Wash pellet with 70% ethanol to remove
residual salts and other contaminants.
• Discard ethanol and allow pellet to dry.
After
Thêm cn và
mui vào  làm
kt ta tù ddch
nưc thu  bưc 3
Supernatant
Pellet
70% EtOH
Dissolve pellet
(H
2
O, TE, etc.)
Bưc 4: Thu nhn ADN (kt ta)

Before After
Centrifuge Wash Centrifuge
PP Tách ly/Kt ta
Bưc 5: bo qun ADN
Vai trò ca các hóa cht ưc s dung
trong phương pháp ly trích
9
Phenol/Chloroform = Tin
Phenol/Chloroform = Tin
h khi
h khi


t DN A
t DN A
Phenol: làm bin tính protein, các thành phn không hòa tan
hình thành  phn solid gia 2 phn ddch
Chloroform: có tác dng gia tăng  nht ca phn dung
môi hu cơ (+ làm bin tính protein)
Isoamyl alcohol: có tác dng ngăn cn s trn ln gia 2
phn ddch
Tác dng ca Enz. Protease?
- Enz. Protease có tác dng phân hy các protein liên kt vi
ADN , òng thi phân hy các Enz. trong TB cht co tác dng
làm toornhaji ADN (VD: DN ase).
- X ly vi Protease trong quá trình ly trích làm gia tăng hàm
hưng ADN nguyên vn thu ưc.
10
Tác dng ca mui trong ddch ly trích ?
- Trong ddch m ca protease ã có cha sn thành

phn mui.
- N a
+
(trong mui N aCl) liên kt vi gc phosphate
ca ADN , làm trung hòa in tích ca phân t ADN .
- S hin din ca N aCl giúp các phân t ADN có th
nhóm li vi nhau, thay vì Ny nhau ra do in tích
ca chúng  s kt ta ADN d dàng hơn khi cn
ưc thêm vào.
Cn có tác dng tách nưc khi ADN :
• Cho phép các cations liên két vi gc phosphat ca
ADN
• Gim lc Ny nhau gia các phân t ADN
• Làm cho các phân t ADN tp trung vi nhau  kt ta
Kt ta ADN bng cn
11
Ti sao cn s dng cn lnh ?
- DN A không hòa tan trong cn.
- Thêm cn lnh s làm cho các phân t ADN kt
li thành khi và kt ta.
- Phân t DN A kt ta dưi dng chùm si như i
bông gòn.
- Các bt khí nh trong ddch liên kt vi nhau,
khi ADN kt ta  hình thành các bt khí ln,
ni lên, s kéo theo ADN t phn ddch nưc ni
lên phn dung môi hu cơ  phia trên.
CTAB:
Cht tNy cha
Cation
(MC 6.61-6.62)

CTAB
(low ionic
conditions)
N+
CH
3
Br-
CH
3
CH
3
C
16
H
33
12
K
K
thu
thu


t
t
C
C


t (
t (

Digestion) v
Digestion) v
à
à
n
n


i
i
(Ligation)
(Ligation)
ADN
ADN
Enz. DN A nuclease
Exonuclease

Ct cu ni
phosphodiester  u
mút

Không s dng 
cloning
Endonuclease

Ct cu ni
phosphodiester  gia
phân t ADN

ưc s dng trong

KT cloning
-A-C-G-A-A-T-T-C-C-A
| | | | | | | | | |
-T-G-C-T-T-A-A-G-G-T
-A-C-G-A-A-
T
| | | | |
|
-T-G-C-T-T-
A
T
T
A
G
C
A
C
G
-A-C-G-A-A-T-T-C-C-A
| | | | | | | | | |
-T-G-C-T-T-A-A-G-G-T
-A-C-G-A-A
| | | | |
-T-G-C-T-T
T-T-C-C-A
| | | | |
A-A-G-G-T
13
Enz. endonucleases chuyên bit và không
chuyên bit

Endonuclease không chuyên bit: (loi I, III)

V trí ct ngu nhiên

Không s dng trong cloning
Endonuclease chuyên bit: (loi II)

Ct  v trí nhn din rt chuyên bit

ưc s dng trong cloning
Điểm nhận diện (Recognition site)
của Enz. cắt giới hạn loại II
im nhn din thưng có trình t ‘i xng’
(palindromic):
“Able was I, ere, I saw Elba”
Bam H1 site:
5’-GGATCC-3’
3’-CCTAGG-5’
14
Aat II GACGTC
Acc65 I GGTACC
Acc I GTMKAC
Aci I CCGC
Acl I AACGTT
Afe I AGCGCT
Afl II CTTAAG
Afl III CRYGT
Age I ACCGGT
Ahd I GACN N N N N GTC
Ale I CACN N N N GTG

Alu I AGCT
Alw I GGATC
AlwN I CAGN N N CTG
Apa I GGGCCC
ApaL I GTGCAC
Apo I RAATTY
Asc I GGCGCGCC
Ase I ATTAAT
AsiS I GCGATCGC
Ava I CYCGRG
Avr II CCTAGG
Bae I AC(N 4)GTAPyC
BamH I GGATCC
Ban I GGYRCC
Ban II GRGCYC
Bbs I GAAGAC
Bbv I GCAGC
BbvC I CCTCAGC
Bcc I CCATC
BceA I ACGGC
Bcg I CGAN N N N N N TGC
BciV I GTATCC
Bcl I TGATCA
Bfa I CTAG
BfrB I ATGCAT
BfuA I ACCTGC
BfuC I GATC
Một số Enz. cắt giới hạn (EBL)
Isoschizomers: các enz. ct gii hn khác nhau, nhưng có cùng trình
tu im nhn din (VD: MboI và Sau3A

là
là
nh
nh


ng Isochizomer,
ng Isochizomer,
vì
vì
có cù
có cù
ng tr
ng tr
ì
ì
nh t
nh t

 im nhn din GATC)
Complete Isoschizomers: Cùng im nhn din (recognized site)
Cùng im ct (cleaved sites)
VD: Hpa II và Msp I (C↓CGG  to u dính (cohensive ends)
Incomplete Isoschizomers: Cùng im nhn din (recognized site)
Khác nhau  im ct (cleaved sites)
VD: Sma I (CCC↓GGG  to u bng (blunting ends)
Xma I (C↓CCGGG  to u dính (cohensive ends)
Isoschizomer
Isoschizomer
15

Các dng u ct to ra bi Enz. ct gii hn
5’ protruding ends
3’ protruding ends
5’-CCCGGG-3’
3’-GGGCCC-5’
5’-CCC-OH
3’-GGG- p
p -GGG-3’
OH-CCC-5’
+
SmaI
u bng (blunting ends)
u dính (Cohensive ends)
T
T


n
n
su
su


t
t
c
c


t

t
c
c
a
a
Enzyme
Enzyme
gi
gi


i
i
h
h
n
n
(
(
Ư
Ư
c
c
l
l
ư
ư
ng
ng
d

d


a
a
theo
theo
qui
qui
lu
lu


t
t
tô
tô
̉
̉
h
h


p
p
)
)
4 nucleotide (A, T, C, G) + Giả nh:
+ 4 N u. hin din vi số lưng bng nhau (tn số ¼)
+ 4 N u. sp xp ngu nhiên trong genome (qui lut tổ hp)

Ví d: Trình tự on nhn din (recognition site)
AT
AT


T
T


n
n
su
su


t
t
= 1/4 A x 1/4 T = 1/
= 1/4 A x 1/4 T = 1/
16
16
AT
AT
(1/4)
(1/4)
2
2
ATT
ATT



T
T


n
n
su
su


t
t
= 1/4 A x 1/4 T x 1/4 T = 1/
= 1/4 A x 1/4 T x 1/4 T = 1/
64
64
AT
AT
(1/4)3
(1/4)3
ATTGCG
ATTGCG


T
T


n

n
su
su


t
t
= 1/
= 1/
4096
4096
ATTGCG
ATTGCG
(1/4)
(1/4)
6
6
n N u.
n N u.


T
T


n
n
su
su



t
t
=
=
(1/4)
(1/4)
n
n
ô
ô
̣
̣
dà
dà
i
i


o
o
n
n
nh
nh


n
n
di

di


n
n
↑
↑


Kho
Kho
ng
ng
cá
cá
ch
ch
gi
gi


a
a
cá
cá
c
c
i
i



m
m
c
c


t
t
↑
↑


Sô
Sô
́
́
l
l
ư
ư
ng
ng
i
i


m
m
c

c


t
t
↓
↓
16
Bn  ct bi Enz. gii hn
(Restriction Map)
Restriction Map = Bn  v trí ct ca các enz. gii hn trên 1
on ADN cho trưc
Công c h tr  xác nh Restriction Map = các chương trình vi
tính chuyên dng cho phân tích ADN (VD: BioEdit, CLC Free
Workbech)
ng dng ca Restriction map:
+ Xác nh v trí ct ca 1 Enz gii hn trên on ADN kho
sát
+ Ưc lưng s lưng và kích thưc ca các on ADN s
nhn ưc khi s dng 1 hay nhiu Enz. gii hn  ct 1 on
ADN kho sát
Lưu ý !!!
Hiu qu ca Enz. gii hn ph thuc:
+  sch ca ADN
+ Buffer thích hp
+ N hit  thích hp
+ T l: s lưng ADN /s lưng Enz. gii hn
+ Tính cht ca Enz. gii hn
17
N i ADN (DN A ligation) = hình thành cu ni phospodiester

gia 2 mch ADN , nu u 5’ có gc Phosphat.
Enz Ligase:
Ligase ca phage T4
Co-factor: ATP
s dng cho c u dính và u bng
Ligase ca E. coli
Co-factor: N AD+
ch s dng cho u dính
N i ADN (DN A ligation)
u ca 2 on ADN cn ‘tương thích’  ni thành công
-N-N-G A-A-T-T-C-N-N-
| | | | | | | | | |
-N-N-C-T-T-A-A G-N-N-
-N-N-G
| | |
-N-N-C-T-T-A-A
G-A-T-C-C-N-N-
| | |
G-N-N-
-N-N-A-G
| | | |
-N-N-T-C
C-T-N-N-
| | | |
G-A-N-N-
-N-N-G
| | |
-N-N-C-T-T-A-A
C-T-N-N-
| | | |

G-A-N-N-
Compatible cohesive ends Non-compatible cohesive ends
Compatible blunt ends Non-compatible cohesive/blunt ends
‘tương thích’ : + dng u ging nhau
+ có th to l/kt b sung
18
K
K
thu
thu


t
t
i
i


n di (Electrophoresis)
n di (Electrophoresis)
in di ADN (DN A Electrophoresis)
N guyên tc
•
•
G
G


c
c

phosphate
phosphate
c
c
a A
a A
DN mang
DN mang
i
i


n t
n t
í
í
ch âm
ch âm


phân t
phân t


ADN s
ADN s


di chuy
di chuy



n v
n v


c
c


c dương trong môi tr
c dương trong môi tr
ư
ư
ng i
ng i


n
n
.
.
•
•
i
i


n t
n t

í
í
ch âm 
ch âm 
ư
ư
c phân b
c phân b
 
 
u d
u d


c phân t
c phân t


ADN
ADN


t
t


c
c





di chuy
di chuy


n
n
c
c
a A
a A
DN ph
DN ph


thu
thu


c v
c v
à
à
o
o
kí
kí
ch th
ch th

ư
ư
c
c
c
c
a
a
chú
chú
ng.
ng.
•
•
T
T


c 
c 


di chuy
di chuy


n
n
cò
cò

n p
n p
h
h
thu
thu


c v
c v
à
à
o
o
môi tr
môi tr
ư
ư
ng gel
ng gel
s
s


d
d
ng.
ng.



Kí
Kí
ch th
ch th
ư
ư
c ADN n
c ADN n
h
h
ho
ho


c k
c k
há
há
c bi
c bi


t v
t v


k/t
k/t
h
h

ư
ư
c c
c c


a c
a c
á
á
c
c
phân t
phân t


ADN r
ADN r


t n
t n
h
h
= gel
= gel
polyacrylamide
polyacrylamide



Kí
Kí
ch th
ch th
ư
ư
c ADN l
c ADN l


n ho
n ho


c k
c k
há
há
c bi
c bi


t v
t v


k/t
k/t
h
h

ư
ư
c c
c c


a c
a c
á
á
c
c
phân t
phân t


ADN l
ADN l


n = gel
n = gel
agarose
agarose
19
K
K
thu
thu



t
t
i
i


n di ADN
n di ADN
Phân lo
Phân lo


i:
i:
+
+
i
i


n di trên gel agarose
n di trên gel agarose
+
+
i
i


n di trên gel Polyacrylamide

n di trên gel Polyacrylamide
Cá
Cá
c b
c b
ư
ư
c ti
c ti


n h
n h
à
à
nh
nh
B
B
ư
ư
c 1:
c 1:
Chu
Chu
N
N
n b
n b



m
m


u i
u i


n di
n di
B
B
ư
ư
c 2:
c 2:
Chu
Chu
N
N
n b
n b


gel v
gel v
à
à
i

i


n di
n di
B
B
ư
ư
c 3:
c 3:
N hu
N hu


m m
m m


u
u






c k
c k



t q
t q
u
u
Ch
Ch
n gel t
n gel t
hí
hí
ch h
ch h


p
p
PP nhu
PP nhu


m m
m m


u t
u t
hí
hí
ch h

ch h


p
p


i t
i t
ư
ư
ng ADN i
ng ADN i


n
n
di v
di v
à m
à m
c tiêu nghiên
c tiêu nghiên
c
c


u
u
20

‘
‘


phân gi
phân gi


i
i
’
’


c
c
a gel
a gel
(
(
P
P
ulse
ulse
F
F
ield
ield
G
G

el
el
E
E
lectrophoresis)
lectrophoresis)
Agarose Gel Electrophoresis
21
N hum gel agarose
Mc ích: N hum màu ADN  nhân din
Hàm lưng ADN ↑  Bt màu càng m
Các hóa cht nhum:
Gel Agarose: Ethium Bromide
Cyber green
Methylene Blue
 nhy: Ethium Bromide ~ Cyber green > Bleu Methylene
c hi : Ethium Bromide > Cyber green > Bleu Methylene
Giá thành: Cyber green > Ethium Bromide > Bleu Methylene
22
Agarose Gel Electrophoresis
ng dng:
– Phân tách ADN da theo kích thưc phân t
– Tinh lc on ADN cn quan tâm
Ưu i
Ưu i


m
m
:

:


-
-
PP ơn
PP ơn
g
g
an (k
an (k
hông 
hông 
ò
ò
i h
i h


i nhi
i nhi


u kinh nghi
u kinh nghi


m v
m v
à k

à k
thu
thu


t)
t)


-
-
í
í
t m
t m


t th
t th


i gian (
i gian (
TB: 4
TB: 4
5
5
-
-
60 ph

60 ph
ú
ú
t/RUN )
t/RUN )


-
-
Phương
Phương
phá
phá
p nhu
p nhu


m m
m m


u nhanh,
u nhanh,
có
có
th
th
 ch
 ch
p

p


nh k
nh k


t q
t q
u
u
ngay
ngay


-
-
D
D
 dà
 dà
ng phân l
ng phân l


p tr
p tr
 l
 l
i ADN t

i ADN t


gel
gel
Khuy
Khuy


t i
t i


m
m
:
:


-
-


phân gi
phân gi


i th
i th



p (
p (
khá
khá
c bi
c bi


t k/
t k/
th
th
ư
ư
c c
c c
ó
ó
th
th


nh
nh


n di
n di



n >
n >
50
50
N u.
N u.


-
-
Thu
Thu


c nhu
c nhu


m Ethium bromide
m Ethium bromide


Cancergen
Cancergen
Polyacrylamide Gel Electrophoresis
23
Polyacrylamide Gel Electrophoresis
+ Gel = hn hp 2 ddch: acrylamide and bis-acrylamide (to liên
kt mng lưi) khi ông c (polymer hóa)

+ Quá trình polymer hóa khi ng bi TEMED và ưc xú tác
bi ammonium persulfate
+ Rt c (neurotoxin) khi  dng lng (chưa polymer hóa),
không c  dng ông c (ã polymer hóa)
+ Quá trình Polymer-hóa b c ch bi không khí (k him khí)
 gel thưng  gia 2 ming kính
+ Thưng là dng gel ng
+  phân gii ca gel tùy thuc nng  ca polyacrylamide
(3.5%-20%):
3.5%: 100-1000bp
8%: 60-400bp
20%: 10-100bp
Polyacrylamide Gel Electrophoresis
Hàm lưng gel: cao  Phân tách ph/t k/thưc <
thp  Phân tách ph/t k/thưc >
24
Lưu ý
in di vi hiu in th thp:
- Tc  di chuyn ca ADN chm  tn nhiu thi gian
- Band thng và rng
in di vi hiu in th cao:
- Tc  di chuyn ca AN D nhanh  ít tn thi gian
- d b ‘smile’, nhưng band hp và nét
N hum gel Polyacrylamide
Mc ích: N hum màu ADN  nhân din
Hàm lưng ADN ↑  Bt màu càng m
Các hóa cht nhum:
N itrat Bc (AgN O3)
Fluorecent dye (IR700, IR800 – LICOR Corp.)
ng v phóng x P32

 nhy: P32 ~ Fluor. dye > AgN O3
c hi : P32 > AgN O3 ~ Fluor. dye
Giá thành: P32 > Fluor. dye > AgN O3
25
K
K
thu
thu


t PCR
t PCR
(Polymerase Chaine Reaction)
(Polymerase Chaine Reaction)
PCR = T/hp DN A trong ng nghim
Sao chép ADN trong TB (in vivo):
M xon mch kép
To con mi (primer)
Kt ni các N u. t do
Hoàn chnh mch và óng xon
Sao chép ADN trong ng nghim (in vitro):
M xon mch kép : nhit 
To con mi (primer) : con mi tng hp
Kt ni các N u. t do : Taq Polymerase
óng xon : nhit 
 K thut PCR (công ngh gien)